DK147162B - Fremgangsmaade til submers dyrkning af en basidiomycet af slaegten coriolus - Google Patents

Description

(19) DANMARK (¾)

φ (12) FREMLÆGGELSESSKRIFT od 147162 B

DIREKTORATET FOR

PATENT- 06 VAREMÆRKEVÆSENET

(21) Patentansøgning nr.: 3756/77 (51) lnt.CJ.3: C12 N 1/14 (22) Indleveringsdag: 24 aug 1977 (41) Alm. tilgængelig: 25 feb 1978 (44) Fremlagt: 30 apr 1984 (86) International ansøgning nr.:- (30) Prioritet: 24 aug 1976JP 51/100157 (71) Ansøgen *KUREHA KAGAKU KOGYO KABUSHIKI KAISHA; Tokyo, JP.

(72) Opfinder: Chlkao *Yoshikuml; JP, Toshlhiko *Wada; JP, Hlromltsu ‘Maklta; JP, Kfnzaburo ‘Suzuki; JP.

(74) Fuldmægtig: Ingeniørfirmaet Lehmann & Ree (54) Fremgangsmåde til submers dyrkning af en basidiomycet af slægten Coriolus

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til submers dyrkning af en basidiomycet af slægten Coriolus, ved hvilken et dyrkningsmedium podes med en homogeniseret podekultur af basidiomyceten.

I de senere år har en stadig stigende anvendelse af basi- · diomyceter af slægten Coriolus som udgangsmateriale for medicinske præparater omfattende antitumorigene midler og for sundhedsbefordrende levnedsmidler og drikkevarer fundet sted, og det stigende behov for sådanne basidiomycet er har tilskyndet til emfattende studier 0 vedrørende dyrkning af svampene, og der er fremkommet mange forsk- N ningsrapporter om dette emne. Imidlertid kræver basidiomyceterne

D

— lang dyrkningstid sammenlignet med bakterier eller gær, og dette har udgjort et alvorligt problem ved industriel produktion af t 2 147162 svampene. Der er talrige faktorer, såsom substratsammensætning, dyrkningstemperatur, substrat-pH, beluftningshastighed og omrøringshastighed, som må tages i betragtning ved afkortning af dyrkningsperioden ved submers dyrkning af basidiomyceterne, og den mængde podekultur, der inokuleres i mediet, er også en betydningsfuld faktor i denne forbindelse. Generelt gælder, at jo større den mængde podekultur, der inokuleres pr. mængdeenhed substrat, er, jo mere afkortes dyrkningsperioden. Imidlertid er der naturligvis en vis øvre grænse for den podekulturmængde, der kan inokuleres i et substrat, og specielt i forbindelse med anvendelse af en stor tank som fermenter er store rumfang podestof nødvendige, hvilket i økonomisk henseende er en ulempe.

I beskrivelsen til britisk patent nr. 1.331.513 beskrives en fremgangsmåde til submers dyrkning af basidiomyceter, bl.a. af slægten Coriolus, ved hvilken fremgangsmåde et submers dyrkningsmedium podes med en homogeniseret podningskultur af svampen, men den angivne fremgangsmåde er helt generel, og der findes i patentskriftet ingen indikation vedrørende størrelsen af myceliepartik-lerne og den mængde homogeniserede myceliepartikler, som skal podes i et bestemt volumen af hovedkulturens dyrkningsmedium.

Et nærmere studium af dette emne har imidlertid godtgjort, at ved submers dyrkning af basidiomyceter, som tilhører slægten Coriolus af Polyporaceae-familien, kan dyrkningsperioden af basidiomyceterne reduceres betydeligt og/eller udbyttet øges væsentligt samtidig med, at der er behov for en betydelig mindre mængde podningsmycelium.

Dette opnås ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen af den i indledningen omhandlede art, hvilken fremgangsmåde er ejendommelig. ved, (a) at podekulturen homogeniseres til en ensartet opslæmning indeholdende det homogeniserede mycelium i partikler med en størrelse på 50-1000 micron, og (b) at det submerse dyrkningsmedium podes med den homogeniserede opslæmning af podekulturen, således at det submerse dyrkningsmedium indeholder 0,01-0,2 g myceliumpartikler pr. liter dyrkningsmedium.

Betegnelsen "submers dyrkning" benyttes her i betydningen rystedyrkning eller beluftet rystedyrkning. Rystedyrkning benyttes normalt til dyrkning af podekultur i dens initiale stadium eller til kulturproduktion i lille målestok, medens beluftet rystedyrk- 3 147162 ning benyttes til forholdsvis omfattende produktion under anvendelse af en tankfermenter.

Opfindelsen vil nu blive nærmere belyst under henvisning til tegningen, hvor: fig. 1 er en grafisk afbildning, der, i relation til et sammenligningseksempel, viser den opnåelige reduktion af rumfanget af podestof i substratet og af den nødvendige dyrkningstid, når der til indpodning ifølge fremgangsmåden ifølge opfindelsen benyttes en homogen opslæmning fremkommet ved homogenisering af podekultur, og fig. 2, 3 og 4 er fotografier af mycelium efter homogeniseringsbehandlingerne 1, 2 og 3 (jvf. nedenstående eksempel 1).

I den grafiske afbildning på fig. 1 viser den lodrette akse den dyrkningstid, der er nødvendig for at opnå et mycelium-udbytte af størrelsen 11 g/liter, og den vandrette akse viser koncentrationen (g/liter1 af den i substratet indpodede podekultur. Endvidere viser kurve (I) resultatet ved fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse, og kurve (II) resultatet af sammenligningseksemplet .

Ved betragtning af figurerne 2, 3 og 4 skal det bemærkes, at de klumper, som eksisterede efter behandlingerne 2 og 3, ikke kunne erkendes ved visuel betragtning udefra uden hjælpemidler af den homogeniserede opslæmning, hvori de var frembragt.

De i forbindelse med opfindelsen benyttede basidiomyceter er sådanne, som tilhører slægten Coriolus af Polyporaceae-familien, og de mykologiske egenskaber af disse basidiomyceter er beskrevet i "Colored Illustration of Fungi of Japan" af Rokuya Imazeki og Tsuguo Hongo, bind I, 1975, og II, 1974, og "Fungi in Japan" af Seiya Itoh. Typiske eksempler på disse basidiomyceter er Coriolus versicolor (Fr.) Quel., Coriolus consors (Berk.) Imaz., Coriolus hirsutus (Fr.) Quel., Coriolus pargamenus (Fr.) Pat., Coriolus pubesens (Fr.) Quel. og Coriolus conchifer (Schw.) Pat.

I den foreliggende opfindelse benyttes podekulturen af disse basidiomyceter ikke i den form, den umiddelbart fremkommer i, men i form af en homogen opslæmning fremkommet ved homogenisering af den på forhånd fremstillede podekultur.

147162 4

De ved dyrkning af en basidiomycet fremkomne podekulturer omfatter trådede mycelier, og de fleste er granulære eller har form af klumper, stort set på størrelse med adzuki-bønner, hvorved et uhomogent blandingssystem dannes. At homogenisere en sådan podekultur er at udsætte klumperne for forskydningskræfter, således at klumperne opbrydes, hvorved det trådformede mycelium bliver ligeligt dispergeret enkeltvis, og dannelse af små snit i myceliet under.homogeniseringen gør ingen skade for så vidt angår den foreliggende opfindelse. Der kan således tilvejebringes en opslæmning, hvor myceliet under forskydningskraften dispergeres ligeligt. Det bør derfor forstås, at homogeniseringsbehandlingen af den til fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse anvendte podekultur udøves, indtil der er fremkommet en opslæmning, der er homogeniseret i en sådan grad, at tilstedeværelsen af mycelieklumper ikke kan erkendes udefra, og at størrelsen af klumperne ligger i området fra 50 til 1000 μια.

Homogeniseringsbehandlingen af podekulturen gennemføres sædvanligvis ved at anvende velkendt udstyr, såsom en homogenisator, en homogeniseringsblender, et dispersionsblandeapparat, en frugtsaftpresser eller et skrueblandeapparat.

Den tid, der er nødvendig for ved hjælp af sådant homogeniseringsudstyr af podekulturen at danne en homogen opslæmning, i hvilken det homogeniserede mycelium indeholdes i partikler med en størrelse på 50-1000 micron, ligger, skønt den varierer alt efter den anvendte type basidiomycet og dyrkningsbetingelserne ved fremstilling af podekulturen, sædvanligvis i området fra 30 sekunder til ca. 10 minutter. Det bør her bemærkes, at hvis podekulturen udsættes for for voldsom forskydningskraft, således at størrelsen af mycelieklumpen reduceres til 2-3 μ x 10-50 μ, kan myceliet blive sønderdelt, hvilket har en ugunstig virkning på opformeringen af svampene ved den påfølgende dyrkning.

Den mængde podekultur af ovennævnte homogene opslæmning af homogeniseret podekultur, der indpodes i substratet med henblik på hoveddyrkningen, er 0,01-0,2 g, fortrinsvis 0,05-0,15 g pr. liter substrat. Når disse tal sammenlignes med de, som er nødvendige (0,3-1,0 g/1), når en sædvanlig ikke-homogeniseret'podekultur benyttes, er det klart, at fremgangsmåden ifølge opfindelsen markant kan reducere den mængde podekultur, der er nødvendig til indpodning.

5 147162

Det til dyrkning af basidiomyceter ved indpodning af podekultur ifølge fremgangsmåden ifølge opfindelsen anvendte substrat er et vandigt substrat til dyrkning af basidiomyceter, og dette substrat er gængs. Dyrkningsbetingelserne, såsom dyrkningstemperatur, beluftningshastighed og omrøringshastighed, er de almindeligt anvendte dyrkningsbetingelser. I det følgende er nogle udførelsesformer for fremgangsmåden ifølge opfindelsen angivet.

Eksempel 1 120 liter substrat med følgende sammensætning: dextrose 50 gram gærekstrakt 7,5 gram vand 1 liter (pH: 6,5) indførtes i en fermenter med rumindholdet 200 liter og underkastedes tryksterilisering ved 120°C ifølge en velkendt metode. Derefter homogeniseredes mycelium af Coriolus versicolor (Pr.)

Quel., som på forhånd var dyrket i en 30 liter glasfermenter, ved hjælp af en homogeniseringsblender (fremstillet af Sakuma Seisakujo Ltd.) i den i nedenstående Tabel 1 viste tid, indtil klumperne blev usynlige for det blotte øje. Det homogeniserede mycelium indpodedes i 200-liter fermenteren under anvendelse af de i Tabel 1 viste podemængder og udsattes derefter for en 150 timers dyrkning ved en temperatur på 25°C, en beluftningshastighed på 0,5 v.v.m. og en omrøringshastighed på 250 rpm. Myceliet fraskiltes fra den fremkomne kultur, vaskedes med vand, ethyl-alkohol og acetone og tørredes derefter ved 80°C. Resultaterne er vist i nedenstående Tabel 1.

6 147162

Tabel 1

Nr. Homogeniserings- Podemængde Iagttagelser/ Mycelieudbytte behandling af podekultur partikelstør- (g/1 substrat) (tid) (g/l substrat) relse 1 0 0,011 Mycelieklumper 5,5 forefandtes/ 1500-3000 ym 2 2 min. 0,011 Mycelieklumper 10,9 forefandtes i ringe grad/600-'1000 ym 3 7 min. 0,031 Mycelieklumper 12,9 forsvandt stort set/100-500 ym 4 0 0,100 Mycelieklumper 11,6 forefandtes/ 1500-3000 ym

Af ovenstående tabel ses det, at når dyrkningen gennemføres ved at indpode en ensartet opslæmning af homogeniseret podekultur, kan der opnås samme mycelieudbytte for en inokuleringsmængde på ca. 1/10 af den, der er nødvendig, når ikke-homogeniseret podekultur benyttes.

Eksempel 2 I dette eksempel gennemførtes dyrkning ved i et dyrkningsforløb at anvende den homogeniserede podekultur fremstillet ifølge opfindelsen og ved i et andet dyrkningsforløb at benytte den ikke-homogeniserede podekultur, og de tider, der var nødvendige for at nå et udbytte på ca. 11 g pr. liter substrat for de respektive dannede mycelier, sammenlignedes.

Podekulturen af samme art, som benyttedes i eksempel 1, homogeniseredes ved den i eksempel 1 beskrevne fremgangsmåde til en partikelstørrelse på 100-500 ym, og denne homogeniserede podekultur indpodedes i samme substrat som anvendtes i eksempel 1 og underkastedes derefter dyrkning, medens en podekultur af samme art som nævnt ovenfor, men ikke homogeniseret, inokuleredes og dyrkedes på tilsvarende måde i et andet dyrkningsforløb. De fremkomne resul 7 147162 tater var de på tegningen viste. Det ses af tegningen, at ved anvendelse af en ensartet opslæmning af homogeniseret podekultur er den dyrkningstid, der er nødvendig for at opnå et myceliumudbytte af størrelsen 11 g/1, betydeligt afkortet ved en illle mængde podestof sammenlignet med det tilfælde, hvor ikke-homoge-niseret podekultur anvendes.

Eksempel 3 (Sammenlignende eksperimenter)

De bedre resultater, der opnås ved fremgangsmåden ifølge nærværende opfindelse fremgår af de i efterfølgende Tabel 2 anførte eksperimentelle afprøvningsdata.

Blandt de anførte forsøg svarer eksperiment (1) til foranstående eksempel 1, medens eksperiment (5) er en eftergørelse af eksempel 10 i beskrivelsen til britisk patent nr. 1.331.513, og eksperiment (2), (3) og (4) repræsenterer modifikationer af disse eksempler. I eksperimenterne (2), (3) og (4) blev podningskulturen således fremstillet ved stationær dyrkning, men for at opnå et mycelium med finere partikler blev homogeniseringstiden i eksperiment (2) og (3) forlænget til 30 minutter, således at der fremkom mycelium med en gennemsnitlig partikelstørrelse med en diameter på 100-1000 micron.

Formålet med udførelsen af eksperimenterne (2), (3) og (4) var at belyse virkningen af forskelle mellem eksempel 1 ifølge nærværende ansøgning og eksempel 10 ifølge det britiske patentskrift.

I eksempel 1 ifølge nærværende ansøgning fremstilles pode-kulturen ved submers dyrkning, medens den ifølge eksempel 10 i det britiske patentskrift fremstilles^ ved.,stationær dyrkning, og desuden er der mindre forskelle mellem dyrkningsmedierne anvendt i eksempel 1 ifølge nærværende ansøgning og i eksempel 10 ifølge det britiske patentskrift såvel som forskelle i driftsbetingelserne.

Eksperimenterne (2), (3) og (4) blev udført med henblik på at belyse, om disse forskelle havde nogen indvirkning på udbyttet af mycelium fra hovedkulturen.

Det fremgår af tabellen, at der er stor forskel mellem mycelieudbyttet i eksperiment (3) og eksperiment (5), samt mellem eksperiment (2) og eksperiment (4).

Til trods for forskellene mellem sammensætningen af dyrkningsmediet og driftsbetingelserne mellem eksperiment (2) og eksperiment (3) henholdsvis mellem eksperiment (4) og eksperiment (5) er forskellene i udbytte mellem eksperiment (2) og eksperiment (3) „ 147162 8 henholdsvis mellem eksperiment (4) og (5) forholdsvis små.

Disse resultater viser klart, at forskellene i de opnåede mycelieudbytter mellem eksperiment (3) og (5) henholdsvis mellem eksperiment (2) og (4) skyldes podekulturens myceliepartikelstør-relse ved podning i hovedkulturmediet, eftersom sammensætning og driftsbetingelserne ved (3) og (5) henholdsvis ved (2) og (4) er de samme.

Forsøgsresultaterne viser således klart nærværende fremgangsmådes overlegenhed i forhold til den fra britisk patentskrift nr. 1.331.513 kendte fremgangsmåde og viser endvidere, at nærværende fremgangsmåde ikke kan uddrages som en lære af det britiske patentskrift.

9 147162 la * 11!

m 4J LO g» IL M ΐ 5 W

CT* *H · CO »i λ ·§ H H «8 3¾ tf" CO rS H H O fl,Tl .j, H'Hh & % t § SI 2 * . 10 i S ? rH |fl|o ΰ 1H i S 5 r~ g S <; -Η Ό H ^ ih lt - H ?,aj "

Ilt O I s-°a & |®= *, |l| M-i »§ J2 Η Τι n

^+)®u s S 8ti’H

SI|I ti i- έ § Jji*_ n hj 'x 51 -S-H -H H o o w o * 8,8,5 4J in in o in ^1

ft1 Κ Π ft g S CM rH O CM

j2 φ Φ -P 8 8 _.

W Ό Λ Cfl U3 W XJ m n I f. 1¾ il! 3 1 ~H til o ith«

il ~ g -S Ϊ U S i O Η H fl 3 I H ' U

3 JS i il I " i S ~ ~ ~ O 044

2 O I 3 ·* * H 0 ?sif “'I

<” laf S g g E3 " 0 S & φ SnsJS » « « η ^ m 1 i? 1\ «η M i 3 H il I ° &Jt l C^jjSsh Ό& & o ø -ϋ O) 2 SS-S 8 y 3 So 3 H -§| e* % I Jtøl il * " i s Saln c s “I 11? I ·Η -H 3 ° « s ^ s «* 11 > i5¾ ja s s " H z" * " ^ ” 3«1 i li λ s.*h *h |s| » S SB1® -|rHrH «8 3 *3 3 64 'H b*'h I s. 1 g 5 -η 3 ^ s S § ^ I ε « *y di i ^ ^3 s ^ °i 8* .5 gj ο π 031¾ TD o o Md)

<ij ffl a> m -η η o ^ o in o H

q, 5 S q, £ mm-in c tf S Η B 5 g g IN rH O CM 33 eses § S s 1 31 JUtj r i li'SSl 3 - au 1 λ al s ^ -s 51 is «

Il Ή I g- 8si 251 f ou 1 > u S>_ I

trtj ·· 1 -d tfl S ό tf h S H w tf ^ ti ® ^ g ό

Bj ^ cf i — i3 <i) ·· ti · 3 ·· m y &)Q ^ c tf S> Π to -hi _ -d Τ3 H o- 3 y 44 -p. - 9 d to g S tf C? a ni h ad - s 113s i&f a s S s | ϊ «si g I ri»i tlPPil a.3|f| il itll :|| : i 111 li 11 lu i! 1 #iP 11 li 21 fil :

i å is I 21 iP