DK162239B - Fremgangsmaade til fremstilling af inosin og/eller guanosin - Google Patents

Fremgangsmaade til fremstilling af inosin og/eller guanosin Download PDF

Info

Publication number
DK162239B
DK162239B DK526882A DK526882A DK162239B DK 162239 B DK162239 B DK 162239B DK 526882 A DK526882 A DK 526882A DK 526882 A DK526882 A DK 526882A DK 162239 B DK162239 B DK 162239B
Authority
DK
Denmark
Prior art keywords
oxygen
medium
adenine
inosine
guanosine
Prior art date
Application number
DK526882A
Other languages
English (en)
Other versions
DK162239C (da
DK526882A (da
Inventor
Yasuhiro Sumino
Koji Sonoi
Muneharu Doi
Original Assignee
Takeda Chemical Industries Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Takeda Chemical Industries Ltd filed Critical Takeda Chemical Industries Ltd
Publication of DK526882A publication Critical patent/DK526882A/da
Publication of DK162239B publication Critical patent/DK162239B/da
Application granted granted Critical
Publication of DK162239C publication Critical patent/DK162239C/da

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/26—Preparation of nitrogen-containing carbohydrates
    • C12P19/28—N-glycosides
    • C12P19/38—Nucleosides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/26—Preparation of nitrogen-containing carbohydrates
    • C12P19/28—N-glycosides
    • C12P19/38—Nucleosides
    • C12P19/40—Nucleosides having a condensed ring system containing a six-membered ring having two nitrogen atoms in the same ring, e.g. purine nucleosides
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/813—Continuous fermentation
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/818—Aeration or oxygen transfer technique
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/8215—Microorganisms
    • Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
    • Y10S435/832—Bacillus
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/8215—Microorganisms
    • Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
    • Y10S435/832—Bacillus
    • Y10S435/839—Bacillus subtilis

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Description

i
DK 162239 B
Den foreliggende opfindelse angår en særlig fremgangsmåde af den i indledningen til krav 1 angivne art til fremstilling af inosin og/eller guanosin.
Inosin og guanosin er vigtige udgangsforbindelser til 5 syntese af bl.a. lægemidler og smagsgivende 5'-ribonukleoti-der, og det er betydningsfuldt at kunne fremstille disse forbindelser til lav pris og i stor produktionsmålestok.
Ved en konventionel gæringsmetode til fremstilling af inosin og/eller guanosin under anvendelse af en adeninkræ-10 vende mikroorganisme er det nødvendigt at regulere den mængde af adeninkilden, der sættes til dyrkningsmediet, inden for et bestemt koncentrationsområde, og det er kendt at hvis adeninkilden tilsættes i overskud i forhold hertil vil udbyttet af inosin og/eller guanosin påvirkes i uheldig ret-15 ning (jvf. fx Journal of Biochemistry (Japan) 69, side 342 (1971) og Agricultural and Biological Chemistry 43, side 393 (1979)).
Der er imidlertid gennemført et omfattende forskningsarbejde for at udvikle en ny type gæring af inosin 20 og/eller guanosin, som ikke har de nævnte ulemper, og det har herved vist sig at hvis man går frem som angivet i krav l's kendetegnende del, vil udbyttet af inosin og/eller guanosin blive forøget bemærkelsesværdigt. Fremgangsmåden ifølge opfindelsen er derfor ejendommelig ved det i krav l's 25 kendetegnende del anførte.
Den i krav 1 angivne mængde oxygenrig gas svarende til 40 x 10-7 mol 02/min.ml er baseret på omstående tabel 3, idet en oxygenoverførselsrate på 1,0 WM fcol/vol-minut) luft eksperimentelt svarer til 21 x 10"7 mol 02/min.ml; følgelig 30 svarer 0,75 WM luft til 15,75 x 10"7 mol 02/min.ml. der suppleret med 0,25 WM oxygen eller 25 x 10-7 mol 02/min.ml giver 40,75 x 10~7 mol 02/min.ml.
Den ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen anvendte adeninkilde kan være selve forbindelsen adenin, et adeninde-35 rivat eller et materiale der indeholder adenin.
Eksempler på egnede adeninderivater er adenosin, 5'-adenosinmonofosfat, 3'-adenosinmonofosfat, 5'-adenosindifos-
DK 162239 B
2 fat, 5'-adenosintrifosfat, ribonukleinsyre, desoxyribonukle-insyre og adenylravsyre.
Eksempler på egnede materialer der indeholder adenin er mikroorganismeceller, fx gær og ekstrakter deraf samt 5 andre naturlige organiske materialer såsom kødekstrakt, fiskekødekstrakt osv.
Den i krav 1 angivne mængde adenin er større end den mængde adenin som ville føre til maksimalt udbytte af inosin og/eller guanosin ved aerob dyrkning under anvendelse af al-10 mindelig luft i konventionel mængde (0,2-2,0 l/min.-l) som oxygenkilde. Det skal i den forbindelse nævnes at Journal of Biochemistry (Japan) 69, side 342 (1971) oplyser at den mængde adenin som vil give et maksimalt akkumuleret udbytte af inosin er 50-150 pg/ml, afhængigt af den anvendte mikro-15 organismestamme; og i Agricultural and Biological Chemistry 43, side 393 (1979) anføres det at den optimale koncentration af adeninkilden (ribonukleinsyre) til akkumulering af guanosin er ca. 1,4 g/1 (ca. 0,014% adenin) og at hvis· koncentrationen af ribonukleinsyre overskrider 1,8 g/1 (ca.
20 0,018% adenin), reduceres udbyttet af guanosin drastisk. Den foreliggende opfindelse kan gennemføres ved at man som den større mængde adenin end konventionelt, der fører til maksimalt udbytte af inosin og/eller guanosin, bruger overskud af adenin (0,03-0,08%) i forhold til den grænseværdi (0,005-25 0,015%), der angives i kendt teknik ifølge ovennævnte litte ratur (når adeninkilden er en anden end adenin, den ækvivalente mængde adenin). Ovenfor og overalt i det følgende, hvor adeninindholdet i mediet er udtryk i %, er der tale om % v/r, (vægt/rumfang, dvs. forhold mellem vægtenheder og 30 rumfangsenheder som mellem gram og milliliter).
Den foretrukne koncentration af adeninkilden som skal inkorporeres i mediet ved udførelse af fremgangsmåden ifølge opfindelsen er ca. 200-800 pg/ml (0,02-0,08%) som adenin, og fortrinsvis ca. 300-500 pg/ml (0,03-0,05%) som adenin.
35 Det tidspunkt hvor adeninkilden sættes til mediet er praktisk talt valgfrit. Hele mængden kan fx sættes til mediet før gæringen indledes, eller adeninkilden kan tilsættes 3
DK 16223? B
portionsvis efterhånden som gæringen forløber. Dyrkningen gennemføres i praksis ved at der bobles en gas med indhold af en større mængde oxygen end almindelig luft ind i mediet på konventionel måde, fx ved en aerob submers dyrkningstek-5 nik.
Den oxygenrige gas der anvendes ved udøvelse af den foreliggende fremgangsmåde kan være rent oxygen, en gasfor-mig blanding af oxygen og luft eller en oxygenberiget gas, fx vundet ved en molekylsigtemetode eller fra en membranse-10 parationsgenerator.
En gas der indeholder højere koncentration af oxygen end almindelig luft kan tilføres konstant med en konstant beregnet hastighed i løbet af hele gæringsprocessen, eller den kan tilføres automatisk som den nødvendige mængde under 15 overvågning på grundlag af data for opløst oxygen. Til levering af den oxygenrige gas kan man tilføre almindelig luft og oxygen fra indbyrdes uafhængige dyser.
Når en sådan gas tilføres med konstant hastighed over hele gæringsprocessen kan man ifølge opfindelsen med fordel 20 gå frem som angivet i krav 4.
Den ifølge opfindelsen anvendte mikroorganisme kan være en hvilken som helst adeninkrævende art af slægten Bacillus, der har evne til at udvikle inosin og/eller guano-sin. Ifølge opfindelsen bruges særlig hensigtsmæssigt Bacil-25 lus pumilus eller Bacillus subtilis, og ifølge opfindelsen kan der især anvendes en af stammerne Bacillus pumilus nr. 148-S-16 (FERM BP-6, IFO 12483), Bacillus pumilus nr. 158-A-17 (FERM BP-7, IFO 12477) og Bacillus subtilis ATCC 13956 (IFO 14124). Også stammen Bacillus subtilis ATCC 19221 (IFO 30 14123) er egnet.
De ovennævnte Bacillus pumilus nr. 148-S-16 og Bacillus pumilus nr. 158-A-17 er deponeret i Institute for Fermentation, Osaka (IFO) siden 11. januar 1967 under accessionsnumrene henholdsvis IFO 12483 og IFO 12477 samt deponeret 35 siden 4. juni 1981 ved Fermentation Research Institute,
Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry (FRI) i overensstemmelse med
DK 162239 B
4
Budapesttraktaten under accessionsnumrene under henholdsvis FERM BP-6 og FERM BP-7.
De ovennævnte Bacillus subtilis ATCC 19221 og Bacillus subtilis ATCC 13956 er opført i The American Type 5 Culture Collection Catalogue of Strains I, 14. udgave, 1980. Bacillus subtilis ATCC 19221 og Bacillus subtilis ATCC 13956 er blevet deponeret i Institute for Fermentation, Osaka under accessionsnumrene under henholdsvis IFO 14123 og IFO 14124.
10 Som medium ved den foreliggende fremgangsmåde kan der anvendes et hvilket som helst af de medier der generelt anvendes til gæring af inosin og/eller guanosin. Fx kan mediet som kulstofkilder indeholde forskellige kulhydrater såsom stivelse, glukose og sakkarose; monovalente eller poly-15 valente alkoholer såsom glycerol, metanol, ætanol og sorbitol; og fedtsyrer såsom eddikesyre, propionsyre, stearinsyre og oliesyre. Olier og fedtstoffer såsom sojabønneolie, olivenolie, fiskeolie, spermacetolie, bomuldsfrøolie, palmeolie og svinefedt; n-paraffiner såsom nonan, dekan, undekan, he-20 xadekan, eikosan og pentakosan, og kulbrinter såsom petroleum, gasolie og tung gasolie. Disse kulstofkilder kan anvendes alene eller som en blanding egner sig også. Foretrukne kulstofkilder er kulhydrater såsom stivelse, glukose og sakkarose .
25 Nitrogenkilderne der inkorporeres i mediet kan fx væ re organiske nitrogenkilder såsom pepton, sojabønnemel, majsstøbevand, gær, kødekstrakt og urinstof samt uorganiske nitrogenkilder såsom ammoniumsalte af svovlsyre, salpetersyre, saltsyre og kulsyre; og ammoniakgas; ammoniakvand. Disse 30 nitrogenkilder kan anvendes enten alene eller i blanding.
Desuden kan der til mediet sættes et passende udvalg af uorganiske salte der er nødvendige for mikroorganismens vækst, fx sulfater, hydroklorider, karbonater, nitrater, fosfater, acetater af kalcium, kalium, natrium, magnium, mangan, jern, 35 kobber og zink såvel som aminosyrer og vitaminer som er nødvendige for mikroorganismens vækst. Disse næringskilder kan anvendes alene eller i kombination. Om nødvendigt kan der
DK 162239 B
5 også til mediet sættes et antiskumningsmiddel eller et o-verfladeaktivt stof såsom en silikoneolie eller polyalky-lenglykolæter.
Mediets pH-værdi er fortrinsvis i området fra ca. 5 5 til ca. 8. Det foretrukne pH-område er fra ca. 5,5 til ca.
7,5 og når mediets pH ændres i løbet af gæringen kan det bringes til det ønskede område ved til mediet at sætte en vandig opløsning eller suspension af et alkalimetalhydroxyd, kalciumkarbonat eller ammoniakgas. Som inkubationstemperatur 10 bør der vælges en temperatur der er velegnet for mikroorganismens vækst. Det er fordelagtigt at gennemføre gæringen ved ca. 20-60eC, fortrinsvis ved ca. 25-45eC.
Med hensyn til dyrkningens varighed dyrkes mikroorganismen indtil udbyttet af inosin og/eller guanosin er maksi-15 malt. I almindelighed kan det opnås ved dyrkning af mikroorganismen i 24-144 timer.
Inosin og/eller guanosin som er til stede i gæringsvæsken kan let udvindes fra den, enten hver for sig eller som en blanding, ved anvendelse af kendte rensningsmetoder 20 såsom kromatografi under anvendelse af en ionbytterharpiks eller aktiveret kulstof, udfældning eller opløsningsmiddelekstraktion.
Ved den foreliggende fremgangsmåde akkumuleres inosin og/eller guanosin i højt udbytte i gæringsvæsken. Derfor kan 25 der under anvendelse af et givet udstyr opnås større udbytte end ellers af det ønskede inosin og/eller guanosin. Da desuden gæringssuppen indeholder inosin og/eller guanosin i højere koncentrationer end ellers kan udvindingen af de ønskede produkter lettes. Fremgangsmåden ifølge opfindelsen er 30 derfor kommercielt fordelagtig.
Fremgangsmåden ifølge opfindelsen belyses nærmere i det følgende ved nogle eksempler. I eksemplerne står WM for vol/vol x min.).
Eksempel 1
DK 162239 B
6
En kultur af Bacillus pumilus nr. 148-S-16 (FERM BP-6, 5 IFO 12483) dyrket på et næringsagarmedium indeholdende 100 mg/1 adenin anvendtes til podning af fem 200 ml koniske kolber indeholdende 20 ml af et steriliseret forkulturmedium sammensat af 4% glukose, 0,2% urinstof, 0,1% kaliumklorid, 0,006% mangansulfat (ca. 4h20), 0,2% kalciumklorid (2H20), 0,03% histidin, 200 μg/l 1q biotin, 2% maj sstøbevand, 0,25% ribonukleinsyre (75%s renhed) og vand. De podede flasker inkuberedes under rystning ved 37°C i 18 timer. Hele mængden af den resulterende forkultur overførtes til 5-liters gæringskar hvert indeholdende 2 liter af et steriliseret gæringsmedium sammensat af 2% glukose, 0,4% 15 ammoniumsulfat, 0,5% natrium-L-glutamat, -0,2% magniumsulfat (7H20), 0,1% kaliumklorid, 0,2% kalciumklorid (2Η2<3) , 0,003% mangansulfat (ca. 4H20), 0,03% histidin, 200 pg/l biotin, 0,005% inosin, 2,5% majsstøbevand og varierende mængder af ribonukleinsyre (75%s renhed) og vand (se tabel 1). Hvert gæ-20 ringskar inkuberedes ved 38°C og 1000 omdr. pr. minut. Denne gæring blev gennemført som dobbeltforsøg, dvs. under tilførsel af luft (0,6 WM) og under samtidig tilførsel af luft (0,4 WM) og ren oxygen (0,2 WM). Efter 12 timers inkubering førtes der separat steriliseret 80%s glukoseopløsning til gæringskar-25 ret således at gæringssuppens glukoseniveau ville blive opretholdt på mindre end eller lig med 0,2%. Gæringen fortsattes i 92 timer. Gæringsmediets pH-værdi holdtes på 6,7 ved automatisk tilførsel af 25%s ammoniakvand. Den resulterende gærings-suppe afprøvedes for inosin og guanosin ved højtydende væske-3q kromatografi. Resultaterne er vist i tabel 1.
35
V DK 162239 B
P
0) C
T3 -H
•H Cfi m o— m r* o o m 0 G <—i "- ** *· * -* * d) rO \ inincMCNoæ .-M G d Cd »—1— CM r- ,Χ Φ Cd — d Ά C Qj d
iw td (ΰ ω Cr> τ! G
i—ί Ή G
OP ·Η —n 1— LD CM P-· -31 Γ" χ; $ id·-) *.*·**·>* ndtJi 0\ inincNOor-~ C G Cd r- r- CN «- Η -Η ·Η m G Cd I d) G -P Cd •h d c G i—i •'-i fB td P Cd «-t-1 to Cd 4-1 ooLnincoo rO rø u-ι P ^ ^ ru N n h (L/fljd> ^ ^ ‘
Cn> -P CN CVJ (N CN CM ΡΊ c1 d c0 Φ Φ 1-1 Ή Qi Cd~ ε o. c d d -η Pi co c
i M
U-IM I <l>
(0 Cd to -1-1 S -H
tjl 4J H'-I CM O CM CO O
c ^ p,w · ασ r*· tn *— co ld (CSO nm^LDincd 1—1 UM UM Φ Cd »**** *
dl g .-t M G OOOOOO
X! d -H O -H
(0 Pi -P M G
G G G
i cu ω tu w Cd Cd Cd G >M >M >i
Cd i—i X X
φ 0 0 0 Ή m rB P + + + s φ U-l 4J 4J .p .p -p -p
QjrH U-l U-l U-l Ή U-l ·Η >i-h P d d d d d
Em +J ‘i—I i—l i—I i—I iH i—I
Φ r^J oV o\° o\° o\° o\° o\° G oo oo m ro oo oo O UM Γ- t— 00 ΓΟ ^ ^ prO oooooo cOG ·> ·* * * - “
>.-H OOOOOO
ω o G
iH G Φ * Μ Οΐ (0 to fO (0 (0 Φ
EMP4(C OOOOOO
u-i m i d i , G G inu^mininin
Ο0-ΡΦ OJ tM >ί Ί1 IC IC
GrQOP'-' - - *· *· * “
O-MH >idP OOOOOO
Ϊ6 P rX Cd —
Eksempel 2
DK 162239B
8
Der gennemførtes gæring på samme måde som beskrevet i eksempel 1 bortset fra at der anvendtes Bacillus subtilis ATCC 19221 (IFO 14123) i stedet for Bacillus pumilus No. 148-S-16 (FERM BP-6, IFO 12483), og idet ribonukleinsyre (renhed 75%) tilsattes i de mængder der er vist i tabel 2 og inkuberingstemperaturen var 34°C. Efter de 18 timer tilsattes en steriliseret 80%s glukoseopløsning på samme måde som i eksempel 1 og gæringen fortsattes i 70 timer. Resultaterne er vist i tabel 2.
10 15 20 25 30 35
9 DK 162239 B
CP O I cn O Cp •h c m *h O P c S3
•H CP^" i—I
IU -H \ LD CPi CTi i— (0 CP ** *· *· *· C ^ <tf o m rQ -H 00
H W S
0 0 Φ jC C Qi T) (0 Q< G O o h cp ω w c CP i (L) o +J cp h o a U i—I Ή
(B t/1 M
cpy-i S3 (0 tp
O-I OD LD "tf O
(0 rQ o_| 00 00 (Ti O
(L) (0 - - * * CP > ^ r- 00 c C P tO (D <D <L> LU a tp-p
g ac-H
0 0 -π h PS ω c i —
D P
UH I (1) (0 cp tø -P S -H Øl-P rH r-r G p Qj—' o o in o co (OSO ιηιηιηο iu iu φ CP oo m rH g η (0 C ' " ' ' 0) o -h 0 -h o o o o
-Q PS -P MG
B G C
1 Φ CL) en cp Cp
(0 >1 >H
CPi—i ><! X
Φ 0 0 LU tø (OP + +
S
φ iu -P -p +J -p -
Q,rH , LW LU lu UH
>vH 0 0 0 0
[H -p rH rH rH rH
Φ rø dP dP # # C oo oo mm Φ IU " " co co p (0 o o o o (0 C * ·"
> . -H O O O O
ω O C
rH C Φ .... ------ -η O Ό (0 (0 (0 (0
μ O O O O O
iu (0 I G I
. c c in κι in κι OO-ηΦ OOOO'tf'tf S3! ø ^ - *- ** *· 0·ΗΗ>ΚίΡ o o o o p ^ tø
Eksempel 3
DK 162239 B
10
Ca. 100 ml af en forkultur af Bacillus pumilus nr. 148-S-16 (FERM BP-6, IFO 12483) vundet ved at anvende samme fremgangsmåde og samme medium som beskrevet i eksempel 1 an-vendtes til at pode et 5-liters gæringskar indeholdende 2 liter af et steriliseret medium sammensat af 2% glukose, 0,8% ammoniumsulfat, 1% natrium-L-glutamat, 0,3% magniumsulfat (7^0), 0,15% kaliumklorid, 0,3% kalciumklorid (21^0), 0,0045% mangansulfat (ca. 4^0), 0,045% histidin, 300 μg/1 biotin, 0,075% inosin, 7% majsstøbevand, 0,7% ribonukleinsyre (renhed 75%) og 1% urinstof samt vand. Gæringen gennemførtes under samtidig tilførsel af luft (0,3 WM) og ren oxygen (0,3 WM) og ellers på samme måde som beskrevet i eksempel 1 i 96 timer.
I løbet af denne time blev der forbrugt 1,2 liter af en 80%s ^ 5 glukoseopløsning og der vandtes et slutgæringsmedierumfang på 3 liter. Denne gæringssuppe afprøvedes for inosin og guanosin ved højtydende væskekromatografi. Resultaterne var henholdsvis 25,3 g/1 og 21,6 g/1.
Cellerne filtreredes fra fra gæringssuppen og filtratet behandledes med en affarvende harpiks og en anion-bytterharpiks på konventionel måde til udvinding af en inosin-og guanosinfraktion. Denne fraktion koncentreredes under nedsat tryk hvorved der vandtes rå blandede krystaller af inosin og guanosin. Disse blandede krystaller opløstes i vand og ren-sedes yderligere ved adsorption på aktiveret kulstof og omkrystallisation på i sig selv konventionel måde hvorved der vandtes 60,6 g inosin og 52,7 g guanosin, begge i form af krystaller.
Eksempel 4
Der gennemførtes'gæring på samme måde som beskrevet i eksempel 1 bortset fra Bacillus pumilus nr. 158-A-17 (FERM BP-7, IFO 12477) anvendtes i stedet for Bacillus pumilus nr. 148-S-16 35 (FERM BP-6, IFO 12483), og idet yderligere adenin tilsattes i niveauer på 0,015%,0,04% og 0,08%.Efter de 8 timer tilførtes der kontinuerligt en steriliseret 80%s glukoseopløsning til
DK 162239 B
11 gæringskarret således at glukoseniveauet i gæringssuppen holdtes ved =1%. Gæringen fortsattes i 70 timer. Den vundne mængde inosin var som vist i tabel 3.
5 TABEL 3
Koncentra- Type af Rumfang af til- Rumfang af gæ- Inosinmængde tion af ade- gastilfø- ført glukoseopløs- ringssuppe ved i slutgærings- nin (%) ring ning (1) afslutningen af mediet (g/1) gæringen (1) 0,015 luft(l,0WM) 0,400 2,16 24,1 {'luft(0,75WM) + 0,400 2,19 22,5 pxygen( 0,25WM) 0,040 luft(0,10WM) 0,725 2,49 1,8 fluft(0,75WM) 15 0,040 -f + 1,125 2,98 33,4 [.oxygen (0,2 5WM) n lUft(l,0WM) 1,375 3,10 1,0
0,0oU
riuft(0,25WM) °'080 < + 1,700 3,48 28,0 ^ ® Loxygen (0,7 5WM) 25 30 35

Claims (5)

1. Fremgangsmåde til fremstilling af inosin og/eller guanos in ved dyrkning af en adenin-krævende og inosin- og/el-5 ler guanosin-producerende bakterie af slægten Bacillus i et dyrkningsmedium for at få bakterien til at udvikle og akkumulere inosin og/eller guanosin i gæringssuppen, hvorefter inosin og/eller guanosin udvindes derfra, kendetegnet ved at man lader en adeninkilde være til stede i me-10 diet i en mængde på 200 til 800 pg/ml, regnet som adenin svarende til en koncentration på 0,02-0,08%, fortrinsvis 0,03-0,08%, idet man dyrker mikroorganismen mens der bobles en oxygenrig gas i en mængde svarende til ca. 40 x 10-7 mol 02/min.ml ind i mediet.
2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved at man anvender en mikroorganisme der hører til arten Bacillus pumilus eller arten Bacillus subtilis.
3. Fremgangsmåde ifølge krav 2, kendetegnet ved at man som mikroorganisme anvender Bacillus pumilus nr. 20 148-S-16 (FERM BP-6, IFO 12483), Bacillus pumilus nr. 158-A- 17 (FERM BP-7, IFO 12477) eller Bacillus subtilis ATCC 13956 (IFO 14124).
4. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved at den oxygenrige gas tilføres mediet ved at der tilfø- 25 res almindelig luft og oxygen fra indbyrdes uafhængige dyser, hvorved de mængder luft og oxygen som bobles i mediet er i overensstemmelse med følgende ligninger: Qiuft = loo-c x Qo 30 79 Qoxygen — ^ ~ 21 X Q0 79 35 hvor Q1uft og Qoxygen er de respektive mængder (l/min.’l) af luft og oxygen, som tilføres mediet, Q0 er den tilførte mængde almindelig luft ved den konventionelle fremgangsmåde, DK 162239 B dvs. 0,2-2,0 liter/minut pr. liter medium, og C er oxygenkoncentrationen (%) af en gasformig blanding af oxygen og luft, som arbitrært bestemmes til ikke at være mindre end værdien C0 beregnet ud fra følgende eksperimentelle ligning:
5 C0 = Ad x 103 hvor C0 repræsenterer den mindste oxygenkoncentration (%) af en gasformig blanding af oxygen og luft, som er nødvendig 10 til at opnå det maksimale akkumulerede udbytte af inosin og/eller guanosin når den med adenin ækvivalente koncentration af adeninkilden i mediet er Ad % v/r. 15 20 25
DK526882A 1981-11-27 1982-11-26 Fremgangsmaade til fremstilling af inosin og/eller guanosin DK162239C (da)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP19103381 1981-11-27
JP56191033A JPS5894397A (ja) 1981-11-27 1981-11-27 イノシンおよびグアノシンの製造法

Publications (3)

Publication Number Publication Date
DK526882A DK526882A (da) 1983-05-28
DK162239B true DK162239B (da) 1991-09-30
DK162239C DK162239C (da) 1992-03-02

Family

ID=16267773

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DK526882A DK162239C (da) 1981-11-27 1982-11-26 Fremgangsmaade til fremstilling af inosin og/eller guanosin

Country Status (7)

Country Link
US (1) US4578336A (da)
EP (1) EP0080864B1 (da)
JP (1) JPS5894397A (da)
KR (1) KR880001455B1 (da)
DE (1) DE3275388D1 (da)
DK (1) DK162239C (da)
ES (1) ES517702A0 (da)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH0757198B2 (ja) * 1987-10-07 1995-06-21 味の素株式会社 ジデオキシイノシンの製造方法
US5204245A (en) * 1991-05-15 1993-04-20 E. I. Du Pont De Nemours And Company Extraction of thymidine and other nucleosides
DE19938853B4 (de) * 1999-08-17 2005-09-29 Air Liquide Gmbh Verfahren zur Begasung einer Anlage für den anaeroben und/oder aeroben mikrobiellen Abbau und Umwandlung organischer Abfälle zu Gärrest und/oder Kompost sowie dazugehörige Anlage

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA662009A (en) * 1963-04-23 Tamagawa Yosio Process for producing nucleosides by microorganisms
US2038451A (en) * 1934-03-14 1936-04-21 Schattaneck Erich Device for aerating fermentation liquids
US3111459A (en) * 1959-10-19 1963-11-19 Ajinomoto Kk Method for preparation of inosine
IT1001452B (it) * 1965-06-11 1976-04-20 Ajinomoto Kk Metodo per produrre inosina mediante fermentazione
GB1175979A (en) * 1965-12-28 1970-01-01 Takeda Chemical Industries Ltd A method for the Production of 5'-Inosinic Acid and Inosine
GB1127544A (en) * 1969-08-19 1968-09-18 Ajinomoto Kk Method of preparing ribonucleosides by microorganism
JPS5417033B2 (da) * 1973-06-14 1979-06-27
US3846246A (en) * 1974-01-09 1974-11-05 Dainippon Ink & Chemicals Cultivation process for micro-organisms
JPS5545199B2 (da) * 1974-03-30 1980-11-17

Also Published As

Publication number Publication date
ES8401527A1 (es) 1983-12-16
US4578336A (en) 1986-03-25
EP0080864B1 (en) 1987-02-04
ES517702A0 (es) 1983-12-16
DK162239C (da) 1992-03-02
EP0080864A3 (en) 1984-09-12
DE3275388D1 (en) 1987-03-12
DK526882A (da) 1983-05-28
JPS5894397A (ja) 1983-06-04
KR840002453A (ko) 1984-07-02
JPS6336757B2 (da) 1988-07-21
KR880001455B1 (ko) 1988-08-10
EP0080864A2 (en) 1983-06-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DK171869B1 (da) Fremgangsmåde til fremstilling af 2-keto-L-gulonsyre samt biologisk ren mikroorganismekultur til anvendelse ved fremgangsmåden
NO150785B (no) Fremgangsmaate for fremstilling av toerre stivelseholdige naeringsmidler
EP0388152A3 (en) Process for producing an immunosuppressant agent (demethimmunomycin) using a mutant strain of a microorganism
EP0335386B1 (en) Ks-506 compounds and process for the production thereof
NO300812B1 (no) Fremgangsmåte for fremstilling av antitumorsubstans BE-13793C, samt biologisk ren kultur istand til å frembringe denne
DK162239B (da) Fremgangsmaade til fremstilling af inosin og/eller guanosin
NO128618B (da)
US5447856A (en) Method for the production of trehalose using strains of Micrococcus and Deinococcus
US3689359A (en) Method for producing citric acid
EP0531708A2 (en) Process for producing riboflavin by fermentation
US4593000A (en) Method of producing guanosine
CA2299269A1 (en) Macrolides with antitumor activity
AU773234B2 (en) A process for the preparation of derivatives of Ruscus aculeatus steroid glycosides
JP2592468B2 (ja) 新規抗生物質ベナノマイシンａおよびｂならびにその製造法
NO158254B (no) Analogifremgangsmaate for fremstilling av bicyklo(3,2,1)oktan-karboksylsyrederivater.
JPH0728750B2 (ja) 微生物によるピラジン酸の水酸化物の製造方法
NO127316B (da)
US4661352A (en) WS 7739 substances, their preparation and pharmaceutical composition containing the same
JPH02138996A (ja) カンタキサンチンの製造法
US6440708B1 (en) Fermentation of clavulanic acid at a controlled level of ammonia
US5290689A (en) New cyclic FR-900520 microbial biotransformation agent
DE60307296T2 (de) Verfahren zur herstellung von vitamin-b6
JPH0319695A (ja) トランス―４―シアノシクロヘキサンカルボン酸アミドの製造法およびそれに用いる酵素
DE1923885A1 (de) Antibiotische Substanzen und Verfahren zu ihrer Herstellung
JPS6257179B2 (da)

Legal Events

Date Code Title Description
PBP Patent lapsed