DK158409B - Fremgangsmaade til fremstilling af justerings- eller kontrolsera med ringe uklarhed. - Google Patents

Description

i

DK 158409B

Opfindelsen angår en fremgangsmåde til fremstilling af en kontrol- eller justeringsserum med formindsket tilbøjelighed til uklarhedsdannelse ved rekonstitution efter forudgående lyofilisering.

5

Som kontrol- eller justeringssera betegner man naturlige sera af human eller dyrisk oprindelse og serumlignende kunstige sammensætninger med nøjagtigt indstillet indhold af forskellige interessante serumbestanddele, som er bestemt til juste-10 ring eller kontrol af fremgangsmåder til bestemmelse af serumbestanddele.

Anvendelse af humansera og dyriske sera eller af sammensætninger af lignende art, der er afledt af sera eller plasmaer til 15 fremstilling af kontrol- og justeringssera, er kendt. Indstilling af koncentrationen eller aktiviteten af klinisk relevante parametre (substrater, elektrolytter, enzymer, hormoner) til ønskede værdier er ligeledes kendt (Proc. Royal Soc. Med. 68 (1975) 624-629).

20

Kontrol- eller justeringssera, som indeholder følsomme stoffer, såsom enzymer, bilirubin, 1 ipoproteiner, hormoner osv., må af holdbarhedsgrunde dybfryses eller efter lyofi 1isering lagres ved køleskabstemperatur.

25

Gennem lyofi 1 iseringsprocessen forringes opløseligheden af nogle komponenter, og som følge heraf frembringes der i den rekonstituerede prøve en uklarhed, som især optræder, hvis kontrol- eller justeringsserumen har højere 1ipidkoncentrati-30 oner.

Det er kendt for fagmanden, at uklarheder i kontrol- eller justeringssera er meget uønskede. Således kan dér optræde problemer ved mange spektrofotometriske metoder, hvis der ikke 35 tages hensyn til uklarheden af prøven ved en tilsvarende tomværdi af prøven.

2

DK 158409 B

Særlige problemer forårsager uklarheden i kontrol- eller ju-steringssera især ved bestemmelse af enzymaktiviteter, som er baseret på NADH/NAD+-målingen og f.eks. udføres ved 340 nm.

5 Ved målinger ved 340 nm kan uklarheden af prøven (kontrol eller justeringsserum) yderligere forhøje den i forvejen høje ekstinktion af NADH i reaktionsblandingen så meget, at de fremkomne ekstinktionsmålinger må udføres inden for et ikke mere nøjagtigt ekstinktionsområde af fotometeret. Det betyder, 10 at målingerne bliver med unøjagtige (dvs. at variationskoefficienten (VK) af bestemmelserne bliver større). Endvidere afhænger de fremkomne resultater stærkt af kvaliteten af det anvendte fotometer.

15 Man har allerede forsøgt at løse uklarhedsproblemet på flere måder.

1) Ved chokfrysning af kontrol- eller justeringsseraene i granulatform i et egnet frysebad, lyofi 1isering af det frosne 20 granulat i bulkform og tør aftapning af det fremkommende lyo-granulat ved afvejning i egnede flasker (DE offentliggørelses-skrift 22 43 014).

Denne fremgangsmåde har den fordel, at der uden manipulation 25 af kontrol-/justeringsserumråstoffet kan fås et produkt- med forholdsvis lav uklarhed. En ulempe består i, at denne teknologi kræver store investeringer, og at problemet med lyogra-nulataftapningen for tiden ikke er løst tilfredsstillende, dvs. er uigennemførlig teknisk i større omfang.

30- 2) Ved at skille de /5-1 ipoproteiner, der hovedsagelig er ansvarlig for uklarheden fra seraene og eventuelt påfølgende udvidelse af kolesterin med en egnet 1ipoproteinfraktion (a-li-poprotein) eller af triglycerid med triocta'noin i nærværelse 35 af triton X 114 (Cl i n. Chem. 22 (1976) 456-460, 1299-1305).

En væsentlig ulempe ved denne fremgangsmåde er, at udfældning af β-lipoproteinerne ved hjælp af Ca2 + /dextransulfat og .fra- 3

DK 158409B

skillelse deraf medfører en betydelig fordyrelse af serumråstof f et .

En påfølgende udvidelse af grundmassen med en egnet lipopro-5 teinfraktion for at forøge kolesterinkoncentrationen, er ganske vist mulig og betinger en moderat vækst i uklarhed (ved 300 mg kolesterin/dl E > 0,7), men en samtidig forhøjelse af triglyceridkoncentrationen er dermed ikke mulig.

10 Kritisk er ligeledes tilsætningen af detergent (triton X 114). Prøveforstyrrelser og/eller enzyminaktiveringer må forventes herved.

3) Ved tilsætning af sukkerarter, sukkeralkoholer og aminosuk-15 kerarter til kontrol- eller justeringsseraene, som formindsker eller undgår denaturering af 1ipoproteinerne under lyo-filiseringen (DE offentliggørelsesskrift 28 25 391).

Denne fremgangsmåde har sammenlignet med fremgangsmåderne 1 og 20 2 den fordel, at den traditionelle teknologi kan anvendes, og en omarbejdning af råstoffet kan omgås.

Ulemper ved denne fremgangsmåde ligger i, at der tildels må tilsættes store mængder "stabilisator”, hvorved egenskaberne 25 af den rekonstituerede kontrol/justeringsserum ændrer sig (viskositet), og at stabilisatorerne er "fysiologiske" stoffer, som kan ødelægge bestemte prøver (f.eks. forstyrrelser af glucosebestemmelsen ifølge HK/G6P-DH metoden som følge af glucose, glucosamin, fructose) eller som muligvis kan ændre sig i 30 serumen (f.eks. hydrolyse af saccharose eller lactose i kraft af α-glucosidase, invertase eller Ø-galactosidase, da disse enzymer ved enzymopbygningen kan komme ind i kontrol/juste-ringsserumen, som såkaldte enzymforureninger). 1

Uklarheden (s ekstinktion af den ufortyndede med vand eller fortyndingsmiddel rekonstituerede prøve målt ved HG 546 nm overfor vand) af en ifølge fremgangsmåde 1 (chokfrysning) fremstillet prøve er ca. 0,5.

4

DK 158409B

Uklarheden af på konventionel metode af normal human-serum fremstillet kontrol/justeringsserum (lyofi 1isering af den ved -30 til -50 * C frosne prøve) ligger ved 0,8-1,3.

5 Kontrol-/justeringssera, der er fremstillet efter fremgangsmåde 2) har en uklarhed på ca. 0,3. Indholdet af triglycerid eller kolesterin er dog meget lavt efter fraskillelse af ø-lipo-proteinerne.

10 W0 patentansøgning 79/00106 angår en fremgangsmåde til stabilisering af flydende prøver, som er blevet rekonstitueret efter lyofilisering. Formålet er at stabilisere rekonstituerede opløsninger, som sædvanligvis holder sig maksimalt 1 dag og derefter må kasseres. Til dette formål bliver lyofilisatet 15 opløst i en blanding af vand og 20-50 vægt% af en alkylenpoly-ol i stedet for i rent vand. Ved denne rekonstitutionsmåde kan det hurtige forfald af den rekonstituerede opløsning forhindres. Det betyder, at de egenskaber, som den rekonstituerede opløsning har fået gennem opløsningen, kan opretholdes i end-20 nu nogle dage.

Formålet med den foreliggende opfindelse er noget andet. Her drejer det sig om det problem, at opløseligheden af nogle af bestanddelene forringes ved lyofi 1 iser ingsprocessen, og at der 25 derfor sker en uklarhedsdannelse efter rekonstitueringen af prøven. Det sker især i prøver med stort 1 ipidindhold. For at undgå dette bliver der til prøven før lyofi 1iseringen tilsat 0,5-10 vægt% af nærmere definerede forbindelser. På denne måde forhindres, at den rekonstituerede opløsning udviser en for 30 stor grad af uklarhed. Medens altså reaktioner, der optræder under lyofi 1iseringen og rekonstitueringen, bliver påvirket ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen, bliver prøver, som allerede er lyofiliseret og rekonstitueret, stabiliseret ved fremgangsmåden ifølge WO 79/00106. Det drejer sig derfor om to 35 helt forskellige fremgangsmåder.

Selv om en gennemsnitsfagmand havde taget det, der fremgår af W0 79/00106, i 'betragtning for at løse den foreliggende opfin- 5

DK 158409 B

delses problem, noget som på grund af de helt forskellige problemer ikke ville ske, ville han alligevel ikke vare nået frem til den foreliggende opfindelse. Medens det nemlig ifølge WO 79/00106 er nødvendigt med en mangde på 20-50 vægt% alky-5 lenpolyol (i eksemplerne 33 vægt* ethylenglycol) til stabilisering, er det ifølge den foreliggende opfindelse tilstrækkeligt med kun 0,5-10 vægt* af de nærmere definerede forbindelser for at opnå den ønskede virkning. Det måtte altså i alle tilfalde være overraskende for gennemsnitsfagmanden, at det 10 var muligt at stabilisere en prøve under lyofi 1iseringen og rekonstitueringen med en så lille mangde af disse forbindelser. Dette kunne ikke udledes af W0 79/00106.

Formålet med den foreliggende opfindelse er at tilvejebringe 15 en justeringsserum eller kontrolserum, der udviser en formindsket tilbøjelighed til uklarhedsdannelse, men som ikke har ulemperne ved de kendte løsninger på dette problem.

Det har nu vist sig, og herpå er opfindelsen baseret, at min-20 dre uklare og mere homogene kontrol-/justeringssera kan fremstilles ved den traditionelle teknologi, hvis man til udgangsmaterialerne på basis af humansera eller dyresera eller et andet af serum eller plasma afledt materiale før lyofi 1iseringen sætter bestemte organiske forbindelser, der ikke hører til 25 sukkerarterne.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen er ejendommelig ved, at man før lyofi 1iseringen tilsætter mindst en af følgende forbindelser: methanol, natriumacetat, triethanolammoniumacetat, tetra-30 methyl-diethylen-ammoniumdiacetat, natriumpropionat, natriunr- lactat, alanin, natrium-2,2-bis(hydroxymethyl)-propionat, N-methy1 di ethanol ammon ium-2,2-bi s(hydroxymethyl)-propionat, 2,2-(bishydroxymethyl)-propionsyreamid, natrium-2-hydroxy-2-meth-ylbutyrat, valin, 2-methoxyethanol, triethylenglycol, tetra-35 ethylenglycol, tetramethylethylendiammoniumdiacetat, tetrame- thylethylendiammonium-di-(2-hydroxyisobutyrat) og tetramethyl-ammoniumacetat i en mængde på 0,5-10 vægt* beregnet på den rekonstituerede opløsning.

β

DK 158409B

En særlig stærk opklaringsvirkning udviser de forbindelser, som indeholder carboxylatgrupper. De til grund liggende carboxylsyrer neutraliseres før anvendelsen i opfindelsen.

5 Den mængde, som giver en ønsket uklarhedsforbedring afhænger vidtgående af, hvilken forbindelse, der anvendes. Den virksomme koncentration for normal sera ligger sædvanligvis mellem 0,5 og 10 g pr. dl. Den nødvendige mængde af det anvendte stof afhænger ikke kun af stoffet selv, men bestemmes også af 10 grundmassen og dens sammensætning (f.eks. af dens lipid- og proteinindhold) og kan derfor variere fra tilfælde til tilfælde.

Det er også muligt at sætte flere stoffer af den ovenfor an-15 førte art sammen til serummen eller til den af serum afledte grundmasse. Herved kan der optræde virkninger, der gensidigt forstærker eller svækker hinanden.

Opfindelsen egner sig især til universelle kontrol- eller ju-20 steringssera, dvs. produkter, der kan anvendes til kvalitetskontrol eller justering (kalibrering) af automater til alle klinisk relevante serumparametre, såsom enzymer, substrater, metaboliter, hormoner, elektrolytter osv. Opfindelsen egner sig ligeledes til kontrol- eller juster ingssera til specielle 25 formål til hvilke der f.eks. kan gives afkald på tilsætning af enzymer eller hormoner. Eksempler herpå er 1ipidkontrolserum eller lipidjusteringsserum/lipidkalibrator.

Ifølge opfindelsen bliver ikke serummet som helhed mere homo-30 gent, men præcisionen af koncentrations- og'akti vitetsbestem-melser af de i kontrol-/juster ingssera indeholdte parametre forbedres. Det betyder, at de krævede værdier for de enkelte parametre bliver sikrere, og at genfindingen af de deklarerede krævede værdier for den, der benytter kval itetskontrolse-35 raene lettes, eller at justeringen af apparater med disse ka- libratorer forbedres.

DK 158409 B

7

De følgende eksempler belyser opfindelsen nærmere.

Formindskelsen af uklarheden måles som følger:

Ekstinktionerne ved Λ = 546 nm af de ufortyndede med vand 5 rekonstituerede prøver måles i en 1 cm kuvette og ekstinktionerne af prøver med tilsætning/tilsætninger sammenlignes med prøver uden tilsætning (= kontrol).

Ekstinktionen ved denne bølgelængde bestemmes overvejende 10 af prøvens uklarhed/inhomogenitet, lysabsorptionen er forholdsvis ringe. Lysintensiteten svækkes altså overvejende af lysspredningsvirkninger. Geometrien af måleanordningen {lysvej/· anordning af lyskilde og -modtager, blænde, kuvet-teform osv.) påvirker ligeledes den af lysspredning betin-15 gede lysintensitetssvækkelse.

Ekstinktionerne måles med et liniespektralfotometer (Eppen= dorf 6115).

Rekonstitution eller rekonstitutionering af prøven betyder her tilsætning af vand eller en vandig opløsning (fortyn-20 dingsmiddel) til den lyofiliserede prøve i den mængde, der forelå før lyofiliseringen.

Eksempel 1-Γ5

Som serumgrundmasse anvendes- i denne forsøgsrække humanserum samlet fra sunde donorer. For bedre at demonstrere den uklar-25 hedsopklarende virkning af de tilsatte stoffer, blev der til den samlede serum sat æggeblommeekstrakt for at forhøje serum-grundmassens koncentration af triglycerider til værdier på 160 til 270 mg pr. dl. Serumgrundmassens kolesterinindhold blev ikke ændret.

DK 158409B

s

Efter tilsætning af enzymer, substrater, elektrolytter eller hormoner til s erumgrundma s s en blev der tilsat de i tabel 1 anførte stoffer i den anførte koncentration til serumgrund-massen. Derefter blev materialerne med og uden tilsætning 5 filtreret kimfri (0,2 μ membranfiIterlag) fyldt på flasker og lyofiliseret. Efter rekonstitiution med vand bestemmes uklarheden af prøverne.

Kbncentra- Uklarheds- (E_. ) s 11

Eksempel Tilsætning tion (%) Median interval Mfa n ..................E.....E .

....................................max . .min 1 Methanol 0 0,82 0,35 0,07 0,72 1,5 0,60 0,07 0,63 0,56 3,0 0,28 0,03 0,30 0,27 2 Natriumacetat 0 0,87 0,23 0,91 0,78 2 0,25 0,02 0,25 0,23 3 Triethanolam= 0 0,92 0)08 0,97 0,89 moniuraacetat 5,2 0,32 0,03 0,33 0,30 4 Tetramethyl= 0 0,81 0,35 1,07 0,70 SS&SS? 3 0 r01 0,23 0,22 5 Natriumpro= 0 0,87 0,23 0,91 0,78 pionat 2,4 0,41 0,09 0,44 0,35 6 Natrium= 0 0,87 0,23 0,91 0,78 lactat 3 0,16 0,00 0,16 0,16 7 Alanin 0 0,96 0,23 0,04 0,81 3 0,40 0,05 0,44 0,39 8 Natrium-2,2- 0 0,96 0,09 0,98 0,89 bis (hydroxy- 3,5 0,45 0,06 0,48 0,42 methyl)-pro- pionat 9 N-methyldietha= 0 1,23 0,15 0,31 1,16 nolaitnonium-2,2- 5,7 ' 0,40 0,09 0,41 0,32 - bis- (hydroxymeF= thyl)-propionat DK 158409B ! 9 10 2,2-bis(hydroxy= 0 0,96 0,09 0,98 0,89 methyl) -propion= 3 0,67 0,07 0,69 Q,63 syreamid 11 Natrium-2-hydroxy- 0 0,87 0,23 0,91 0,78 2-methylbutyrat 3 0,26 0,03 0,27 0,24 12 Valin . 0 0,87 0,23 0,91 0,78 3 0,42 0,03 0,43 0,40 13 2-methDxyethanol 0 1,01 0,11 1,06 0,95 3 0,53 0,03 0,53 0,50 14 Triethylengly- 0 1,01 0,11 1,06 0,95 col 3 0,42 0,09 0,50 0,41 15 Tetraethylen= 0 0,01 0,11 1,06 0,95 glycol 3 0,36 0,10 0,45 0,35

Resultaterne i tabel 1 viser, at for det meste 3% tilsatte stoffer er tilstrækkelige til betydeligt at sænke uklarheden af den anvendte humanserum. Særligt effektiv er methanol, acetat, lactat og 2-hydroxyisobutyrat.

5 Endvidere kan det ses, at homogeniteten af de rekonstituerede prøver forbedres af tilsætningerne. Intervallet (Emax“ E .j ) uklarhederne af mindst 11 enkelte prøveflasker bliver tydeligt mindre, dvs. produktet bliver som helhed mere ensartet eller homogent.

10 Eksempel 16 til 19

Til denne forsøgsrække blev anvendt human- eller okseserum. Lipid'indholdet af human- eller dyreserumgrundmassen er bragt op på 350 henholdsvis 150 mg kolesteri.n/dl og 300 henholdsvis 150 mg triglycerid/dl. Tabel 2 sammerfatter resultaterne.

10

DK 158409B

Tabel' 2 · Koncentrat · Uklarhed (E545) Median • Eksempel' Tilsætning' tiofi (g/dl) ' ‘ Humanserum.....Okséserum

Ingen - 2,25 0,65 16 TRA-acetat 5,2 1,40 0,52 17 0MED-(acetat) 2 3,0 0,55 0,25 18 TMED-(2-hy- 4,0 0,51 0,22 droxyisobu- tyrat)2 19 TMA-acetat 3,8 0,31 0,18 TRA = triethanolammonium TMED = tetramethylethylendiammonium TMA = tetramethylammonium 5 Det vil ses, at ved hjælp af en forbindelse af formlen I, hvor Z = COO t sammen med en egnet kation,kan uklarheden af * lipæmiske sera formindskes stærkt. Uklarheden i eksempel 19 stemmer endog overens med det ikke lyofiliserede udgangsmateriale.

Claims (1)

1. DK 158409B Patentkrav. Fremgangsmåde til fremstilling af justerings- eller kontrol-5 sera med ringe uklarhed ved blanding af de ønskede bestanddele i vandig opløsning, lyofi 1isering af opløsningen og rekon-sti tut ion af lyofilisatet med vandig medium, kendetegnet ved, at man før lyofiliseringen tilsætter mindst en af følgende forbindelser: methanol, natriumacetat, triethanolam-10 moniumacetat, tetramethyIdiethylen-ammoniumdiacetat, natrium-propionat, natriumlactat, alanin, natrium-2,2-bis(hydroxyme-thy1)-propi onat, N-methyl di ethanol ammoni um-2,2-bi s (hydroxymethyl )-propionsyreamid, natrium-2-hydroxy-2-methy1 butyrat, valin, 2-methoxyethanol, triethylenglycol, tetraethylenglycol, 15 tetramethy1 ethyl endi ammoni umdi acetat, tetramethylethyl end i am-monium-di-(2-hydroxyisobutyrat) og tetramethylammoniumacetat i en mængde på 0,5 til 10 vægt%, beregnet på den rekonstituerede opløsni ng. 20 25 1 35