CN1771366A - 利用细菌聚生体生物漂白牛皮纸浆的方法 - Google Patents

利用细菌聚生体生物漂白牛皮纸浆的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及环境友好的、安全和有效的四阶段生物漂白牛皮纸浆的方法，该方法使用保藏号为MTCC5096、MTCC5094、MTCC5095和MTCC5098的细菌菌株，使用包含保藏号为MTCC5094、MTCC5095和MTCC5098的木质素分解性细菌分离株的协同性混合物的微生物聚生体，本发明涉及保藏号为MTCC5096、MTCC5094、MTCC5095和MTCC5098的细菌菌株，以及制备保藏号为MTCC5096的细菌分离株接种物的方法，进一步涉及制备包含保藏号为MTCC5094、MTCC5095和MTCC5098的木质素分解性细菌分离株的聚生体的方法，以及用于生物漂白的纸浆悬浮液的制备方法。

Description

利用细菌聚生体生物漂白牛皮纸浆的方法
发明领域
本发明涉及环境友好的、安全和有效的四阶段生物漂白牛皮纸浆的方法，该方法使用保藏号为MTCC5096、MTCC5094、MTCC5095和MTCC5098的细菌菌株，使用包含保藏号为MTCC5094、MTCC5095和MTCC5098的木质素分解性细菌分离株的协同性混合物的微生物聚生体，本发明涉及保藏号为MTCC5096、MTCC5094、MTCC5095和MTCC5098的细菌菌株，以及制备保藏号为MTCC5096的细菌分离株接种物的方法，进一步涉及制备包含保藏号为MTCC5094、MTCC5095和MTCC5098的木质素分解性细菌分离株的聚生体的方法，以及用于生物漂白的纸浆悬浮液的制备方法。
背景和现有技术参考
从化学纸浆中去除木质素以生产鲜亮甚至是完全白色的成品纸浆的过程称为“漂白”。因为制浆后残余木质素滞留将赋予纸不合需要的棕黄色所以因美学原因和提高纸品质而需漂白。目前牛皮纸浆的漂白使用大量基于氯的化学品。这些化学品的使用产生了含氯有机物，具有高度毒性的后者导致多种健康危害。因此，替代性和具有成本效率的方法即使用微生物和酶提供了一种非常简单和经济的途径以减少氯和其他漂白化学品的使用。多种生物的概览
真菌
木质素是生物圈中最丰富的芳香族聚合物。在所有维管植物细胞壁中均发现与纤维素和半纤维素联合的木质素。因木质素单元间键不能水解，故木质素难于化学性或物理性降解。在植物细胞壁中木质素环绕纤维素形成基质，后者本身可抗降解。木质素生物降解是使用中木材天然解构的主要原因，同时在植物病理机制中具有重要地位。另外，木质素降解生物和它们的酶的潜在应用变得具有吸引力，因为这些应用可为纸浆和造纸工业提供环境友好的技术。至今只有少部分生物能降解复杂的木质素聚合物，其中白腐真菌(white rot fungi)是它们的最佳代表。大部分有关木质素生物降解的研究仅集中于某些真菌如黄孢原毛平革菌(Phanerochaetechrysosporium)、绿孢链霉菌(Streptomyces viridosporus)、刺芹侧耳(Pleurotus eryngii)、毛栓菌(Trametes trogii)、Fusarium proliferatum(Ragaldo等，1997)等(1)。
引起木材白色腐烂的白腐担子菌纲真菌是自然界中最有效的木质素降解者(Kirk和Farrell，1987；Eriksson等，1990)，并且它们可能也是自然界中木质素化组织中碳循环的主要中介。未见其它纯培养微生物如此有效地矿化木质素化组织(Krik和Cullen，1998)。它们是一组分类学异质的高等真菌，以其利用一组细胞外木质素分解酶使木质素解聚和矿质化的独特能力为特征。在过去三十年中，对白腐真菌降解木质素在涉及生物制浆、生物漂白、制浆工厂废水处理和土壤除污的生物技术应用方面进行了深入研究(Akhtar等，1992，1998；Lamar等，1992；Messner和Srebotnik，1994)。
1992年，Frederick Archibald(2)证明真菌杂色栓菌(Trametesversicolor)能在2至5天期间使未漂白的工业牛皮纸浆基本上脱色和脱木质素。
一年以后，同组研究人员表明生物漂白性的培养物上清含有硬木牛皮纸浆(HWKP)生物漂白和脱木质素所需的全部成分，但该上清需要经常接触真菌以维持上述活性。因此，不稳定的小分子真菌代谢物可能是由真菌更新或替代的生物漂白系统极其重要的成分。由含HWKP的培养物得到的几乎所有CO2均源自加入的葡萄糖，这表明生物漂白过程中HWKP不是重要的能量来源。培养物中HWKP的存在显著地增加了培养物中许多酸性代谢物包括草酸、乙醛酸和乙醇酸的生产。
已发现多用途的子囊菌-曲霉(Aspergilli)也能高效转化广谱的木质素相关芳香族化合物。研究显示它们可过量产生高水平的半纤维素分解酶(4)。
Maria Teresa等证实烟管菌BOS55株(Bjerkandera sp.StrainBOS55)是一种能漂白经EDTA提取过，经桉树氧脱木质素的牛皮纸浆(UKP)且无需锰的白腐真菌。进一步在无锰条件下与不加酸的结果比较，按1-5mM添加简单生理性有机酸(如乙醇酸、乙醛酸和草酸等)可刺激二至三倍地提高纸浆亮度和脱木质素。刺激作用归功于MnP和LiP产量的增加以及藜芦基醇和草酸生理浓度的增高。这些因子可大幅提高过氧化物阴离子自由基的产生，而后者可导致更广泛的生物漂白(5)。
细菌
细菌在木质素生物降解中的作用仍处于推测之中。某些研究者已证实细菌混合物(Sundman等，1968)或纯培养物(Sorensen，1962)可以木质素为碳源生长。Kawakami(1976)以及Odier和Monties(1977)声称假单孢菌(Psudomonas spp.)可降解植物木质素。Odier和Monties也指出数种其它细菌菌株在七天时间内可利用含葡萄糖的无机物培养基中供给的半数以上木质素。
检测了自含有高载量废弃木质素的湖水中分离的几种诺卡氏菌(Nocardia spp.)和假单孢菌(Psudomonas spp.)及一些未鉴定细菌自14C专门标记的松柏醇(DHP)或玉米秆木质素脱氢聚合物中释放14CO2的能力。然而，其中仅有一些细菌可从标记的木质素中释放显著量的14CO2。受检测的诺卡氏菌(Nocardia spp.)比假单孢菌及一些未鉴定细菌更具活性(6)。
放线菌是在木质纤维素受到降解的土壤和堆肥中发现的丝状细菌。一些报告提供了链霉菌属的某些种能降解木质素的证据。其它降解木质素的放线菌包括嗜温热单胞菌(Thermomonsopora mesophil)、马杜拉放线菌属(Actinomadura)、小单胞菌属(Micromonospora)，其中链霉菌属(Streptomyces)表现出最高的木质素降解能力。在多数研究中，木质素降解酶在含有木质纤维素的培养物中以较高水平产生，提示某种诱导机制在发挥作用。
Ajit Verma等(1994)在研究白蚁和其肠道微生物的共生关系时得出白蚁粪便和白蚁肠道细菌在聚合物解聚过程中扮演重要角色的结论。肠道细菌具备更为有效的降解纤维素和半纤维素物质的能力。已经从白蚁肠道中获得数种可水解纤维素和半纤维素的细菌分离株的纯培养物。其中一些为节杆菌属(Arthrobacter sp.)、蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)、梭菌属(Clostridium sp.)、微球菌属(Micrococcus sp.)、链霉菌属(Streptomycessp.)、粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)。从白蚁肠道中只分离到少数木聚糖分解细菌(藤黄微球菌(Micrococcus luteuns)、铜绿假单胞菌(Psuedomonas aeruginosa))。因为大部分的白蚁肠道为厌氧而木质素降解的厌氧性机制未知(7)，故白蚁木质素降解问题是神秘的。
Berrocal等(1997)展示固态发酵生长的链霉菌无细胞滤液能够溶解多达20％的[14C]木质素。发现两种酶即胞外过氧化物酶和酚氧化酶(漆酶)的活性与木质素的溶解速率和矿化速率相关(8)。
腐烂木材中存在的通常与真菌联合的细菌已成为众多研究报告的主题。然而。仍不清楚它们在木材成份降解中的确切作用。尽管获得营养性氮可抑制黄孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)将合成的14C木质素代谢为CO2，但是对于细胞栗褐链霉菌(Streptomyces Badius)降解木质素而言高水平有机氮是最佳的(9)。
酶是代谢的催化性基石同时酶不仅是生物学界而且也是世界范围内工艺设计人员/工程师、化学工程师和其他科学领域内研究工作者深入研究的焦点。自远古以来，酶在众多制造方法如产生酒、乳酪、面包等的方法中扮演重要角色。二十世纪后半叶见证了我们关于微生物、其代谢产物和酶在众多基础研究领域内应用和其潜在工业用途的知识的空前扩张。然而只是在过去二十年中，微生物酶才得以在纸浆和造纸工业中商业应用。
在造纸工业中酶的最常见应用是促进漂白。在1988年至1993年间，至少提交了15项涉及酶处理以促进漂白牛皮纸浆的专利或专利公开。
牛皮纸制浆又称为硫酸盐或化学制浆，其使用硫磺从树木中获得纤维。牛皮纸制浆对树的利用率小于50％。树的其余部分成为淤泥，后者得以焚毁，摊铺在地表或填埋土地。牛皮纸制浆的一个优点是工厂中对化学品可回收再利用。另一个优点是牛皮纸纤维异常坚固(“Kraft”德语意为“坚固”)。牛皮纸浆通常为暗色，常以氯化合物漂白。牛皮纸工艺约占美国总纸浆产量的85％，是世界纸制造业的最大部分。牛皮纸制浆去除木质素，溶解和降解半纤维素同时不破坏纤维素。不幸的是在制浆过程中产生的降解产物卡在基质中使牛皮纸浆呈褐色。蒸煮消耗了制浆化学品，残余木聚糖(与共价连接的降解产物一同)沉积在纤维素纤维表面。据认为发色团由残余木质素和碳水化合物降解产物组成。因为它们共价连接在纸浆基质的碳水化合物分子上而难于提取。制造者使用自然氯(Cl2)和二氧化氯(ClO2)漂白发色团然后提取纸浆制造白纸。Cl2的成本为每公吨纸浆12至15美元，但因为这导致含氯的芳香族化合物的产生，故使用了替代性漂白剂如O2、ClO2或H2O2。这些漂白剂比Cl2贵数倍。漂白大幅提升了产品的价值，因此额外的支出是合理的。
氯漂白可导致环境问题。含氯有机化合物是使用这些化学品的副产物，其中某些有毒、致突变、持久的和生物富集性并在生物系统中导致多种有害干扰(Onysko，1993)。可用的选择为氧法脱木质素、延长的蒸煮和用二氧化氯替代氯，过氧化氢和臭氧。但上述方法大多涉及高额工艺改造资本投入。因此，备选的和有成本效率的方法即应用酶提供了一种非常简单和经济的途径以减少氯和其他漂白化学品的使用。
迄今所有基础性和应用性研究工作仅仅集中于真菌。就粗纸浆的生物漂白而言，由于真菌菌丝引起的结构性障碍而使应用真菌不可行。利用从真菌纯化的酶漂白纸浆不经济因为酶纯化步骤使工艺昂贵而冗长。因此，需要开发经济上可行且有效的生物漂白纸浆的方法
本发明目的
本发明主要目的是提供利用经四阶段过程使用细菌分离株漂白硬木牛皮纸浆的方法。
本发明的另一个目的是提供文中所述的细菌聚生体，用于安全、经济和有效地漂白硬木牛皮纸浆。
本发明的另一个目的是提供本发明中应用的细菌菌株，用于生物漂白牛皮纸浆。
本发明的另一个目的是研发使用本申请的菌株制备接种物的方法。
发明概述
本发明涉及环境友好的、安全和有效的四阶段生物漂白牛皮纸浆的方法，该方法使用保藏号为MTCC5096、MTCC5094、MTCC5095和MTCC5098的细菌菌株，使用包含保藏号为MTCC5094、MTCC5095和MTCC5098的木质素分解性细菌分离株的协同性混合物的微生物聚生体，本发明涉及保藏号为MTCC5096、MTCC5094、MTCC5095和MTCC5098的细菌菌株，以及制备保藏号为MTCC5096的细菌分离株接种物的方法，进一步涉及制备包含保藏号为MTCC5094、MTCC5095和MTCC5098的木质素分解性细菌分离株的聚生体的方法，以及用于生物漂白的纸浆悬浮液的制备方法。
发明详述
本发明涉及环境友好的、安全和有效的四阶段生物漂白牛皮纸浆的方法，该方法使用保藏号为MTCC5096、MTCC5094、MTCC5095和MTCC5098的细菌菌株，使用包含保藏号为MTCC5094、MTCC5095和MTCC5098的木质素分解性细菌分离株的协同性混合物的微生物聚生体，本发明涉及保藏号为MTCC5096、MTCC5094、MTCC5095和MTCC5098的细菌菌株，以及制备保藏号为MTCC5096的细菌分离株接种物的方法，进一步涉及制备包含保藏号为MTCC5094、MTCC5095和MTCC5098的木质素分解性细菌分离株的聚生体的方法，以及用于生物漂白的纸浆悬浮液的制备方法。
在本发明的另一个实施方案中，其中使用保藏号为MTCC5096、MTCC5094、MTCC5095和MTCC5098的细菌菌株的环境友好、安全和有效的四阶段生物漂白牛皮纸浆的方法，所述的方法包括以下步骤：
●以具有木聚糖酶活性的细菌菌株MTCC5096的接种物接种纸浆悬液作为第一阶段，
●在约26-32℃，约100-120转/分下培养已接种的纸浆约15-20小时，
●将氢氧化钠和过氧化氢加入步骤(c)的已接种纸浆进行碱提取作为第二阶段，
●在约65-70℃温育大约1.5-2.5小时，
●过滤纸浆并以无菌蒸馏水洗涤，
●在新鲜的基本盐培养基中悬浮洗过的纸浆，
●以包含保藏号为MTCC5094、MTCC5095和MTCC5098的木质素分解性细菌菌株的聚生体接种纸浆悬浮液作为第三阶段，
●在pH约5-9约26-32℃约100-120转/分下温育步骤(g)的已接种的纸浆约15-20小时，
●重复步骤(b)至(e)以碱提取为第四阶段而获得亮度％约17％的纸浆。
在本发明的另一个实施方案中，其中生物漂白的第三阶段期间温度约为30℃。
在本发明的另一个实施方案中，其中生物漂白的第三阶段期间pH约为8℃。
在本发明的另一个实施方案中，其中加入20-30mg氢氧化钠和200-250μl过氧化氢。
在本发明的另一个实施方案中，其中基本盐培养基(MSM)具有约0.1至1.0％的葡萄糖。
在本发明的另一个实施方案中，其中聚生体诸菌株的比例为1∶1∶1。
在本发明的另一个实施方案中，其中微生物聚生体包含保藏号为MTCC5094、MTCC5095和MTCC5098的木质素分解性细菌分离株的协同性混合物。
在本发明的另一个实施方案中，其中保藏号为MTCC5096的细菌菌株用于生物漂白纸浆。
在本发明的另一个实施方案中，其中菌株显示约8％的生物漂白力。
在本发明的另一个实施方案中，其中细菌菌株保藏号为MTCC5094。
在本发明的另一个实施方案中，其中细菌菌株保藏号为MTCC5095。
在本发明的另一个实施方案中，其中细菌菌株保藏号为MTCC5098。
又在本发明的另一个实施方案中，其中所述制备保藏号为MTCC5096的细菌分离株接种物的方法包括以下步骤：
●分离细菌菌株，
●在含有土壤提取物和营养培养基的培养基上培养细菌分离株，
●接种细菌分离株，
●培养并在培养物达到所需O.D.(1.00-2.00)后离心获得的培养物以收获沉淀，
●在pH约6.8约0.03-0.05M的磷酸盐缓冲液中悬浮沉淀，及
●获得接种物。
在本发明的另一个实施方案中，其中分离株在含有等比例土壤提取物和营养培养基的培养基上培养。
在本发明的另一个实施方案中，其中将细菌分离株接种于含葡萄糖的基本盐培养基内而后在约28-34℃和100-120转/分下搅拌培养。
在本发明的另一个实施方案中，其中在1-4℃下以合适转速优选地为8000-12000转/分离心获得的生长物大约20-30分钟。
在本发明的另一个实施方案中，其中在合适的缓冲液如磷酸盐缓冲液或Tris缓冲液中悬浮沉淀。
在本发明的另一个实施方案中，其中涉及如权利要求5所述的包含保藏号为MTCC5094、MTCC5095和MTCC5098的木质素分解性细菌分离株的聚生体的制备方法，所述的方法包括步骤：
●分离细菌菌株，
●分别接种各细菌分离株，在定义的条件下培养和生长并按照光密度值等比例混合它们，及
●离心获得的悬浮液以得到沉淀，
●在磷酸盐缓冲液中悬浮沉淀，及
●获得由三种细菌菌株组成的聚生体。
在本发明的另一个实施方案中，其中在30-35℃约100-120转/分下搅拌细菌分离株而培养16至18小时。
在本发明的另一个实施方案中，其中在30-37℃之间培养细菌分离株16至18小时。
在本发明的另一个实施方案中，其中在1-4℃以合适转速优选地为8000-12000转/分下离心获得的微生物聚生体约20-30分钟。
在本发明的另一个实施方案中，其中在合适缓冲液如磷酸盐缓冲液或Tris缓冲液中悬浮沉淀。
在本发明的另一个实施方案中，其中涉及制备用于生物漂白的纸浆悬浮物的方法，所述方法包括以下步骤：
●在约12-28psi高压灭菌未漂白的湿纸浆约15-25分钟，
●在无菌条件下以含有0.2％葡萄糖的基本盐培养基悬浮高压灭菌的纸浆。
在本发明的另一个实施方案中，其中高压灭菌7-10％的未漂白纸浆。
地方保藏号和国际保藏号之间的联系如下述：
1.CBTCC/51-03-MTCC 5096
2.CBTCC/52-03-MTCC 5094
3.CBTCC/53-03-MTCC 5095
4.CBTCC/54-03-MTCC 5098
细菌特征：
MTCC 5096
革兰氏阴性，杆菌
MTCC5094
革兰氏阴性，小杆菌
MTCC 5095
革兰氏阴性，球菌
MTCC5098
革兰氏阴性，长杆菌
上述编号可互换运用，然而权利要求只严格限定于国际保藏的细节。
在本发明的另一个实施方案中，其中本发明提供了漂白硬木牛皮纸浆的新生物方法。该方法排他性地涉及细菌分离株漂白纸浆的用途。四阶段过方法包括在不同阶段以细菌分离株两次接种纸浆然后碱洗。本方法中使用的细菌分离株自位于印度Roorkee的特定地点分离。
与本发明有关的细菌分离株保藏于位于印度昌迪加尔的微生物技术研究所的国际保藏单位(International Depository，Institute of MicrobialTechnology，Chandigarh，India)，这是一个WIPO承认的国际保藏单位，并且
在本发明的另一个实施方案中，其中在定义的条件下这些细菌分离株表现了显著的硬木牛皮纸浆漂白能力。
在本发明的另一个实施方案中，其中本发明中的细菌分离株自位于印度Roorkee的一处木材加工车间分离，在那里锯末持续堆积超过10-12年。
在本发明的另一个实施方案中，其中本发明中的细菌分离株包括降解木聚糖的细菌和木质素分解性细菌，因此在分离前对这两类细菌进行了不同的富集。
在本发明的另一个实施方案中，其中为提高木聚糖降解细菌的产量，将来自上述地点的5克新鲜土壤接种到含100ml土壤提取物、0.2％木聚糖和50μl CandidB(抗真菌)的500ml高压灭菌烧瓶中。富集烧瓶在30℃120转/分下保持96小时。
在本发明的另一个实施方案中，其中为诱导木质素分解性细菌，将来自上述地点的5克新鲜土壤接种到含100ml土壤提取物、0.3％木质素、1mM藜芦醇、1mM愈创木酚和50μl CandidB的500ml烧瓶中。富集烧瓶在30℃120转/分下保持96小时。
在本发明的另一个实施方案中，其中为制备土壤提取物，取1Kg土壤并在50℃干燥2小时。将400g干燥的土壤溶解于960ml单蒸水中并在15lbs下高压灭菌1小时。高压灭菌后，在5000转/分下离心样品10分钟。收集上清(提取物)并贮存在灭菌瓶内以制备富集烧瓶和进一步应用。
在本发明的另一个实施方案中，其中富集的土壤样本在0.85％的盐水中系列稀释。取各稀释度下的100μl稀释液涂布在含有土壤提取物、50％营养琼脂和0.2％木聚糖的培养皿上以分离木聚糖降解细菌，或涂布在含有土壤提取物、50％营养琼脂和0.2％木质素的培养皿上以分离木质素分解性细菌。如此获得的培养皿在30±2℃下倒置培养24-96小时。
在本发明的另一个实施方案中，其中根据菌落形态和颜色，共挑选60个分离株以检测它们漂白硬木纸浆的能力。挑单独分离的菌落在含有相同培养基的新鲜培养皿上划线。重复上述步骤直至获得纯菌落。
在本发明的另一个实施方案中，其中在MSM和0.7％木聚糖中120转/分/37℃下对不同分离株进行培养以筛选分泌细胞外木聚糖酶的分离培养物。每隔24小时进行木聚糖酶分析。为测定β-木聚糖酶活性，将200μl分离株培养物和800μl 0.7％(重量/体积)木聚糖混合并在55℃下温育10分钟。加1.5ml 3，5-二硝基水杨酸终止反应并充分混合溶液后沸水浴中加热15分钟。作为对照，温育800μl木聚糖、冷却后加入200μl磷酸盐缓冲液和1.5ml 3，5-二硝基水杨酸以校正底物溶液中的还原性糖。最初溶液和对照溶液中还原性糖的等价物以D-木糖为标准在540nm(Miller等1996)处测量光密度得以测定。每单位β-木聚糖酶活性定义为在给定条件下每分钟产生1μmol还原性糖的酶量。
在本发明的另一个实施方案中，其中为了检测经分离细菌的木质素分解活性，在30ml试管内加入10ml 0.4％木质素并接种单种细菌分离株。3天后，观察到木质素脱色。
在本发明的另一个实施方案中，其中在四阶段内用分离的细菌漂白硬木牛皮纸浆。第一阶段使用分泌木聚糖酶的细菌分离株而第二阶段涉及碱洗涤。第三阶段包括使用木质素分解性细菌，然后第四阶段用碱提取。
在本发明的另一个实施方案中，其中未漂白的硬木牛皮纸浆取自印度世纪造纸厂。在250ml无菌烧瓶中以100ml高压灭菌的含0.3％葡萄糖的基本盐培养基(MSM)溶解7g湿的高压灭菌纸浆。按1∶5比例接种1.00O.D.的木聚糖酶阳性细菌分离株。在28℃/120转/分下保持上述的漂白烧瓶20小时。20小时培养后，加30mg氢氧化钠(NaOH)和250μl过氧化氢(H2O2)并在70℃下烧瓶保持2小时。纸浆以简单沃特曼纸过滤并在无菌条件下以100ml含0.3％葡萄糖的新鲜MSM再次悬浮。按1∶5比例加入包含三种木质素分解性细菌的聚生体并在30℃/120转/分下保持20小时。加入30mg氢氧化钠(NaOH)和250μl过氧化氢(H2O2)再次进行碱提取后续70℃下2小时温育。过滤纸浆并在100ml新鲜的三次蒸馏水中悬浮。对不含细菌的对照烧瓶进行同样的试验过程。
本发明进一步提供四阶段方法以利用自特定地点分离的细菌漂白硬木牛皮纸浆，该方法包括：
a)在如培养基、温度、pH、碳源等定义的诸条件下培养自特定地点分离的所述细菌；
b)在漂白过程的不同阶段维持细菌培养物的密度。用100ml具有1％葡萄糖的MSM在250ml烧瓶中生长培养物。培养物烧瓶在30℃/120转/分下培养16-18小时以达到O.D.等于1.00；
c)在达到所需的O.D.(1.00)后离心得到的培养物以获得沉淀；
d)在20ml 0.05M pH 6.8的PO4 -3缓冲液中溶解上述沉淀；
e)在具有0.3％葡萄糖的MSM中制备纸浆。在含100ml基本盐培养基的250ml烧瓶中溶解7g新鲜未漂白的纸浆；
f)以(d)中形成的木糖酶特异性细菌沉淀接种纸浆并在28℃/120转/分下培养烧瓶20小时；
g)加入30mg氢氧化钠(NaOH)和250μl过氧化氢(H2O2)至(f)中提到的烧瓶并在70℃下培养2小时；
h)洗涤并用简单沃特曼纸过滤纸浆；
i)以100ml新鲜的含0.3％葡萄糖和1mM藜芦醇的MSM悬浮洗涤过的纸浆；
j)以(b)、(c)和(d)中制备的含三种木质素分解性细菌的聚生体接种并在30℃/120转/分下培养20小时；
k)加入30mg氢氧化钠和250μl过氧化氢至(f)中提到的烧瓶并如(g)中一样70℃下培养2小时；
l)洗涤并用简单沃特曼纸过滤纸浆；
m)在50℃下干燥纸浆5小时并测定亮度。
在本发明的另一个实施方案中，细菌从位于印度Roorkee特定的锯末地点分离。分离涉及所述的用于分泌木聚糖酶的细菌和木质素分解性细菌的富集和不同培养基。
在本发明的另一个实施方案中，如上所述的细菌分离株在具有1％葡萄糖的基本盐培养基中培养，并在30℃/120转/分下监测生长16-18小时以达到所需的O.D.
在本发明的另一个实施方案中，离心细菌培养物并在20ml 0.05M，pH6.8的PO4 -3缓冲液中悬浮以制备用于漂白研究的接种物。
在本发明的进一步实施方案中，木聚糖酶按已知方法(Miller等，1960)分析。
在本发明的另一个实施方案中，在具有0.3％葡萄糖的MSM中制备纸浆。在具有100ml MSM的250ml烧瓶中溶解7-10克新鲜未漂白纸浆。
在本发明的另一个实施方案中，以木聚糖酶特异性的细菌沉淀接种纸浆并在28℃/120转/分下维持烧瓶20小时。
在本发明实施方案中，向烧瓶中加入20-30mg氢氧化钠和200-250μl过氧化氢并在70℃下温育2小时。
在本发明的另一实施方案中，用简单沃特曼滤纸进行纸浆的洗涤和过滤，并将纸浆转移到100ml含0.3％葡萄糖和1mM藜芦醇的新鲜MSM中。
在本发明的进一步实施方案中，加入包含三种细菌分离株的木质素分解性聚生体并在30℃/100-120转/分下保持烧瓶2小时。
在本发明的另一实施方案中，向烧瓶中加入20-30mg氢氧化钠和200-250μl过氧化氢并在70℃下温育2小时。
在本发明的进一步实施方案中，用简单沃特曼滤纸进行纸浆的洗涤和过滤并且在50℃下干燥纸浆5小时。
实施例1
在100ml含1％葡萄糖的MSM中接种一环来自琼脂平板的名为CBTCC/51-03的细菌分离株。在摇床培养箱内以100至120转/分30℃培养16-24小时。培养后，在650nm处测量光密度。通过稀释或浓缩细菌悬浮液以维持培养物光密度至1.00。在4℃下以10,000转/分离心培养物30分钟。沉淀在20ml 0.05M，pH6.8的磷酸盐缓冲液中溶解。
在100ml含0.2％葡萄糖的MSM中溶解10g高压灭菌的湿纸浆而制备硬木纸浆悬浮液。将如上制备的细菌沉淀1ml接种于纸浆中并在35℃时以100转/分培育烧瓶15小时。由于不适宜的温度和细菌接种物量少未观察到纸浆显著变白。
实施例2
在100ml含1％葡萄糖的MSM中接种一环来自琼脂平板上的名为CBTCC/51-03的细菌分离株。在摇床培养箱内以100至120转/分30℃温育16-24小时。温育后，在650nm处测量光密度。通过稀释或浓缩细菌悬浮液以维持培养物光密度至1.00。在4℃下以10,000转/分离心培养物30分钟。沉淀在20ml 0.05M，pH6.8的磷酸盐缓冲液中溶解。
在100ml含0.2％葡萄糖的MSM中溶解7g高压灭菌的湿纸浆而制备硬木纸浆悬浮液。将如上制备的细菌沉淀10ml接种于纸浆中并在35℃时以100转/分培育烧瓶15小时。由于不适宜的温度和细菌接种物量少未在观察到纸浆显著变白。
实施例3
400ml MSM中接种一环来自琼脂平板上的名为CBTCC/51-03的细菌分离株培养物。在摇床培养箱内以100至120转/分30℃温育16-24小时。温育后，在650nm处测量光密度。通过稀释或浓缩细菌悬浮液以维持培养物光密度至1.00。在4℃下以10,000转/分离心培养物30分钟。沉淀在80ml0.05M，pH6.8的磷酸盐缓冲液中溶解。
分别在100ml含0.2％葡萄糖的MSM中溶解7g高压灭菌的湿纸浆而制备四个烧瓶的纸浆悬浮液。每个烧瓶内接种如上制备的细菌接种物20ml。第一个烧瓶在22℃温育而第二个烧瓶在28℃温育。第三个烧瓶在34℃且第四个烧瓶在40℃下温育。对所有烧瓶的纸浆在NaOH和H2O2存在时于70℃下温育2小时进行碱提取。在28℃下保持的烧瓶与其它烧瓶相比更亮(8％)(表1)
表1：运用不同细菌的生物漂白方法中温度的优化
  烧瓶编号   接种物   温度   亮度
  第一烧瓶   20ml   22℃   2％
  第二烧瓶   20ml   28℃   8％
  第三烧瓶   20ml   34℃   5％
  第四烧瓶   20ml   40℃   3％
实施例4
漂白实验按四个步骤进行。以一环来自琼脂平板上的名为CBTCC/51-03的细菌分离株生长物接种400ml MSM制备第一接种物。其次分别培养具有150ml各自接种了一环CBTCC/52-03、CBTCC/53-03、CBTCC/54-03的生长物的MSM的三个烧瓶得以制备第二接种物。全部烧瓶在摇床培养箱内以100至120转/分30℃培养16-24小时。培养后，在650nm处测定光密度。通过稀释或浓缩细菌悬浮液以维持培养物光密度至1.00。第一培养物单独离心而将为制备第二接种物的三种培养物等量混合后共同离心。第一培养物的沉淀在80ml 0.05M，pH6.8的磷酸盐缓冲液中溶解而三种合并培养物的沉淀在90ml 0.05M，pH6.8的磷酸盐缓冲液中溶解。
将每100ml含0.2％的MSM溶解7g湿纸浆而制备八个纸浆烧瓶。前四个烧瓶接种20ml第一“—细菌名—”的接种物。所有烧瓶在28℃/120转/分培养20小时。20小时培养后，每个烧瓶中加入30mg NaOH和250μl H2O2并在70℃温育2小时。用简单沃特曼滤纸过滤纸浆并于无菌条件下在四个具有100ml新鲜含0.2％葡萄糖的MSM的烧瓶内重新悬浮。向每个烧瓶中加入20ml含三种木质素分解性细菌的第二接种物(聚生体)。所有烧瓶在35℃/120转/分下温育20小时。加入30mg NaOH和250μl H2O2再次进行碱提取并于70℃温育2小时。过滤纸浆并以100ml新鲜的三次蒸馏水悬浮。对没有细菌的对照烧瓶进行同样的实验。最后，测试的纸浆烧瓶中观察到10-11％亮度(表2)。
      表2：漂白实验中单种细菌和三种细菌聚生体的联合效应。
  编号   第一阶段(单种细菌)   第二阶段   亮度％  第三阶段(三种细菌的聚生体)   第四阶段   亮度％
  1234   20ml接种物20ml接种物20ml接种物20ml接种物 碱提取   8798  20ml接种物20ml接种物20ml接种物20ml接种物 碱提取   10111110
实施例5
为观察pH和温度对生物漂白试验的影响，在16个100ml纸浆烧瓶中制备第一接种物。对第二接种物而言，同样在16个烧瓶中制备了三种细菌的聚生物。接种物按上述实施例中提到的方法制备。
在每100ml具有0.2％的MSM中溶解7g湿纸浆共制备16个纸浆烧瓶。前四个烧瓶接种名为CBTCC/51-03的细菌分离株的第一培养物20ml。烧瓶在28℃/120转/分下温育20小时。20小时温育后，烧瓶中加入30mgNaOH和250μl H2O2并在70℃下保持2小时。纸浆以简单沃特曼滤纸过滤并在无菌条件下于四份100ml新鲜的含0.2％葡萄糖的MSM中重新悬浮。向烧瓶中加入20ml含三种木质素分解性细菌的第二接种物(聚生体)。为观察温度的影响，纸浆烧瓶分别在27℃、30℃、33℃和37℃振摇(120转/分钟)条件下培养20小时。然后向烧瓶中加入30mg NaOH和250μlH2O2再次碱提取并在70℃下温育2小时。过滤纸浆并以100ml新鲜的三次蒸馏水悬浮。对没有细菌的对照烧瓶进行同样的实验。最后，在30℃时观察到更明显的亮度(表3)。
为观察pH对生物漂白试验的影响，用不同缓冲液将纸浆烧瓶的pH分别调节到pH5、pH7和pH9。pH调节后，向这些烧瓶接种名为CBTCC/51-03的细菌分离株的第一培养物20ml。烧瓶在28℃/120转/分下培养20小时。20小时培养后，加入30mg NaOH和250μl H2O2并将烧瓶在70℃保持2小时。纸浆用简单沃特曼滤纸过滤并在四份100ml新鲜的具有不同pH即pH5、7、8和9的MSM中再次悬浮。向每个烧瓶中加入20ml含三种木质素分解性细菌的第二接种物(聚生体)。所有烧瓶在30℃/120转/分下保持20小时。加入30mg NaOH和250μl H2O2再次碱提取并在70℃下温育2小时。过滤纸浆并在100ml新鲜的三次蒸馏水中悬浮。对没有细菌的对照烧瓶进行同样的实验。最后，在pH8观察到纸浆亮度为15％(表4)。
                          表3：漂白实验第三阶段的温度优化
  编号   第一阶段(单种细菌)   温度   第二阶段   亮度％  第三阶段(三种细菌的聚生体)   温度   第四阶段   亮度％
  1234   20ml接种物20ml接种物20ml接种物20ml接种物  28℃28℃28℃28℃   碱提取   7787  20ml接种物20ml接种物20ml接种物20ml接种物  27℃30℃33℃37℃   碱提取   10131111
  编号   第一阶段(单种细菌) pH   第二阶段   亮度％  第三阶段(三种细菌的聚生体) pH   第四阶段   亮度％
  1234   20ml接种物20ml接种物20ml接种物20ml接种物   5789   碱提取   57106  20ml接种物20ml接种物20ml接种物20ml接种物   5789   碱提取   11131510
                            表4：漂白实验时pH的优化
本发明的主要优点
1.所研发的四阶段生物漂白方法替代了纸浆和造纸厂中氯和二氧化氯的使用。因此，不产生有毒的含氯有机物如二氧芑、联苯等。
2.当制备的细菌悬浮液和聚生体协同性作用时，它们取消了纸浆厂化学漂白的CD阶段。
3.与化学漂白相比，所研发方法高度经济。
4.因为无含氯的污染物产生，故所研发的生物漂白方法是环境安全的。
5.就技术、可行性和应用性而言所研发的方法具有高度竞争力。

Claims (24)

1.使用保藏号为MTCC5096、MTCC5094、MTCC5095和MTCC5098的细菌菌株进行环境友好、安全和有效的四阶段生物漂白牛皮纸浆的方法，所述方法包括以下步骤：
a.以具有木聚糖酶活性的细菌菌株MTCC5096的接种物接种纸浆悬液作为第一阶段，
b.在约26-32℃以约100-120转/分培养已接种纸浆约15-20小时，
c.将氢氧化钠和过氧化氢加入步骤(c)的已接种纸浆进行碱提取作为第二阶段，
d.在约65-70℃温育大约1.5-2.5小时，
e.过滤纸浆并以无菌蒸馏水洗涤，
f.在新鲜的基本盐培养基中悬浮洗过的纸浆，
g.以包含保藏号为MTCC5094、MTCC5095和MTCC5098的木质素分解性细菌菌株的聚生体接种纸浆悬浮液作为第三阶段，
h.步骤(g)的已接种纸浆在pH约为5-9，温度约为26-32℃，以约100-120转/分钟温育约15-20小时，
i.重复步骤(b)至(e)以碱提取作为第四阶段获得亮度％约17％的纸浆。
2.如权利要求1所述的方法，其中生物漂白的第三阶段温度为约30℃。
3.如权利要求1所述的方法，其中生物漂白的第三阶段pH为约8℃。
4.如权利要求1所述的方法，其中加入20-30mg氢氧化钠和200-250μl过氧化氢。
5.如权利要求1所述的方法，其中基本盐培养基(MSM)具有约0.1％至1.0％的葡萄糖。
6.如权利要求1所述的方法，其中聚生体的诸菌株比例为1∶1∶1。
7.微生物聚生体，其包含保藏号为MTCC5094、MTCC5095和MTCC5098的木质素分解性细菌分离株的协同性混合物。
8.保藏号为MTCC5096的细菌菌株，其用于生物漂白纸浆。
9.如权利要求8所述的菌株，其中所述菌株显示约8％的生物漂白能力。
10.保藏号为MTCC5094的细菌菌株。
11.保藏号为MTCC5095的细菌菌株。
12.保藏号为MTCC5098的细菌菌株。
13.制备保藏号为MTCC5096的细菌分离株接种物的方法，所述方法包括以下步骤：
a.分离细菌菌株，
b.在含有土壤提取物和营养培养基上培养细菌分离株，
c.接种细菌分离株，
d.培养并在培养物达到所需O.D.(1.00-2.00)后离心获得的培养物收获沉淀，
e.在约0.03-0.05M pH约6.8的磷酸盐缓冲液中悬浮沉淀，及
f.获得接种物。
14.如权利要求13所述的方法，其中在含有等比例的土壤提取物和营养培养基的培养基上培养细菌分离株。
15.如权利要求13所述的方法，其中细菌分离株接种于含葡萄糖的基本盐培养基中并在28-34℃ 100-120转/分的搅拌下进行培养。
16.如权利要求13所述的方法，其中获得的生长物在1-4℃时以合适的转速优选地为8000-12000转/分离心大约20-30分钟。
17.如权利要求13所述的方法，其中沉淀在合适的缓冲液如磷酸盐缓冲液或Tris缓冲液中悬浮。
18.包含保藏号为MTCC5094、MTCC5095和MTCC5098的木质素分解性细菌分离株的聚生体的制备方法，所述方法包括以下步骤：
a)分离细菌菌株，
b)分别接种各细菌分离株，在定义的条件下培养和生长并按照光密度值以大致等比例混合培养物，及
c)离心获得的悬浮液以得到沉淀，
d)在磷酸盐缓冲液中悬浮沉淀，
e)获得由三种细菌菌株组成的聚生体。
19.如权利要求18所述的方法，其中细菌分离株的培养为在30-35℃约100-120转/分下搅拌16至18小时。
20.如权利要求18所述的方法，其中细菌分离株的培养为在30℃-37℃温度之间进行16至18小时。
21.如权利要求18所述的方法，其中获得的微生物聚生体在1-4℃时以合适的转速优选地为8000-12000转/分离心大约20-30分钟。
22.如权利要求18所述的方法，其中沉淀在合适的缓冲液如磷酸盐缓冲液或Tris缓冲液中悬浮。
23.用于生物漂白的纸浆悬浮液的制备方法，所述方法包括以下步骤：
a)在约12-28psi高压灭菌未漂白湿纸浆约15-25分钟，
b)以含0.2％葡萄糖的基本盐培养基在无菌条件下悬浮高压灭菌的纸浆。
24.如权利要求23所述的方法，其中高压灭菌7-10％的未漂白纸浆。
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