CN1348499A - 风味/香味材料及其制备 - Google Patents

Abstract

由基本上天然的方法利用来自植物的材料的生物转化生产风味成分,特别是香草属组合物。阿魏酸是许多植物细胞壁的成分,它可被直接地或间接地转化为香草醛。大量这样的化合物可经过生物转化生成风味组合物的组分。

Description

风味/香味材料及其制备

                 背景

本发明涉及风味/香味材料以及这些材料和关键中间体的制备。本发明特别(虽然不是唯一地)涉及香草风味物质和相关物质。

天然香子兰豆提取液的供应苦于供应不足和品质易变。尽管在最近的10-15年内，大量的天然风味化学物质已经可以买得到，但是仍然没有开发出完全令人满意的天然香草醛风味化学产品或香草风味。开发具有成本效益的香草醛产品的主要困难首先是得不到优选原料阿魏酸；其次是难于找到可以积聚香草醛的微生物菌株，这是由于其易于进一步新陈代谢为比如香草酸，并且对于细胞新陈代谢具有抑制效果。开发天然香草风味的主要困难在于一起有助于香子兰豆提取液的超级风味和香味的大量不同化学物质。此外，由于香草属在香味方面的次要用途，对无色固态产品的需求大于对有色乙醇-水香子兰豆提取液的需求。

我们的较早的申请WO-A-96/39859公开了通过植物材料的酶促水解制备某些酚醛物质。由此通过对小麦胚或小麦麸进行酶处理制备阿魏酸(1a)。通过对向日葵粉进行酶处理制备咖啡酸(1b)。阿魏酸及其酯作为前体化合物并且也作为食物和化妆品的成分，如作为抗氧化剂是有价值的。

不同的工作人员报道阿魏酸(1a)直接(如DE-A-19532317)或通过香草酸(2)(FR-A-2724394)向香草醛(3)的微生物转化。

              本发明概要

本发明特别提供了一种将包含一种或多种式(A)的物质的第一组合物转化为包含一种或多种式(B)的物质的第二组合物的方法：

其中X、Y、X′和Y′独立地选自H、OH和OMe；Z为CO₂H、CO₂carb(其中carb代表碳水化合物残基)、CHO或CH₂OH，Q为CHO、CO₂H或CO₂OH，所述方法包括在一定的条件下用一种或多种微生物处理所述第一组合物，使(A)转化为(B)；所述微生物选自(a)恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)；(b)能将阿魏酸转化为香草酸的红酵母属菌种(Rhodotorula species)和其它酵母；(c)同时具有阿魏酸酯酶活性和侧链内的裂解活性，从而可将阿魏酸苷转化为香草醛和/或香草酸的微生物；以及(d)可将香草酸转化为香草醛的Micromucor isabellinus或烟曲霉(Aspergillus fumigatus)菌株。

本方法可包括从植物材料获得包含阿魏酸的上述第一组合物的预备步骤，采用的是包括下面各步的方法：

(a)处理植物材料以产生包含阿魏酸酯的溶液；和

(b)在一定的条件下用具有阿魏酸酯酶活性的酶组合物处理上述溶液，使阿魏酸酯转化为阿魏酸。注意该酯通常包含碳水化合物残基尤其是糖残基，有时被称为苷。

本发明还提供了在本发明方法中有用的几种微生物。这些微生物包括几种保藏菌株及其突变体(它们可通过化学或其它常规诱变或者通过基因工程来制备)。也可以利用完整的生物体的提取液和离体酶(isolated enzyme)。

本发明包括下述各方面：

A)包含多种风味/香味组分的风味/香味组合物的制备方法，该方法具有下述步骤：

(i)处理植物材料或多种植物材料以产生前体化合物，最好为多种前体化合物(单独的或混合的)，该前体化合物优选包含两种或多种1-苯基链烯烃类，最好为式(4)的物质：其中X和Y独立地选自H、OH和OMe，Z为CO₂H、CO₂carb(其中carb代表碳水化合物残基)、CHO或CH₂OH，最优选包含化合物(4)，其中X＝OMe、Y＝OH、Z＝CO₂H(阿魏酸)，还优选其中X＝H、Y＝OH、Z＝CO₂H(香豆酸)和X＝OH、Y＝OH、Z＝CO₂H(咖啡酸)的化合物；以及优选

(ii)使(从植物材料残余物分离或未分离的)所述前体化合物或多种前体化合物经受一次或多次生物转化以产生风味/香味组合物。对于具有带取代基-CH：CH-CO₂H的苯环的前体化合物(例如结构(4)的化合物)来说，生物转化可以产生该取代基被转化成-CO₂H和/或-CH₂OH和/或-CHO的化合物。

本文中所用的术语“植物材料”包括这些材料，如通过对植物机械加工得到的粉或浆，以及提取种子油之后留下的残余物等。

特别优选用于步骤(i)的植物材料包括玉米、小麦、米、甜菜以及它们的一部分，特别是从它们的普通用途得到的废料如米糠和谷类纤维。例如可通过干或湿磨得到玉米纤维和小麦纤维。可通过浆得到甜菜纤维。也可使用植物材料的混合物来获得所需的前体混合物。

步骤(i)可包括：

(a)用酸(优选柠檬酸，例如可通过加入柠檬或酸橙汁得到)处理(潮湿的或干燥的)植物材料以释放至少阿魏酸的苷，通常在加热至如50-250℃条件下进行；和

(b)用碱(如碱金属碳酸氢盐)或一种或多种具有阿魏酸酯酶(“FAE”)活性的酶处理含苷混合物以释放阿魏酸。合适的酶包括半纤维素酶(从Amano获得，来自种名待定的曲霉属(Aspergillus spp.))和/或Celluzyme(Novo Nordisk)和/或来自Humicola insolens的酶，可作为朋多本(Pentopan)、Biofeed Plus或者Biofeed Beta(Novo Nordisk)得到。这些酶除了它们的FAE活性外，还具有一些木聚糖酶活性。如果需要，可以加入添加的木聚糖酶源以补充已经存在的木聚糖酶活性。(注意：所谓的阿魏酸等的苷实际上是碳水化合物残基的酯，而非是常规的苷醚)。

在步骤(a)中，柠檬酸是合适的，因为它相当地强、热稳定、廉价、对包含一定范围阿魏酸的材料有效、不挥发、并且不易于引起副反应。它适当溶解于谷类“糊”中。它作为不溶盐(如钙)易于被回收再利用。它是“天然”材料，被准许用于食物用途。代替物包括其它有机多元羧酸，尤其是羟基酸，如异柠檬酸、酒石酸、苹果酸、富马酸和琥珀酸。

可以使用包含适当酸的溶液，如包含酒石酸的来自葡萄的溶液；或者包含柠檬酸或苹果酸的发酵介质。

微生物可提供进行步骤(i)(b)和步骤(ii)(阿魏酸和/或其它前体化合物的生物转化)所需的活性。例如，我们开发出了不仅具有必须的FAE活性，也具有链烯烃裂解活性的黑曲霉(Aspergillus niger)、黄曲霉(A.flavus)和产黄青霉(Penicillium chrysogenum)的菌株，以之作用于步骤(a)的产物，将阿魏酸苷转化为香草酸。

步骤(i)还可通过用含水碱如碱金属或碱土金属的氢氧化物、碳酸盐或碳酸氢盐处理植物材料(如玉米纤维)来实施。优选碳酸氢钠。

包含香草酸和其它物质(如从香豆酸得到的对羟基苯甲酸)的产物混合物可以不用分离各组分地经受一次或多次进一步的生物转化，例如将香草酸转化为香草醛，以及进行其它组分的相应转化。

B)香草醛的制备，包括香草酸(2)到香草醇(5)的生物转化、香草醇(5)到香草醛(3)的生物转化。通常这两步采用不同的微生物。注意化合物如香草醇其本身是有价值的风味化学物质。

这些步骤其本身可能是新的。香草酸被还原为香草醇可以通过卵孢接霉(Zygorhynchus moelleri)进行。

C)香草醛的制备，包括香草酸(2)通过微生物菌株如烟曲霉或Micromucor isabellinus直接到香草醛(3)的生物转化。

D)香草醛的制备，包括阿魏酸比如通过恶臭假单胞菌的菌株到香草醛的生物转化。

E)物质的制备和分离，特别是易于进一步反应的物质(如醛类)或易于抑制微生物的物质(如香草醛)，它是通过在水相中用微生物进行生物转化，并使水相与第二相接触，而产物进入第二相来实现的。该“就地产物移除”(“ISPR”)可以采用植物油作为第二相。产物可随后通过如结晶或溶剂萃取从第二相中回收。本ISPR方法可被用于(上述)方法A的步骤(ii)，或被用于方法B、C和D。

F)香草风味/香味组合物，它是上述方法A的产物或者一种或多种这样的产物的混合物和/或一种或多种由上述方法(B)、(D)或(E)制备的物质和/或一种或多种从其它来源得到的香草风味化学物质和/或香子兰豆提取液。

G)恶臭假单胞菌在将阿魏酸转化为香草酸中的应用。原料优选为用柠檬酸盐和FAE酶处理植物材料如谷类纤维所获得的混合物(如上面A段所述)，没有分离阿魏酸。

H)上述各种转化可被用于其它反应物。这可导致更有用的香味/气味组分。例如苯甲酸、4-羟基苯甲酸和3，4-二羟基苯甲酸可被转化为相应的醛和/或苯甲醇。

I)分离用在本发明方法中的微生物菌株的方法。如在琼脂上将包含多种菌株的材料(如土壤样品)用于制备多种菌落，通过适用于检测醛的试剂测试各菌落的有效活性。例如，2，4-二硝基-苯肼围绕产生醛的菌落生成橙色/红色区域，围绕产生醇的菌落生成暗黄色区域。

J)通过方法I)分离的菌株及其突变体(通过常规诱变或通过基因工程自然获得)。这包括已被转化从而获得“亲本”生物体活性的异源生物体，而转化核酸是直接或间接从“亲本”生物体获得的。

一些特别优选的菌株已依据布达佩斯条约进行保藏。简要叙述如下。

a)NCIMB保藏的菌株(NCIMB Ltd，23 St Machar Drive，Aberdeen，A24 3RY，GB)。

1.泡囊短波单胞菌(Brevundimonas vesicularis)(Zyl 295)-NCIMB40987-革兰氏阴性菌(保藏日18/11/98)

2.恶臭假单胞菌(Zyl 503)-NCIMB 40988-革兰氏阴性菌(保藏日18/11/98)

b)IMI保藏的菌株(CABI Bioscience UK Centre Egham，GeneticResource Collection，Bakeham Lane，Egham，Surrey TW20 9TY，GB)

1.红酵母(Rhodotorula glutinis)(Zyl 717)-IMI 379896-酵母，产生红色/橙色色素(20/11/98)

2.黄曲霉(Zyl 714)-IMI 379895-丝状真菌，产生淡绿色孢子(20/11/98)

3.烟曲霉(Zyl 747)-IMI 379902-丝状真菌，产生蓝色/灰色孢子(20/11/98)

4.康宁木霉(Trichoderma koningii)(Zyl 751)-IMA 379903-丝状真菌，产生绿色孢子(20/11/98)

5.黑曲霉(Zyl 759)-IMI 379904-丝状真菌，产生褐色/黑色孢子(20/11/98)

6.Micromucor isabellinus(Zyl 849)-IMI 379893-丝状真菌，产生淡褐色孢子(20/11/98)

7.卵孢接霉(Zyl 851)-IMI 379899-具有气生菌丝的丝状真菌，产生黑色孢子(20/11/98)

8.产黄青霉(Zyl 860)-IMI 379900-丝状真菌，产生蓝色孢子(20/11/98)

9.恶臭假单胞菌(Zyl 581)-IMI 382568，革兰氏阴性菌；保藏日31/1/00

那些菌株的应用在下面的实施例中举例说明。当然，同类的其它菌株也可以用于进行同样的转化。

将根据一些特定实施例来详细阐述本发明。

一般实验条件

在其中生物体在培养肉汤中生长的下述实施例中，菌种生长培养基可包含特定量的维生素添加物和痕量元素添加物两者或其中之一。

如下制备这些物质。

维生素添加物：生物素(2mg L^-1)、叶酸(2mg L^-1)、维生素B₆(10mgL^-1)、维生素B₂(5mg L^-1)、维生素B₁(5mg L^-1)、烟酸(5mg L^-1)、泛酸(5mg L^-1)、维生素B12(0.1mg L^-1)、4-氨基苯甲酸(5mg L^-1)和硫代乙酸(5mg L^-1)。

痕量元素添加物：浓盐酸(51.3mL L^-1)、MgO(10.75g L^-1)、CaCO₃(2.0g L^-1)、FeSO₄·7H₂O(4.5g L^-1)、ZnSO₄·7H₂O(1.44g L^-1)、MnSO₄·4H₂O(1.12g L^-1)、CuSO₄5H₂O(0.25g L^-1)、CoSO₄·7H₂O(0.28g L^-1)和H₃BO₃(0.06g L^-1)。

用采用下述条件的高效液相色谱法(hplc)对松柏醇、松柏醛、咖啡酸、香豆酸、阿魏酸、香草酸、香草醇和香草醛进行分析：

柱          Spherisorb C₁₈

流动相      80∶20去离子水：含1％乙酸的乙腈

流速        1.75mL min^-1

检测        290nm的紫外线

用采用下述条件的高效液相色谱法(hplc)对4-羟基苯甲酸和4-羟基苯甲醛进行分析：

柱          Spherisorb C₁₈

流动相      80∶20去离子水：含1％乙酸的乙腈

流速        2mL min^-1

检测        275nm的紫外线

作为二者择一的方法，可用采用下述条件的薄层色谱法(tlc)对4-羟基苯甲酸和4-羟基苯甲醛进行分析：用石油醚(40-60)∶乙酸乙酯(50∶50)洗脱的硅板，用UV或二硝基苯肼溶液(0.4％在2M HCl中)显色。A)植物材料的应用

玉米纤维是廉价原料的一个例子，它可提供用于制备风味/香味物质的原料。用碱进行处理导致阿魏酸和少量其它物质尤其是香豆酸的释放。将该混合物经生物转化，生成如香草酸和4-羟基苯甲酸的混合物，其可以进一步经生物转化，如将羧酸基团转化为-CHO和/或-CH₂OH。实施例1A：从玉米得到的阿魏酸和香豆酸

(a)氢氧化钠的使用：向500g基底玉米纤维中加入1升1M的氢氧化钠溶液，将所得悬浮液彻底混合，然后将其在环境温度(22℃)下保持15小时。然后加入1升乙酸乙酯和100mL浓盐酸，并混合悬浮液。将乙酸乙酯相分离，用另外的1升乙酸乙酯再萃取纤维悬浮液。将合并的有机溶剂相进行干燥(Na₂SO₄)，并蒸发至干燥以得到稠油。用正己烷反复洗涤该油，得到包含33％阿魏酸和2.9％香豆酸的浅黄色固体。

(b)碳酸氢钠的使用：在250ml锥形瓶中，向含有1.75％w/w阿魏酸(FA)和0.1％w/w香豆酸(CA)的10g玉米纤维中加入100ml 0.5m碳酸氢钠溶液。使用电热板搅拌装置将所得悬浮液加热并在85℃混合。用hplc全程监测阿魏酸和香豆酸向溶液中的释放。阿魏酸和香豆酸产量如下：60分钟，FA 20mg，CA 1.6mg；245分钟，FA 100mg，CA 4.3mg；315分钟，FA 127mg，CA 5.6mg；365分钟，FA 126mg，CA 6.2mg。在365分钟时的收率分别相当于72％和62％有用阿魏酸和香豆酸的释放。

用挤压通过网袋的方法对玉米悬浮液进行粗滤，用10ml去离子水洗涤回收的固体，并在离心分离(4,000×g，15分钟)之前将滤液合并。用浓盐酸将上清液的pH调节至pH2.5，随后用乙酸乙酯(3×100ml)进行萃取。将合并的乙酸乙酯层蒸发至干燥，得到216mg包含41％阿魏酸和2.7％香豆酸的黄色/橙色固体物质。

在随后的实施例(c)和(d)中，从玉米纤维制备阿魏酸和香豆酸是通过两步法来进行的。首先，通过加热和柠檬酸溶液实现纤维的酸解，柠檬酸是以溶解在水中的定量的柠檬酸或者来自新榨的柠檬或酸橙的果汁来供应的。第二步，通过加入产生阿魏酸和香豆酸的水解酶制剂实现可溶性肉桂酸糖酯的水解。

(c)在250ml的锥形瓶中，将玉米纤维(20g)与100ml柠檬酸溶液(2％)混合，并在126℃加热1小时。通过在剧烈混合下加入10M氢氧化钠溶液，使玉米悬浮液的pH升至pH5.0。将酶制剂(40mg，半纤维素酶，Amano)加入到悬浮液中，将其在50℃培养46.5小时，并以200rpm进行混合。如上述通过hplc对阿魏酸的释放进行监测。培养1.5小时之后，溶液中存在总量为51mg的阿魏酸，46.5小时之后，该量升至220mg。

(d)在2L的锥形瓶中，将玉米纤维(200g)与1升柠檬酸溶液(2％)混合，并在126℃加热1小时。用榨汁机将玉米悬浮液分离为不能溶解的固体和液体部分。第一次压榨产生大约800ml液体；用另外200ml水洗涤回收的固体，再次压榨得到大约1升的合并的液体部分。通过在剧烈混合下加入10M氢氧化钠，使玉米液体的pH升至pH7.0。将酶制剂(Biofeed Plus L，2ml，Novo Nordisk)加入到液体中，将其在60℃培养7.5小时，并以160rpm进行混合。如上述通过hplc对阿魏酸和香豆酸的释放进行监测。培养7.5小时之后，检测到溶液中有1.6g L^-1阿魏酸和0.1g L^-1对香豆酸。如下所述通过萃取入乙酸乙酯，从水溶液中回收肉桂酸，随后进行溶剂的碱萃取以得到肉桂酸钠盐，或者将溶剂蒸发至干燥以得到肉桂游离酸。

通过加入浓盐酸将玉米溶液(1L)调节至pH3，并通过硅藻土过滤以除去不溶物质。用300ml乙酸乙酯两次萃取滤液，并将溶剂萃取液合并。将溶剂蒸发至干燥以得到2.6g橙色固体，该固体包含1.39g阿魏酸和0.1g香豆酸，纯度分别为53.5％和3.8％。为了以其钠盐的形式回收肉桂酸盐，在剧烈混合含水相下将乙酸乙酯连续泵送到10M氢氧化钠溶液(10ml)中。持续该操作直到几乎痕量的肉桂酸盐都已被回收进水相中(约2小时)。在45℃、真空下将水相干燥以得到11.5g膏状固体物质，该物质包含1.3g阿魏酸和0.1g香豆酸，纯度分别为11.3％和0.87％。

e)柠檬酸处理过的玉米纤维悬浮液向包含阿魏酸和香草酸的消化浆(digested pulp)的转化

将包含大约1.75％w/w阿魏酸的4g玉米纤维和20ml 2％w/v柠檬酸溶液加入3个50ml锥形瓶各瓶中，并将其在126℃高压灭菌55分钟。冷却之后，用10M氢氧化钠溶液将处理过的悬浮液的pH调节至pH6.0。用Zyl 714(IMI 379895)黄曲霉、Zyl 759(IMI 379904)黑曲霉或产黄青霉Zyl 860(IMI 379900)的孢子对各瓶进行接种，并在30℃培养，在定轨混合器上以250rpm摇动。用hplc测定各瓶的水解产物阿魏酸和阿魏酸侧链裂解产物香草酸。

经过89小时培养之后，在用于产黄青霉实验的溶液中阿魏酸和香草酸的浓度为：阿魏酸，未检测到；香草酸，1.35g/L。

在用于黄曲霉、黑曲霉的溶液中，经过5天培养之后，阿魏酸和香草酸的浓度分别为1g/L阿魏酸和0.3g/l香草酸；未检测到阿魏酸和1.2g/L香草酸。

三种真菌都将玉米纤维悬浮液还原为消化浆，将纤维片段变为精细固体。

f)中间工厂规模加工玉米纤维以释放阿魏酸

使3批10kg的玉米纤维各自悬浮在50L的2％w/v柠檬酸水溶液中。采用Agemore扫描表面加热/混合容器将1和2批加热至126℃持续1小时，然后快速冷却至80℃。然后用Vigo 72L榨汁机将固体从溶液中分离，用水洗涤固体以恢复起始体积。

1和2批共产生100L的溶液。通过加碱水解(base hydrolysis)处理该溶液的样品以释放可利用的阿魏酸，并用hplc进行分析，阿魏酸浓度为1.5gL^-1。

将第三批加热至134℃持续15分钟，快速冷却至80℃，并采用与1和2批相同的装置进行压榨，但是第一次压榨之后不用水洗涤固体。该批产生44.5L溶液。通过加碱水解处理该溶液的样品以释放可利用的阿魏酸，并用hplc进行分析，阿魏酸浓度为1.12gL^-1。

将全部三批溶液混合得到145L，通过折射法所测定的悬浮固体浓度为10.5％w/v，所测定的pH为pH3.4。然后用Junior升/降板式蒸发器在60℃将该溶液浓缩。获得19.5L溶液，通过折射法测定悬浮固体含量为50％。通过加碱水解处理该溶液的样品以释放可利用的阿魏酸，并用hplc进行分析，阿魏酸浓度为8.0gL^-1。

然后将该浓缩溶液转移至70L Biolafitte发酵罐内，并用水稀释至总体积为33L。用2.5L 32％w/v氢氧化钠溶液将该溶液的pH从pH3.0调节至pH6.0。然后将该溶液加热至45℃。以0.8gL^-1的浓度加入酶，即半纤维素酶(Amano)，将该混合物在搅拌条件下培养30小时。经过酶处理之后，用hplc分析该溶液，阿魏酸浓度为3.5gL^-1。

用82.5％w/v磷酸将该溶液的pH降至pH3.0，并采用CarrPowerfuge通过离心分离除去悬浮固体。然后用50L的乙酸丁酯(分为25L的两批)从溶液中萃取出阿魏酸。在发酵罐内将乙酸丁酯覆盖在溶液上并轻轻地混合，直到乙酸丁酯层中阿魏酸的浓度停止增加。当萃取完成时，回收了48L乙酸丁酯。通过hplc对乙酸丁酯进行分析，得到阿魏酸浓度为2.64gL^-1。

g)中间工厂规模加工甜菜以释放阿魏酸

使40kg Fibrex甜菜纤维悬浮在200L水中一整夜。采用Agemore扫描表面加热/混合容器将该悬浮液加热至134℃持续30分钟，然后快速冷却至80℃(冷却时间为10分钟)。然后用Vigo 72L榨汁机将固体从溶液中分离，用水洗涤固体以恢复起始体积。

获得200L溶液，pH测定为pH4.0，通过折射法测定悬浮固体含量为9.5％w/v。通过加碱水解处理该溶液的样品以释放可利用的阿魏酸，并用hplc进行分析，阿魏酸浓度为1.03gl^-1。

然后用Junior升/降板式蒸发器在60℃将所得溶液浓缩。获得31L溶液，通过折射法测定悬浮固体含量为50％w/v。通过加碱水解处理该溶液的样品以释放可利用的阿魏酸，并用hplc进行分析，阿魏酸浓度为5.2gL^-1。

然后将该溶液转移至70L Biolafitte发酵罐内，并加热至60℃。用20％w/v磷酸将pH调节至并控制在pH6.5。以1.8gL^-1的浓度加入酶，即朋多本BG 500(Novo Nordisk)，将该混合物在搅拌条件下培养24小时。经过酶处理之后，用hplc分析该溶液，阿魏酸浓度为2.55gL^-1。

用82.5％w/v磷酸将该溶液的pH降至pH3.0，并采用CarrPowerfuge通过离心分离除去悬浮固体。然后用35L的乙酸丁酯(分三批，2×15L，1×5L)从溶液中萃取出阿魏酸。在发酵罐内将乙酸丁酯覆盖在溶液上并轻轻地混合，直到乙酸丁酯层中阿魏酸的浓度停止增加。当萃取完成时，回收了32L乙酸丁酯。通过hplc对乙酸丁酯进行分析，得到阿魏酸浓度为2.10gL^-1。

然后通过碱萃取从乙酸丁酯中萃取出阿魏酸。在500ml的Duran瓶内，将乙酸丁酯泵送经过50ml去离子水。采用Metrohm pH Stat滴定10M氢氧化钠将水保持在pH9.0，并采用磁搅拌器板和搅拌棒进行混合。一旦经过水相，则乙酸丁酯被泵送回到本体溶剂体积内。这一安排将阿魏酸从溶剂相中萃取出来，并将其在pH9.0的水相中浓缩。水相最后变得对阿魏酸饱和并形成沉淀，通过在真空下滤过Whatman41号滤纸回收该沉淀。在烘箱内将这些固体在50℃干燥一整夜。通过本方法获得的第一批固体重34g，经hplc分析，含24g阿魏酸。第二批固体重18g，经hplc分析，含8g阿魏酸。

h)通过加碱水解以中间工厂规模加工玉米纤维以释放阿魏酸

使1吨玉米纤维悬浮在包含600kg 30.5％氢氧化钠的10,000L水中。然后将其在15m³不锈钢夹套式容器中加热至50℃，并混合8小时。该悬浮液的pH经测定为pH11.8。

然后用涡管滗析器(scroll decanter)将块状固体除去，将所得溶液转移至储存容器中。然后用160kg 75％w/v磷酸将溶液的pH调节至pH6.0。

然后采用APV蒸发器将该溶液浓缩，得到2.5吨最终产物。浓缩之后，用180kg75％w/v磷酸将溶液的pH降至pH3.0。取出该物质的样品并用hplc分析阿魏酸，阿魏酸浓度为2.1gKg^-1。

i)重复使用柠檬酸溶液以从玉米纤维中萃取出阿魏酸

将20g柠檬酸溶解在1升RO水中，pH经测定为pH2.20。将200g玉米纤维(由Staley提供)加到柠檬酸溶液中，然后在121℃高压灭菌60分钟。然后当悬浮液仍然在80℃时，采用Vigo台式榨汁机从溶液中分离出固体。从初榨回收到800ml溶液。然后用200ml RO水洗涤留存的固体，再榨第二遍。从第二次压榨回收到220ml溶液。将两次压榨获得的溶液加到一起，总体积为1.02L。溶液的pH经测定为pH2.32。

通过加碱水解处理该溶液的样品以释放可利用的阿魏酸，并用hplc进行分析，阿魏酸浓度为2.49gL^-1。这代表从玉米纤维得到阿魏酸的收率为1.24％w/w。

用2.37g柠檬酸将该溶液的pH调回到pH2.20。将新鲜的200g玉米纤维(由Staley提供)加到该溶液中，然后将其在121℃高压灭菌60分钟。如上所述处理悬浮液，从第一次压榨回收到730ml，用270mlRO水洗涤固体，再次压榨，从第二次压榨回收到320ml。将两次压榨获得的溶液加到一起，总体积为1.05L。溶液的pH经测定为pH2.58。

通过加碱水解处理该溶液的样品以释放可利用的阿魏酸，并用hplc进行分析，阿魏酸浓度为3.13gL^-1。这代表从玉米纤维得到阿魏酸的收率为0.82％w/w。

           实施例1B：产物混合物的生物转化

在装有50mL基本培养基(含有2g/l KH₂PO₄；0.2g/l NaCl；0.22g/lMgSO₄；0.015g/l CaCl₂；1ml/l痕量元素溶液；10ml/l维生素溶液；4g/l酵母提取物；4g/l葡萄糖)的250mL摇瓶内，使红酵母(Zyl 717)的接种期培养物在30℃生长24小时，并伴以200rpm的摇动。该培养物被用于接种(2％)一个250mL的摇瓶，该摇瓶装有50mL相同的培养基，其中加入了300mg上述实施例(a)中所制备的玉米提取液。这相当于2gL^-1阿魏酸和0.18gL^-1香豆酸反应物。将该混合物在30℃、以500rpm进行搅拌，溶解氧的浓度为饱和度的60％。反应物和产物的浓度经hplc测定如下：16小时，阿魏酸0.68gL^-1，香草酸1gL^-1，香豆酸0.08gL^-1，4-羟基苯甲酸0.05gL^-1，3，4-二羟基苯甲酸0.02gL^-1；18小时，阿魏酸0.14gL^-1，香草酸1.54gL^-1，香豆酸0.035gL^-1，4-羟基苯甲酸0.08gL^-1，3，4-二羟基苯甲酸0.05gL^-1。

例如采用卵孢接霉或Micromucor isabellinus可以使产物混合物经受进一步的生物转化，如将-CO₂H基团还原为-CH₂OH和/或-CHO(见下文)。由此香草酸可被转化为比例可变的香草醛和香草醇的混合物。同样地，4-羟基苯甲酸可被转化为4-羟基苯甲醛和4-羟基苯甲醇的混合物。次要的酸组分可以经历相应的还原。所以最终产物是散发气味的化合物的复杂混合物，主要是香草型的复杂混合物。醛(如香草醛)的比例可以例如采用泡囊短波单胞菌通过混合物中醇的生物转化得到提高。

             实施例1C-从玉米纤维制备香草酸

如上面(c)所述，使玉米纤维(1kg)经受柠檬酸解(5L，2％溶液)，随后压榨和洗涤玉米固体以得到大约5升的玉米溶液。用10M的氢氧化钠将溶液的pH调节至pH5.8。将上述溶液的2L等分部分转移到工作容积为5L的发酵罐内，并加热至100℃持续1分钟。也对剩余的溶液进行热处理并独立储存。用200ml产黄青霉(Zyl 860)的培养物对发酵罐进行接种，所述培养物在1升锥形瓶(28℃，以250rpm摇动)内的pH5.8玉米溶液中生长了30小时。发酵罐内的物质在28℃生长15小时，同时将溶解氧的浓度控制在饱和度的30％。不控制培养物的pH，但在整个培养期间其保持不变。15小时之后，发酵罐内物质的体积最初增加到3.5L，然后再经7小时的培养，增加到5L。如前所述继续再培养3天，之后如上所述通过hplc分析发酵罐内的物质。显示出玉米溶液包含1.2gl^-1香草酸和仅为痕量的阿魏酸。通过使发酵罐内物质经过榨汁机的一次压榨将真菌生物量从玉米溶液分离，以得到澄清的含水产物。

尽管产黄青霉(Zyl 860)是目前优选的菌株，但是黄曲霉(Zyl 714)和黑曲霉(Zyl 759)也是可用的。

可以通过萃取进乙酸乙酯，随后使溶剂蒸发至干燥或者通过加入己烷使香草酸从溶剂沉淀，从含水溶液中回收香草酸。例如，将包含567mg香草酸的培养肉汤(900ml)酸化至pH3.0，并用乙酸乙酯萃取3遍(1×400ml，2×200ml)。将溶剂萃取液合并，并如上所述用hplc进行分析，发现其包含485mg香草酸(86％回收率)。

从合并的乙酸乙酯萃取液取等分部分(200ml)，通过蒸发使其体积减小至大约10ml。将己烷(40ml)缓慢加入该浓缩萃取液中，并伴随恒定混合，通过过滤干燥回收沉淀物质，得到140mg包含115mg香草酸的浅黄色固体(82％纯度)。因此，从溶剂的回收率为88％，从初始培养肉汤的总回收率为76％。

            实施例1D-从玉米纤维制备香草醛

如下文实施例4所述，通过加入营养物质提高从实施例1C得到的澄清的溶液的营养含量，用以使Micromucor isabellinus生长。不再向溶液中加入香草酸。使Micromucor isabellinus(Zyl 849)的培养物在30℃、在用1.5％琼脂固化的pH5.8的玉米溶液(实施例1C所述)上生长3天。将该培养物用于接种装在100ml锥形瓶中的20ml上述提高了的澄清溶液。在用于接种(2.5％)第二个完全相同的瓶之前，将瓶内物质在30℃培养24小时，并伴以250rpm的摇动。培养条件如前所述。如上所述用hplc全程测定溶液中香草酸和香草醛的浓度。经过24小时培养之后，在约1.5小时内将溶液的pH从pH5.2缓慢降至pH3.7。pH开始降低之后2.25小时，检测到溶液中有0.02gL^-1香草醛。4.5小时之后，香草醛浓度增至0.12gL^-1。在7.5小时时，香草醛和香草酸的浓度分别为0.275gL^-1和0.81gL^-1。经过13小时培养之后，香草酸的浓度降至0.45gL^-1，香草醛的浓度达到最大值0.35gL^-1。

           B)从香草酸经香草醇得到香草醛

香草酸到香草醛的‘单罐(one pot)′生物转化是已知的，但是它们通常显示出低收率和低转化率和/或低产物浓度(如EP 453368，FR2724394)。我们发现卵孢接酶可被用于从香草酸生产非常高浓度的香草醇(如＞5g/l)。香草醇可以比如通过泡囊短波单胞菌被有效地氧化成香草醛。

            实施例2：从香草酸得到香草醇

将生长在酵母麦芽琼脂上的卵孢接酶(Zyl 851)的培养物用于在250mL的起子培养物烧瓶中接种，该瓶包含50mL培养基(20g葡萄糖；5g(NH₄)₂SO₄；2g NaCl；MgSO₄ 0.22g/L；CaCl₂ 0.015g/L，10mL；痕量元素溶液，1mL；维生素溶液10mL，用pH6.0的磷酸盐缓冲剂使体积达到1升，0.2M)，包含2g/L香草酸，将其在30℃培养24小时，并伴以200rpm的摇动。将该起子培养物加入到发酵罐内的5升相同培养基中，除了培养基组分溶解在去离子水中之外，它也包含2g/L香草酸。将其在pH5.2(30℃)搅拌24小时，之后在1小时内将pH改变至3.5，温度保持在30℃。整个过程中将溶解氧保持在饱和度的70％。通过hplc进行分析。在允许pH下降之前(在24小时阶段)，体系中所存在的香草酸的量没有降低，并且没有看到产物。随着反应进行，如下加入不同量的反应物和营养物：31.75小时，10g香草酸和25g葡萄糖；47.5小时，50g葡萄糖；55小时，20g香草酸。产物测定如下：31.75小时，香草酸，0.26g/L，香草醇，0.3g/L；47.5小时，香草酸，1.17g/L，香草醛，0.1g/L，香草醇，2.38g/L；55小时，香草酸，0.64g/L，香草醛，0.06g/L，香草醇，3.5g/L；5天，香草酸，1.21g/L，香草醛，0.05g/L，香草醇，6.6g/L；这一阶段之后没有观测到进一步的产物积聚。在pH5.2时没有反应物被转化成任何产物，生物转化只在pH被降至pH3.5时才开始，这也是显而易见的。

            实施例3：从香草醇得到香草醛

用泡囊短波单胞菌(Zyl 295)接种250mL摇瓶内的无菌营养肉汤(第2号)(50mL)，在30℃进行培养，并伴以200rpm的摇动。24小时后，加入50mg香草醇，之后通过hplc有规律地监测烧瓶中的香草醇和香草醛。在接种后最多71小时，香草醇的量降至初始含量的大约10％，从反应物到香草醛的摩尔转化量增至大约90％。通过核磁共振波谱学确认了对产物结构的识别。

如果是在对烧瓶接种时加入香草醇，那么反应物的量直到16小时培养后第一次检测到香草醛时才开始减少。总的转化紧随着当反应物加入24小时之后所看到的那些物质的出现而进行。

               C)从香草酸得到香草醛

如上所述，香草酸到香草醛的生物转化是已知的，但是已知方法的收率低，使其在商业上不具备吸引力。FR-A-2724394公开了一种采用担子菌的方法，它在百分比范围(percentage terms)内具有相当好的收率和转化率，但是其绝对收率低。在一个实施例中所得到的香草醛的最高收率为628mg/l。

我们发现了可以提供大于1g/l香草醛，并且可用于连续生产系统的菌株。优选的微生物是Micromucor isabellinus和烟曲霉的菌株。

        实施例4：通过M.isabellinus制备香草醛(a)将生长在酵母麦芽琼脂上的Micromucor isabellinus(Zyl 849)的培养物用于接种250mL的起子培养物烧瓶，该烧瓶装有50mL培养基(15g葡萄糖；5g(NH₄)₂SO₄；2g K₂HPO₄；0.2g NaCl；0.2g MgSO₄；0.015g CaCl₂；痕量元素溶液1mL；维生素溶液10mL，用去离子水使体积达到1升)，包含2g/L香草酸，将其在30℃培养16.5小时，并伴以200rpm的摇动。将该起子培养物加入到发酵罐内的5升相同培养基中，并将香草酸加至浓度为1.5gL^-1。将发酵罐内物质在30℃进行搅拌，整个过程中将溶解氧保持在饱和度的70％。如上所述通过hplc进行分析。随着反应进行，如下加入添加量的香草酸：22.5小时，2.5g；24小时，2.5g；25.75小时，1g；26.5小时，1g；27.5小时，1g；31小时，2.5g。反应物和产物浓度测定如下：22.5小时，香草酸0.6gL^-1；香草醛0.84gL^-1；24小时，香草酸1.36gL^-1；香草醛0.96gL^-1；25.75小时，香草酸1.15gL^-1；香草醛1.1gL^-1；26.5小时，香草酸1.27gL^-1；香草醛1.17gL^-1；27.5小时，香草酸1.43gL^-1；香草醛1.33gL^-1；31小时，香草酸1.16gL^-1；香草醛1.6gL^-1；46.5小时，香草酸1.58gL^-1；香草醛1.70gL^-1。(b)将生长在酵母麦芽琼脂上的Micromucor isabellinus(Zyl 849)的培养物用于接种500mL的起子培养物烧瓶，该烧瓶包含100mL培养基(15g葡萄糖；5g(NH₄)₂SO₄；2g K₂HPO₄；0.2g NaCl；0.2g MgSO₄；0.015g CaCl₂；痕量元素溶液1mL；维生素溶液10mL；用pH6.0磷酸盐缓冲剂(0.2M)使体积达到1升)，包含2g/L香草酸，将其在30℃培养24小时，并伴以200rpm的摇动。并在接种之前立即将该起子培养物加入到发酵罐内的5升相同培养基中，用去离子水使培养基组分达到1升，将香草酸加至浓度为1.5gL-^-1。将发酵罐内物质在30℃搅拌18小时，通过加入5M的氢氧化钠溶液将培养基的pH保持在pH5.2。之后在45分钟之内通过加入5M HCl将培养基pH逐渐地降至3.7，将温度保持在30℃。整个过程中将溶解氧浓度保持在饱和度的70％。如上所述通过hplc进行分析。在使pH在18小时阶段降低之前，体系中香草酸的量经测定为1.48g L-^-1；检测到溶液中香草醛为0.02gL^-1。随着反应进行，如下加入不同量的香草酸或葡萄糖：19.25小时，50g葡萄糖；20.25小时，3g香草酸；21.5小时，4g香草酸；23小时，4g香草酸。反应物和产物浓度测定如下：19.25小时，香草酸1.5gL-^-1；香草醛0.1gL-^-1；20.25小时，香草酸1.16gL-^-1；香草醛0.36gL-^-1；21.5小时，香草酸1.07gL-^-1；香草醛0.74gL-^-1；23小时，香草酸1.06gL^-1；香草醛1.22gL-^-1；26小时，香草酸0.83gL-^-1；香草醛1.96gL-^-1。

          实施例5：通过烟曲霉制备香草醛

将烟曲霉(Zyl 747)的孢子悬浮液用于接种5升的基本培养基(除了加入3gL-^-1香草酸而不是1.5gL^-1之外，成分如实施例4(a)所述)。将发酵罐内物质在30℃进行搅拌，不需控制pH，溶解氧浓度保持在饱和度的60％。如上所述通过hplc进行分析。培养肉汤中反应物和产物的浓度如下：16小时，香草醛0.015gL^-1；24小时，香草醛0.075gL-^-1；40小时，香草醛0.69gL-^-1；47小时，香草醛0.9lgL-^-1；48.5小时，0.98gL-^-1；53.5小时，1.02gL-^-1；112小时，香草酸1.32gL^-1，香草醛1.09gL^-1。

              D)从阿魏酸得到香草醛

实施例6：通过Zyl 581和Zyl 503的NTG衍生突变体将阿魏酸转化成香草醛

                      背景

ZYL 503将阿魏酸(FA)经中间体香草醛转化为香草酸(VA)。该反应的限速步骤为FA到香草醛，因此观察不到香草醛在培养基质中的积聚。以下述NTG突变法为基础，制备出ZYL 503突变体，当其与FA一起被供应时将在培养基中积聚香草醛。

(a)ZYL 503的NTG诱变

使ZYL 503在10ml营养肉汤中生长至中期指数生长期，收割，在100mM柠檬酸钠缓冲剂(pH5.5)中洗涤一次，使其再悬浮于10ml包含0.1gl^-1 NTG的该缓冲剂中，并在室温下进行培养。在5分钟间隔时，取出0.5ml等分部分，在50mM磷酸钾缓冲剂中洗涤两次，并使其再悬浮在1ml该缓冲剂中。然后将这些试样在50mM磷酸盐缓冲剂中稀释并将其涂在基本培养基琼脂(pH7，被0.4M磷酸盐缓冲)上，该基本培养基琼脂包含20gl^-1葡萄糖或1gl^-1香草醛加2gl^-1酵母萃取液和2gl^-1阿魏酸。将板在30℃培养24-48小时。选出不能在香草醛板上生长的生成菌落。在该步骤的基础上获得Zyl 581。

(b)商品阿魏酸(游离酸)通过Zyl 581到香草醛的转化

使Zyl 581的预培养物(preculture)在200rpm、30℃下，在250ml的摇瓶内生长24小时，该摇瓶装有50ml基本培养基(gl^-1：(NH₄)₂SO₄，5；K₂HPO₄，2；NaCl，0.2；酵母萃取液，0.2；葡萄糖，20；10ml含有0.1MMgSO₄/0.01M CaCl₂的溶液；10ml维生素溶液和1ml痕量元素溶液)。然后将该培养物用于接种装有1.2l相同培养基的生物反应器，用2MNaOH将pH控制在8.0，用100-400rpm的搅拌器速度级联、空气流速1.3vvm将氧气控制在70％。在接种之前，如下表所示，随着发酵的进行，加入2gl^-1阿魏酸(Lancaster，99％)。另外设置一个pH控制在8.5的相同反应器。通过HPLC测量反应产物。PH8.0时间(h)  FA(gl^-1)   VA(gl^-1) 香草醛(gl^-1) 加入的FA(gl^-1)0     1.8881       0.000        0.00019.7    0.616        0.298        0.54521.2                                            1.38021.7    1.953        0.433        0.46023.7    1.865        0.347        0.61925.7    1.806        0.798        0.26027.7    1.786        0.912        0.18243.4    1.105        1.039        0.27848.0    0.387        1.245        0.577PH8.5时间(h)  FA(gl^-1)   VA(gl^-1) 香草醛(gl^-1) 加入的FA(gl^-1)0       1.891       0.000       0.00019.7     0.520       0.000       0.54521.2                                            1.45021.7     1.802       0.000       1.16123.7     1.380       0.000       1.41825.7     1.074       0.025       1.47526.0                                            0.97027.7     1.829       0.038       1.52143.4     0.424       0.083       2.24744.8                                            1.54048.0     1.871       0.115       2.193

在pH8时，香草酸是从阿魏酸得到的主要转化产物；而在pH8.5时，香草醛是主要的产物。43小时之后在pH8.5时，香草醛浓度为2.247gl^-1，对应于消耗的阿魏酸的摩尔收率为73％。

(c)来自甜菜的阿魏酸(钠盐)通过Zyl 581到香草醛的转化

用乙酸丁酯萃取从经朋多本500BG处理的甜菜溶液得到的阿魏酸，然后反萃取进碱中以得到阿魏酸钠盐(70.8％w/w作为游离酸的阿魏酸)。

除了在接种之前加入5.65g/l甜菜阿魏酸萃取液(4gl^-1可利用的以钠盐形式存在的阿魏酸)之外，如上所述在pH8.5条件下，使Zyl 581在生物反应器内生长。40小时后，反应器内阿魏酸的浓度为0.05g/l，香草酸为0.21g/l，香草醛为1.69g/l这代表香草醛的摩尔收率为54％。所加入的阿魏酸的72％可被认为成了香草酸、香草醛或剩下的阿魏酸。

(d)从失去效能的培养肉汤中回收香草醛

取出Zyl 581发酵中的培养肉汤，通过离心分离除去细胞，将肉汤调节至pH7.5，用等体积的乙酸丁酯覆盖，并通宵搅拌。在真空下使乙酸丁酯蒸发，并用10ml己烷洗涤所得固体，经过滤回收，并在40℃通宵干燥。

采用下述步骤提纯从Zyl 581发酵中得到的400mg萃取所得固体(经HPLC测定为95％w/w香草醛)。将产物溶解在10ml乙醚中，并向其中加入40mg二氧化硅(70-200μm)。将醚蒸发，留下吸附在二氧化硅上的固体。用500ml在石油醚(60-80馏分)中的2％(v/v)乙酸乙酯溶液洗涤二氧化硅。将该溶液滤过玻璃熔渣，并在真空下蒸发，得到含有超过99％w/w香草醛的白色非晶形固体(277mg)。

              E)就地产物移除(“ISPR”)

本原理包括在水相中进行生物转化，该水相与不混溶相是处于接触中的或者使之与不混溶相接触，产物可(唯一地或优先地)进入不混溶相。可能的好处包括a)防止产物在水相中进一步反应；b)通过高产物浓度避免微生物对产物形成的抑制；c)使平衡反应能够将较大比例的起始物质转化为产物；和d)易于分离产物。而且，ISPR能够有助于连续体系的发展。

ISPR易于被应用于这样的体系，即其中极性反应物(例如羧酸，如阿魏酸或香草酸)被转化成极性较低的产物，该产物可被非极性溶剂优先萃取，非极性溶剂比如植物油材料，优选食用级别。极性副产物也倾向于停留在含水相中。

实施例7和8对应于实施例4和5，但是使用ISPR。

根据体系不同，当生物转化在水相中进行时，不混溶相可以与水相接触，或者它可以与已从生物反应器被(暂时地)取出的水相的一部分接触。可以对被取出的相进行处理(如通过pH调节)以促进通过不混溶相进行的萃取。

    实施例7：采用ISPR通过M.isabellinus制备香草醛

使5升Micromucor isabellinus(Zyl 849)的培养物在如实施例4b所述的发酵罐内生长。将发酵罐内物质在30℃搅拌20小时，通过加入5M的氢氧化钠溶液将培养基的pH保持在5.2。之后在45分钟之内通过加入5M HCl将培养基pH逐渐地降至3.8，此后保持在该pH；温度保持在30℃。整个过程中将溶解氧浓度保持在饱和度的70％。如上所述通过hplc进行分析。监测反应的进度直到培养肉汤中香草醛的浓度达到0.96gL-^-1。在整个过程中，向培养基中加入香草酸以保持1.5gL-^-1的浓度。此时，一个外部香草醛萃取系统如下开始工作：经过滤装置从发酵罐内将培养基连续抽出从而生物量被保留在发酵罐内；将离开发酵罐的培养基加热至60℃，并通过加入10M氢氧化钠溶液将其调节至pH6.5；将该培养基加入到装有5升向日葵油的萃取容器中；通过采用顶部搅拌器剧烈搅拌水相(保持在1升体积)和油相，从而实现香草醛从培养基到油相的连续选择性萃取；香草酸不被萃取进油相，全部保留在水相中；将水相连续抽回发酵罐中。在整个过程中，发酵罐内的体积和萃取容器内的体积保持相对恒定。发酵罐内香草酸的浓度被保持在大约1.5gL-^-1，发酵罐内香草醛的浓度被保持在最大值1.5gL-^-1。采用该连续外部萃取设备，在约20小时的操作期间内，5升Micromucor isabellinus的培养物产生了18.9g香草醛。可以通过将香草醛萃取进水、或醇如甲醇或乙醇、或者萃取进醇/水混合物中，将其从向日葵油中回收。适当混合的溶剂为80％乙醇和20％水。在萃取溶剂蒸发之后，可通过传统技术如再结晶、升华等进一步提纯香草醛。

        实施例8：采用ISPR通过烟曲霉制备香草醛

将含有2gL^-1香草酸的基本培养基(成分如实施例4所述)装进装有不锈钢载体的无菌玻璃柱(60mL容积)，并用烟曲霉(Zyl 747)的孢子进行接种。将空气抽进柱的底部以使体系充满气体并进行有效混合。使玻璃柱在室温(22℃)下保持70小时。之后发生真菌的大量生长，并全部附着在不锈钢载体材料上。溶液中香草醛的浓度经测定为0.65gL^-1。如上所述保持换气，将柱内物质连续从柱内抽出进入独立的萃取容器，该容器装有500mL向日葵油和200mL与前述相同的基本培养基。此外，将1g香草酸加入到水相中。将萃取容器内物质彻底混合，将水相连续抽回流经柱。通过给柱装上二氧化硅管道护套并使水在34℃的温度抽吸经过，实现对柱内物质在约30℃的培养。以8天的时间间隔分析(hplc，如上所述)香草醛在萃取容器内的油和水相中的浓度。以从体系得到的总的香草醛收率表示的结果如下：24小时，113mg；48小时，140mg；72小时，269mg；96小时，385mg；168小时，597mg；192小时，566mg。

实施例9证明了实施例8体系的长期连续应用的适应性。

            实施例9：采用ISPR连续制备香草醛

将烟曲霉(Zyl 747)的孢子悬浮液用于接种在发酵罐(5L工作容积)内的3升基本培养基(除了加入3.3gL^-1香草酸而不是1.5gL^-1之外，成分如实施例9所述)。将发酵罐内物质在30℃进行搅拌，不需控制pH，溶解氧浓度整个过程中保持在饱和度的60％。如上所述通过hplc进行分析。经过24小时培养之后，检测到溶液中有0.15gL^-1香草醛。此时，向发酵罐内加入2升含有0.5gL^-1香草酸的向日葵油，并如前所述连续进行培养。在28天的期间内，以频繁的间隔除去发酵罐内的油相，并代之以含0.5gL-^-1香草酸的新鲜油。香草醛的生成以从体系得到的总的香草醛产量表示，如下所述：

时间(小时)    香草醛产量(g)

    48           0.64

    72           1.43

    96           2.71

    168          4.60

    192          5.12

    216          5.58

    240          6.20

    264          6.87

    336          9.16

    360          10.32

    384          11.50

    408          12.25

    432          12.80

    504          13.80

    575          14.50

    665          16.26

665小时之后终止实验；但是真菌仍然活跃地制造香草醛。

          G)将恶臭假单胞菌用于香草酸的制备

           实施例10：阿魏酸到香草酸的转化

将恶臭假单胞菌(Zyl 503)的营养琼脂板培养物作为接种物来源用于在250ml锥形摇瓶内的50ml生长培养基(5g阿魏酸；20g葡萄糖；2g KH₂PO₄；5g(NH₄)₂SO₄；0.2g NaCl；0.22g MgSO₄；0.015g CaCl₂；1ml痕量元素溶液；10ml维生素溶液，用0.2M、pH7.0的磷酸盐缓冲剂使体积达到1升)。将该培养物在30℃进行培养，以250rpm摇动，并如上所述用hplc进行分析。随着反应进行，如下加入添加量的阿魏酸：24.5小时0.25g；48小时0.125g；72小时0.05g；90小时0.25g；96小时0.5g。反应物和产物浓度经测定如下：20.5小时，阿魏酸2.71gl^-1，香草酸2.08gl^-1；24.5小时，阿魏酸1.51gl^-1，香草酸3.01gl^-1；48小时，阿魏酸2.4gl^-1，香草酸7.0gL^-1；72小时，阿魏酸2.08gl^-1，香草酸9.5gL^-1；96小时，阿魏酸4.47gL^-1，香草酸12.11gL^-1；160小时，阿魏酸4.45gL^-1，香草酸19.05gL^-1。

           实施例11：从玉米纤维制备香草酸

向250ml锥形瓶内的30g玉米纤维中加入100ml的8％w/v柠檬酸溶液。将瓶内物质加热至85℃，并有效地混合16小时。之后，通过滴加氢氧化钠溶液(10M)中和搅拌过的玉米纤维悬浮液。将水解酶制剂(500μl，Biofeed Plus，Novo Nordisk)加入到悬浮液中，将其在45℃进行培养，并连续混合24小时。如上所述通过hplc进行分析。24小时之后，在溶液中检测到3.3gl^-1阿魏酸。

将生长在营养琼脂上的恶臭假单胞菌(Zyl 503)的培养物用于接种250ml摇瓶，该摇瓶内装有50ml基本盐培养基(4g阿魏酸；20g葡萄糖；5g(NH₄)₂SO₄；0.2g NaCl；2g K₂HPO₄；0.22g MgSO₄；0.015g CaCl₂；1ml痕量元素溶液；10ml维生素溶液；用0.2M、pH7.0的磷酸盐缓冲剂使体积达到1升)。将瓶内物质在30℃培养24小时，以250rpm摇动。这之后，通过离心分离(4000×g，20分钟)收割培养物，用0.2M、pH7.0的磷酸盐缓冲剂洗涤一次以除去残留的不是来自玉米的阿魏酸或香草酸，最后使其再悬浮在2ml的相同缓冲剂(×25浓度)中。将该浓缩的细胞悬浮液加入装在100ml锥形瓶内的上述水解玉米悬浮液的20ml等分部分中。在伴以250rpm摇动的在30℃的培养之前，溶液中的阿魏酸浓度经测定为2.8gl^-1。在整个培养期间，所存在的香草酸的浓度经测定如下：4小时，0.11gl^-1；24.5小时，1.44gL^-1；29.5小时，1.98gL^-1；31小时，2.0gL^-1。

              H)其它反应物的转化

如实施例1所示的阿魏酸到香草酸的转化，是肉桂酸(AR-AR-CH＝CH-CO₂H)到苯甲酸(AR-CO₂H)的转化。这可被应用于其它肉桂酸，如香豆酸(4-羟基肉桂酸)和咖啡酸(3，4-二羟基肉桂酸)。

        实施例12：得自香豆酸的4-羟基苯甲酸

在装有50mL基本培养基(如实施例1所定义)的250mL摇瓶内，使红酵母(Zyl 702)的接种期培养物在30℃生长24小时，并伴以200rpm的摇动。该培养物被用于接种(2％)一个250mL的摇瓶，该摇瓶装有50mL相同的基本培养基，并且加入200mg香豆酸以得到4gL-^-1的最终浓度。培养条件如前所述，并如上所述通过hplc进行分析。反应物和产物浓度经测定如下：18小时，香豆酸1.75gL^-1，4-羟基苯甲酸1.28gL^-1，3，4-二羟基苯甲酸0.27g L-^-1；22小时，香豆酸0.36gL^-1，4-羟基苯甲酸1.92gL-^-1，3，4-二羟基苯甲酸0.44gL-^-1；23小时，香豆酸0.12gL^-1，4-羟基苯甲酸2.10gL-^-1，3，4-二羟基苯甲酸0.47gL-^-1

如实施例4所示的香草酸到香草醛的转化，是羟基苯甲酸到羟基苯甲醛的转化。这可被应用于其它苯甲酸，特别是羟基苯甲酸，如4-羟基苯甲酸(如实施例12所制备的)或3，4-二羟基苯甲酸(原儿茶酸)。

               实施例13：4-羟基苯甲酸到

           4-羟基苯甲醛和4-羟基苯甲醇的转化

将生长在酵母麦芽琼脂上的卵孢接酶(Zyl 851)的培养物用于接种250mL的锥形瓶，该瓶装有42mL包含100mg 4-羟基苯甲酸的培养基。将培养肉汤在30℃进行培养，并伴以200rpm的摇动。如上所述通过hplc测定反应进度。反应物和产物浓度经测定如下：24小时，4-羟基苯甲酸2.26gL^-1，4-羟基苯甲醛痕量，4-羟基苯甲醇痕量；42小时，4-羟基苯甲酸1.06gL^-1，4-羟基苯甲醛0.53gL^-1，4-羟基苯甲醇0.55gL^-1；66小时，4-羟基苯甲酸0.1gL^-1，4-羟基苯甲醛痕量，4-羟基苯甲醇2.6gL^-1。

      实施例14：4-羟基苯甲酸到4-羟基苯甲醛的转化

将生长在酵母麦芽琼脂上的康宁木霉(Zyl 751)的培养物用于接种在250mL锥形瓶中的50mL基本培养基(如实施例4a所定义的)。接种之前，向培养基中加入150mg(3gL^-1)4-羟基苯甲酸，随后将其在30℃进行培养，并伴以200rpm的摇动。如上所述通过hplc和tlc进行分析。经过大约30小时的培养之后，经hplc分析检测到在溶液中有0.3gL^-1 4-羟基苯甲醛。该观测结果进一步得到tlc分析的支持，tlc分析显示在R_f0.59与4-羟基苯甲醛的参考样品一致的物质的存在。观测到的产物还产生与二硝基苯肼溶液的阳性显色反应。

  实施例15：3，4-二羟基苯甲酸到3，4-二羟基苯甲醛的转化

将生长在酵母麦芽琼脂上的卵孢接酶(Zyl 851)的培养物用于接种250mL的锥形瓶，该瓶装有50mL包含100mg香草酸的培养基。将培养肉汤在30℃进行培养，并伴以200rpm的摇动。如上所述通过hplc测定反应进度。经过42小时培养之后，大约50％的香草酸被转化为了香草醇。此时，向培养物中加入100mg 3，4-二羟基苯甲酸(如来自实施例12，或者提取自洋葱皮)并继续培养。再经过6小时培养之后，检测到相当于3，4-二羟基苯甲醛的新产物浓度为约0.20gL^-1。24小时之后，该产物浓度些微增至约0.025gL^-1。48小时之后，3，4-二羟基苯甲醛从溶液中消失。

          实施例16：苯甲酸到苯甲醛的转化

在1升的烧瓶内，加入50mg苯甲酸之后，用10μL铂环量的康宁木霉(Zyl 751)的孢子接种200mL培养基(50g葡萄糖；5g(NH₄)₂SO₄)₄；2g K₂HPO₄；0.2g NaCl；0.22g MgSO₄；0.015g CaCl₂；1ml痕量元素溶液，1mL；10ml维生素溶液，用去离子水使体积达到1升)。将其在30℃进行培养，并伴以200rpm的摇动。通过hplc进行分析，在25小时培养时，在培养肉汤中首次检测到苯甲醛。在接下来的5个小时内，苯甲醛浓度升至0.165g/L；此时，溶液中也存在浓度为0.1g的苯甲醇。

实施例3中香草醇到醛的转化也可被应用于其它苯甲醇，如实施例14所制备的4-羟基苯甲醇。

     实施例17：4-羟基苯甲醇到4-羟基苯甲醛的转化

遵循实施例17所述的操作法，但是在生物体的24小时生长期，将4-羟基苯甲醇加入到烧瓶中以得到1mg/mL的最终浓度。再经过28小时之后，由hplc对反应进度的监测显示反应物的量降至初始的10％，在该阶段4-羟基苯甲醛达到0.37mg/mL的浓度。

注意到通过ISPR的应用在实施例14-17中醛的收率无疑得到了提高。

        I)对由羧酸产生醛的生物体的选择性筛选

i)琼脂板的制备

最少盐琼脂(minimal salts agar)：20g葡萄糖；5g(NH₄)₂SO₄；2gK₂HPO₄；0.2g NaCl；0.22g MgSO₄；0.015g CaCl₂；10ml痕量元素溶液；1ml维生素溶液；20g琼脂和2g香草酸或阿魏酸，用去离子水(真菌分离)或0.2M、pH7.0的磷酸钠缓冲剂(细菌分离)使体积达到1升。

将滤纸(Whatman 1号)裁成90mm直径的圆片，并用高压灭菌法灭菌。在注入上述最少盐琼脂之前，先将一枚圆片放进90mm无菌陪替氏培养皿中。

ii)土壤样品的制备

将大约100mg土壤加到2ml去离子水中。将所得悬浮液彻底混合(涡动搅拌器)；将其在室温(22℃)下保持1小时，随后进一步混合以使悬浮物质分散。使肉眼可见的固体沉淀约10分钟，采用平板涂布技术将上清液(100μl)涂到制备好的最少盐琼脂板上。将板在28℃进行培养直至观测到菌落发育(约5天)。

iii)产生醛的菌株的选择可见性

为了使香草酸或阿魏酸生物转化产物可见，遵循下述步骤：

通过将刮刀插入滤纸圆片下方，将琼脂从各陪替氏培养皿底部抬起，随后注入1ml二硝基苯肼(DNP)溶液(在2M HCl中的0.4％DNP)。将琼脂放回培养皿中的原位，使DNP溶液渗透整个琼脂。由于存在与浅黄色背景相对的围绕着菌落的橙色/红色区域，从而使产生醛产物的菌落可见。由于存在与浅黄色背景相对的围绕着菌落的暗黄色区域，从而使产生醇产物的菌落可见。

Claims (63)

1.一种将包含一种或多种式(A)的物质的第一组合物转化为包含一种或多种式(B)的物质的第二组合物的方法：其中X、Y、X’和Y’独立地选自H、OH和OMe；Z为CO₂H、CO₂carb(其中carb代表碳水化合物残基)、CHO或CH₂OH，Q为CHO、CO₂H或CH₂OH，所述方法包括在一定的条件下用一种或多种微生物处理所述第一组合物，使(A)转化为(B)；所述微生物选自(a)恶臭假单胞菌；(b)能将阿魏酸转化为香草酸的红酵母属菌种和其它酵母；(c)同时具有阿魏酸酯酶活性和侧链内裂解活性从而可将阿魏酸苷转化为香草醛和/或香草酸的微生物；以及(d)可将香草酸转化为香草醛的Micromucorisabellinus或烟曲霉菌株。

2.权利要求1的方法，其中Y和Y’为OH。

3.权利要求1或权利要求2的方法，其中Z为CO₂H或CO₂carb。

4.权利要求1、2或3的方法，其中所述第一组合物包含阿魏酸或者一种或多种阿魏酸酯，所述第二组合物包含香草酸和/或香草醇和/或香草醛。

5.权利要求4的方法，其中所述第一组合物包含阿魏酸，所述第二组合物包含香草酸，所述微生物选自(a)和(b)。

6.权利要求5的方法，其中所述微生物为红酵母。

7.权利要求5的方法，其中所述微生物为恶臭假单胞菌NCIMB40988或红酵母IMI379896。

8.权利要求4的方法，其中所述第一组合物包含阿魏酸酯，所述微生物选自(c)。

9.权利要求8的方法，其中所述微生物选自青霉和曲霉属的菌种。

10.权利要求9的方法，其中所述微生物选自产黄青霉、黑曲霉和黄曲霉。

11.权利要求10的方法，其中所述微生物选自产黄青霉IMI379901、黄曲霉IMI379895和黑曲霉IMI379904。

12.权利要求8-11中任一项的方法，其中以植物材料的形式提供所述阿魏酸酯，所述微生物直接作用于所述植物材料。

13.前述权利要求中任一项的方法，其中所述对第一组合物的处理产生包含香草酸的第二组合物，并用一种或多种其它微生物处理所述第二组合物以使所述香草酸转化为香草醛。

14.权利要求13的方法，其中用第二微生物处理所述第二组合物从而将所述香草酸转化为香草醇；然后用第三微生物进行处理从而将所述香草醇转化为香草醛。

15.权利要求14的方法，其中所述第二微生物为卵孢接霉。

16.权利要求14的方法，其中所述第二微生物为卵孢接霉IMI379899。

17.权利要求14、15或16的方法，其中所述第三微生物为泡囊短波单胞菌。

18.权利要求17的方法，其中所述第三微生物为泡囊短波单胞菌NCIMB40987。

19.权利要求11的方法，其中用烟曲霉或Micromucor isabellinus处理所述第二组合物从而将香草酸转化为香草醛。

20.权利要求17的方法，其中用烟曲霉IMI379902或M.isabellinus IMI379893处理所述第二组合物。

21.权利要求4的方法，其中在一定的条件下用假单胞菌的菌株处理所述第一组合物，使香草醛积聚。

22.权利要求21的方法，其中所述菌株为恶臭假单胞菌。

23.权利要求21的方法，其中所述菌株为恶臭假单胞菌IMI382568。

24.权利要求21、22或23的方法，其中所述菌株可以从阿魏酸制造香草酸和香草醛，其比率取决于pH；其中选择并保持相对有利于香草醛积聚的pH。

25.前述权利要求中任一项的方法，其中所述第二组合物包含至少一种易于进一步转化的所需成分；其中所述第一组合物的所述转化在水相中进行，且使该水相与萃取所述至少一种所需成分的有机相接触。

26.前述权利要求中任一项的方法，其中所述第一组合物包含阿魏酸和至少一种式(A)的其它化合物，其中Z既不是CO₂H，也不是CO₂carb，并且其中所述至少一种其它化合物也经受转化。

27.由权利要求26的方法得到的包括香草醛的混合物。

28.权利要求1-26中任一项的方法，它包括从植物材料释放所述第一组合物的预备步骤。

29.权利要求1-26中任一项的方法，它包括从植物材料获得包含阿魏酸的上述第一组合物的预备步骤，采用的是包括下面各步的方法：

(a)处理植物材料以产生包含阿魏酸酯的溶液；和

(b)在一定的条件下，用具有阿魏酸酯酶活性的酶组合物处理上述溶液，使阿魏酸酯转化为阿魏酸。

30.权利要求28或29的方法，其中所述植物材料选自玉米、小麦、甜菜和米。

31.权利要求30的方法，其中所述植物材料包括纤维、糠或稻草。

32.权利要求29、30或31的方法，其中在步骤(a)中，用包含柠檬酸或碳酸氢钠的溶液处理植物材料。

33.权利要求32的方法，其中在50-250℃范围内的温度下处理所述植物材料。

34.权利要求29的方法，其中所述植物材料包含甜菜纤维，步骤(a)包括在水中加热。

35.权利要求29-34中任一项的方法，其中步骤(b)采用衍生自曲霉或Humicola insolens菌种的酶。

36.权利要求35的方法，其中酶衍生自Humicola insolens，并且基本上在6-7的pH范围内进行处理。

37.获得用于权利要求1-26或28-36中任一项的方法的微生物菌株的方法，它包括通过适于检测醛的试剂筛选多种菌落。

38.权利要求37的方法，其中通过突变获得多种菌落。

39.权利要求1-26或28-36中任一项的方法，它包括通过权利要求37或38的方法获得用于所述方法的微生物的预备步骤。

40.可将阿魏酸转化为香草酸的恶臭假单胞菌NCIMB40988及其突变体。

41.可将阿魏酸转化为香草酸的红酵母IMI379896及其突变体。

42.可将阿魏酸酯转化为香草酸的产黄青霉IMI379900及其突变体。

43.可将阿魏酸酯转化为香草酸的黄曲霉IMI379895及其突变体。

44.可将阿魏酸酯转化为香草酸的黑曲霉IMI379904及其突变体。

45.可将香草酸转化为香草醇和香草醛的卵孢接霉IMI379899及其突变体。

46.可将阿魏酸转化为香草醛的恶臭假单胞菌IMI382568及其突变体。

47.可将香草酸转化为香草醛的烟曲霉IMI379902及其突变体。

48.可将香草酸转化为香草醛的Micromucor isabellinus IMI379893及其突变体。

49.可将香草醇转化为香草醛的泡囊短波单胞菌NCIMB40987及其突变体。

50.可将4-羟基苯甲酸转化为4-羟基苯甲醛的康宁木霉IMI379903及其突变体。

51.在权利要求40-50的任一项中所定义的生物体的萃取物或酶，它(们)具有相对于生物体的特定活性。

52.采用红酵母或恶臭假单胞菌或者来自它们的萃取物或酶所进行的香豆酸到对羟基苯甲酸的微生物转化。

53.采用卵孢接霉或来自它的萃取物或酶所进行的对羟基苯甲酸到对羟基苯甲醇的微生物转化。

54.采用康宁木霉或卵孢接霉或者来自它们的萃取物或酶所进行的对羟基苯甲酸到对羟基苯甲醛的微生物转化。

55.采用泡囊短波单胞菌或来自它的萃取物或酶所进行的对羟基苯甲醇到对羟基苯甲醛的微生物转化。

56.采用卵孢接霉或来自它的萃取物或酶所进行的3，4-二羟基苯甲酸到3，4-二羟基苯甲醛的微生物转化。

57.采用康宁木霉或来自它的萃取物或酶所进行的苯甲酸到苯甲醛的微生物转化。

58.采用恶臭假单胞菌或红酵母或者来自它们的萃取物或酶所进行的阿魏酸到香草酸的微生物转化。

59.采用产黄青霉、黑曲霉或黄曲霉或者来自它们的萃取物或酶所进行的阿魏酸酯到香草酸的微生物转化。

60.采用烟曲霉或Micromucor isabellinus或者来自它们的萃取物或酶所进行的香草酸到香草醛的微生物转化。

61.采用恶臭假单胞菌或来自它的萃取物或酶所进行的阿魏酸到香草醛的微生物转化。

62.采用卵孢接霉或来自它的萃取物或酶所进行的香草酸到香草醇的微生物转化。

63.采用泡囊短波胞菌或自它的萃取物或酶所进行的香草醇到香草醛的微生物转化。