DE2617742A1

DE2617742A1 - Stabiles blutplasma, verfahren zu dessen herstellung und seine verwendung als vergleichsplasma bei gerinnungs-untersuchungen

Info

Publication number: DE2617742A1
Application number: DE19762617742
Authority: DE
Inventors: Helmut Dr Heber; Norbert Dr Reimburger; Horst Dr Schwinn; Axel Dr Sieber
Original assignee: Behringwerke AG
Current assignee: Siemens Healthcare Diagnostics GmbH Germany
Priority date: 1974-12-31
Filing date: 1976-04-23
Publication date: 1977-06-30

Description

Stabiles Blutplasma, Verfahren zu dessen Herstellung und
seine Verwendung als Vergleichs plasma bei Gerinnungs-Untersuchunffen Gegenstand des Hauptpatents (Patentanmeldung P 2461 969.0-41-Hoe 74jB 033, Ma 213)ist ein Verfahren zur Herstellung eines Blutplasmas, das hinsichtlich seiner Gerinnungseigenschaften in für Gerinnungsuntersuchungen geeigneten Testsystemen ein weitgehend unverändertes Verhalten zeigt und demzufolge als Standardplasma für Gerinnungsuntersuchungen geeignet ist.
Dieses Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass lyophilisiertes, gegebenenfalls einen Stabilisator enthaltendes Blutplasma in eine Kohlendioxid-Atmosphäre eingebracht wird.
Es wurde nun überraschend gefunden, dass ein lyophilisiertes Blutplasma, das unter einem Schutzgas gelagert wird, mindestens in Bezug auf die folgenden zu nennenden Gerinnungsparameter stabil bleibt, wenn das Schutzgas aus mindestens zwei Komponenten besteht und mindestens 5 °,4, vorzugsweise 10 - 50 Kohlenidoxid enthält. Die in Frage kommenden Gerinnungsparameter sind insbesondere Quickzeit, partielle Thromboplastinzeit, Plasmathrombingerinnungszeit, die Gerinnungsfaktoren II (Prothrombin), V (Akzellerin), X (Stuart-Prower-Faktor), XIII (fibrinstabilisierender Faktor) und Fibrinogen.
Gegenstand der Erfindung ist demnach ein Verfahren zur Stabilisierung von Blutplasma, das dadurch gekennzeichnet ist, dass lyophilisiertes, gegebenenfalls einen Stabilisator enthaltendes Blutplasma in ein Schutzgas eingebracht wird, das aus mindestens zwei Komponenten besteht und mindestens 5 vorzugsweise 10 - so* Kohlendioxid enthält.
Im besonderen betrifft der Erfindungsgegenstand ein Verfahren, wonach lyophilisiertes Blutplasma enthaltende Gefäße evakuiert werden und der luftleere Raum mit einem Kohlendioxid in der genannten Menge enthaltenden Schutzgas gefüllt wird.
Als weitere Bestandteile, die das Schutzgas neben Kohlendioxid enthalten kann, kommen die für diesen Zweck bekannten Gase in Frage. Dies sind ganz allgemein inerte Stoffe, die bei -250C in gasförmiger Phase vorliegen. Zu diesen Gasen gehört in erster Linie Stickstoff, aber auch andere inerte Gase z.B. die Edelgase wie Helium, Neon oder Argon.
Wie bei Blutplasen allgemein erforderlich, enthält das Plasma das zur Verhinderung der Gerinnung des Blutes zugesetzte Anti koagulans, beispielsweise Oxalat- oder Zitrationen in einer bei der Plasmagewinnung üblichen Konzentration von etwa 1 Teil Antikoagulans und 9 Teilen Blut und ggf. weitere Kolloidstabilisierende Zusätze, vorteilhaft in Form von niedrigmolekularen Kohlenhydraten. Letztere in einer Konzentration von 1 - 5 °ffi.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird frisch gewonnenes Blut in bekannter Weise zu einer vorgelegten Menge eines Antikoagulans gegeben, wobei im Falle der Vorwendung von Zitrat beispielsweise 1 Volumenteil einer 8,1 molaren Natriumcitratlösung von pH 7,Q mit 9 Volumenteilen des frisch gewonnenen Blutes vermischt wird. Das Blut wird zentrifugiert, beispielsweise bei 7.500 +- 500 g 20 - 40 Min., vorzugsweise 30 Min., und das über den Blutkörperchen stehende Plasma angegossen und ggf. mit stabilisierenden Substanzen versetzt. Das Plasma wird danach in nicht benetzbare, vorteilhaft in silikonisierte Glasgefäße oder entsprechende Kunststoffgefäße gefüllt, wobei darauf e achtet wird, daß die eingefülite Plasmamange nur etwa 1/3 1/10 des Gesamtvolumens des Gefäßes füllt. Das Plasma wird in den Gefäßen mit möglichst großer Oberflache eingefroren - dies kann vorteilhaft durch rotierendes Einfrieren erreicht werden -und schließlich getrocknet. Die das getrocknete Plasma enthaltenden Gefäße werden evakuiert, wobei es sich als vorteilhaft verwiesen hat, - ein Vakuum von bis 10-4 Torr anzlogen und die Plasmen 2 - 5 Stunden, vorzugsweise 3 - 4 Stunden im Vakuumzu belassen, anschließend den luftleeren Raum mit einem Kohlendioxid enthaltenden Schutzgas zu f und- sphließllo'n io Gefäße luftdicht abzuschließen.
Bekanntlich ist der Gerinnungsmechanismus bei allen Wirbeltieren grundsätzlich ähnlich, so daß kein Hinderungsgrund besteht, entsprechend dem beabsichtigten Verwendungszweck jedes Blutplasma von Wirbeltieren in der beschriebenen Form hinsichtlich der Gerinnungsparameter zu stabilisieren. In der klinischen Diagnostik besteht jedoch ein Bedarf an menschlichen Plasmen mit standardisierten Gerinnungsparametern, so daß als Ausgangsmaterial für das lyophilisierte Plasma gemäß der vorliegenden Erfindung vorzugsweise menschliche Blutplasmen verwendet werden. Insbesondere werden von gesunden Spendern erhaltene Blutplasmen vermischt und erfindungsgemäß stabilisiert Es besteht jedoch keln Hinderungsgrund, Plasmen von Probanden mit definierten Gerinnungsstörungen in der gleichen Weise aufzuarbeiten, um als ein stabiles Bezugssystem für die Bestimmung bzw. den Nachweis von entsprechender Gerinnungsstörung verwendet werden zu können.
Es wurden schon bisher den Blutplasmen bzw. Seren stabilisierende Substanzen zugesetzt, insbesondere zur Stabilisierung der Blutplasmaproteine, vorzugsweise in Form von niedrigmolekularen Kohlenhydraten.
Es hat sich auch im Rahmen der vorliegenden Erfindung als zweckmäßig erwisen, derartige Verbindungen zuzusetzen. Es muß jedoch dabei darauf geachtet werden, daß die verwendeten Stoffe das Gerinnungssystem nicht beeinflussen. Unter diesem Gesichtspunkt sind als stabilisierende Substanzen vorteilhaft neutrale Kohlenhydrate in einer Konzentration bis zu 5 Gew.% den zu lyophiii sierenden Plasmen zuzusetzen. Besonders geeignet sind beispiele weise Saccharose und Lactose, die einzeln oder zusammen 1 - 2 P im Plasma vorhanden sein können. Zudem hat es Eich als vorteilhaft erwiesen, dem Plasma Puffersubstanzen zuzsetzen, die das flüssige Plasma auf einen pH-wert zwischen etwa 7,1 und 7,2 einzustellen vermögen, wobei auch hier darauf zu acht int, daß Puffersubstanzen gewählt werden, die in der erforderlichen Men das Gerinnungssystem im vorliegenden Plasma nicht beeinflussen keine Komplexbildung eingehen und pKa-Werte von etwa 6 bis 8,5 besitzen. Von den diesbezüglich voii N.X. Good et al. 1966 (Biochemistry 5, 467-477) vorgeschlagenen Puffern' die in biochemischen Systemen ein weitgehend indifferentes Verhalten zeigen, hat sich beispielsweise der N-2-Hydroxyäthylpiperazin-N äthansulfonsäure (Hepes)-Puffer in einer Konzentration bis zu 0,01 M als günstig erwiesen. Die Schwierigkeit bei Pufferzusätzen ist u.a. auch dadurch gegeben, daß der Pufferzusatz in fester Form eine lokale Verschiebung des pH-Wertes im Plasma mit der Polge der Störung des Gerinnungssystems bewirkte wohingegen der Zusatz des Puffers in gelöster Form eine unzulässige Verdunnung des Plasmas verursacht.
Das unter einem ohlendioxid enthaltenden Schutzgas aufbewahrte Blutplasma wird wegen seiner Stabilität als Vergleichsplasma bei Gerinnungsuntersuchungen verwendet, insbesondere zur Bestimmung des Quickwertes, der partiellen Thromboplastinzeit, der Plasmathrombingerinnungszeit, der Gerinnungsfaktoren II, V, X, XIII und des Fibrinogens. Die Bestimmungsmethoden entsprechen den im Hauptpatent wiedergegebenen.
Die Erfindung soll am nachstehenden Beispiel näher erläutert werden.
Beispiel: Zu 50 ml eier Zitratpufferlösung mit einem Gehalt von 0,1 M/l Natriumzitrat und einem pH-Wert von 7,0, die steril und frei von Konservierungsmitteln ist, läßt man 450 ml Venenblaut eines gesunden Spenders vorsichtig unter Vermeidung von Schaumbildung zulaufen und mischt die beiden Bestandteile sorgföltig. Das Zitratblut wird bei 8.000 g 30 Min. lang zentrifugiert und das Plasma abgehebert. Das Plaana wird mit dem auf. die gleiche Weise gewonnenen Zitratplasma von 9 weiteren Spendern vermischt so daß ein Pool von insgesamt 10 gesunden Blutspendern resultiert.
Zu der Blasmamischung wird Lactose und Saccharose jeweils bis zu einer Endkonzentration von 1 % zugesetztz. Ferner wird mit einem Zusatz von 4 g N-2-Hydroxyäthylpiperazin-N-äthansulfonsaure (HEPES) pro Liter Plasma, der pH-Wert des Plasmas auf 7,1 eingestellt. Die Plasmamichung wird danach in 1,0 ml Porti onen in Gefäßen mit einem Gesamtinhalt von 6,5 wnl abgefüllt und im Block eingefroren. Das eingefrorene Plasma wird in einer Lyophilisationsanlage getrocknet. Anschließend wird ein Vakuum von 5 x 10-4 Torr erzeugt. Die lyophilisierten Plasmen verbleiben in diesem Vakuum 3 Stunden. Danach läßt man in den evakuierten Raum bis zum Ausgleich auf Atmosphärendruck eine Mischung von 50% Kohlendioxid mit 500% Stickstoff (v:v) oder eine Mischung von 5% Kohlendioxid und 95% Stickstoff einfüllen, wobei der Stickstoff auch durch ein inertes stabiles Edelgas wie Helium, Neon oder Argon mit dem Kohlendioxid gemischt, ersetzt werden kann Die Gefäße werden schliesslich luftdicht verschlossen.
Eine Qualitätsprüfung von 5 willkürlich herausgegriffenen Mustern ergab im Durchschnitt für die Quickzeit 12,0 Sekunden, die partielle Thromboplastinzeit 41,8 Sekunden und für die Plasmathrombingerinnungszeit 19,4 Sekunden. Es hat sich gezeigt dass diese Werte nach einigen Monaten Lagerung seDst bei 370C kaum verändert sind und bei einer Lagerung bei 40C über mehr als 3 Jahre nur unwesentliche Abweichungen erwarten lassen.

Claims

Patentansprüche Verfahren zur Stabilisierung von Blutplasma gemäss Patent (Patentanmeldung 24 61 969.0-41), dadurch gekennzeichnet, dass lyophilisiertes, ggf. einen Stabilisator enthaltendes Blutplasma in ein Schutzgas eingebracht wird, das aus mindestens 2 Komponenten besteht und mindestens 50/b, vorzugsweise 10-50 Kohlendioxid enthält.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass frisch gewonnenes Blut zu einer vorgelegten Menge eines Antikoagulans gegeben, das Blut zentrifugiert, das Plasma gewonnen, ggf. mit stabilisierenden Substanzen versetzt, in nicht benetzbare Gefäße abgefüllt, unter Ausbildung einer grossen Oberfläche eingefroren, lyophilisiert, evakuiert und schliesslich unter einem Schutzgas gemäss Anspruch 1 verschlossen wird.
3. Verwendung von lyophilisiertem, unter einem Schutzgas gemäss Anspruch 1 aufbewahrtem Blutplasma als Vergleicnsplasma bei Gerinnungsuntersuchungen.