DK147914B - Lithiumpseudomonat og fremgangsmaade til fremstilling deraf - Google Patents

Description

1479-14 i

Den foreliggende opfindelse angår det hidtil ukendte lithiumsalt af pseudomonsyre, som er en antibakteriel forbindelse, og en fremgangsmåde til fremstilling deraf.

5 Pseudomonsyre er forbindelsen med formlen I

OH

10 CH,

3 T T COO(CH-)qCOOH

CH3 I

OH

15 Det beskrives i britisk patentskrift nr. 1.395.907, at denne forbindelse har antibakteriel virkning, og at den derfor er værdifuld i behandlingen af bakterielle infektioner i mennesker og dyr. Den fremgangsmåde, der beskrives i britisk patentskrift nr. 1.395.907 til 20 fremstilling af pseudomonsyre, omfatter isolering af en blanding, der indeholder de principielle aktive syrebestanddele fra et dyrkningsmedium, hvorpå eller hvori Pseudomonas fluorescens er dyrket vinder aerobe betingelser, hvorefter syren skilles fra blandingen 25 ved chromatografi.

Det har nu vist sig, at pseudomonsyre kan isoleres direkte fra en ekstraheret opløsning af gæringsmediet i form af sit lithiumsalt.

30

Lithiumsaltet af pseudomonsyre (i det efterfølgende benævnt lithiumpseudomonat) er som nævnt en hidtil ukendt forbindelse og udgør ét aspékt af den foreliggende opfindelse. Selv om natriumsaltet af pseudomonsyre beskri-35 ves i britisk patentskrift nr. 1.395.907, er anvendelsen af lithiumsaltet hverken beskrevet eller gjort nærliggende derved. Medens natriumsaltet er en amorf og hygro- 147914 2 skopisk forbindelse, er lithiumpseudomonat overraskende stabilt, krystallinsk og ikke-hygroskopisk. Desuden er lithiumsaltet langt mindre opløselig end natriumsaltet.

Disse egenskaber kunne ikke forudsiges på grundlag af 5 britisk patentskrift nr. 1.395.907 og gør lithiumpseudomonat til et nyttigt mellemprodukt til isoleringen eller rensningen af pseudomonsyre.

Et andet aspekt af den foreliggende opfindelse er såle-10 des en fremgangsmåde til fremstilling af lithiumpseudomonat, hvilken fremgangsmåde er ejendommelig ved, at et råpræparat, der indeholder pseudomonsyre, eks-traheres med et polært, organisk, med vand ikke-bland-bart opløsningsmiddel, hvori pseudomonsyre er opløse-15 lig, ekstrakten behandles med et lithiumsalt, som er i det mindste lidt opløseligt i det med vand ikke-bland-bare opløsningsmiddel, og det resulterende lithiumpseudomonat isoleres.

20 Lithiumpseudomonatet kan derpå omdannes til den fri syre, pseudomonsyre, eller et andet salt deraf ved konventionelle teknikker.

Fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse er 25 særlig egnet til isolering af pseudomonsyre i form af sit lithiumsalt fra et dyrkningsmedium, hvorpå eller hvori pseudomonsyreproducerende bakteriestammer er dyrket. I dette tilfælde udføres fremgangsmåden mest hensigtsmæssigt på den nedenfor beskrevne måde.

30

En pseudomonsyreproducerende bakterie, i almindelighed en bakteriestamme af slægten Pseudemonas, dyrkes ved en standardmetode under aerobe betingelser i eller på et egnet dyrkningsmedium. Sådanne dyrkningsmedier er 35 almindeligt kendte og indeholder uorganiske salte og kilder for assimilerbart nitrogen og carbon. Det er mest hensigtsmæssigt at anvende bakterien Pseudomonas 3 1479 14 fluorescens. En egnet offentlig tilgængelig stamme er Pseudomonas fluorescens NC1B 10586. Mikroorganismen lades vokse, indtil der er en passende mængde pseudo-monsyre til stede i dyrkningsmediet. Faste partikler 5 kan derpå fjernes fra mediet ved filtrering eller centrifugering, hvorved fås en klar væske. Den klare væskes pH-værdi indstilles til 3,0 - 5,0, hensigtsmæssigt ca. pH-værdi 4,5.

10 Denne syrnede vandige opløsning ekstraheres derpå med et polært, organisk, med vand ikke-blandbart opløsningsmiddel. Der foretrækkes aprote opløsningsmidler. Opløsningsmidlet bør have en tilstrækkelig polaritet til at opløse pseudomonsyren i tilstrækkelig grad.

15 Egnede opløsningsmidler er f.eks. ethylacetat, butanol, methylisobutylketon (MIBK) eller methylendichlorid.

Der kan alternativt anvendes blandede opløsningsmidler, f.eks. ether, der indeholder ca. 5% ethanol. Et foretrukket opløsningsmiddel er methylisobutylketon.

20

Det volumen opløsningsmiddel, der anvendes til ekstraktionen, bør holdes på et minimum, medens der sikres god fysisk adskillelse mellem de to faser. Når der ekstraheres en dyrkningsvæske, er et passende volumen fra 1/2 25 til 1/6, fortrinsvis 1/4 af volumenet af den væske, der skal ekstraheres.

Det er ofte fordelagtigt at vaske ekstrakten med saltopløsning, f.eks. under anvendelse af et volumen på 1/10 30 af ekstraktvolumenet for at reducere vandmængden i ekstrakten.

Det næste trin i fremgangsmåden er at behandle ekstrakten med et lithiumsalt. Det anvendte lithiumsalt bør ideelt 35 være mere opløseligt i opløsningsmidlet end lithiumpseudomo-nat. Det er fortrinsvis lithiumsaltet af en organisk carboxylsyre, f.eks. et salt af en alkansyre med den almene

formel II

-14791A

4 — +

R - COOLi II

5 hvor R betegner en alkylgruppe, der f.eks. indeholder fra 1 til 20 carbonatomer, fortrinsvis fra 1 til 8 carbon-atomer.

10 Eksempler.på egnede lithiumsalte er acetatet, propionatet og hexanoatet, idet et foretrukket salt er lithium-2-ethyl-hexanoat.

Lithiumsaltet kan sættes til ekstrakten i fast form, men 15 det foretrækkes at tilsætte det som en koncentreret opløsning i et co-opløsningsmiddel, som opløser lithiumsaltet, men som i det væsentlige ikke solubiliserer lithiumpseudomonat. Sådanne co-opløsningsmidler er f.eks. ethanol og, fortrinsvis, methanol.

20

Det foretrækkes almindeligvis at anvende ca. 10%'s overskud af lithiumsalt og langsomt at tilsætte en opløsning . af saltet til ekstrakten. I de fleste tilfælde vil li-thiumpseudomonatet krystallisere ud, en proces, som 25 lettes ved at afkøle til ca. 0 - 5°C. Lithiumpseudomo-natet kan isoleres ved konventionelle teknikker. Det kan være fordelagtigt, efter isoleringen af den første mængde lithiumpseudomonat, at koncentrere og isolere et yderligere udbytte.

30

Da lithiumpseudomonat ikke er hygroskopisk, kan det tørres i en luftovn. Dette er ikke muligt med natrium-pseudomonat og heller ikke med pseudomonsyre selv, som det er vanskeligt at tørre på anden måde end i en 35 vakuumovn eller meget forsigtigt ved lav temperatur.

14791A

5

Lithiumpseudomonatet kan omdannes til andre salte eller den fri syre selv ved konventionelle teknikker, f.eks. ved syrning og ekstraktion med et organisk opløsningsmiddel.

5 Fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse belyses nærmere ved eksempel 1, mens eksempel 2 belyser omdannelsen af lithium-pseudomonat til pseudomonsyre.

Eksempel 1.

10

Isolering af lithiumpseudomonat.

Et dyrkningsmedium, der indeholder pseudomonsyre, syrnes til pH-værdi 4,5 under anvendelse af 20%'s saltsyre og 15 ekstraheres med 1/4 af sit eget volumen methyliso-butylketon. Methylisobutylketonekstrakten vaskes med 1/10 af sit eget volumen mættet saltopløsning. Pseudo-monsyreindholdet er i dette trin 2500 ^,ug/ml og vandindholdet er 1,0%.

20

Til 10 liter af methylisobutylketonekstrakten sættes dråbevis en opløsning af 9,0 g lithiumethylhexanoat i 35 ml methanol i løbet af 0,5 time ved stuetemperatur, og blandingen omrøres i yderligere 1 time ved 20°C og 25 derpå i 1 time ved 5°C. Det udfældede produkt isoleres ved filtrering, vaskes med methylisobutylketon og lufttørres ved 50°C, hvorved fås 26,5 g (90% af det teoretiske) lithiumpseudomonat, smeltepunkt 169°C, renhed 87%.

30

Eksempel 2.

Omdannelse til pseudomonsyre.

35 10 g af det i eksempel 1 vundne lithiumpseudomonat op løses i 200 ml vand. Der tilsættes 85 ml methylisobutylketon, og pH-værdien indstilles til 4,0 med 4N saltsyre.

Claims (5)

147914 δ Den øvre methylisobutylketonfase fraskilles og tørres over vandfrit natriumsulfat, og den frie syre udfældes ved tilsætning af 130 ml heptan. Efter afkøling til 5°C isoleres pseudomonsyre ved filtrering. Herved 5 fås 8,0 g (85% af det teoretiske), smeltepunkt 77 - 78°C, renhed 90%. 10

1. Lithiumpseudomonat.

2. Fremgangsmåde til fremstilling af lithiumpseudomonat, kendetegnet ved, at et råpræparat, der indeholder 15 pseudomonsyre, ekstraheres med et polært, organisk, med vand ikke-blandbart opløsningsmiddel, hvori pseudomonsyre er opløselig, ekstrakten behandles med et lithiumsalt, som er i det mindste lidt opløseligt i det med vand ikke-blandbare opløsningsmiddel, og det resulterende lithiumpseudo-20 monat isoleres.

3. Fremgangsmåde ifølge krav 2, kendetegnet ved, at råpræparatet, der indeholder pseudomonsyre, er et dyrkningsmedium, på 25 eller i hvilket pseudomonsyreproducerende bakteriestammer er dyrket.

4. Fremgangsmåde ifølge krav 3, kendetegnet ved, at den pseudomonsyreproducorencio 30 bakteriestamme tilhører arten Pseudomonas fluorescens.

5. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 2-4, kendetegnet ved, at det lithiumsalt, hvormed 35 ekstrakten behandles, er et salt af en alkansyre med den almene formel - + R - COOLi hvor R betegner en alkylgruppe med 1-20 carbonatomer.