DK167885B1 - Fotoresponderende anordning til i et flydende medium at bestemme tilstedevaerelsen, maengden eller koncentrationen af en substans, fremgangsmaade til at foretage bestemmelsen samt system til brug ved fremgangsmaaden - Google Patents

Description

i DK 167885 B1 Påvisningen af et materiales tilstedeværelse og/eller dets mængde i bestemte omgivelser bliver et stadigt mere vigtigt fænomen i et samfund, som søger at kontrollere og styre sit miljø. På trods af den lange historie, som ken-5 detegner udviklingen af anordninger til måling af forskellige materialer i flydende medier, er der stadig rig lejlighed til at foretage forbedringer med hensyn til sensitiviteten, effektiviteten, økonomien og den bekvemme anvendelse af sådanne anordninger. Blandt de talrige me-10 toder og anordninger til påvisning af materialer findes en anordning, som i den senere tid har fundet udbredt anvendelse, nemlig den såkaldte felteffekttransistor (FET) og forskellige modifikationer af denne. Der har været foretaget forskellige undersøgelser rettet mod anvendelsen 15 af FET’er til måling af organiske molekyler; se f.eks. Stenberg et al., J. Coll. Interface and Sci. (1979) 72:255-264; Bergveld and DeRooij, Med. Biol. Eng. Compt. (1979) 17:647-654; Bergveld et al., IEEE Trans. BMI-23 (1976) side 136-144 og Lauks og Zemel, IEEE Trans, on 20 Electron Devices, Vol. ED-26, No. 12 (December 1979), side 10959-10964. Disse referencer er blot illustrative eksempler på referencer, som omtaler halvlederanordnin-ger, i særdeleshed felteffekttransistorer til måling af materialer i opløsning. FET-anordningerne har ikke vundet 25 kommerciel udbredelse, og i mange situationer mangler de den fornødne fleksibilitet. Til anvendelse som kemiske detektorer lider FET-anordningerne især af den vanskelighed, som ligger i at opnå eksponerede bestrålingsområder, når man arbejder med anordninger i eksperimentelle omgi-30 velser.

i I sammenligning med andre måleapparater udviser halvle der anordningerne og andre anordninger, som reagerer på et elektrisk signal, et antal fordele. En anordning, som re-35 sponderer på et elektrisk signal, kan således reagere på relativt små signaler. Ved forskellige teknikker er det endvidere muligt at modulere signalet, ligesom baggrunds- 2

Ulv 10/000 D I

støjen kan formindskes eller i det væsentlige elimineres.

Det er ofte muligt at fremstille elektriske apparater i meget små størrelser, således at man kan udvikle et udstyr med relativt beskeden størrelse til måling af æn-5 dringer i forskellige væsker.

Blandt litteraturreferencerne af interesse kan anføres Gronet and Lewis, Nature (1982) 300:733-735; Bard and Faulkner, 1980. Electrochemical Methods-Fundamentals and 10 Applications, John Wiley and Sons, New York; og Photoef-fects at Semiconductor-Electrolyte Surfaces, ed. Nozik, American Chemical Society, Washington, D.C., 1981. Se også US patentskrift nr. 4 293 310, PCT ansøgning nr. W083/02569 og JP offentliggørelsesskrift nr. 58-180941, 15 der svarer til US patentskrift nr. 4 486 272.

Den foreliggende opfindelse angår en fotoresponderende anordning til i et flydende medium at bestemme tilstedeværelsen, mængden eller koncentrationen af en substans.

20 Opfindelsen angår endvidere en fremgangsmåde til at foretage denne bestemmelse samt et system til brug ved fremgangsmåden.

Den foreliggende opfindelse tilvejebringer en anordning 25 til i et flydende medium at bestemme tilstedeværelsen, mængden eller koncentrationen af en substans, hvilken anordning er kendetegnet ved at omfatte et elektrisk fotoresponderende element, hvorpå der påtrykkes et potential gennem mediet, og en strålingskilde til bestråling under 30 det påtrykte potential benyttes som funktion til at give en måling af den parameter, der skal bestemmes.

Opfindelsen angår desuden en fremgangsmåde til at foretage den' ovennævnte bestemmelse, hvilken fremgangsmåde be-35 står i, at man bringer det fotoresponderende element i kontakt med væsken, påtrykker elementet et potential gennem væsken, bestråler elementet og måler responsen som DK 167885 B1 3 omtalt ovenfor.

Et antal steder på en fotoresponderende overflade kan bestråles med lys inden for et på forhånd fastlagt bølge-5 længdeområde til frembringelse af individuelt analyserbare signaler, hvor hvert signal er relateret til et bestemt volumen af mediet forbundet med det bestrålede sted.

10 I det følgende beskrives særlige udførelsesformer for opfindelsen under henvisning til tegningen, hvor fig. 1 er et første eksempel på et kredsløb til anvendelse ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen, 15 fig. 2 er et andet eksempel på et kredsløb, som sikrer en automatisk opretholdelse af fotosignalet fra en fotoresponderende overflade på en på forhånd bestemt værdi, 20 fig. 3 er et skematisk tværsnit af en fotoresponderende anordning til analysering af flere adskilte områder, fig. 4 er et skematisk, delvis løsrevet snit af et forgreningssystem til anvendelse sammen med den fotorespon-25 derende anordning ifølge opfindelsen, fig. 5 er et skematisk snit af en fotoresponderende anordning og et tilknyttet prøvehåndteringssystem, 30 fig. 6 er en grafisk afbildning, som viser den relative koncentration af farvestof i et medium som funktion af den målte respons i volt ved bestråling af en fotoresponderende overflade igennem en opløsning af farvestoffet, og 35 fig. 7 er en grafisk afbildning, der viser den observerede spænding under varierende redox-sammensætninger/- DK T67885 ΒΊ 4 sammensætninger.

Med den foreliggende opfindelse tilvejebringes generelt en fremgangsmåde og en anordning, som gør det muligt at 5 foretage en samtidig eller i det væsentlige, samtidig bestemmelse af trinvis stigende portioner af et medium. Anordningen ifølge opfindelsen gør brug af et fotosensitivt føleelement, som tjener som en elektrode, der via et signal/analyserende kredsløb og et medium med elektrisk 10 kontakt er koblet elektrisk til mindst en modelektrode.

Et eller flere steder på den lysfølsomme overflade bestråles individuelt med lys, hvis bølgelængde ligger inden for et på forhånd fastlagt område, hvorved signalerne på sådanne individuelle steder kan analyseres 15 individuelt. Det målelige signal på hvert af disse steder sættes i relation til bestrålingsniveauet på hvert sted og tilstanden af ledningsbåndet inden i det lyspåvirkelige føleelement som et resultat af det flydende medium, der grænser op til det bestrålede sted på den fotorespon-20 derende overflade.

Det fotoresponderende element polariseres i forhold til mindst en modelektrode. De to elektroder står i elektrisk kontakt med hinanden igennem mediet. Man anvender et 25 kredsløb, som gør det muligt at polarisere den lysfølsomme elektrode med enten ensrettet eller modsat forspænding, idet strømmen enten inhiberes eller får lov at strømme igennem et elektrisk kommunikerende ikke-metal-lisk medium, sædvanligsvis et polært flydende medium, 30 f.eks. et vandigt medium. Man foretrækker at inhibere strømpassagen igennem det ikke-metalliske, elektrisk kommunikerende medium, idet man herved forøger den fysiske stabilitet af føleelementets overflade, i særdeleshed med en silicium-halvleder. Med henblik på at bestemme 35 tilstanden af en gradvis stigende del af et medium af interesse bestråler man et sted i nærheden af denne stigende del, hvorefter man måler det resulterende signal DK 167885 B1 5 og sammenligner dette med en standardværdi.

Det fotoresponderende element kan bestå af et halvledende materiale eller et fotoledende materiale. Halvledende ma-5 terialer omfatter sådanne materialer som silicium, galli-umarsenid, galliumselenid, aluminiumgalliumarsenid eller lignende. Det halvledende materiale kan enten være af p-eller n-typen, og det kan efter behov være depot med sådanne materialer som bor, aluminium, phosphor, arsen, an-10 timon eller lignende. Graden af denne doping kan variere inden for vide grænser, idet der findes en lang række kommercielt tilgængelige dopede tynde materialer (såkaldte "wafers"), som kan anvendes. Koncentrationen af midlet, hvormed materialet er dopet, vil normalt variere em-15 pirisk med henblik på at opnå den ønskede fotorespons, hvilket hyppigt er et spørgsmål om bekvemmelighed, og koncentrationen er generelt fra omkring 101® til 102® 3 atomer/cm . Når der er tale om silicium, vil materialets ydeevne sædvanligvis være omkring 5-20 ohm.cm. Blandt de 20 lysledende materialer kan anføres chlorgalliumphthalo- cyanin? se Rieke and Armstrong, J. Am. Chem. Soc. 106:47-50 (1984).

Man kan benytte forskellige elektriske kredsløb til at 25 måle de ændringer i føleelektrodens fotorespons, som skyldes ændringerne i tilstanden af en gradvis stigende del af mediet. Disse elektriske kredsløb kan primært måle ændringerne i fototransduktans, som omfatter fotopotential, foto-ledningsevne, fotokapacitans og fotoinduktans 30 eller kombinationer deraf. Kredsløbene vælges på en sådan måde, at der opnås en maksimal sensitivitet med henblik på påvisning af små ændringer i mediets tilstand. Disse målinger benævnes generelt "fotorespons".

35 Det observerede signal fra kredsløbet kan være et resultat af en ændring i jævnstrøm eller vekselstrøm eller indvirkningen af en jævnstrøm på en vekselstrøm.

6

UK Ib/«ab D I

Når der anvendes tynde halvledermaterialer, kan disse foreligge i en række forskellige størrelser og udformninger, der kan variere fra chip-størrelse, hvor den største dimension er omkring 0,1 mm, til wafer-størrelse, 5 som kan være omkring 100 mm, men sædvanligvis højst omkring 75 mm i den største dimension. Anordningen har sædvanligvis mindst en glat overflade eller en glat del af en overflade, som fortrinsvis er en plan, og som tjener som sted for bestrålingen. Materialet kan være 10 rundt, rektangulært, aflangt eller lignende. Tykkelsen er sædvanligvis ikke over 1 mm, normalt under ca. 0,2 mm, og generelt er tykkelsen ikke under ca. 0,05 um, sædvanligvis ikke under 0,1 mm.

15 Overfladen, som udsættes for bestråling, har normalt en tilknyttet matrix. Denne matrix kan omfatte en belægning på mindst ca. 2,5 nm (25 Å), sædvanligvis mindst ca. 5 nm (50 Å), idet belægningen kan være væsentligt tykkere i afhængighed af sin funktion. Den overstiger dog normalt 20 ikke 100 nm (1000 Å), og fortrinsvis overstiger den ikke 50 nm (500 Å). Der er for det meste tale om en belægning indeholdende en lille mængde af et beskyttende lag, eksempelvis siliciumoxid eller siliciumnitrid.

25 Alternativt, eller i kombination, kan man lade overfladen reagere med en lang række organiske silaner, især i form af halogenider eller estere, som kan tilvejebringe en organisk belægning på overfladen. Organisilanerne omfatter organiske grupper med mellem 1 og 30, sædvanligvis 30 mellem 1 og 25 carbonatomer, idet disse grupper kan være alifatiske, alicycliske, aromatiske eller heterocycliske eller kombinationer deraf. Der er sædvanligvis tale om carbonhydridgrupper, såsom mættede eller umættede alifatiske ' carbonhydridgrupper, eller der kan være tale om 35 substituerede carbonhydridgrupper med en polær ende, idet polariteten kan skyldes (1) en ladning, eksempelvis car-boxylat, phosphat eller ammonium, (2) en zwitterion, ek- DK 167885 B1 7 sempelvis betain, eller (3) en dipol, eksempelvis 3,4-dinitrophenyl, carboxylatester, phosphattriester etc.

Når der anvendes carbonhydridgrupper, især alifatiske 5 grupper med omkring 6-24 carbonatomer, som enten er mættede eller umættede, kan man anvende et ekstra lag, således at der opnås en dobbeltlagsmembran. Til fremstilling af dette ekstra lag kan man anvende et hvilket som helst lipid, som kan tilvejebringe en stabil bilamel-mem-10 bran. Alternativt kan man til begge lag anvende lipider, som danner stabile lamel-membraner, idet man herved undgår en covalent binding til overfladen. Som eksempler på illustrative grupper kan anføres phosphorlipider, sphingomyeliner, gangliosider, cholesteriske forbindel-15 ser, acylglyceroler, voksarter og lignende.

Man kan bekvemt anvende et polymeriseret lipid-dobbelt-lag, som kan være fremstillet på forhånd og anbragt i position på overfladen; se f.eks. Wegner, kapitel V, R.A.

20 Welch Foundation Conf. on Chemical Research XXVI Synthetic Polymers, Nov. 15-17, 1982, Houston, Texas. Det er ønskeligt, at graden af polymerisation er under 100%, sædvanligvis fra omkring 20 til omkring 90%, således at der sikres en betydelig grad af fluiditet og lateral dif-25 fusion. Om ønsket kan man også anvende et første lag under det polymeriserede lag.

Der kan anvendes forskellige andre materialer i tilslutning til overfladen, og disse materialer kan være bundet 30 enten covalent eller ikke-covalent, eller de kan fastholdes mekanisk til overfladen. Materialerne kan være naturligt forekommende eller syntetiske, eller der kan være tale om kombinationer heraf. Disse materialer omfatter porøse film, der generelt har en tykkelse på mellem ca.

35 2,5 og ca. 125 am, og der er normalt tale om polære mate rialer, såsom nitrocellulose, delvis hydrolyseret poly-vinylacetat, polyacrylater, proteiner, polysaccharider

UIV 10/000 D I

8 såsom agarose etc.

Der kan også anvendes forskellige geler, såsom agar, po-lyacrylamid eller lignende. Disse lag kan have uafhængig 5 integritet, eller de kan afhænge af den lysfølsomme anordning, der anvendes som understøtning. De vil være helt eller delvis i direkte kontakt med det lysfølsomme element, enten direkte eller via mellemliggende lag.

10 Der kan også være knyttet forskellige andre materialer til den lysfølsomme elektrode, hvilke materialer vil blive beskrevet i nærmere detaljer nedenfor. Blandt disse materialer kan nævnes et umiddelbart overfor liggende lag, eksempelvis en plade eller et stykke glas. Andre ma-15 terialer kan være til stede for at sikre specifikke vekselvirkninger, især kompleksdannelse imellem specifikke bindingsmaterialer. Disse materialer kan være bundet direkte eller indirekte til den lysfølsomme overflade, især til den beskyttende belægning, eller til det overfor 20 liggende lag.

De anvendte film, belægninger eller lag bør ikke gribe forstyrrende ind i den transmission af lys med en bestemt bølgelængde, hvormed den fotoresponderende overflade be-25 stråles. Desuden kan det være nødvendigt at tilvejebringe en matrix ved den lysfølsomme overflade for at muliggøre polære vekselvirkninger som et resultat af ioner eller af binding eller kompleksdannelse hos polære, især ladede materialer, f.eks. proteiner, lipider, neuraminsyrer og 30 andre ladede saccharider eller lignende.

Denne matrix kan have en vilkårlig tykkelse, så længe den muliggør en tilstrækkelig transmission af lys til den halvlédende overflade, og så længe den sikrer den ønskede 35 intensitet og den bestemte modifikation af mediets tilstand på det pågældende sted på overfladen. Mediet, som anvendes på dette sted af overfladen, vil sædvanligvis DK 167885 B1 9 muliggøre en diffusion af ioner. I den udstrækning, hvor der anvendes faste film, vil disse derfor være porøse, og de vil befinde sig nedsænket i et flydende medium, således at det bliver muligt for de ioner og molekyler, som 5 ligger op mod den følsomme elektrodeoverflade, at diffundere og dermed tilvejebringe en elektrisk kommunikation mellem elektroderne.

Anordningen kan have en enkelt kontinuert overflade, hvis 2 2 10 areal kan være fra omkring 1 mm til omkring 50 cm , sæd- 2 vanligvis omkring 25 cm . I nogle tilfælde kan der være tale om et større antal individuelle fotoresponderende overflader, som er isoleret fra hinanden, således at der kan sendes uafhængige signaler til det samme kredsløb.

15 Disse individuelle enheder vil sædvanligsvis have en 2 2 størrelse på mellem ca. 0,1 mm og ca. 5 mm eller derover, idet den øvre grænse primært bestemmes af bekvemmelighedshensyn, selv om det i nogle situationer er muligt at opnå et forstærket signal ved at anvende et stort 20 overfladeareal. De individuelle enheder kan være i kontakt med medier, som er delvis isolerede fra hinanden gennem tilstedeværelsen af skilleflader, som muliggør en elektrisk kommunikation, f.eks. membraner, frittede vægge eller skillevægge, som kun udstrækker sig til en vis af-25 stand til overfladen, typisk fra 25 til 90% af afstanden til overfladen. Sådanne skilleflader kan også finde anvendelse i forbindelse med en stor lysfølsom overflade, således som det vil blive beskrevet i det følgende.

30 Den fotoresponderende overflade kan fysisk være opdelt på en række forskellige måder, således at den består af afsnit, som kan have en hvilken som helst passende periferi, f.eks. cirkulære, kvadratiske eller lignende former, eller som kan bestå af kanaler, der kan være cir-35 kulære, snoede eller retlinede, eller kombinationer deraf. Forøgede arealer, eksempelvis frembragt ved hjælp af riller, gør det muligt at undersøge en opløsning i bevæ-

Ulv 10/000 D I

10 gelse på forskellige tidspunkter. Sådanne riller eller kanaler kan tilvejebringes ved at forsyne den matrix, der er forbundet med den lysfølsomme overflade, med riller, og der kan frembringes opdel te afsnit ved hjælp af ind-5 skæringer i den matrix, der er knyttet til den lysfølsomme overflade. Antallet af uafhængige enheder, som skal måles, kan være 2 eller derover, sædvanligsvis 5 eller derover, og der kan være tale om mere end 50 enheder og helt op til 2500 enheder.

10

Alternativt kan man på overfladen tilvejebringe en fast film, et fast lag eller en plade, som sikrer en passende struktur, hvilket resulterer i, at den lysfølsomme overflade opdeles i afsnit og/eller kanaler. Den forreste 15 overflade er sædvanligvis stiv, og den kan være transparent, uigennemsigtig eller delvis gennemskinnelig for lys, idet den kan være fremstillet af metal, keramiske materialer, glas eller lignende. Når denne overflade er uigennemsigtig eller kun delvis gennemskinnelig for lys, 20 kan man (af hensyn til det bestrålende lys og når den forreste plade ligger op imod den lysfølsomme overflade) forsyne pladen med huller, således at lyset kan trænge igennem pladen på et antal steder. Man kan også anvende optiske fibre til at lede lyset igennem pladen på bestem-25 te steder. Pladen kan være af et inert materiale, hvis den blot skal benyttes til at tilvejebringe den fornødne struktur, eller den kan være således modificeret, at den kan binde forskellige materialer til sin overflade. Sådanne materialer er involveret ved bestemmelsen af til-30 standen af en stigende del af et medium, således at der tilvejebringes individuelle steder, hvor der kan foretages individuelle bestemmelser, og på denne måde kan man hurtigt bestemme et større antal resultater.

35 Bestrålingen af den fotoresponderende overflade kan finde sted på begge sider af waferen. Hvis bestrålingen foretages på den side, som ligger modsat den side, der er i 11 kontakt med mediet af interesse, vil det imidlertid være nødvendigt, at waferen er særdeles tynd, således at det ledende bånd, som påvirkes af mediet af interesse, også kan påvirkes af bestrålingen med lys. I denne situation 5 vil tykkelsen af det fotoresponderende element normalt være mellem ca. 0,05 um og ca. 2 μπι.

Den lysfølsomme overflade kan påvirkes af en række egenskaber, som forekommer i den trinvis stigende del af et 10 medium. Det er klart, at en af disse egenskaber er evnen til at absorbere lys i de tilfælde, hvor mediet kan variere med hensyn til den absorberende mængde lys. Variationer i koncentrationen af en substans, som absorberer lys i det bestrålede bølgelængdeområde, og som er til stede i 15 lysstrålen, kan således påvises og måles på basis af det observerede signal. I dette tilfælde kan den trinvis stigende del af mediet af interesse være i kontakt med eller adskilt fra det bestrålede sted på den fotoresponderende overflade. Variationer i lysets flux eller intensitet kan 20 således påvises og benyttes til at måle mængden af et absorberende materiale i lysstrålen, når det absorberende materiale er et materiale af interesse, eller mængden af det absorberende materiale, som har relation til et andet materiale af interesse.

25

Andre fænomener, som sikrer en strøm af lys, omfatter fluorescens eller kemiluminescens. En bestråling af den lysfølsomme overflade kan derfor komme fra en kemisk og ikke fra en fysisk kilde. En fluorescens kan være et re-30 sultat af en excitationsbestråling af et medium, som in-- deholder et fluorescerende middel, med en passende belys ning, som ved fluorescens resulterer i en lysstrøm, på hvilken det fotoresponderende element kan reagere, eller en kemisk reaktion, som ved energioverførsel frembringer 35 et fluorescerende produkt. Alternativt kan der være tale om kemi luminescens, hvorved man ved en kemisk reaktion opnår et produkt, som udsender lys, f.eks. luciferase og 12 DK 167355 61 luciferin, nedbrydning af dioxoclyclobutaner etc. Man kan anvende forskellige teknikker, hvorved den mængde af lysets flux, som skyldes det fluorescerende eller kemi luminescerende middel, kan moduleres i relation til den 5 mængde af et materiale, som er til stede i den stigende del af mediet.

Ud over variationerne i lyset kan man også anvende andre fænomener, enten kemiske eller fysiske, som kan påvirke 10 det lysfølsomme elements fotorespons, til at måle tilstanden i et medium. Disse fænomener omfatter pH-værdien, ionstyrken, redoxpotentialet og lignende. I de fleste tilfælde kræver disse fænomener, at den stigende del af mediet befinder sig i umiddelbar nærhed af det sted på 15 den lysfølsomme overflade, som bliver bestrålet.

Lyskilden kan være en hvilken som helst bekvem lyskilde, i særdeleshed med en energi, der mindst svarer til ledningsbåndgabet hos det fotoresponderende element, således 20 at der frembringes ionpar, dvs. frie elektroner og positive huller. Lyskilden vil generelt variere i området fra synligt til infrarødt lys, og for silicium er der tale om en størrelsesorden på omkring 1,1 eV. Herved opnås et bølgelængdeområde, der generelt strækker sig fra omkring 25 0,1 um til 1 wm. På lignende måde kan andre halvledere bringes til at passe til en bestemt lyskilde. Hvis man anvender farvestoffer som det tynde lag på den lysfølsomme overflade, kan man anvende lys med en lavere energi koblet med en redox-reaktion. De lyse og mørke perioder i 30 den pulserende bestråling kan være ens eller forskellige, _2 idet de generelt er af en størrelsesorden fra 10 til — fi 10 sekunder. Den totale bestrålingstid er ikke kritisk, _3 og den kan være fra 10 til 1 sekund.

35 Man kan anvende en hvilken som helst lyskilde, som tilvej ebringer periodisk tilbagevendende lys i korte tidsperioder, idet man især foretrækker en lyskilde, som kan DK 167885 B1 13 cyclisere lyset med en på forhånd fastlagt frekvens, eksempelvis 100 Hz-100 KHz, sædvanligsvis 100 Hz-50 KHz,især 1-20 KHz, under bestrålingsperioden. Af særlig stor interesse er LED-stråler, som kan opnås ved hjælp af 5 rødt lys eller hvidt lys, f.eks. fra en wolframlampe. Alternativt kan man anvende en enkelt kilde, f.eks. fluorescerende lys i det synlige område. Når man anvender lukkere, kan man også benytte nematiske flydende krystaller, gittere, optiske fibre, afbrydere eller lig-10 nende.

Sædvanligvis bestråler man de forskellige steder på forskellige tidspunkter, hvorved man opnår en simpel metode til at skelne de signaler, der er knyttet til de indi-15 viduelle steder, fra hinanden. Man kan imidlertid også foretage en samtidig bestråling af forskellige steder, idet man i så fald anvender et system til at skelne signalerne fra hinanden, eksempelvis faseskift, vekslende frekvenser eller andre kombinationer, hvormed signalerne 20 kan adskilles fra hinanden.

Som angivet i det foregående kan man med den foreliggende opfindelse analysere en eller flere trinvis stigende portioner af et eller flere medier, hvor den udvalgte por-25 tion eller det udvalgte volumen kan være en indikation af mediets totale egenskaber eller egenskaberne af de trinvis stigende portioner af mediet, idet egenskaberne af de enkelte portioner kan afvige fra hinanden såvel som fra egenskaberne af det samlede medium. Man kan undersøge de 30 enkelte dele af mediet ved at bestråle et sted på den lysfølsomme overflade, som er knyttet til den bestemte del af mediet. En bestråling på et bestemt sted kan foretages ved at anvende en lyskilde, som bestråler det specifikke sted som følge af en bevægelse af lyskilden og 35 den lysfølsomme overflade i forhold til hinanden, eller ved at anvende et større antal lyskilder, som bestråler forskellige dele af den lysfølsomme overflade i overens- 14 UK Ib/BSb bl stemmelse med et på forhånd fastlagt mønster, og man kan også anvende kombinationer af disse metoder. På denne måde kan man anvende forskellige dele af mediet til at bestemme tilstanden i en bestemt del med hensyn til en ræk-5 ke forskellige egenskaber, og man kan bestemme varia tionerne i mediets tilstand over et stort volumen. Man kan endvidere anvende en eller flere kanaler og bestemme tilstanden af de enkelte portioner af mediet langs en kanal, således at man kan sætte variationerne i de enkelte 10 portioners tilstand langs kanalen i relation til en tidsbestemt ændring, som optræder i mediet. Ved at anvende en kontinuerlig eller en periodevis vekslende strømningsteknik og ved at blande to medier, som tilvejebringer en påviselig reaktion inden bestrålingen, kan man op-15 nå en stabil tilstand på hvert enkelt bestrålingssted langs kanalen. På denne måde kan man bestemme reaktionshastigheder ved at observere mediets egenskaber i stabil tilstand på forskellige steder langs en kanal.

20 Den foreliggende opfindelse gør det således muligt at foretage en i det væsentlige samtidig undersøgelse af tidsbestemte hændelser. Man kan derfor vælge enten at bevæge en eller flere lyskilder eller den lysfølsomme overflade, eller man kan tilvejebringe et større antal lyskilder, 25 som vil bestråle en overflade i overensstemmelse med et på forhånd fastlagt mønster. Man kan også tilvejebringe et antal isolerede lysfølsomme overflader, som man kan bestråle samtidigt eller på forskellige tidspunkter.

30 Som følge af de mange forskellige egenskaber, som kan påvises, og de mulige variationer i udformningen og fleksibiliteten i opbygningen af kredsløbene kan man med den foreliggende opfindelse håndtere en lang række forskellige Systemer og situationer. Selv om man først og frem-35 mest vil analysere væsker under modulation af et fotoresponderende elektrisk signal, er det med den foreliggende opfindelse også muligt at analysere faste og halvfaste DK 167885 B1 15 stoffer i passende situationer.

Med den foreliggende opfindelse kan man analysere forskellige strømme, såsom spildevandsudløb, naturlige vand-5 løb, industrielle væskeudledninger fra kemiske virksomheder, udledninger fra raffinaderier, kraftværker og lignende, luft og andre fluida, så længe disse indeholder en komponent, som kan fremkalde et fotoresponderende elektrisk signal, eller en komponent, som kan anvendes i for-10 bindelse med andre materialer med henblik på at fremkalde en sådan respons.

I et illustrativt eksempel på anvendelsen af den omhandlede anordning forefindes der en eller flere kanaler 15 imellem den fotoresponderende overflade og en transparent metalplade, idet den fotoresponderende overflade og den transparente metalplade tjener som plader i en kondensator. Udløbet fra et Cottrell-udfældningsapparat kan, fra den samme kilde eller fra et antal forskellige kilder, 20 ledes igennem et antal kanaler, idet hver af disse kanaler kan overvåges uafhængigt af hinanden og i det væsentlige samtidigt. Hvis ladningen spredes med tiden, kan man, ved at kontrollere strømningshastigheden igennem kanalen, også bestemme spredningshastigheden af denne 25 ladning ved at måle signalet på forskellige steder langs kanalen. Ændringen i det lysfølsomme elektriske signal i kanalens strømningsretning kan således benyttes til at bestemme den hastighed, hvormed en ladning spredes.

30 I en anden udførelsesform for opfindelsen kan man måle ændringen i det biologiske oxygenbehov (BOD) eller det kemiske oxygenbehov (COD) i eksempelvis en spildevandsstrøm eller i en flod, idet man tilvejebringer et antal kanaler, således at strømmen kan opdeles i et antal indi-35 viduelle strømme. Man kan indføre forskellige kemikalier i hver enkelt kanal, idet det tilsatte kemikalie eller det pågældende reaktionsprodukt gør det muligt at mo-

Ulv ΙΟ/ΰΰΰ D I

16 dulere det fotoresponderende elektriske signal. Når der sker en ændring i lysabsorption, pH eller andre fysiske fænomener, kan hastighedsændringen bestemmes ved at bestemme ændringen i det elektriske signal på forskellige 5 steder langs kanalen og sætte denne ændring i relation til det kemiske eller biologiske oxygenbehov.

Man kan også anvende den omhandlede anordning til at måle reaktionshastigheder, såsom hastigheder for enzymatiske 10 reaktioner, når en sådan enzymatisk reaktion resulterer i en ændring af mediets absorptionsevne, en ændring i pH eller lignende. Dette kan gøres på dynamisk eller statisk måde, idet man ved at anvende en strøm i bevægelse kan gøre hastighedsbestemmelsen i det væsentlige øj eblikke-15 lig. Alternativt kan man også bestemme reaktionshastigheden ved at anvende en relativt statisk opløsning på et bestemt sted, som bestråles periodevis, mens man aflæser resultaterne på forskellige tidspunkter.

20 Som nævnt kan den foreliggende opfindelse også anvendes i forbindelse med halvfaste eller faste medier, for så vidt man foretager de fornødne tillempninger. F.eks. kan man anvende geler til at påvise biologiske transformanter eller forligelige virustyper, og man kan også anvende 25 geler i andre situationer, hvor man ønsker at bestemme "plaques". Denne metode involverer normalt, at man dyrker et lag af celler på en nærende agar og inficerer cellelaget med et forligeligt eller ukendt virus. I de tilfælde, hvor der sker en lysering, dannes der en lille 30 "plaque" eller klar plet. Ved at anbringe den fotoresponderende overflade i umiddelbar nærhed af gelen, som bufres til en på forhånd fastlagt pH-værdi og ionstyrke, kan man bestemme de steder, hvor pletterne findes, og registrere disse steder ved scanning af gelen fra den mod-35 satte side af den fotoresponderende overflade og efterfølgende bestemmelse af variationerne i lystransmissionen.

DK 167885 B1 17

Alternativt vil man ofte transformere celler ved hjælp af en "markør", som bevirker udtrykkelse af et enzym, der reagerer med et substrat under dannelse af en farve.

F.eks. anvender man sædvanligvis Ø-galactosidase, efter-5 som et kommercielt tilgængeligt substrat vil frembringe en blå farve. Som beskrevet ovenfor kan man dyrke kloner på overfladen af en nærende agar, hvorefter man automatisk kan screene klonerne på basis af tilstedeværelsen af den blå farve.

10

En tredje situation, som involverer geler, kan eksemplificeres ved gelelektroforese af proteiner. Når man har gennemført elektroforesen, kan man bringe gelen i kontakt med en opløsning af et antistof til et protein af inter-15 esse, som er konjugeret til et enzym, der producerer et påviseligt produkt, f.eks. et syreprodukt. Efter at man har inkuberet i et tidsrum, der er tilstrækkeligt til, at et eventuelt antistof kan binde sig til et protein, som er tilgængeligt, og diffundere ind i gelens overflade, 20 kan man tilsætte et tyndt lag substrat og bringe den fotoresponderende overflade i kontakt med den vandige fase.

Man kan igen foretage en scanning fra den modsatte side ved hjælp af lys, hvorved man kan påvise en variation i mediets pH som et resultat af tilstedeværelsen af det 25 pågældende enzym.

Et fjerde tilfælde involverer ligeledes elektroforese af proteiner i geler, der indeholder en pH-gradient. Ved disse teknikker, som omfatter isoelektrisk fokusering, 30 opstiller man kunstigt en pH-gradient, hvorefter man analyserer hastigheden af proteinets vandring (migration) eller endepunktspositionen af proteinets vandring inden for pH-gradienten. Ved scanning af gelens overflade med lys, Svarende til den ovenfor beskrevne situation, kan 35 man både bestemme gelens pH på forskellige steder og proteinernes position i gelen.

Ulv 10/000 D I

18 I stedet for proteiner kan man foretage elektroforese af enkelt- eller dobbeltstrengede polynucleotid-sekvenser.

Når man anvender en restriktions-endonuclease til at di-gerere et DNA-element, eksempelvis et chromosom, et virus 5 eller et plasmid, hvor længden af sekvensen eller sekvenserne er udtryk for et genetisk kendetegn ved en bestemt polymorfi, et plasmid eller en virusstamme, kan man anvende den foreliggende opfindelse til hurtigt at bestemme, hvilken polymorfi, hvilket plasmid eller hvilken 10 stamme, der er til stede. Efter digestion og denaturering af DNA-prøven kan man anvende ssDNA-markører med kendt længde i et tilgrænsende bånd, hvorefter man kan underkaste de to blandinger elektroforese. Det fraseparerede DNA i gelen kan derefter overføres til en nitrocellulosefilm 15 og fikseres ved opvarmning, hvorpå det fikserede DNA kan analyseres ved hjælp af en mærket prøve under hybridise-rende betingelser. Derefter scannes filmen for at bestemme det relative forhold imellem de hybridiserede dsDNA-strenge fra prøven og dsDNA-strengene fra markøren, hvil-20 ket gøres ved at bringe filmen i kontakt med den fotoresponderende overflade, idet man anvender et passende medium til udvikling af et detekterbart signal. Derefter ledes lys igennem filmen på forskellige tidspunkter langs filmens længde, og den relative adskillelse af dsDNA-seg-25 menterne bestemmes på basis af det signal, der observeres med den omhandlede anordning. Det rumlige forhold mellem segmenterne kan benyttes til at diagnosticere tilstedeværelsen eller fraværet af et bestemt DNA-element.

30 Den foreliggende opfindelse er af særlig stor interesse, når der er tale om at påvise tilstedeværelsen af en specifik komponent i et medium, hvor denne komponent kan være et kemikalie, enten syntetisk eller naturligt forekommende,' såsom medikamenter, hormoner, proteiner, stero-35 ider, receptorer, nucleinsyrer eller lignende, eller aggregeringer af forbindelser, såsom nucleosomer, virustyper, celler (såvel prokaryote som eukaryote) eller DK 167885 B1 19 lignende. Disse bestemmelser foretages ofte i fysiologiske væsker, såsom blod, plasma, spyt, hjerne-rygmarvsvæske, lymfevæske, urin eller lignende.

5 Disse bestemmelser involverer en kombination af en ligand og en receptor, hvor liganden og receptoren har specifik affinitet for hinanden, således at de udgør et specifikt bindingspar. Sådanne receptorer vil for det meste være antistoffer, enzymer eller naturligt forekommende recep-10 torer, og de kan til opfindelsens formål omfatte nuclein-syrer, mens liganderne kan være vilkårlige forbindelser, til hvilke der forefindes eller kan fremstilles en receptor.

15 De systemer, der involverer specifikke bindingspar, kan variere inden for vide grænser og kan involvere et "homogent" system, hvori der ikke er nogen binding til en fast overflade, eller et "heterogent” system, hvor der kan være en binding, som er udskiftelig eller ikke-udskiftelig.

20 Ved "udskiftelig" forstås, at man kan fjerne en af prøvesystemets aktive komponenter fra overfladen og erstatte den med en anden komponent.

I de fleste tilfælde anvender men et vandigt bufret me-25 dium, idet mediet kan være let eller kraftigt bufret i afhængighed af arten af det materiale, der frembringer signalet. Man kan anvende forskellige buffere, såsom car-bonat, phosphat, borat, tris, acetat, barbital, Hepes eller lignende, i koncentrationer i området fra omkring 30 0,01 til omkring 0,5 M. Organiske polære opløsningsmidler f.eks. oxygenerede neutrale opløsningsmidler, kan være til stede i mængder på mellem 0 og ca. 40 volumen-%, såsom methanol, ethanol, a-propanol, acetone, diethylether eller lignende.

35 I assays, der omfatter specifikke bindingspar, er en mærkning konjugeret til en substans, og modulationen af

Ulv 10/009 D I

20 det lysfølsomme signal vil have relation til mængden af den pågældende substans i den prøve, der analyseres. Substansen kan være det stof, der analyseres for, eller en analog hertil, eller den kan være den komplementære del 5 af et bindingspar eller en substans, der binder sig til et af disse stoffer. Sådanne substanser omfatter antistoffer til bestemte immunoglobuliner, f.eks. antistoffer fra får til immunoglobulin fra mus. Hertil hører også par, især hapten-receptor-par, hvor substansen er modifi-10 ceret med et hapten, eksempelvis biotin, og en mærket reciprok bindingssubstans, eksempelvis avidin. Mærkningen kan således være bundet direkte eller indirekte, covalent eller ikke-covalent, til den del af det specifikke bindingspar, der omfatter den komponent, som man analyserer 15 for.

Der anvendes et system, som kan indeholde en eller flere komponenter, der tilvejebringer et materiale i relation til et fotoresponderende sted, som modulerer det fotore-20 sponderende elektriske signal. Den måde, hvorpå modulationen foretages, kan kræve, at materialet befinder sig i umiddelbar nærhed af den fotoresponderende overflade, at materialet befinder sig i banen for det bestrålende lys eller lignende. Der kan anvendes en lang række forskel-25 lige modulerende materialer i de specifikke bindingsfor søg, hvilke materialer kan være produkter af en katalyseret reaktion, eksempelvis en enzym-katalyseret reaktion.

For det homogene systems vedkommende er det kun nødven-30 digt, at bindingen resulterer i en modulation af et prøvesystem, som atter resulterer i en modulation af det fotoresponderende elektriske signal. Bindingen kan finde sted i umiddelbar nærhed af den lysfølsomme overflade eller i -en afstand fra denne, idet den lysfølsomme overfla-35 de i det sidstnævnte tilfælde kan anvendes på et senere tidspunkt til at bestemme niveauet af den detekterbare forbindelse i forsøgsmediet. F.eks. kan man gennemføre et DK 167885 B1 21 antal forsøg i separate beholdere, f.eks. mikrotiterglas, hvor en farve, eksempelvis fra et farvestof, dannes i hvert af glassene i overensstemmelse med mængden af prøvesubstansen. Man kan derefter anbringe mikrotiterpla-5 derne under den fotoresponderende flade, og ved at bestråle de enkelte glas efter et på forhånd bestemt mønster kan man hurtigt bestemme signalet for hvert af glassene. Når evnen til at absorbere lys er involveret, vil det ofte være ønskeligt at råde over en relativt lang 10 vejlængde. I stedet for at anvende de normale glas med mikrotiterplader kan man således anvende glas, som er relativt dybe, og som har en ringe diameter, således at lyset vil passere igennem en relativt lang vejlængde, som omfatter størstedelen af prøvemediet.

15 Når der frembringes andre produkter end farvestoffer, der kan tilvejebringe den elektriske fotorespons, vil det være nødvendigt, at der indtræder en vis elektrisk vekselvirkning med den lysfølsomme overflade. Denne elektriske 20 vekselvirkning kan have form af en kapacitans, men det er mere almindeligt, at den omfatter en kontakt med en lysfølsom overflade, idet vekselvirkningen da er et resultat af en ændring i pH, ionstyrke, redox-niveau i systemet eller lignende. Man kan opnå dette ved at tilvejebringe 25 et antal glas, hvori forskellige prøver analyseres, og derefter mekanisk overføre en prøve fra hvert af glassene til et angivet sted på den fotoresponderende overflade, idet de enkelte steder adskilles fra hinanden på forskellig måde, eksempelvis ved hjælp af skillevægge, porøse 30 faste stoffer, geler eller lignende. Hver prøve udviser en elektrisk vekselvirkning med en fælles lysfølsom halv-lederelektrode.

Med hensyn til det homogene assay kan dette gennemføres i 35 umiddelbar nærhed af den fotoresponderende overflade, idet der tilvejebringes et antal partielle opdelinger, der kun udstrækker sig til en del af afstanden igennem

UIV 10/009 D I

22 prøvemediet, og idet prøven indføres i umiddelbar nærhed af den fotoresponderende overflade. Eftersom hastigheden for dannelsen af det detekterbare produkt vil variere med mængden af analyt i det enkelte afsnit, kan man, ved at 5 sammenligne forskellene imellem de afsnit, der indeholder prøven, sætte resultaterne i relation til standardværdierne. Homogene assays, der omfatter sådanne forsøg, er beskrevet i US patentskrifterne nr. 3 817 837 (enzym), nr. 3 935 074 (alle ligander), nr. 3 996 345 (flu- 10 orescens-af bryder-par), nr. 4 160 645 (ikke-enzymatisk katalysator), nr. 4 193 983 (liposom), nr. 4 208 479 (enzym-modificerende middel) nr. 4 275 149 (partikler) og nr. 4 193 865 (selvmordsinhibitorer). Disse patentskrifter involverer enzymer, fluorescerende midler, redox-15 reaktanter og kombinationer deraf.

F.eks. findes der et kommercielt assay, som forhandles under varemærket EMIT. Dette assay gør brug a£ enzymet glucose-6-phosphat-dehydrogenase, som producerer NADH ud 20 fra NAD. Ved at sørge for, at der sker en oxidation ved den fotoresponderende overflade, hvorved NADH omdannes til NAD, enten direkte eller via andre redox-forbindelser, kan man bestemme den hastighed, hvormed enzymet danner NADH.

25

Det homogene enzym-assay gør brug af antistoffer til en analyt, idet analytten eller en analog hertil også er bundet til enzymet, således at der dannes et enzym-analyt-konjugat. Når antistoffer til analytten bindes til 30 dette enzym-analyt-konjugat, reduceres den enzymatiske aktivitet i betydelig grad. Hastigheden for dannelsen af NADH kan således bestemmes og sættes i relation til den mængde af analytten, som er til stede i det volumen, der er knyttet til det fotoresponderende sted.

35

Ved gennemførelsen af analysen kan det fotosensitive sted være forsynet med et antal opdelinger, som definerer et DK 167885 B1 23 antal afsnit, idet prøvemediet strækker sig ud over opdelingerne. Prøvemediet indeholder enzym-konjugatet samt buffere, stabilisatorer eller andre additiver, som ikke er direkte involveret i det system, der tilvejebringer 5 det detekterbare signal. Man fremstiller en prøveopløsning, som indeholder antistoffet, prøven og passende substrater, hvorefter man inkuberer blandingen og injicerer den i det pågældende afsnit af anordningen. Den hastighed, hvormed der produceres et redox-reagens, eller 10 hvormed der dannes et andet detekterbart produkt eller sker en ændring i pH, kan derefter følges om en indikation af den mængde af analytten, der er til stede i prøven.

15 Ud over at have et enzym konjugeret til analytten eller til den ene del af et reciprokt bindingspar kan man også konjugere substrater, co-faktorer, selvmords-inhibitorer eller lignende. Disse forskellige teknikker er omtalt i de ovenfor nævnte US patentskrifter. Man kan derfor frem-20 stille et konjugat, der består af en selvmords-inhibitor og en analyt. Derefter kan man binde et enzym, enten covalent eller ikke-covalent, til en overflade, enten den fotoresponderende overflade eller en overflade i umiddelbar nærhed af den fotoresponderende overflade. Man frem-25 stiller en prøveopløsning bestående af et antistof til analytten, prøven, selvmords-inhibitor-konjugatet, substrater og andre reagenser, som er nødvendige for at frembringe et detekterbart produkt. Derefter kan man sætte prøveopløsningen til det enzym, der er bundet til 30 overfladen, og derved bestemme den enzymatiske aktivitet.

En anden homogen prøve udnytter en enzym-underenhed af et enzym bestående af mange enheder, idet denne underenhed kan tjene som mærkning. Bindingen af antistoffet til un-derenh'eds-konjugatet forhindrer, at underenheden danner 35 komplekser med andre enheder. Alternativt kan man anvende selvkombinerende proteinfragmenter. Som et eksempel herpå kan nævnes enzymet ribonuclease, som kløves af subtilisin 24 υκ Ιϋ/ΰΰο D i til S-peptidet og S-proteinet, der rekombinerer til dannelse af et aktivt enzym.

Det heterogene system gør det muligt at foretage en sepa-5 ration af komplekser imellem specifikke bindingspar og specifikke dele af bindingspar, der ikke har dannet komplekser. Dette opnås ved, at den ene af delene i et specifikt bindingspar er bundet til en fast overflade.

Man kan således fremstille en klar glasplade, som på for-10 skellige steder er forsynet med specifikke antistoffer, således at man kan analysere en prøve for et større antal analytter. Til opløsningen kan man derefter sætte antistoffer for hver af analytterne, således at man anvender et "sandwich"-immunoassay. Disse antistoffer kan passende 15 være monoklonale antistoffer, således at man begrænser tvær-reaktiviteten til et minimum. Man kan derefter tilsætte enzym-konjugat til et antistof, som er specifikt over for immunoglobuliner fra en bestemt art. Hvis de monoklonale antistoffer f.eks. hidrører fra mus, kan man 20 fremstille kanin-antistoffer til muse-immunoglobulin. Det er således kun på de steder, hvor det monoklonale museantistof har bundet sig, at der også findes et enzym-kon-jugat. Derefter kan man anbringe den klare glasplade i umiddelbar nærhed af den fotoresponderende overflade, som 25 registreres, således at man opnår en definition af, hvor hvert af de oprindelige antistoffer har befundet sig. En tynd flydende film på overfladen vil tilvejebringe de fornødne reaktanter og substrater til reaktion med enzymet under dannelse af den detekterbare forbindelse. Der-30 efter bestråles overfladen sekvensvis igennem den klare glasplade, således at det kan fastslås, hvorvidt et enzym er blevet bundet til et bestemt sted. På denne måde kan man analysere en prøve for et antal forskellige analytter, og denne analysering kan foretages i det væsentlige . 35 samtidigt, således at man opnår en komplet samling af bestemmelser på en enkelt prøve, samtidig med, at der kunne kræves ekstremt små mængder af prøven.

DK 167885 B1 25

Heterogene teknikker er beskrevet i US patentskrifterne nr. 3 654 090 (enzym), nr. 3 791 932 (enzym), nr.

3 853 987 (fluorescerende partikel), nr. 3 970 518 (magnetisk partikel) og nr. 4 134 792 (enzym-substrat).

5

Hvis man ønsker at anvende den samme overflade gentagne gange, kan man påføre den ene del af et specifikt bindingspar på overfladen, mens den komplementære del konjugeres til en del af et specifikt bindingspar, der er 10 knyttet til analytten. F.eks. kan man belægge overfladen med den samme eller forskellige sukkerarter, haptener, receptorer, antistoffer eller dele af naturlig forekommende ligand-receptor-par. Man kan derefter konjugere den del af det specifikke bindingspar, der har relation 15 til analytten, til den del af bindingsparret, som er komplementær del til det materiale, der er bundet til overfladen. Som illustration kan man belægge overfladen med et saccharid og konjugere den del af det specifikke bindingspar, der er analyt-relateret, eksempelvis et anti-20 gen, til et lectin. Man kan således fremstille konjugater af antistoffer til en protein-analyt og lectiner. Ved at sætte en opløsning af antistof-lectin-konjugatet til den saccharidbelagte overflade opnår man, at antistofferne bliver bundet til overfladen. Derefter kan man gennemføre 25 analysen som beskrevet ovenfor, og når man har fuldført analysen, kan man fjerne det kompleksbundne materiale fra overfladen ved at tilsætte en koncentreret opløsning af saccharidet. Man kan anvende andre par ved analogi, hvor man i stedet for et lectin anvender et antistof eller en 30 naturlig receptor. Man kan således anvende en enkelt overflade, som gentagne gange kan suppleres, således at man kan anvende den samme eller forskellige typer af analyser efter hver bestemmelse. Ved at binde forskellige forbindelser til overfladen på forskellige steder kan man 35 dirigere specifikke dele af bindingspar til et specifikt sted med et passende konjugat.

Lslv ΙΟ/ΟΟϋ D I

26

Det er muligt at anvende forskellige teknikker med enzymer for at opnå en forstærkning og en forøget sensitivitet. Således kan man anvende pH-kaskader ved at benytte enzymer med forskellige pH-optima. Ved at sørge for, at 5 størstedelen af opløsningen holdes ved en pH-værdi svarende til et bestemt enzym, der producerer et produkt, som kan frembringe en anden pH-værdi i afgrænsede lokaliserede omgivelser, hvilken pH-værdi er optimum for et andet enzym, der producerer et produkt, som yderligere æn-10 drer pH i den samme retning, kan man frembringe en lokaliseret forøgelse eller forstærkning. På lignende måde kan man anvende enzymer, som kræver coenzymer eller substrater, der kan produceres af et andet enzym. I det ovenfor givne eksempel kan man binde et første enzym til 15 glaspladen, mens det andet enzym konjugeres til receptoren. Det første enzym kan således sikre en høj lokaliseret koncentration af substratet eller coenzymet for det andet enzym. Som eksempler på illustrative enzympar kan anføres glucoseoxidase og peberrod-peroxidase, som produ-20 cerer et kraftigt farvet produkt, en kinase og G6PDH, der sammen med glucose og NAD kan producere NADH, som derefter kan kobles med INT-farvestof etc.

Det er muligt at anvende andre katalysatorer end enzym-25 katalysatorer, i særdeleshed redox-katalysatorer. Disse katalysatorer kan omfatte sådanne forbindelser som phenazin-methosulfat, methylenblåt, nicotinamid-adenin-dinucleotid, Meldola-blåt, flavinmononucleotid, ferri- og ferrocyanid og lignende. Disse forbindelser kan benyttes 30 i kombination med enzymer eller andre katalytiske forbindelser, hvorved der opnås et redox-potential på halvlederens overflade. I stedet for at konjugere receptorer med enzymer kan man f.eks. konjugere receptorer med phe-nazin-methosulfat, Meldola-blåt, methylenblåt etc. Ved 35 derefter at anvende et par bestående af NADH og et tetrazoliumsalt kan man frembringe en intens farve på overfladen.

DK 167885 B1 27

Redox-reagenser kan kobles med naturligt forekommende enzymtransportsystemer, der involverer celler, membranfragmenter eller individuelle dele, som er sammenknyttet in vitro eller ubundne i mediet. Derved kan man opnå en 5 amplifikation. Alternativt kan tilstedeværelsen af intakte celler eller cellefragmenter detekteres ud fra deres indflydelse på et redox-par.

I mange situationer vil det være af interesse at bestemme 10 tilstedeværelsen af en naturlig receptor i en fysiologisk væske, især blod eller plasma. Sædvanligvis vil denne receptor være et antistof, som hidrører fra en autoimmun lidelse, en fremmed substans eller en infektion. Antistoffet kan påvises i et "konkurrence-assay", hvor det 15 endogene antistof konkurrerer med et mærket antistof til det komplementære antigen, eller antistoffet kan tjene som en bro til at binde det mærkede antigen til et antigen, som er bundet til en overflade eller en partikel. I øvrigt vil dette antistof-assay i alt væsentligt følge de 20 teknikker, som anvendes til påvisning af antigener.

I visse situationer kan det være ønskeligt at råde over mono- eller dobbeltlag af lipider, som på covalent eller ikke-covalent måde er bundet til den fotoresponderende 25 overflade eller til en anden overflade, der kan anbringes i umiddelbar nærhed af den fotoresponderende overflade.

Man kan danne et enkelt lipid-lag ved anvendelse af alifatiske silylhalogenider eller -estere, hvor silylfor-bindelsen kan indeholde fra 1 til 3 alifatiske kæder, som 30 sædvanligvis omfatter fra omkring 12 til omkring 24 car-bonatomer, oftest fra omkring 12 til omkring 20 carbon-atomer. Der kan også være andre materialer til stede, der enten er bundet til en silylgruppe eller til den alifatiske kæde, herunder arylgrupper, funktionelle grupper 35 såsom carboxylgrupper, halogengrupper, aminogrupper eller lignende. Man kan derefter tilvejebringe det andet lag ved at neddyppe overfladen igennem et lipid-monolag og

UK 10/003 D I

28 derefter hæve overfladen horisontalt, således at det andet lag dannes ovenpå det første lag under dannelse af et dobbeltlag.

5 Det er muligt at anvende en lang række lamel-dannende li-pider, i særdeleshed phosphorlipider, som benyttes ved dannelse af liposomer og lignende. Alternativt kan man fremstille et dobbeltlag ved plasma-rensning af den pågældende overflade, idet man leder det tynde materiale 10 vertikalt igennem monolaget og trækker det ud med en hastighed, som er tilstrækkelig langsom til, at vandet kan løbe fra overfladen. Derefter skubbes det tynde materiale horisontalt igennem monolaget, hvorefter det dækkes med en dækstrimmel.

15

Dobbeltlagene muliggør en lateral diffusion inden i laget, Man kan frembringe forskellige grupper bundet til lipider, som specifikt vil binde sig til en analyt, eksempelvis antistoffer. Man kan også tilvejebringe flu-20 orescerende midler og reaktions-standsende midler bundet til antistoffer, som er specifikke for forskellige antigener på en celleoverflade. Cellens tilstedeværelse vil bringe disse reaktions-standsende forbindelser og fluorescerende midler sammen, hvorved enhver forekomst af 25 fluorescens inhiberes efter magnetisering af dobbeltlaget. Når lyset, som udsendes af det fluorescerende middel, nærmer sig energien svarende til ledningsbåndgabet, og især når lyset, som anvendes til magnetisering, er parallelt med den fotoresponderende overflade, vil den 30 mængde lys, som rammer overfladen, have relation til tilstedeværelsen eller fraværet af en celle, hvor de antige-niske steder er knyttet til antistofferne, som er bundet til dobbeltlaget. Det er ikke væsenligt, at lyset er parallelt med den fotoresponderende overflade, idet det 35 er tilstrækkeligt, at lyset enten er vinkelret på overfladen eller befinder sig i en vinkel til overfladen, ved hvilken der opnås en væsentlig formindskelse af sig- DK 167885 B1 29 nalet, når cellen der indeholder komplementære anti-geniske steder, er til stede og binder sig til de antistoffer, som er til stede i dobbeltlaget, og resulterer i udslukning.

5

Anvendelsen af dobbeltlag kan også kobles med ionophorer som mærkninger, idet disse ionophorer gør det muligt at transportere ioner igennem dobbeltlaget til den fotoresponderende overflade. Ionophorerne kan således kobles 10 til specifikke bindingspartnere, f.eks. ligander eller receptorer, der kan binde sig specifikt til deres komplementære partner, der er bundet til dobbeltlaget. Tilstedeværelsen af frie ionophorer vil modulere fotoresponsen, som skyldes den forøgede koncentration af ioner i umid-15 delbar nærhed af overfladen. Som eksempler på illustrative ionophorer kan anføres mellitin, nonactin, valinomy-cin, alamethicin, krone-ethere og lignende.

Ud over haptener, proteiner og saccharider kan man også 20 påvise nucleinsyrer ved den omhandlede fremgangsmåde. Nu-cleinsyrer, enten RNA eller DNA, kan påvises ved hybridi-sering med prøver, som indeholder komplementære sekvenser på konkurrerende eller ikke-konkurrerende måde. Ved den konkurrerende måde kan en nucleinsyresekvens være bundet 25 til en overflade. En prøve, som mistænkes for at indeholde den komplementære sekvens, kan kombineres med en mærket komplementær sekvens, eksempelvis mærket med biotin. Blandingen kombineres derefter med det overfladebundne polynucleotid under hybridiserende betingelser, hvorefter 30 de ikke-specifikt bundne oligonucleotider fjernes. Der kan derefter tilsættes et enzym-avidin-konjugat, idet avidinet binder sig til eventuelt tilstedeværende biotin. Tilstedeværelsen af et specifikt bundet enzym kan derefter påvises i overensstemmelse med de tidligere beskrevne 35 metoder.

DK 167885 B1 30

Alternativt kan en prøve, som indeholder et større antal mikroorganismer, udspredes på en passende nærende agargel og klones. Idet man anvender Grundstein-Hogness-teknikken, overfører man cellerne til en porøs nitrocellulose-5 film, som på passende måde registrerer cellernes position på gelen, og efter lysering af cellerne fikseres DNA'et til filmen ved opvarmning. De prøver, der indeholder en komplementær sekvens til en enkelt sekvens af organismen af interesse, frembringes i form af partielle enkelt-10 strenge med en dobbeltstrenget 3’-terminal, der indeholder en sekvens, som specifikt genkendes af et protein, eksempelvis repressor, rho, N-proteinet af lambda eller lignende. Filmen bringes i kontakt med prøven under hy-bridiserende betingelser, f.eks. en 50% vandig saltopløs-15 ning af dimethylformamid, hvorefter den hybridiserende opløsning fjernes. Når filmen er vasket, kan en opløsning af den specifikke bindingsreceptor mærkes med et antal catecholer. Efter et tidsrum, som er tilstrækkeligt til, at det mærkede protein kan binde sig, vaskes filmen fri 20 for ikke-specifikt bundet protein og anbringes i tæt sammenstilling med den fotoresponderende overflade. Derefter tilsættes en borsyreopløsning, og pH bestemmes på individuelle steder, som er forbundet med hver klon, ved bestråling af klonerne. Surhedsgraden af den kompleks-25 bundne borsyre benyttes til at skelne tilstedeværelsen af de mikroorganismer, der har interesse.

Mikroorganismerne kan også benyttes til at måle tilstedeværelsen af en biostat eller et biocid i et medium. Ved 30 at kombinere mediet med voksende mikroorganismer i sam menligning med en standard, som kun afviger ved fraværet af mediet, kan tilstedeværelsen af et biocid fastslås.

Ved at anvende uforgængelige pattedyrceller, f.eks. tu-morceller, kan tilstedeværelsen af vækstregulatorer også 35 påvises.

DK 167885 B1 31

Endelig kan man bestemme strømningshastigheden af et medium ved at bestemme strømningspotentialet, eksempelvis den tribogalvaniske effekt.

5 De efterfølgende eksempler er illustrative eksempler på den praktiske anvendelse af fremgangsmåden ifølge opfindelsen. Anordningen, som enten omfatter en enkelt overflade eller et antal individuelle ikke-tilgrænsende overfladeenheder, er forsynet med afgrænsninger, således at 10 man kan isolere individuelle arealer eller afsnit. En film anbringes i umiddelbar nærhed af overfladen, som indeholder lectiner, der er specifikke for et bestemt monoeller oligosaccharid. Antistofferne modificeres med det pågældende saccharid, og antistoffer for det samme eller 15 for forskelige ligander introduceres i hvert afsnit, hvorefter overskuddet vaskes væk. Derefter indføres en prøve, som overskyller skillevæggene imellem hvert afsnit, hvorved enhver komplementær ligand bliver bundet i det pågældende afsnit. Prøven vaskes væk, hvorpå der 20 tilsættes en blanding af antistoffer, som binder sig til de enkelte eller mangfoldige ligander, der er bundet til antistofferne i de enkelte afsnit. Disse antistoffer hidrører alle fra en enkelt kilde, eksempelvis fra mus. Opløsningen af antistofferne vaskes, hvorefter der til-25 sættes et konjugat af et enzym med kanin-antistof for muse-immunoglobulin, og dette konjugat får lov at overskylle væggene imellem afsnittene og at binde sig til eventuelt tilstedeværende muse-immunoglobulin i de enkelte afsnit. Det ikke-specifikt bundne enzym kan derefter 30 vaskes væk, og den enzymatiske aktivitet i hvert afsnit kan bestemmes ved at sætte et substratmedium til hvert afsnit, hvilket medium frembringer et produkt, som kan bestemmes ved fotorespons, eksempelvis pH-ændring, farve-absorption eller lignende.

En anden teknik involverer en gel, hvor forskellige antistoffer er til stede i intervaller på omkring 2 mm. Denne 35 32

Ulv ID/OOO D I

gel fremstilles med en saltopløsning og er af hensyn til den elektriske kommunikation i kontakt med en saltopløsning. Gelen bringes derefter i kontakt med prøven, som indeholder konjugater af ligander af interesse, idet 5 mærkningen er et fluoriserende middel med lang levetid, eksempelvis et europium-chelat. Mængden af det fluorescerende middel, som er til stede på det enkelte sted i gelen, vil være omvendt proportional med den tilstedeværende mængde af liganden. Efter fjernelse af eventuelt 10 ikke-specifikt bundet fluoriserende middel bestråles de individuelle steder, og signalet observeres, efter at bestrålingen er stoppet og det fluorescerende lys er udsendt.

15 I en anden udførelsesform tilvejebringes individuelle lysledende enheder, som indeholder antistoffer, der er bundet covalent til overfladen af hver enhed via en si-lyl-substitueret alifatisk carboxylsyre. Prøven bringes derefter i kontakt med antistoffet, hvorefter prøven 20 vaskes bort, og der tilsættes enzym-konjugeret antistof.

Efter en tilstrækkelig bindingstid fjernes det ikke-spe-cifikt bundne enzym, og der tilsættes en fremkalderopløsning, som producerer NADH. Den mængde NADH, som produceres af enzymet, kan indirekte reoxideres af den lysføl-25 somme elektrode, således at NAD'et kan recirkuleres.

Dannelseshastigheden for NADH har relation til fotoresponsen som et resultat af en fotooxidation.

Man kan anvende forskellige kredsløb til at bestemme til-30 standen af det medium, der befinder sig i umiddelbar nærhed af overfladen. Ud over den lysfølsomme føleelektrode skal der være mindst en modelektrode, fortrinsvis to modelektroder, og der kan være en modelektrode for hvert afsnit eller hver kanal i anordningen. Den samme elek-35 trode eller en anden elektrode kan tjene som kontrol eller referenceelektrode.

DK 167885 B1 33

Man kan benytte forskellige elektroder fremstillet af en række forskellige materialer, så længe elektrodematerialerne ikke på uheldig måde påvirker den fotoresponderende elektrode, og så længe elektrodematerialerne ikke i 5 uheldig retning påvirkes, og fortrinsvis ikke er følsomme over for det elektrisk kommunikerende medium, som elektrodematerialerne heller ikke må påvirke i uheldig retning. Som illustrative elektroder kan anføres sådanne materialer som platin, rhodium, palladium, sølv/sølvchlo-10 rid, calomel, ledende glaselektroder (Sni^, InC^ eller ITO) etc. I nogle tilfælde kan det være ønskeligt at indeslutte elektroden i et elektrisk kommunikerende hylster, eksempelvis gelatine.

15 I en udførelsesform for opfindelsen omfatter anordningen tre elektroder, nemlig føleelektroden, en referenceelektrode og en kontrolelektrode. Potentialet imellem føleelektroden og referenceelektroden kan varieres ved at variere det potential, som påtrykkes kontrolelektrode, i 20 forhold til føleelektroden. Den lysemitterende diode eller en anden lyskilde forsynes med spænding fra et ydre elektronisk kredsløb, således at der udsendes lys, som i et regelmæssigt mønster, eksempelvis firkantbølger, sinusbølger eller lignende, varierer i intensitet med ti-25 den, hvilket resulterer i en tidsafhængig respons hos føleelektroden, som kan påvises ved at måle den strøm igennem kontrolelektroden, der kræves for at opretholde et konstant potential imellem følelektroden og referenceelektroden.

30 I denne konfiguration vil top-til-top-amplituden af den periodisk varierende strøm igennem kontrolelektroden variere som funktion af de kemiske omgivelser omkring føleelektroden og som funktion af det potential, som påtryk-35 kes imellem føleelektroden og kontrolelektroden. Denne konfiguration kan forenkles yderligere ved at kortslutte ledningerne til kontrol- og referenceelektroderne og DK 167885 B1 34 fjerne referenceelektroden fra kredsløbet.

På tegningens fig. 1 ser man, at halvlederelektroden 10 er anbragt i overfladen af et vandigt medium 12. Lednin-5 gen 13 og potentiostaten 11, som f.eks. er en Model 363 Potentiostat/Galvenstat PAR (Princeton Applied Research), forbinder halvlederelektroden 10 med referenceelektroden 14 og kontrolelektroden 15. Potentiostaten 11 leverer en polariserende strøm igennem kontrolelektroden 15 og føle-10 elektroden 10, som opretholder et konstant potential imellem føleelektroden og referenceelektroden 14. Den strøm, som kræves for at opretholde et fast potential imellem elektroderne 10 og 14, registreres som en spænding på voltmeteret 16. En LED-lyskilde 32 kontrolleres 15 af pulskredsløbet 34, således at der udsendes regelmæssige impulser med en på forhånd fastlagt frekvens. Ved drift af anordningen vil lyset fra LED-lyskilden 32 f.eks. passere igennem mediet 12 og ramme overfladen af elektroden 10. En ændring i potentialet imellem føle-20 elektroden 10 og kontrolelektroden 15 frembringes ved, at lyset rammer overfladen af føleelektroden 10. Denne ændring i potentialet vil variere som funktion af de kemiske omgivelser i nærheden af det sted på følelektroden 10, som påvirkes af lyset. Strømmen fra potentiostaten 11 25 indstilles således, at disse ændringer udlignes, og der opretholdes et konstant potential imellem føleelektroden 10 og kontrolelektroden 15. Ændringen i denne strøm, som måles med måleinstrumentet 16, er således en funktion af ændringen i de kemiske omgivelser i nærheden af det sted, 30 der testes. Skiftende steder kan testes ved et antal metoder som beskrevet i det foregående, eksempelvis ved at rette lyset mod forskellige steder på forskellige tidspunkter. De kemiske omgivelser på et antal isolerede steder· på den enkelte elektrode 10 kan således testes ved 35 anvendelse af det på fig. 1 viste kredsløb.

35 DK 167885 B1 Målepunkterne kan isoleres, f.eks. ved at anvende en tynd siliciumplade som elektrode 10 til måling af pH-ændrin-ger. Den udtømmelsesregion, som dannes ved en pH-ændring i et punkt på siliciumpladen, vil ikke udstrække sig til 5 et separat punkt, hvorved det bliver muligt at opnå isolerede punkter.

Et andet kredsløb involverer en automatisk variation af potentialet imellem kontrolelektroden og føleelektroden, 10 således at der opretholdes en sinusstrøm med konstant amplitude igennem kontrolelektroden som respons på en sinusbølgeformet bestråling af føleelektroden. Variationer i de kemiske omgivelser i nærheden af føleelektroden kan således bestemmes ved at måle det potential, som 15 kræves for at opretholde en konstant strøm. Desuden tillader denne metode, at føleelektroden drives ved en optimal strøm, som sikrer en maksimal variation i potentialet som funktion af de kemiske omgivelser. En given ændring i de kemiske omgivelser vil således resultere i en maksime-20 ret potentialforskel.

Hvis man herefter betragter fig. 2, ser man, at der i det viste kredsløb indgår en tynd silicium-wafer 42, som tjener som føleelektrode, og en platinelektrode 43, som tje-25 ner som kontrolelektrode (modstande og kondensatorer omtales ikke specifikt, selv om de er afbildet på figuren). En operationsforstærker 44 omdanner den strøm, som passerer igennem de kontrollerende og p-dopede silicium-halvlederelektroder, til en spænding, og den fører signa-30 let til en båndpas forstærker 46, som er sammensat af 3 operationsforstærkere 50, 52 og 54. Båndpasforstærkeren 46 filtrerer den uønskede støj fra, mens den sinus-frekvens, som benyttes til målingen, får lov at passere. Signalet fra båndpasforstærkeren 46 føres til præcisions-35 ensretteren 56, som omfatter 2 operationsforstærkere 60 og 62 såvel som 2 dioder 64 og 66. Et variabelt RC-filter 70 er indskudt for at udjævne det ensrettede signal og DK 167885 Bl 36 bestemme kredsløbets responstid med hensyn til ændringer i de kemiske omgivelser omkring siliciumelektroden. Et negativt signal føres til kontrolforstærkeren 72, som omfatter potentiometeret 74 og operationsforstærkeren 76.

5 Udgangssignalet fra kontrol forstærkeren 72 tjener til at kontrollere potentialet ved platinelektroden 43. Det negative signal, som føres til kontrol forstærkeren 72, er knyttet til amplituden af vekselstrømmen igennem Pt- og Si-elektroderne i respons til sinusbølge-bestrålingen af 10 Si-elektroden 42. Med henblik på registrering føres udgangssignalet fra kontrolforstærkeren 72 til enhedsforstærkeren 77, som gør det muligt at kontrollere registreringsanordningens basisværdi. Udgangssignalet 78 fra forstærkeren 77 viser den mængde feed back, som føres til 15 platinelektroden 43, og det er en funktion af de kemiske omgivelser i nærheden af føleelektroden 42.

Når forskellige steder således bestråles med regelmæssige sinusbølge-impulser på overfladen af den tynde silicium-20 wafer, vil registreringsanordningen reagere ved at aflæse det potential imellem Pt- og Si-elektroderne, som er nødvendigt for at opretholde en vekselstrøm med konstant amplitude imellem Pt- og Si-elektroderne. Dette kredsløb betegnes CAM, hvilket står for "constant amplitude mo-25 dule". Dele af kredsløbet, som ikke er vist, sørger for, at silicium-waferen bestråles med lys med sinusbølgeform i overensstemmelse med et på forhånd fastlagt mønster.

Et tredje generelt kredsløb, som kan anvendes, omfatter 30 en automatisk variation af LED-udgangssignalets top-til-top-amplitude, således at der opretholdes en konstant fotorespons hos føleelektroden ved et konstant potential imellem føleelektroden og kontrolelektroden. I denne konfiguration er det påviste signal, som er følsomt for om-35 givelserne ved føleelektroden, den top-til-top-strøm, som passerer igennem LED-lyskilden.

37 DK 167885 B1 Når man anvender kapacitans som den elektriske respons, kan man bestemme ændringen i kapacitans i relation til en ændring i den strøm, der opstår som følge af en ændring i prøvemediets kapacitans.

5

Fig. 3 viser et tværsnit af en udførelsesform for en anordning, som består af en tynd silicium-wafer 80 (svarende til føleelektroden 10 på fig. 1) forbundet til et kredsløb (såsom kredsløbet vist på fig. 2)) via tråden 10 82. Anordningen er anbragt i en beholder 84, som består af et antal afsnit 86, hvori der findes forskellige prøver til analyse. Væggene 88, der adskiller disse afsnit, har en generel tykkelse på mellem ca. 0,5 og ca. 5 mm. Når der foregår en reaktion i hvert af afsnittene, 15 især når der foregår en reaktion i nærheden af waferens overflade, frembringes et produkt, som diffunderer til waferens overflade 90. Når der f.eks er tale om en redoxreaktion, vil de redox-produkter, som produceres i et givet afsnit, bevæge sig til overfladen 90 og påvirke 20 overfladens fotorespons, enten ved at reagere eller ved at tilvejebringe et overfladepotential. På denne måde er der kun en relativt lille vekselvirkning imellem de signaler, der opnås fra de forskellige steder på waferens overflade 90, som står i forbindelse med de enkelte af-25 snit 86. Et transparent eller semi-transparent vindue 93 er adskilt fra siliciumoverfladen 90 ved hjælp af støtter 94. Der findes et lille mellemrum 95 imellem overflade 90 og væggene 88, således at væsken kan passere igennem de enkelte afsnit og derved tilvejebringe en elektrisk 30 kommunikation imellem siliciumelektroden 80 og platin elektroderne 97. Afsnittene 99 vil ikke blive påvirket af ændringer i afsnittene 86, hvorved sammensætningen af opløsningen holdes i det væsentlige konstant under analysen. En række af LED-lyskilder 92 sørger for en sekvens-35 vis belysning igennem afsnittene 86 til et tilknyttet sted på overfladen 90. Signalet aflæses i forbindelse med belysningsperioden. Således benyttes den enkelte silici- DK 167885 Bl 38 umplade 80 til at måle de kemiske omgivelser på et antal forskellige steder. Afslæsningen og registreringen af de forskellige signaler på forskellige tidspunkter kan foretages manuelt eller ved at anvende en mikrodatamat 5 eller lignende.

Fig. 4 er et delvis gennemskåret skematisk billede, hvor man fra oven ser en anordning, der omfatter et antal kanaler. Kabinettet 100 er forsynet med et antal kanaler 10 102, som omfatter en indløbsforgrening 104 og en udløbs forgrening 106. Anordningen omfatter en enkelt referenceelektrode 108 samt et antal kontrollerende modelektroder 110, som er anbragt på den indre overflade af vinduet 111. Et antal tilledningsåbninger 112, som er forbundet 15 med hver af kanalerne, gør det muligt at indføre prøven i en bestemt kanal. Prøven blander sig med prøvemediet fra forgreningen 104, og blandingen løber igennem kanalen 102. Kanalens basis er en lysfølsom elektrode 114. Efter prøven kan man indføre en luftblære for at skille prøve-20 blandingen fra den efterfølgende væske. Der opstilles en række af LED-lyskilder, som ikke er vist, og som oplyser hver af kanalerne langs disses længde, således at et eller flere steder i hver kanal 102 kan blive bestrålet. En lysfølsom elektrode 114 er i kontakt med de strømme af 25 prøvemediet, som passerer igennem kanalerne 102 og udfylder disse, således at de er i kontakt med modelektroderne 108 og 110.

På denne måde kan man anvende en homogen prøveteknik, som 30 gør brug af et enzym, der katalyserer den reaktion, som resulterer i en ændring i pH eller redox-potentialet i prøvemediet. Reaktionshastigheden i hver kanal kan bestemmes ved at foretage sekvensvise aflæsninger som funktion af tiden i de samme eller i forskellige punkter.

35 Reaktionshastigheden kan bestemmes ved at foretage sekvensvise aflæsninger, efterhånden som prøvemediet passerer igennem kanalen, i forskellige punkter langs kanalen.

39 DK 167885 B1

Man kan således bestemme hastigheden af ændringen af den enzymatiske aktivitet i hver kanal og sætte denne hastighed i relation til koncentrationen af analyt i prøvemediet. Den kontinuerlige strømning af prøvemedium 5 igennem kanalen kan tjene til at vaske denne og rekonstituere den til den næste bestemmelse. Alternativt kan man, ved at anvende forskellige ventiler, udskifte mediet med en vaskeopløsning, således at man kan rekonstituere kanalen til dennes oprindelige tilstand.

10

Fig. 5 er et skematisk billede af en lysfølsom overflade, som omfatter et antal steder, der er isoleret fra hinanden, men som er forbundet til en fælles samleskinne, således at overfladen indeholder adskilte afsnit til prøve-15 mediet. Anordningen omfatter en beholder 120, som på figuren kun har en række af lysfølsomme halvledere 122. De lysfølsomme halvledere er i elektrisk kontakt med en fælles samleskinne 124, der via ledningen 126 er forbundet til et passende kredsløb (såsom kredsløbet vist på 20 fig. 2). Et antal rør 130, som er forbundet med tilledninger 132, gør det muligt at indføre opløsninger i afsnittene 134. Hvert af disse afsnit er adskilt fra de øvrige ved skilleanordninger 136. Rørene 130 er forsynet med tregangshaner 140, hvorved det bliver muligt at ind-25 føre eller fjerne vaskeopløsninger eller andre fælles opløsninger ved hjælp af tilledningskanalen 142. Ved passende manipulation af ventilerne 140 kan den samme opløsning indføres i eller fjernes fra hvert af afsnittene samtidigt, hvilket sikrer ensartethed. Hvert afsnit er 30 forsynet med et individuelt prøvetilledningsrør 144, således at prøveopløsningen indføres direkte i et afsnit 134 uden at blive forurenet med andre prøver. Der anvendes en fælles modelektrode 146, som er indført et antal forskellige steder for at gøre det muligt at opnå en 35 gennemsnitsærdi. Disse elektroder er forbundet til kredsløbet (ikke vist), hvortil den fælles samleskinne også er forbundet. En LED-række 150 er forsynet med individuelle DK 167885 B1 40 LED-lyskilder 152, som reguleres således, at de sekvensvis belyser afsnittene i anordningen i overensstemmelse med et på forhånd fastlagt mønster, hvorved det observerede signal kan sættes i relation til et specifikt 5 afsnit. Hver af de lysfølsomme anordninger 122 er belagt med et specifikt bindingslag, som er vist ved den mørke linie 154. Af hensyn til det efterfølgende eksempel er dette lag et saccharid-lag, hvortil der findes et specifikt lectin.

10

En analyse kan gennemføres på følgende måde: Idet man anvender forgreningssystemet 156, indstiller man ventilerne 140 på en sådan måde, at en opløsning, der indeholder et enzym, såsom acetylcholinesterase konjugeret til lectin, 15 samtidigt kan indføres i hvert af afsnittene igennem tilledningsrørene 132. Efter en tilstrækkelig inkubationstid udtages opløsningen igennem tilledningsrørene 132, og hvert af afsnittene vaskes med en passende bufret vaskeopløsning. Der fremstilles individuelle prøveopløsninger, 20 der indeholder en ukendt prøve eller standard, et antistof til en analyt, f.eks. morfin og et morfin-konjugat til en acetylcholinesterase-inhibitor, f.eks. morfin-fluorphosphonat, methyl, ethoxy, thiophosphater etc. Man kan også inkludere et acetylcholinesterase-substrat og 25 bufre opløsningen forsigtigt til pH 7. Hvert af afsnittene i anordningen vil derefter være delvis fyldt med den let bufrede opløsning, hvorefter en indføring af prøven igennem indføringsrørene 144 og 132 vil bevirke, at de enkelte afsnit flyder over, således at der er en ensartet 30 elektrisk kontakt med modelektroderne 146.

Hydrolysen af acetylcholin resulterer i en dannelse af eddikesyre, som vil ændre pH i det medium, der grænser op til den lysfølsomme overflade. Den mængde enzym, som 35 inhiberes, vil være direkte proportional med mængden af analyt i prøven, eftersom enzym-inhibitor-konjugatet, som er bundet til antistoffet for analytten vil være inaktivt DK 167885 B1 41 med hensyn til at inhibere enzymet. Efter et tidsrum, der er tilstrækkeligt til at reaktionen kan indtræde, således at der opnås et detekterbart signal i koncentrationsområdet af interesse, bestråles afsnittene sekvensvis, og 5 signalerne detekteres ved hjælp af et kredsløb (ikke vist). Efter et tilstrækkeligt tidsrum, hvor man vil have foretaget en eller flere aflæsninger, afslutter man bestemmelsen ved at udtage opløsningerne fra hvert af afsnittene igennem tilledningsrørene 132 og 142 ved at dre-10 je hanerne 134, således at hvert af tilledningsrørene 132 forbindes med røret 142. Efter fjernelse af prøvemedierne og afvaskning af de enkelte afsnit kan man gentagne gange indføre en koncentreret saccharid-opløsning i hvert af afsnittene, indtil hele mængden af enzymet er blevet 15 fjernet fra overfladen. Derefter vaskes afsnittene med en vaskeopløsning, således at hele mængden af ubundet sac-charid fjernes, hvorpå man indfører enzym-leetin-konju-gatet for at rekonstituere afsnittet til den oprindelige tilstand med henblik på at gennemføre en ny analyse.

20

De i det følgende beskrevne eksperimenter blev gennemført for at demonstrere anvendelsen af anordningen til at overvåge 3 forskellige karakteristika for flydende medier: Det første af disse karakteristika er pH, det andet 25 er tilstedeværelsen af molekyler, der kan deltage i redox-reaktioner, og det tredje er tilstedeværelsen af lysabsorberende specier i lysstrålen. Det vises endvidere, at signalerne modificeres specifikt af kemiske forbindelser, som grænser op til det belyste sted på den 30 tynde silicium-wafer, og at tilstedeværelsen eller fraværet af lignende forbindelser på tilgrænsende, men ikke-belyste steder har en virkning, der kan negligeres.

Medmindre andet er angivet, har man i de følgende eksemp-35 ler anvendt den CAM-kontrollerede anordning sammen med en enkelt lysfølsom halvlederelektrode bestående af to væskefyldte kanaler med åbne ender i umiddelbar nærhed af DK 167885 B1 42 overfladen. Halvlederelektroden er en Plll 7-14 ohm "Pen Prime" bor-dopet tynd silicium-wafer med en diameter på ca. 5 cm, hvilken wafer er fastloddet til en kobbertråd, idet den elektriske kontakt frembringes ved hjælp af en 5 indium-gallium-blanding. For at konstruere kanalerne fastgør man den tynde silicium-wafer til en tynd, optisk klar plade af granat-mineral ved hjælp af 3 strimler af tape, som er forsynet med klæbestof på begge sider, og som har en tykkelse på 70 um. Denne dimension svarer 10 således til dybden af kanalerne, idet de andre dimensioner er en bredde på 0,5 cm og en længde på 3 cm. Granatoverfladen, som udsættes for eksponering, dækkes derefter med optisk ugennemskinneligt sort elektrisk tape, undtagen på 2 steder med et areal på 25 mm2. Disse 2 trans-15 parente steder ligger hver især opad den ene af de 20 kanaler og den ene af 2 LED-lyskilder. Denne konfiguration muliggør en sted-specifik (og kanalspecifik) belysning af den overfor liggende kontinuerlige siliciumoverflade. Halvlederelektroden anbringes i position på en 20 sådan måde, at de 2 kanaler begge er neddyppet nogle få mm i det samme bad bestående af 40-50 ml 0,1 M phosphat-buffer, ph 6,7-6,8. Platinelektroden er enten anbragt i det samme bad eller i et tilgrænsende bad bestående af 40-50 ml 0,1 M phosphat-buffer, hvortil der eventuelt 25 (især med henblik på redox-målinger) kan være sat K4[Fe(CN)6] til en koncentration på 0,2 mmol og K^EFeiCNjg] til en koncentration på 0,3 mmol (tilnærmelsesvis). I denne sidstnævnte udførelsesform er badet, som indeholder platinelektroden, forbundet til det bad, der 30 indeholder siliciumelektroden, ved hjælp af en saltbro bestående af en halvvejs mættet KC1-opløsning, som er bragt til at størkne ved hjælp af 2% agar. Det ioniske redox-par letter platinelektrodens reversibilitet, hvilket er et træk, som kan være væsentligt med hensyn til at 35 reducere fejlvisningen og forøge den elektriske stabilitet ved visse anvendelser.

DK 167885 B1 43 I den ovenfor beskrevne udførelsesform er det påtrykte potential typisk mellem -600 mV og -1000 mV, mens AC-fotoresponsen fastholdes på en på forhånd valgt værdi.

5 For at demonstrere anordningens anvendelse til måling af pH fremstillede man en række bestående af 6 bufrede saltopløsninger, hvis pH-værdier (som bestemt ved anvendelse af et Fisher Accumet pH-meter, Model 629) var 4,0, 5,0, 6,0, 7,0, 8,0 og 9,0. I alle tilfælde var bufferen 10 tilsat til en koncentration på 0,01 M, og koncentrationen af NaCl var 0,135 Μ. I de bufrede saltopløsninger, hvor pH var 4,0 og 5,0, var bufferen et acetat. I de bufrede saltopløsninger, hvor pH var 6,0 og 7,0, var der tale om en phosphatbuffer, og de i bufrede saltopløsninger, hvor 15 pH var 8,0 og 9,0, var bufferen TRIS. En kanal beliggende op ad silicium-waferen blev i rækkefølge fyldt med hver af de bufrede saltopløsninger og bestrålet, som tidligere beskrevet, ved hjælp af en LED-lyskilde. Man registrerede det påtrykte potential, som var nødvendigt for at opret-20 holde en konstant fotorespons. Dette påtrykte potential er stort set proportionalt med pH, idet hældningen -40 mV pr. pH-enhed. Når den anden kanal på lignende måde blev fyldt sekvensvis med bufrede saltopløsninger og be-strålét, opnåedes i alt væsentligt et identisk resultat.

25 En ændring af væskens pH i den ikke-belyste kanal påvirker ikke størrelsen af det påtrykte potential, som er nødvendigt for at opretholde en konstant fotorespons, når det belyste sted holdes ved en konstant pH-værdi. Det betyder, at responsen er specifik for den kanal, som bely-30 ses, og den kan derfor benyttes til at måle pH-variatio-ner på forskellige steder på den samme silicium-wafer. Udvælgelsen foretages ved at variere belysningsstedets beliggenhed.

35 Når anordningen holdes ved et konstant påtrykt potential, således at den målte respons er amplituden af den fotoinducerede vekselstrøm, opnår man analoge resultater ved DK 167885 Bl 44 at variere pH i forskellige områder af silicium-waferen.

Den kendsgerning, at den lysfølsomme elektrode kan registrere pH-gradienter på sin overflade, blev yderligere eftervist ved anvendelse af et fast påtrykt potential.

5 Der fremstilledes en vandig opløsning af 5% (w/w) gelatine i 0,15 M NaCl. Gelatinen blev afsat til en dybde på omkring 5 mm i en petri-skål af plast med en diameter på 100 mm. Der blev udskåret cirkelformede skiver af gelatine med en diameter på 1 cm, og disse skiver blev gen-10 nemvædet i buffere med pH-værdier på 4,0, 7,0 eller 10,0 natten over, hvorefter de igen blev anbragt i deres positioner i petri-skålene. En række bestående af 6 LED-lyskilder med samme lysintensitet blev anbragt ved bundens overflade i petri-skålene, således at de passede med 15 udskæringerne af gelatine. LED-lyskilderne blev pulseret ved en frekvens på 100 Hz, og fotoeffekterne blev registreret for hvert af de 6 områder med defineret pH-værdi som tidligere beskrevet. De fotoresponser ved vekselstrøm, som blev aflæst for pH 4, var 0,55 og 0,68 volt.

20 Ved pH 7 aflæstes 0,20 og 0,18 volt, og ved pH 10 fandt man 0,02 og 0,02 volt som top-til-top-værdier. I petriskålen anbragte man en opløsning i en elektrodebeholder, idet denne opløsning var i elektrisk kontakt med gelatinen, og den bestod af 0,15 M NaCl.

25

Ved at konstruere et større antal kanaler eller afsnit, som ligger tæt op ad silicium-waferen, kan man lettere sammenligne en eller flere "eksperimentelle" prøver med en eller flere "referenceprøver". Når man anvender den 30 ovenfor beskrevne anordning med 2 kanaler, som omfatter en tynd silicium-wafer og en tynd plade af granatmineral, bliver det muligt at overvåge begge kanaler på i det væsentlige kontinuerlig basis, idet man benytter en vekselvis belysning af de 2 steder som tidligere beskre-35 vet. Den fotorespons, som modificeres af referenceprøven, kan automatisk trækkes fra den respons, som modificeres af den eksperimentelle prøve, ved at belyse begge kanaler 45 DK 167885 B1 kontinuerligt med sinusformet lys, som er faseforskudt 180° og registrere amplituden af vekselstrømmen ved anvendelse af det på fig. 1 viste kredsløb, eventuelt med referenceelektroden og kontrolelektroden kortsluttet i 5 forhold til hinanden. Denne teknik har været benyttet til at måle væksten af bakterier på basis af deres evne til at reducere pH i deres omgivelser. Som standardopløsning benyttedes en næringsopløsning bestående af 0,85% NaCl, 0,75% glucose og 0,25% pepton, og dette næringsmedium in-7 3 10 deholdt 10 E. coli-celler pr. cm , fremstillet til sammenligningsformål. Næringsopløsningen blev ledt igennem standardkanalen, mens bakteriesuspensionen blev ledt igennem prøvekanalen på omtrent samme tidspunkt. Efter 20 minutters forløb kunne man notere, at der var sket et be-15 tydeligt fald i pH, hvilket viste sig ved en ændring af potentialet på 50 mV i tidsrummet fra 0-20 minutter. Systemet kan således anvendes til at påvise tilstedeværelsen af bakterier i et medium, som ellers skulle være bakteriefrit, og ved at anvende antistoffer til bestemte 20 mikroorganismer kan man tilvejebringe en specifik binding af mikroorganismerne, hvorefter man kan foretage en udvaskning for at fjerne de ikke-specifikt bundne mikroorganismer. På dette grundlag kan man bestemme, hvorvidt der har været nogen ændring i pH som funktion af tiden.

25 På tilsvarende måde har man undersøgt aktiviteten af et enzym (penicillinase), som fremkalder en reduktion i pH, når det indvirker på sit substrat (penicillin). Til denne undersøgelse anvendtes den samme teknik som ovenfor. Man 30 kombinerede 10 n/liter af en opløsning, der indeholdt forskellige koncentrationer (under 5 enheder/ml) af penicillinase i PBS, med en ml af en opløsning (1 mg/ml) af penicillin G i en opløsning af 10,5 mmol PO^, og 0,15 mol NaCl, -pH 8,3. Denne blanding blev bragt i kontakt med 35 anordningens lysfølsomme overflade. Referenceopløsningen indeholdt ikke penicillinase. Man anvendte kredsløbet fra fig. 1 med den ændring, at referenceelektroden og kon- DK 167885 B1 46 trolelektroden var indbyrdes kortsluttede. Grænsen for detektering var omkring 0,25 enheder/ml penicillinase, baseret på de ændringer i elektrisk respons, som skyldes ændringerne i pH. Når penicillinasen imidlertid blev ind-5 ført i høje koncentrationer (omkring 5 enheder/ml), blev den bundet til overfladen, og man kunne derefter anvende den bundne penicillinase til at bestemme koncentrationen af de opløsninger af penicillin, som senere blev tilsat.

Man kunne denaturere og/eller fjerne penicillinasen ved 10 at behandle overfladen med 1 N NaOH efterfulgt af 1 N HC1 og derefter vaske med PBS.

Med henblik på at demonstrere anordningens anvendelighed til at detektere lysabsorberende specier i lysstrålen 15 fastgjorde man mikroskop-objektglas til granat- mineralsiden af en sammensat wafer af silicium og granatmineral, idet man anvendte tape med klæbestof på begge sider. Dette tape blev anbragt på en sådan måde, at der konstrueredes endnu et sæt 70 ym kanaler (imellem granat-20 mineralet og mikroskop-objektglassene), som lå nøjagtig ovenpå det første sæt af kanaler (imellem silicium- og granat-pladerne). Det første sæt (som lå op ad siliciumpladen) blev fyldt med en phosphat-bufret saltopløsning med en pH-værdi på 6,8. Der fremstilledes forskellige 25 koncentrationer af et grønt farvestof, Schilling Food Color (en blanding af FD&C gul nr. 5 og FD&C blå nr. 1), som benyttedes til sekvensvis fyldning af det andet sæt af kanaler. Det påtrykte potential, som var nødvendigt for at opretholde en konstant tidsafhængig fotorespons på 30 belysning med LED-lamper med en bølgelængde på 655 nm, blev registreret (fig. 6). Ved anvendelse af Beer's lov fandt man, at det påtrykte potential udviste en lineær afhængighed af det indfaldende lys på overfladen af siliciumpladen, og denne lineære sammenhæng kan således 35 benyttes til måling af koncentrationen af lysabsorberende specier i lysvejen. Ved sammenligning af disse resultater med de resultater, som opnås ved hjælp af et Beckman DK 167885 B1 47 spektrofotometer, fandt man, at hvis vejlængden af de farvestof-indeholdende kanaler havde været 1 cm i stedet for 70 um, ville en ændring i koncentrationen svarende til 0DCCI- =1,00 (som målt på spektrofotometeret) have obo nm 5 medført en ændring i den påtrykte spænding på 90 mV som målt ved anvendelse af det omhandlede apparatur.

Med henblik på at demonstrere den omhandlede anordnings anvendelighed til måling af koncentrationen af oxiderende 10 (elektron-accepterende) molekyler og overvågning af re- dox-reaktioner foretog man de følgende eksperimenter: Reversibiliteten af platinelektroden blev lettet som tidligere beskrevet, og man anvendte en samling bestående af en tynd siliciumplade og en granat-mineralplade (med 2 15 kanaler). Der fremstilledes en redox-opløsning, som bestod af 0,033 M Fe(CN)6-4/Fe(CN)6-3, 0,1 M NaCl og 0,014 M phosphat. Denne redox-opløsning blev indført i anordningens kanaler. Man foretog en afbildning af det påtrykte potential i mV som funktion af logaritmen til kon- +2 +3 20 centrationsforholdet Fe /Fe , og herved opnåedes en ret linie med en hældning på 49 mV/enhed (fig. 7). Som tidligere beskrevet for pH-bestemmelsen modificeres den respons, som frembringes på det belyste sted, af redox-op-løsningen i kanalen, som ligger op imod dette sted, med 25 en negligerbar interferens frembragt af den opløsning med +2 +3 et andet Fe /Fe -forhold, som sættes til den parallelle, ikke-belyste kanal.

I et andet eksperiment blev forbindelsen methylenblåt 30 (MB) benyttet som elektron-overførende middel, som stod i forbindelse med silicium-waferen. Med mindre andet er angivet, var MB=indholdet 5 μg/ml, og fortyndingsmidlet var en phosphat-bufret saltopløsning i disse eksperimenter. Når man indfører MB i en mængde på 5 μg/ml i en ka-35 nal i silicium/granat-samlingen, registreres et forbigående (ca. 30 sekunder) påtrykt potential-signal på omkring -90 mV. Hvis der på forhånd er blandet NADPH i en DK 167885 B1 48 mængde på 1 mg/ml i MB-opløsningen, og hvis blandingen har fået lov at henstå i omkring 5 minutter (en lukket beholder, som kun indeholder en ringe mængde luft), er det registrerede forbigående signal omkring -8 mV. Ved at 5 anvende varierende koncentrationer af NADPH har man vist, at det er muligt at måle NADPH-koncentrationer ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen.

Det er også muligt at måle koncentrationen af enzymet 10 peberrod-peroxidase (HRPO) ved en tilsvarende teknik. Ved at anvende MB i en mængde på 5 ug/ml og i en mængde på 0,15% sammen med forskellige koncentrationer af HRPO (fra 0,005 til 50 ug/ml) kunne man registrere potentialsignaler, som holdt sig på høje værdier i adskillige mi-15 nutter. I et typisk eksperiment var det målte signal, som måltes 1 minut efter tilsætning af reagenser til anordningen, af størrelsesordenen -80 mV og -470 mV for HRP0-mængder på henholdsvis 0,005 og 50 ug/ml (med mellemliggende potentialværdier opnået for mellemliggende HRP0-20 koncentrationer). I modsætning hertil vil MB + ^°2 * fravær af HRPO frembringe et forbigående signal af 30 sekunders varighed, som er karakteristisk for MB alene, og som falder til basislinieværdien omkring 1 minut efter tilsætning til anordningen.

25

Hvis man sætter MB til mælk til en endelig koncentration på 5 ug/ml, og hvis man indfører denne blanding i anordningen ifølge opfindelsen, kan man opretholde et forhøjet potential-signal i mange minutter. Amplituden af 30 dette vedvarende signal reduceres signifikant, hvis der findes voksende E. coli-baterier i mælken. Dette viser, at man kan overvåge bakterievækst ved en sådan metode. Mælken udviste ikke nogen pH-ændring, hvilket blev fastslået' ved anvendelse af et pH-meter.

Man kan desuden anvende en sådan teknik til måling af koncentrationen af ^2°2' 1 et e^sPeriment, som er bereg- 35 49 DK 167885 B1 net til at illustrere dette, benyttedes MB og HRPO sammen, hver i en mængde på μg/ml. En tilsætning af H202 (i forskellige koncentrationer) forud for indføring af blandinger i anordningen, viste, at det forbigående sig-5 nal, som observeredes ved 6 am ^2Q2 i-15® mV)/ var omkring 50% større end det signal, som observeredes i fravær af H202 (-90 mV). I området 0-50 uM H202 kunne man observere forbigående signaler med amplituder, som varierede tilnærmelsesvis lineært med H202-koncentrationen.

10

En tilsvarende teknik har været anvendt til analyse af glucose. I dette tilfælde introduceredes glucose (i forskellige koncentrationer) til enzymet glucoseoxidase (GO) i en koncentration på 5 ug/ml, og blandingen hen- 15 sattes ved stuetemperatur i 40 minutter. Derefter tilsat tes MB og HRPO, således at der opnåedes en endelig koncentration på 5 μg/ml af hver substans, og opløsningerne blev i rækkefølge indført i anordningen. Ved en koncentration af glucose på 1,55 ug/ml (ca. 8 uM) var det 20 forbigående spændingssignal omkring 50% større end det signal, der observeredes i fravær af glucose.

Som det er sandsynligeort i det foregående, kan man foretage analytiske bestemmelser for substraterne af sådanne 25 enzymer som cholesteroloxidase, galactoseoxidase, uri- case, xanthinoxidase og lignende til et niveau, der er bedre end 10 uM, ligesom man kan analysere for enzymerne i sig selv. De ovenfor angivne enzymer er forbundet med H202-dannelse, men det er også muligt at analysere andre 30 enzymer, som ikke involverer dannelse af H202·

Fotosignalet fra redox-parret er kanal-specifikt. Forskellige redox-sammensætninger i forskellige kanaler kan bestemmes på en enkelt monolitisk overflade, og denne 35 bestemmelse kan ske samtidigt. Det er også muligt at måle et givet fænomen i en kanal, eksempelvis redox-reak-tioner, og et andet fænomen i en anden kanal, eksempelvis DK 167885 B1 50 pH-ændringer.

Som det klart fremgår af de ovenfor angivne resultater, råder man med fremgangsmåden og anordningen ifølge op-5 findelsen over en nøjagtig, hurtig og effektiv metode til måling af en lang række forskellige materialer i et medium, der er i stand til at modulere en elektrisk fotorespons. Anordningen ifølge opfindelsen kan tilpasses til brug med væsker, geler og faste materialer. Anordningen 10 kan anvendes til i det væsentlige samtidigt at måle et stort antal prøver, idet der opnås hurtige udlæsninger, hvilket gør det muligt at opnå resultater i rigelige antal, således at der sikres nøjagtige resultater, og således at der samtidig kan opnås en standardisering af 15 bestemmelserne. Fremgangsmåden ifølge opfindelsen kan anvendes med et statisk (ikke-strømmende) medium såvel som med et dynamisk (strømmende) medium. Desuden kan fremgangsmåden anvendes til bestemmelse af hastigheder.

Man kan overvåge eller analysere forskellige typer af se-20 parationsteknikker, såsom elektroforese, "Southern blot", pletdannelse eller lignende, hvor specifikke punkter kan defineres i overensstemmelse med variationer i signaler og position på en overflade.

25 30 35

Claims (28)

1. Fotoresponderende anordning til i et flydende medium at bestemme tilstedeværelsen, mængden eller koncentrationen af en substans, kendetegnet ved, at den omfatter: et elektrisk fotoresponderende element (10, 80, 114, 10 122); en beholder (12, 84, 100, 120) til at holde det flydende medium i kontakt med det fotoresponderende element; en elektrode (15, 97, 108, 146) til at påtrykke et potential på det fotoresponderende element gennem det flydende 15 medium; en strålingskilde (32, 92, 152) til bestråling af det fotoresponderende element og midler (11, 16) til måling af tilstedeværelsen, mængden eller koncentrationen af substansen som funktion af 20 responsen af det fotoresponderende element under bestrå lingen.

2. Anordning ifølge krav 1, kendetegnet ved, at strålingskilden er en LED-kilde (32, 92, 150) program- 25 meret til at give regelmæssige lysimpulser.

3. Anordning ifølge krav 1 eller 2, kendetegnet ved, at det fotoresponderende element omfatter en fotoresponderende halvleder. 30

4. Anordning ifølge krav 3, kendetegnet ved, at halvlederen er en monolitisk dopet halvleder-wafer (10, 42, 80).

5. Anordning ifølge krav 4, kendetegnet ved, at strålingskilden er således placeret, at den bestråler den meget tynde wafer fra den side, der vender bort fra DK 167885 B1 mediet.

6. Anordning ifølge krav 5, kendetegnet ved, at waferen har en tykkelse på mellem 0,05 og 2 am. 5

7. Anordning ifølge ethvert af kravene 3-6, kendetegnet ved, at det fotoresponderende element inkluderer et klart lag, der er anbragt parallelt med og i meget kort afstand fra halvlederen. 10

8. Anordning ifølge ethvert af de foregående krav, kendetegnet ved, at det fotoresponderende element er forsynet med en belægning på den overflade, der er i kontakt med mediet, hvilken belægning omfatter en 15 matrix til polær vekselvirkning eller kompleksdannelse med mediet.

9. Anordning ifølge krav 8, kendetegnet ved, at belægningen inkluderer et polymeriseret lipid-dob- 20 beltlag.

10. Anordning ifølge ethvert af de foregående krav, kendetegnet ved, at den omfatter et antal steder, hvor det fotoresponderende element er anbragt, 25 idet måleanordningen er indrettet til at måle på hvert af disse steder.

11. Anordning ifølge krav 10, kendetegnet ved, at der findes skillevægge i beholderen, som danner en 30 kanal (102) for mediet, idet målestederne er anbragt langs kanalen for at muliggøre progressive bestemmelser over dennes længde.

12. Anordning ifølge krav 10, kendetegnet ved, 35 at afsnittene (134) i en beholder (120) har en fælles elektrode (146), og at de hver især belyses af en lyskilde (152) fra en række (150) af lyskilder. DK 167885 B1

13. Anordning ifølge krav 12, kendetegnet ved, at lyskilderne (152) er arrangeret på en sådan måde, at målestederne belyses i rækkefølge.

14. Anordning ifølge ethvert af de foregående krav, kendetegnet ved, at midlet til påtrykning af et potential på det fotoresponderende element omfatter et middel til at gennemlede en fotostrøm, og at midlet til at måle fotostrømmen omfatter et middel til at måle det 10 potential, der kræves for at få en given fotostrøm til at bevæge sig eller for at inkubere fotostrømme.

15. Anordning ifølge ethvert af kravene 1-10, kendetegnet ved, at midlet til påtrykning af et poten-15 tial på det fotoresponderende element omfatter en indretning til frembringelse af et sådant potential, og at midlet til måling af fotoresponsen omfatter en indretning til måling af fotostrømmen ved et givet potential. 20

16· Fremgangsmåden til i et flydende medium at foretage bestemmelser af tilstedeværelse, mængde eller koncentration af en given substans, kendetegnet ved, at man: bringer det flydende medium i kontakt med et fotore-25 sponderende element (10, 80, 114, 122)? påtrykker et potential mellem det fotoresponderende element og en elektrode (15, 97, 108, 146); bestråler det fotoresponderende element (10, 80, 114, 122. med en strålingskilde (32, 92, 152) til frembringel-30 se af en elektrisk fotorespons; måler den ved bestrålingen frembragte fotorespons og foretager den ønskede bestemmelse af tilstedeværelse, mængde eller koncentration af substansen ud fra responsen fra det fotoresponderende element.

17. Fremgangsmåde ifølge krav 16, kendetegnet ved, at substansen er resultatet af en enzymatisk 35 DK 167885 B1 reaktion.

18. Fremgangsmåde ifølge krav 16 eller 17, kendetegnet ved, at det fotoresponderende element (10, 5 80, 114, 122) inkluderer et klart lag.

19. Fremgangsmåde ifølge krav 16 eller 18, hvorved det elektrisk fotoresponderende element inkluderer en bindende overflade, der er specifik med hensyn til at binde en 10 del af et første specifikt bindingspar bestående af en ligand og receptor, kendetegnet ved, at man anvender en mærket substans, hvor mærkningen påvirker den elektriske respons af elementet (10, 80, 114, 122) ved bestråling, hvilken substans enten er en del af det før-15 ste bindingspar eller binder sig direkte eller indirekte til en del af dette par.

20. Fremgangsmåde ifølge ethvert af kravene 16-19, kendetegnet ved, at den målte respons er den 20 strøm, der kræves for at holde et potential mellem elementet og elektroden konstant imellem bestråling og ikke-bestråling af elementet.

21. Fremgangsmåde ifølge ethvert af kravene 16-19, 25 kendetegnet ved, at den målte respons er den potentialændring imellem elementet og elektroden, der kræves for at opretholde en sinusformet strøm med konstant amplitude gennem denne i respons til en sinusformet variation i bestrålingen af elementet. 30

22. Fremgangsmåde ifølge ethvert af kravene 16-19, kendetegnet ved, at den målte respons er ændringen i top-til-top amplituden af strålingskildens udgang ved et konstant potential mellem elementet og 35 elektroden. DK 167885 B1

23. Fremgangsmåde ifølge ethvert af kravene 16-22, kendetegnet ved, at den gennemføres to steder på det fotoresponderende element.

24. Fremgangsmåde ifølge krav 23, kendetegnet ved, at der gennemføres to separate bestemmelser i alt væsentligt samtidigt på de to forskellige steder.

25. System til anvendelse ved fremgangsmåden ifølge krav 10 19 omfattende et hapten-konjugeret antistof, kende tegnet ved, at haptenet er reciprokt til en del af et specifikt bindingspar bundet til en fast overflade, og et mærket antistof, hvori mærkningen direkte eller indirekte er i stand til at påvirke det elektriske fotore- 15 spons-signal, som opstår ved bestråling af det fotoresponderende element.

26. System ifølge krav 25, kendetegnet ved, at liganden omfatter biotin bundet til en fast overflade. 20

27. System ifølge krav 26, kendetegnet ved, at receptoren inkluderer avidin.

28. System ifølge krav 26 eller 27, kendetegnet 25 ved, at den mærkede substans binder sig indirekte til liganden. 30 35