DK143606B - Fremgangsmaade til fremstilling af dihydromocimycin eller salte heraf - Google Patents

Description

(19) DANMARK

|j| (12) FREMLÆGGELSESSKRIFT od 143606 B

DIREKTORATET FOR PATENT- OG VAREMÆRKEVÆSENET

(21) Ansøgning nr. 2151/76 (51) intci.9 C 12 P 19/26 (22) Indleveringsdag 15· maj 1976 C 07 H 7/06 (24) Løbedag 15· maj 1976 (41) Aim. tilgængelig 17· nov. 1976 (44) Fremlagt 14. s ep. 1 981 (86) International ansøgning nr. -(86) International indleveringsdag -(85) Videreførelsesdag -(62) Stamansøgning nr. -

(30) Prioritet 16. maj 1975, 20926/75# GB 22. jul. 1975, 50646/75, GB

(71) Ansøger GIST-BR0CADES N.V., Delft, NL.

(72) Opfinder Hendrik Marten Jongsma, NL: Hermanus Jacobus Koore= man, NL: Jan Lambert van Os, NL: Cornells Vos, NL.

(74) Fuldmægtig Internationalt Patent-Bur eau.

(54) Fremgangsmåde til fremstilling af dlhydromoclmycin eller salte heraf.

Opfindelsen angår en fremgangsmåde til fremstilling af et hidtil ukendt antibiotikum kaldet dihydromocimycin eller et ikke-toksisk, farmaceutisk acceptabelt salt heraf. Dette antibiotikum er særlig værdifuldt over for svinesyg-dommen kaldet Treponema dysenteri, Vibrio Doyle, osv.

® Dihydromocimycin har følgende formel

CD

O

CO

OO

-ct *

Q

143606 2 /n ° o ho oh N oh

y<A. A/Y/V

S\ 0 æ% H

H OH

D ihydromocimycin fremstilles ved at forgære Streptomyces ramocissimus og dannes ud over mocimycin. Streptomyces ramocissimus er en mikroorganisme, der er beskrevet i engelsk patentbeskrivelse nr. 1325200. Mikroorganismen er deponeret i kultursamlingen på Centraal Bureau voor Schimmelcultures i Baarn, Holland, hvor den har fået nummeret CBS 190.69, og hvorfra den er tilgængelig for offentligheden.

Den engelske patentbeskrivelse nr. 1325200 beskriver en fremgangsmåde til fremstilling af mocimycin (på det tidspunkt kaldet MYC 8003) ud fra den ovenfor omtalte mikroorganisme. Opbygningen af mocimycin er angivet af Vos og Verwiel i Tetrahedron Letters 52 (1973) pp. 5173-5176. Det har nu vist sig, at Streptomyces ramocissimus fremstiller dihydromocimycin ud over mocimycin.

Dihydromocimycin er et svagt gult fast stof, svagt surtog yderligere karakteriseret ved følgende fysisk-kemiske egenskaber:

Opløse lighed.

Opløseligheden af forbindelsen er god i chloroform, methylisobutylketon, ethylacetat, butylacetat, acetone, dioxan, methanol, ethanol, tetrahydrofuran og i svagt alkaliske vandige opløsninger. Opløseligheden er moderat i carbontetra-chlorid og benzen, og forbindelsen er uopløselig i diethylether, vand, svagt sure vandige opløsninger, cyclohexan og petroleumsether.

Optisk drejning.

[a]p® = -85° (1% methanolisk opløsning).

SmeItepunkt:

Forbindelsen smelter ikke, men dekomponering begynder ved 123°C.

Elementaranalyse: Følgende værdier fandtes:

Fundet: Beregnet for 2N2 ^12 * ^*2 ^: C: 61,8% 61,8% H: 7,5% 8,0% N: 3,4% 3,3% C: 27,2% (ved differens) 26,8% 3 143606

Ultraviolet spektrum:

Det ultraviolette spektrum af dihydromocimycin i en l:l-blanding af vand og methanol ved forskellige pH-værdier er afbildet i fig. 1 på den medfølgende tegning. Koncentrationen af de målte opløsninger var 18,3 /tg/ml. Det ultraviolette spektrum er afhængig af pH-værdien. Følgende maksima måltes (molekylær extink-tion er angivet mellem klammerne): methanol - vand: 233,5 nm (f = 63.000); 267 nm (f = 23.000); 291 nm (£ = 19.000) og 333 nm (£ = 18.000); kurve 1; methanol - 0,5N NaOH: 235 nm (£ = 62.000); 277 nm (£ = 25.000) og 308 nm (fc = 29.000); kurve 2; methanol - 0,5N HC1: 233,5 nm (£ = 65.000); 268 nm (£ = 25.000) og 338 nm (t- 14.000); kurve 3.

Infrarødt spektrum: IR-spektret af dihydromocimycin i chloroform og i kaliumbromid er afbildet i figurerne 2 og 3. Følgende hovedabsorptioner fandtes: chloroform (0 i cm-1): - 3445 (sh); 3430; 2979; 2941; 2886; 1662-1653; 1458; 1100; 1080; 1040; 998; 944; 893; 870 og 840; kaliumbromid (0 i cm'1): ΐ 3400-3320; 2972; 2935; 2880; 1650; 1535; 1455; 1099; 1040; 990; 943; 860; 840 og 790.

PMR-spektrum: PMR-spektret af dihydromocimycin opløst i deuterochloroform, idet man anvendte tetramethylsilan som indre reference^ er afbildet i fig. 4 (60 Mc).

Tynd tlags chr oraa t ograf i:

Tyndtlagschromatogrammer af dihydromocimycin foretoges på kiselgel F 254 plader (Merck, plader der lige er til at anvende), og efter tørring afsløredes pletterne ved fluorescensextinktion eller ved carbonisering efter sprøjtning med en diethylether-svovlsyreblanding. Undersøgelserne afslørede, at den plet, der svarede til dihydromocimycin,selv ved de reneste fremstillinger altid var ledsaget af en lille yderligere plet. Fremkomsten af to pletter skyldes en tautomer ligevægt, som kan vises ved et todimensionelt chromatogram.

Følgende R^-værdier fandtes for dihydromocimycin i forskellige eluerings-midler (R^-værdierne for den ekstra plet er angivet i klammerne): 50:45:5 blanding af methylisobutylketon, acetone og vand: 0,44 (ca. 0,44); 70:20:10:0,5 blanding af ethylacetat, methanol, vand og 25% ammoniak: 0,29 (0,36); 65:40:9 blanding af benzen, 100% ethanol og 33% ammoniak: 0,16 (0,22); 60:42:10 blanding af chloroform, 96% ethanol og 25% ammoniak: 0,4.

143606 4

Den strukturelle formel for dihydromocimycin bekræftedes ud fra følgende beviser: PMR-spektret (220 Mc) af mocimycin (Jfr. Tetrahedron Letters 52 (1973) side 5173-5176 om dets strukturelle formel) og dihydromocimycin viste, at begge forbindelser er ens, bortset fra to dubletter ved S 5,9 og 7,3 ppm (tetramethyl-silan anvendtes som reference), der fandtes i spektret for mocimycin, men som ikke fandtes i spektret for dihydromocimycin. Disse signaler er forårsaget af protonerne ved 5. og 6. carbonatom tilhørende pyridonkernen. Imidlertid fandtes to tripletter i spektret for dihydromocimycin ved S 2,5 og 3,4 ppm. Dette tyder på, at bindingen mellem det 5. og 6. carbonatom i dihydromocimycinets pyridon-keme er mættet. Denne fortolkning bekræftedes ved en ozonisering af en vandig opløsning af dihydromocimycin ved pH 12 i løbet af 5 minutter ved 0°C. Efter reduktion af reaktionsblandingen med hydrogen, der var katalyseret af PtC^jOg efter hydrolyse med koncentreret saltsyre,opdagedes β-alanin, hvilket angav, at bindingen mellem den 5. og 6. carbonatom af pyridonkernen af dihydromocimycin er mættet.

Mange egenskaber ved dihydromocimycin er lig med dem, der findes for mocimycin. Der er imidlertid en vigtig forskel: en lav koncentration af mocimycin tilsat foderet til dyr, der skal fedes som f.eks. kyllinger eller svin, forøger væksten og fødeomdanneIsen bemærkelsesværdigt. Dihydromocimycin på den anden side viser ikke nogen sådan forbedring af væksten eller fødeomdanneIsen hos disse dyr, hvilket er uventet, da in vitro forsøg har vist aktivitet mod de samme mikroorganismer. I mange tilfælde viser det endog bedre aktivitet end mocimycin.

En sammenligning af de antimikrobielle virkninger af de to antibiotika ses af den følgende tabel:

Agarfortyndingsprøver.

Organisme afprøvet Minimum hæmmende koncentration _(/g/ml) anaerob kultur_ mocimycin dihydromocimycin

Staphylococcus aureus A 2000 >100 >100

Staphylococcus aureus A 2001 >100 >100

Diplococcus pneumoniae L54 1,5 < 0,75

Salmonella typhimurium R172 >100 >100

Escherichia coll U20 >100 100

Listeria monocytogenes A2130 6 1,5

Listeria monocytogenes Δ2131 6 6

Listeria monocytogenes A2132 6 6

Clostridium perfrincens A738 >100 >100

Clostridium septicum A2152 10 10 5 143606

Tabel (fortsat)_

Organisme afprøvet Minimum hæmmende koncentration (/tg/ml) anaerob kultur____ mocimycin dihydromocimycin

Streptococcus zooepidemicus A2144 6 6 R-Streptococcen A2148 6 3

Brucella suis (glat) A2126 0,75 0,4

Pasteure11a haemolytica A2136 3 1,5

Treponema spec. A2275 30 10 Væskefortyndingsprøver. _

Organisme afprøvet Minimum hæmmende koncentration (/tg/ml)__ mocimycin dihydromocimycin

Bacillus subtilis ATCC 6633 100 50

Bacillus subtilis ATCC 6051 100 50

Bacillus subtilis 6346 D167 1,2 0,9

Bacillus subtilis 220 D178 75 75

Bacillus subtilis TH 10 100 50

Bacillus cereus D166 0,6 0,6

Bacillus cereus D261 0,9 0,6

Bacillus cereus D220 1,2 0,9

Bacillus cereus B569 2,5 1,2

Bacillus cereus ΤΗ 1 1,8 1,2

Bacillus thuringiensis Wil 1,2 0,9

Bacillus mesenterium D169 100 50

Bacillus cereus var. mycoides 1,2 0,45

Streptococcus haemolyticus A266 0,45 0,45

Streptococcus haemolyticus A2182 0,25 0,12

Mycoplasma hvorhlnus A2230 1 0,3

Streptomyces viridochromogenes 2,5 0,9

Som nævnt producerer Streptomyces ramocissimus under egnede betingelser dihydromocimycin foruden mocimycin. Fremgangsmåden ifølge opfindelsen til fremstilling af dihydromocimycin er i overensstemmelse hermed kendetegnet ved, at man aerobt dyrker en stamme af Streptomyces ramocissimus i et vandigt næringssubstrat, der indeholder assimilerbare kilder for carbon, nitrogen og uorganiske forbindelser, og at man fraskiller dihydromocimycin, der dannes ved dyrkningen, eventuelt i form af et salt. Forgæringen af mikroorganismen kan udføres i et flydende substrat indehol- 143606 6 dende de sædvanlige carbon-, nitrogen-, phosphor-, calcium-, jern-, svovl-, magnesium-, kalium-, vitamin- og sporelementkilder, f.eks. substrater indeholdende roemelasse, maltpasta, jordnødderne1, lactose, kartoffelstivelse, majsstøbe og gærekstrakt. Forgæringssubstratets temperatur bør være mellem 20 og 40°C, fortrinsvis mellem 26 og 34°C og pH-værdien mellem 5 og 9, fortrinsvis mellem 6,5 og 8.

Det vil ses, at den foran omtalte fremgangsmåde ligner fremgangsmåden til fremstilling af mocimycin.

For at opnå et større udbytte af dihydromocimycin i forhold til udbyttet af mocimycin, har det uventet vist sig, at dette kan opnås ved at forøge oxygentrykket i dyrkningssubstratet.

Ud fra dihydromocimycinets formel kunne det forventes, at et højere oxygentryk i dyrkningssubstratet ville nedsætte produktionen af dihydromocimycin i forhold til produktionen af mocimycin. Imidlertid har det vist sig, at dihydromocimycin produceres mere rigeligt end mocimycin ved bedre gennemluftning af dyrkningssubstratet, hvilket kan opnås ved foranstaltninger, der er velkendte af fagmanden, f.eks. ved en større gennemluftningshastighed (rumfang luft pr. rumfang dyrkningssubstrat pr. tidsenhed), eller en højere omrøringshastighed af dyrkningssubstratet i fermentatorer. Ifølge opfindelsen anvendes der fortrinsvis gennemluftningshastigheder for dyrkningssubstratet på 1-3 liter luft, og bedst 1,5 til 2,5 liter luft, pr. 2 liter dyrkningssubstrat pr. minut. En yderligere forbedring af udbyttet af dihydromocimycin opnås ifølge opfindelsen ved, at der drages omsorg for tilstedeværelse af f.eks. jern-, cobalt- eller nikkelioner i lav koncentration i dyrkningssubstratet.

Fraskillelsen af dihydromocimycin fra dyrkningssubstratet er delvis lig med adskillelsen hf mocimycin. Ved det sidste trin, hvor udfældningen af forbindelserne sker fra et organisk opløsningsmiddel, drages der fordel af forskellen i opløselighed af mocimycin og dihydromocimycin. Ifølge opfindelsen udføres fraskil-1· leisen med fordel ved fraktioneret fældning fra en organisk opløsning ved hjælp af en alkalisk forbindelse, fortrinsvis luftformig ammoniak. Ved gennemledning af luftformig ammoniak gennem opløsningen udfældes mocimycin først, og adskillelsen kan udføres ved at lede ammoniak gennem opløsningen, indtil i det væsentlige al mocimycinet er udfældet, og i det væsentlige al dihydromocimycinet er efterladt i opløsningen. Dette kan kontrolleres ved f.eks. tyndtlagschromatografi-prøver. Efter frasfeillelse, f.eks. ved frafiltrering, af mocimycinbundfaidet fra opløsningen fortsættes tilledning af ammoniak, indtil i det væsentlige al dihydromocimycinet er udfældet, således at det kan fraskilles, f.eks. ved frafiltrering. Ammoniakken ledes f.eks. gennem opløsningen med en hastighed af ca. 150 liter pr. liter opløsning pr. time i løbet af ca. 1 til ca. 4 min.(f.eks. ca. 2,5 til 10 liter 7 143606 luftformig ammoniak pr. liter opløsning) ved en temperatur mellem ca. -12°C til ca. +15°C, fortrinsvis mellem -5°C og +8°C. Ved at fortsætte tilledningen af luftformig ammoniak til opløsningen, forøges hydrogenionkoncentrationen tilstrækkeligt til at gøre dihydromocimycinet uopløseligt, n&r ammoniakken tilledes med den ovenfor angivne hastighed i løbet af 10 til ca. 15 minutter (svarende til ca. 25 til ca. 40 liter luftformig ammoniak) under de samme betingelser. Ud over ammoniak kan sædvanligvis alle alkaliske forbindelser anvendes til adskillelsen af mocimycin og dihydromocimycin, f.eks. natriummethoxid og triethylamin.

Det rå dihydromocimycin, der således er udskilt fra dyrkningssubstratet, renses yderligere for mocimycin. . ved at opløse bundfaldet i en stærk fortyndet ammoniakalsk opløsning (pH 9) og ekstrahere denne opløsning med et op løsningsmiddel, såsom chloroform eller methylenchlorid. Mocimycinet er dårligt opløseligt i et sådant opløsningsmidde1, og ved at hælde den således opnåede ekstrakt i et overskud af et apolært opløsningsmiddel (f.eks. petroleumsether, cyclohexan eller pentan) dannes et bundfald af dihydromocimycin, der indeholder mindre end 57. mocimycin.

Meget rent dihydromocimycin kan opnås ved at lede det således opnåede produkt over en 'SEPHADEX" (varemærke) LH 20 søjle, idet man anvender forskellen i adsorption af mocimycin og dihydromocimycin."SEPHADEX"en opslemmes i 100¾ methanol og hældes omhyggeligt på søjlen. Efter at man har erstattet methanolen med chloroform, overføres det ovenfor nævnte dihydromocimycinbundfald til søjlen. Chloroform anvendes som elueringsmiddel. Efter nogen tid opnås først dihydroraoci-mycin, derefter mocimycin. Begge forbindelser kan spores i eluatet, da de viser absorption i det ultraviolette spektrum ved 350 nm. De rene forbindelser kan udvindes fra chlor of ormen ved udfældning med et apolært opløsningsmiddel, såsom cyclohexan eller pentan.

Bekræftelse på forbindelsernes identitet kan opnås ved tyndtlagschrornatogra-

«I II

fi. Man anvender plader af det under betegnelsen Kiselgel F 254 forhandlede produkt, størrelse 20x5 cm (Merck). Elueringsmidlet er en blanding 60:42:10 af chloroform, ethanol og 25% ammoniak. Elueringstiden er 2 timer. Mocimycin viser en -værdi på 0,3 (hovedtautomer) og dihydromocimycin viser en R^-værdi på 0,4 (hovedtautomer).

På et tidligt stadie af undersøgelserne, antog man, at mocimycin havde et lignende antimikrobielt spektrum som tylosin (Merck Index, 8. udgave, side 1089), og at det ville være effektivt over for Treponema hyodysenteriae, der forårsager Treponema dysenteri eller Vibrio Doyle, en af de mest almindelige svinesygdomme. Forsøg udført på det tidspunkt viste,at mocimycin var virksomt over for denne sygdom, men ikke mere end tylosin. Af denne grund blev der ikke foretaget yderligere undersøgelser.

143606 8

Som angivet ovenfor fandtes dihydromocimycin at være mere aktiv end moci-mycin over for mange mikroorganismer, og følgelig foretoges undersøgelser med denne forbindelse over for den mikroorganisme, der forårsager Treponema dysenteri. .Af forsøgene fremgik det, at dihydromocimycin besad en betydelig højere virkning over for mikroorganismerne end tylosin og yderligere,at det var virksomt over for tylosinresistente stammer. Således må dihydromocimycin betragtes som værende bedre end tylosin (og også end mocimycin) til behandling af Treponema dysenteri.

Dihydromocimycin. kan anvendes på den måde, at der til svinefoder tilsættes en vis del dihydromocimycin eller et salt, f.eks. natriumsaltet, heraf. Anti-biotiket eller dets alkalimetal- eller ammonium- eller aminsalt kan også dis-pergeres i eller blandes med et vilkårligt, egnet, inert, fysiologisk udskadeligt bærestof eller fortyndingsmiddel, som kan indgives svin oralt, og som ikke reagerer med antibiotiket, og ikke er skadeligt for svinet ved oral indgivelse. Virksomme mængder af dihydromocimycin indarbejdet i svinefoder til forhindring eller behandling af Treponema dysenteri er ca. 10 til ca. 200 ppm, fortrinsvis 20 til 40 ppm dihydromocimycin, udregnet på foderets vægt.

Dihydromocimycin fremstillet ved den omhandlede fremgangsmåde er et fint, let støvende pulver. Dette kunne føre til vanskeligheder ved blandingsproceduren med foderet, og derfor laves fortrinsvis med en eller flere af svinefoderets komponenter en premix indeholdende dihydromocimycinet i f.eks. en 9- til 99-dob-belt mængde. Velegnede komponenter til at fremstille en premix er f.eks. majsmel, kartoffelmel og sojamel. Forsøg har vist, at dihydromocimycin har en god stabilitet over for pelletering (granulering under højt tryk ved høj temperatur under anvendelse af damp).

Premixen kan sættes til foderet som et profylaktisk middel eller som et middel til behandling af svin, der kun er svagt angrebet af Treponema dysenteri.

Dersom svinene er så hårdt angrebet med Treponema dysenteri, at der er appetittab,eller de syge svin skubbes bort fra fodertruget af de raske svin, administreres dihydromocimycinet fortrinsvis i drikkevandet, fortrinsvis i nærværelse af et smagskorrigerende middel. Til dette formål anvendes dihydromocimycin i vandopløselig form, f.eks. i form af et salt, såsom et kalium-, natriumeller aminsalt.

Svin, der er kraftigt angrebet af dysenteri, kan behandles ved injektion med dihydromocimycin eller et vandopløseligt salt heraf opslemmet eller opløst i sædvanlige injektionsvæsker, f.eks. saltvandopløsning, propylenglycol, glycerol, vandblandinger osv.

g 143606

Fremgangsmåden forklares nærmere 1 de følgende eksempler.

Eksempel 1

Fremstilling af dihydromocimycin.

Mikroorganismen Streptomyces ramocissimus (CBS 190.69) forgæredes i 2000 liter af et substrat, der indeholdt 20 g maltpasta, 10 g gærekstrakt og 5 g faste stoffer fra majsstøbevæske pr. liter ved et pH på ca. 7 under omrøring og gennem-luftning. Efter forgæringen blandedes vækstsubstratet med ca. 27. dicalit (et ekspanderet perlit, et aluminiumsilikat indeholdende kalium, natrium og sporelementer) som filterhjælp, hvorefter blandingen filtreredes. Filtratet syrnedes med 8 N svovlsyre til pH 6,0, hvorefter det ekstraheredes 2 gange med methyliso-butylketon (MIBK) i en mængde på 1/5 af dets rumfang. De dannede emulsioner blev brudt med Hyflo Supercel filterhjælp (en diatomejord). De organiske væsker blandedes og koncentreredes til ca. 1 liter ved inddampning under reduceret tryk, idet inddampningen foretoges med en roterende inddamper. Ud fra det opnåede koncentrat fik man et råprodukt ved at tilsætte 5 gange dets volumen petroleums-ether (kogepunkt 40-60°C), og det dannede bundfald frafiltreres på et glasfilter (G 3). Bundfaldet vaskedes med frisk petroleumsether og tørredes, hvorved man opnåede et gult farvet pulver indeholdende mocimycin og dihydromocimycin.

Man opnåede en renset form af dihydromocimycin indeholdende mindre end 57. mocimycin på følgende måde: Luftformig ammoniak led te s gennem koncentratet med en hastighed på 150 liter pr. liter koncentrat pr. time i 1 minut ved en temperatur på 2°C. Der dannedes et bundfald, der indeholdt mocimycin. Bundfaldet frafiltreredes, og filtratet behandledes atter en gang med luftformig ammoniak i 10-15 minutter. Det nu dannede bundfald frafiltreredes og opløstes i fortyndet ammoniak (pH 9,0). Denne opløsning ekstraheredes med et lige så stort rumfang methylenchlorid, og ekstrakten holdtes ud i det 3-5 dobbelte rumfang cyclohexan. Det dannede bundfald filtreredes fra, tørredes og pulveriseredes.

Man opnåede natriumsaltet af dihydromocimycin ved at opløse dihydromocimycin i vand under tilsætning af 0,1 N natriumhydroxid til pH 9, indtil man fik en mættet opløsning. Opløsningen filtreredes og inddampedes azeotropisk under tilsætning af butanol (i vakuum ved ca. 45°C), og den butanoliske rest opsamledes i en lille mængde vandfri butanol. Petroleumsether sættes dråbevis under omrøring til opløsningen, indtil al saltet var udfældet. Bundfaldet filtreredes fra, vaskedes og tørredes, hvorved man opnåede natriumsaltet af dihydromocimycin. Andre salte af dihydromocimycin fremstilledes på lignende måde.

10 143606

Eksempel 2

Fremstilling af dihydromocimycin med højere udbytter.

For at opnå højere udbytter af dihydromocimycin anvendtes en lyofiliseret kultur af Streptomyces ramocissimus (CBS 190.69) eller en godt sporuleret agarkultur af denne organisme til at pode indholdet af en 50 ml erlenmeyer-kolbe indeholdende 100 ml af et steriliseret substrat med følgende sammensætning: 20 g maltpasta, 10 g gærekstrakt og 5 g faste stoffer fra majs støbevæske pr.liter postevand, pH 7,0.

Efter inkubation på en roterende rysteapparat (300 omdrejninger, udsving 2,5 cm) ved 30°C i 3 dage opnåedes en kultur, der anvendtes til at pode små fer-mentatorer indeholdende 2000 ml af det ovenfor nævnte substrat, hvortil man havde sat 20 mg ΟοΟ^.β^Ο pr. liter. Denne del af væksten, der også udførtes ved 30°C, skete under meget gode gennemluftningsbetingelser for at stimulere produktionen af dihydromocimycin. Til dette formål ledtes mere end 2 liter steril luft gennem vækstsubstratet pr. minut, og vadestsubstratet omrørtes med en hastighed på indtil 1000 omdrejninger. Produktionen af dihydromocimycin begyndte efter en forgæringstid på ca. 12 timer og var maksimal efter ca. 120 timer. Forgæring i stor målestok var mulig, idet man anvendte 48 timer gamle vækstsubstrater, der var opnået i små fermentatorer, som podninger til store fermentatorer.

Det således producerede dihydromocimycin udvandtes fra vækstmediet på følgende måde: Efter tilsætning af 2% diatomejord som filterhjælp, filtrerede man kulturen, og filtratet syrnedes med 8 N svovlsyre til et pH 5 til 6. Herefter ekstraherede man 2 gange med MIBK, idet man anvendte 1/5 af filtratets rumfang. Dersom der dannedes en emulsion, blev emulsionen brudt ved filtrering af blandingen efter tilsætning af noget diatoméjord. Man opsamlede det organiske lag og koncentrerede i vakuum til ca. 1/10 af det oprindelige volumen af vækstmediet. Luftformig ammoniak ledtes gennem koncentratet med en hastighed på 150 liter pr. liter koncentrat pr. time i 1 minut. Det dannede bundfald frafiltreres. Filtratet behandledes atter engang med luftformig ammoniak i 10-15 minutter. Det således opnåede bundfald opløstes i fortyndet ammoniak (pH 9,0), hvorefter man opnåede renset dihydromocimycin (indeholdende ikke mere end 5% mocimycin) ved at ekstrahere opløsningen i ammoniak med lige rumfang methylenchlorid. Ekstrakten ud-hældtes i 3-5 gange dets rumfang cyclohexan, hvorefter det dannede bundfald fra-filtreredes, tørredes og pulveriseredes.

11 143606

Anvendelsesekserapler:

Eksempel A

Dihydromocimycin over for Treponema dysenteri.

20 grise, der var 3 måneder gamle, inficeredes med den mikroorganisme, der forårsager Treponema dysenteri. Dette skete ved at fodre dem med foder blandet med en homogen blanding af indholdet af tarmene og tarmes limhindeme fra to dyr, der led af denne sygdom. De inficerede svin blev opdelt i 4 grupper på 5 dyr hver, og dyrene fodredes med foderet i form af en opslemning fortyndet 1:1 med vand i en uge. Den totale mængde foder pr. dyr var 1,2 kg pr. dag, der blev givet i 2 portioner.

Efter 5 dages forløb observeredes de første symptomer på sygdommen i form af tynd faeces, og de bekræftedes ved mikrobiologisk undersøgelse af faeces. Efter en uge behandledes dyrene på følgende måde:

Gruppe 1: intet antibiotika til foderet; gruppe 2: 100 ppm tylosin sat til foderet; gruppe 3: 25 ppm dihydromocimycin sat til foderet; gruppe 4: 50 ppm dihydromocimycin sat til foderet.

Det antibiotikaberigede foder blev givet i en uge. Efter denne uge gav man foder uden antibiotika igen. Om dyrene overvandt infektionen undersøgtes ved dyrenes vægt og ved at undersøge faecesprøver makroskopisk for deres konsistens og mikroskopisk ved hjælp af særlig immunofluoreseens-teknik.

Under forsøget døde 1 dyr for hver af grupperne 1, 3 og 4.

Resultaterne er vist i den efterfølgende tabel. Her er de angivne vægte middelværdier for de på det angivne tidspunkt stadigt levende dyr. Konsistensen af .'faeces er angivet på følgende måde: + betyder tyndtflydende; - betyder tyktflydende; og - betyder normal.

Resultaterne af immunofluorescens-undersøgelsen er angivet kvantitativt ved at angive antallet af Treponemas i synsfeltet: 5 betyder overfyldt; 4 betyder mange; 3 betyder ca. 10 Treponemas; 2 betyder 1 eller 2 Treponemas, 1 betyder, at der skal mere end et synsfelt for at finde 1 Treponema og - betyder negativ.

12 143806

Gruppe 1 Gruppe 2 Gruppe 3 Gruppe 4 Vægt i kg

Lige før infektion 24,6 24,4 24,2 23,4

Efter 1 uge (1) 23,7 22,2 21,3 21,6

Efter 2 uger 20,9 21,4 20,2 21,2

Efter 3 uger 19,8 23,2 24,0 23,0

Faeces konsistens

Efter 1 uge + + + + + + + + + - + + + + ώ + + + + +

Efter 2 uger + + + + + + + + ί + ΐΐΐ+ + + ik + + .++,,+,+++ + +

Efter 3 uger_ +--+ώ - +- -- - - - - -- +_

Immun of lu or e s cenc

Efter 1 uge 44445 4434 - 54554 5-533

Efter 2 uger 444-4 4422- 4431 2 - i 4 1

Efter 3 uger 2 2 2 2 4 3 - · 2 - 1 -- - - (l)Tidspunktet for start af antibiotikaadministrering; ώ betyder et dyr dødt.

Ud fra konsistensen af faeces samt ud fra immunofluorescens-undersøgelserne fremgik det, at de dyr, der var behandlet med dihydromocimycin blev helbredt betydeligt hurtigere, end de dyr, der var behandlet med tolysin. Når den administrerede mængde antibiotika også blev taget i betragtning,kan det sluttes, at dihydromocimycin er mindst 4 gange så aktiv som tylosin.

Eksempel B

Dihydromocimycin mod Treponema dysenteri.

Fra en gård, der gennem nogen tid havde haft problemer med svinediarré, behandledes svin under den lokale dyrlæges tilsyn og under tilsynet af inspektøren fra Health Service Station. Svinene opdeltes i grupper og behandledes i 4 dage på følgende måde:

Gruppe 1: 66 svin behandledes med foder indeholdende 100 ppm tolysin; gruppe 2: 34 svin behandledes med foder indeholdende 25 ppm dihydromocimycin; gruppe 3: 40 svin behandledes med foder indeholdende 50 ppm dihydromocimycin; gruppe 4: 40 svin behandledes med foder indeholdende 100 ppm dihydromoci mycin.

inden behandlingen afgav alle dyrene tynd eller meget tynd faeces. Prøver af faeces blev undersøgt, og man fandt, at de var Treponema-positive og Salmonella-negative. Nogle ormeæg fandtes.

Dagen efter behandlingens begyndelse, fandt man, at faeces fra svinene i