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Verfahren zur Herstellung von stabilisierten, wäßrigen Hyaluronidase-Lösungen
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von stabilisierten
wäßrigen Hyaluronidase-Lösungen, bei denen als stabilisierender Bestandteil Äthylendiarnintetra-essigsäure-
ver-,vendet wird.
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Hyaluronidase ist ein eiweißartiges Enzym, das die Eigenschaft besitzt,
Hyaluro-nsäure- zu hydrolysieren. Hyaluronsäu.re- ist ein Mucopo:lysaechari#d mit
hohem Molekulargewicht, das einen wesentlichen Bestandteilder Grundsubstanz oder
Zem#entsu,bstanz des Gewebes bildet. Ihre wäßriggen Lösunge#n besitzen e'inehohe
Viskosität. Auf Grund der höhen Viskosität der wäßrigen Lösungen der Hyalu-ronsäulre
und der hydrol'ytischen Wirkung der Hyaluroni,dase auf die Säure hat die Hyaluronidase
eine erfolgreiche klihische Anwendung bei der Förderung der Absorption von therapeutischen
Flüssigkeiten d:urch Gewebe gefunden. Ihre günstige Wirkung scheintauf !die Verminderung
der Viskosität der Geweibeflüssigkeiten durch ihre hydrolytische Wi-rkung auf Hyaluronsäti-re
zurückzuführen zu sein. Die infolge dieser Hydrolyse verminderte Viskosität gestattet
hierbei eine raschere Diffusion der eingeführten therapeutisehen
Flüssigkeit.
Beispietsweise kann bei einer Anwendungsform die intravenöse, Injektion bei Verwendung
der Hyaluronidase. in vielen Fällen durch subkutane Infusion ersetzt werden, was
gleichzeitig Vorteile für Patient und Arzt bietet. Die Hyaluroniidase kann auch
mit Vorteil bei, der Lokalanästhesie. verwendet werden. AußeTdem sind noch andere
Verwendungszwecke be-kannt.
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Bisher war Hyaluronidase in fester Form im Handel, und zwar als Pul'v#,ii'n
verschlossenen Ampullen, das Lactase als inerten TTäger zur Erleichterung der Handhabung
enthielt. Wäßrige Lösungen der Hyaluronidase werden bei Zimmertemperatur in kurzer
Zeit denaturiert.
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Gegenstand der voTliegenden Erfindung ist daher ein Verfahren zur
Herstellung einer wäßrigen Hyaluronidaselösung, welche für -die parentrale Verwen#dung
geeignet ist und -hinreichendee Stabilität besitzt, um sie als solche, beispielsweise
bei Temperaturen von 15 bis 30', lagern und verabreichen zu können.
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Gemäß -der vorliegenden Erfindung wird Natriumchlorid oder CaI.,ciumehlorid
und Äthylendiamintetraessigsäure (H02C - Cii2)2N - CH2 - CH2
- N(CH2'CO-2H)2 odex ihre wasserlöslichen Salze als Stabilisierungsmittel
verwendet. Der Lösung wird eine kleine Menge eines Puffers einverleibt, um sie-
etwa neutral zu halten.
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Äthylendiamintetraessigsäure, welche im folger#-den der Einfachh#eit
halber als »EDTA« bezeichnet werden soll, wurde, bereits zur Stabilisierung verschiedener
Arzneimittel auf Grund ihrer Fähigkeit verwendet, mit Schwermetallen Komplexe zu
bilden, in denen das Metall, nicht mehr lortisiert ist. Auf diese, Weise kann sie
bestimmte Produkte, welche gegenüber Schwermetallionen empfindlich sind, schützen.
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Im vorliegenden Fall ist die Instabilität der wäßrigen Hyalüronidase-Lösung
komplizierterer Natur -und, wird durch andere Faktoren als die Anwesenheit von Schwermetalfionen,
welche nicht die die Stabilität steuernden Faktoren sind, grundlegend beeinträchtigt.
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Der einzige biehenge Versuch zur Verwendung von »EDTA« mit Hyalu#ron-idase
Üt in der Veröffentlichung von Meyer und Rapport (vgl. j. B#icdl. C-hem., 188, 485
bis 490 [1951]) beschrieben. Diese Autoren studierten die augenblickliche Inaktivierung
von Hyalnroni,dase durch Schwermetallionen sowie ihre Reaktivierung und die Verhütung,der
Inaktivierung duTchmeIhrere organisehe und anorganische Mittel. Sie betrachteten
die Wirkun,g als Wettbewerb zwischen der l#yaluron-idase und dem gegen das SchwermetarBohn
angewandte Schutzmittel. In dem Ausmaß, in dem,das Schutzmittel-in diesem Wettbewerb,
vorherrscht, wird die Hyaluronidase geschützt. Unter den geprüften Schutzmitteln
war auch »Versene«, eine Handelsform der »EDTA«. Die Autoren kommen zu dem Schluß,
daß chelatbildende Mittel, wie »Oxine« und »Versene«,- ziemlich schlechte Konkurrenten
des Enzyms für das Metall eind. -Es sei erwähnt, daß d.iese Autoren nur die augenblickliche
und reversible Entaktivierung des Enzyms -und nicht dessen langdauernde Stabilität
untersuchten.
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Versuche, die zu-r vorliegenden Erfindung führten, haben gezeigt,
daß hauptsächlich andere Faktoren als die Schwermetath-- für die Inaktivierung der
Hyaluronidase verantwortlich sind. Beispielsweise ist das mittels Aussafzen- mit
einem Kupfersalz gereinigte Enzym in wäßrigen Lösungen beständiger als das durch
fTaktionierte Gewinnung mit Alkohol gereinigte Enzym, obwohl das erstere einen höheren
Gehalt an Kupfer- und Eisenverunreinigungen aufweist. Die-,durch fraktionierte Gewinnung
mit Al-
kohol gereinigte Hyalüronid.ase wird jedoch vom klinischen Standpunkt
wegen ihrer größeren Reinheit und vom Standpunkt der Erzeugung wegen der größeren
Wirksamkeit des Alkoholreinigungsverfahrens bevorzugt. Die Oberflächenkräfte spielen
,bei der Inaktivierung der Hyaluro-nidase in wäßrige-r Lösung eine w-ibhtige Rolle.
Es scheint, daß die Proteinmoleküle in der verdünnten eiweißartigen Enzynilösung
die Neigung- besitzen, sich an der GrenzflächeLuft-Wasser zu konzentrieren. Unter
diesen Bedingungen scheinen die nicht beanspruchten Oberflächenkräfte auf einige
der schwachen Bindungen zwischen denAminosäureketteneinzuwirken und die teilweise
Entflechtung der Proteinmoleküle und den Verfußt derb Enzymwirksamkeit zu verursachen.
Durch Vergleichsversuche wurde festgestellt, daß eine Vergrößerung der Grenzfläche
Luft-Wasser bei verdünnten wäßrigen Hyal-uronidase-Lösungen die Inaktivierungsgeschwindigkeit
beträchtlich vergrößert. DieseInaktivierungstheorie ist jedoch nicht in allen Punkten
gesichert. Daß die Inaktivierung nicht die Folge. einer Oxydation -ist, erwies sich
dadurch, -daß kein Anwachsen der Inaktivierung gefunden wurde, wenn man derartige
Lösungen mit Sauerstoff sättigte.
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EDTA vermind4--rt die Inakeivierung von Hyaluronidase infolge der
Oberflächenwirkung bereits beträchtlich.
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Weiterhin wuTde gefunden, daß die Anwesenheit von Natrium- oder Calcium#dh.Iorid
die Stabilität von verdünnten, wä3rigen Hya-llironidas---Lösungen weiter vorteilhaft
beeinflußt. So werden durch Zusalz kleiner Mengen von Natrium- oder Calciumchilorid
bei wäßiigen Hyaluronidase-Lösungen erheblidhe Steigerungen und mit den gleichen
Zusätzen bei Hyalüronidase-EDTA-Lösungen sogar Spitzenwerte -der Stabilität der
betTeffenden Lösungen erzielt.
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Aus dem eben Gesagten wird ersichtlich, daß die Inaktivierung von
Hyal-uronidase einen kompilizierten Mechanismus darstellt, bei dem die Anwesenheit
von Schwermetallionen -eine verhältnismäßig untergeordnete Rolle- spielt. Es ist
leicht möglich, daß bis jetzt noch nicht entdeckte Faktoren eine Rolle spiel#-,n.
Es istsehr Überraschend und war nicht vorauszusehen, daß EDTA in Gegenwart der genannten
Salze eine starke i#dh#i#bitorisch,- Wirkung auf al-le bekannten In-aktivierungsersch-einungen
der Hyalur,oni,da-se ausübt. Ihre Verwendung ermöglicht
die Erzeugung
einer stabilen Hyaluronidase-Lösung, welche zur parenteralen Injektion geeignet
ist.
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Gemäß der Erfindung wird beispielsweise eine kleine Menge Hyaluronidase,
z. B . :25 bis ioooTRU/,ccm in vorzugsweise von pyrogenen Stoffen freiem
Wasser gelöst, daseine kleine Menge Natrium- oder Caleiumc'hlorid enthält, z. B.
0,15 M, und o,i bis i mg/ccm EDTA-Dinatriumsalz je
Liter enthält. Die Reaktion
der Lösung wird auf annähernde Neutrafität, z. B. pH 6 bis 8, eingestellt
und kann durch Zugabe eines geeigneten Puffers, wie Phosphatpuffer mit o,oi Ionenstärke
gesteuert werden. Vorteilhaft kann auch eine kleine Menge eines Konservierungsmittels,
wie Natriumäthylmercurithiosa:licylat im Verhältnis i: io ooo vorhanden sein.
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Durchschnittlich sind in einer Hyaluronidasezubereitung 15o TRU in
o,2 mg enthalten. Deshalb sind in 0,033 mg 25 TRU undin 1,33 mg ioooTRU
enthalten. Bei der allgemeinen therapeutischen An-,vendung ist eine Lösung von i5o
bis 2oo TRUiccm zweckmäßig. Wo jedoch nur eine kleine Fläche oder ein kleines
Volumen infiltriert werden soll, z. B. bei der Dentalanästhesie, #fst eine verdünnte
Lösung, die nur :25 bis 3o TRU/ccm. enthält, vorteilhaft. Andererseits ist
bei manchen Verwendungszwecken, z. B. bei der Behandlung von Nierensteinen, eine
konzentrierte Lösung, die beispielsweise 6oo TRU/ccm oder mehr enthält, erwünscht.
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Es wurde weiterhin gefunden, daß der Zusatz einer kleinen Menge einer
einfachen Aminosäure, ,vie Glycin oder Arginin, in manchen Fällen die Schutzwirkung
der EDTA verstärkt. Ein derartiger Zusatz ist jedoch nur zweckmäßig und für die
bevorzugten Zusammensetzungen nicht un-bedingt erforderlich.
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Die hier verwendeten Ausdrücke »Äthylendiamintetraessigsä-ulre« und
»EDTA« sollen auch die einfachen, nicht toxisc1hen wasserlöslichen Salze umfassen,
wie z. B. das Dinatriumsal#z, wobei das in der Lösung vorhandene Salz zum Tei1 durch
das zugesetzte Salz als solches und zum Teil durch,den zur Einstellung des pi-Wertes
verwendeten Puffer bestimmt wird. In den folgenden Beispielen wurde das Dinatriumsalz
der EDTA verwendet. Das EDTA-Anion ist der ausschlaggebende Faktor. Der hier verwendete
Ausdruck »TRU« gibt die »trübungsvermindernden Einheiten« (»turbidity redncing-units«)
an, in dein S.inne, wie er bei den von Aburn und Whitley (vgl. j. Biol. Chem. 192,
379 bis 393 [1951]) beschriebenen Trübungstest verwendet wird. Die
durch Aussalzen mit einem Kupfersalz gereinigte Hyaluronidase (im folgenden als
kupfergereinigte Hyaluronidase bezeichnet) wurde aus frisch gefrorenen Stierhoden
nach einer Methode,dieaufArbeitenvonHahn (vgl.Biochem. Zeitschrift 315,
83 bis 96 [19431) zurückgeht, hergestellt und diedurch fraktionierte
Gewinnung m-it Alkohol gereinigte Hyaluronidase (im folgenden als alkoholgereinigte
Hya;luronidase bezeichnet) wurde nach der Methode von Tint und Bogash (vgl. j. Biol.
Chem. 184, 501 [19501) hergestellt. In den folgenden Beispielen beziehen sich die
angegebenen Zahlen auf erfindungsgemäße Zusammensetzungen und auf Vergleichsversuche,
die weiter oben allgemein besprochen wurden.
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Die Prüfungen, welche die unten angegebenen Ergebnisse lieferten,
wurden nach der Methode von A 1 b u r n und Wh i t 1 e y (a.
a. 0.) durchgeführt.
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Beispi,el i Beständigkeit von alkoholgereinigter Hyaluronidas,-in
verschiedenen Medienbei
37'
Die Lösungen wurden in i: ioooo wäßrigem Merthiolat
hergestellt und, enthielten 192 TRU/ccm. Volumina von
5 cem wurden in 5-ccm-Ampullen
bei
37' gegeben.
| 0/0 Wirksamkeits- |
| Lösung verlust |
| 3o Tage i 6o Tage |
| Wasser ...................... WO ioo |
| o,oi m-Phosphatpuffer, pil 7 ... WO WO |
| o,i5 m-Natriumchlorid ........ 9 38 |
| 0,15 m-Calciumchlorid ......... --3 39 |
| i mg/ccm E D TA - Na . ........ 75 94 |
| i mg/ccm E D TA - Na2 + 0115 M- |
| NaC1 ..................... 4 1:0 |
Beispiel 2 Wirkung des Verhältnisses der Grenzfläche Luft-Wasser zu dem Volumen
der Lösungohne Rühren Die Lösungen der alkoholgereinigten Hyalu#ronidase wurden
in i: io ooo wäßrigem Merthiolat hergestellt und enthielten 192 TRU/ccm.
3 Ccm oder ioceni wurden in io-c#cm-Ampu.llen, wie angegeben, gegeben und
ohne. Schütteln bei 37c) gelagert.
| 0/0 Aktivitätsverlust |
| 3o Tage |
| Lösung 3 ccm gef üllte |
| in der Ampulle |
| Ampulle |
| 0,15 m NaC1 ................. 35 14 |
| i mg/ccm EDTA-Na. + o,i5m- |
| NaC1 ..................... 6 6 |
Beispiel;
3
Wirkungder Grenzfläche Luft-Wasser mit Rühren 5/1o-ccm-Lösu-ngen
wurden wie im Beisp.iel'2, beschrieben hergestellt, die 17o TRU/ccm enthielten.
Sie wurden in io-ccm-Ampullen gegeben, die horizontal am Umfang eines Kugelmühlenbehälters
angebracht waren. Die Kugelmühlk- rotierte mit i2o Umdrehungen
je Minute
bei
37".
| o/' Aktivitäts- |
| Lösung verlust |
| # 20 Stunden |
| 0,15 m NaC1 ..................... 70 |
| i mg/ccm EDTA -Na, + OJ5m NaCi ig |
Beispiel 4 Vergleich der kupfergereinigten und der alkohdlgereinigten Hyal-uronidase
Man lagerte Lösungen von kupfergereinigter Hyaluronidase, die 145 TRU/ccm. o,i5
m-Natriumchlbrid und o,oim-Phosphatpl-iffer in i:ioooowäßrigem Merthiolat bei PH
7 mit und ohne EDTA
- Na2 enthielten, wiihrend der angegebenen Zeiten
Beie
37'.
| Lösung 0/0 Aktivitätsverlust |
| # 41 Tage go Tage |
| ohne EDTA ................ ig 33 |
| i mg/ccm EDTA-Nag ..... .. |
| 8 17 |
| Lösungen von alkoholgereinigter Hyaluroni,dase, |
| wie oben, jedoch 192 TRU/ccm enthaltend. |
| Lösung 0/0 Aktivitätsverlust |
| # 15 Tage 1 32 Tage 6o Tage |
| ohne EDTA ......... 27 35 37 |
| i mg/ccm EDTA-Na, 3 4 io |
| 0/0 Metallverunreinigungen |
| in Hyaluronidase bei den |
| obigen Testen |
| CU Fe |
| Cu-gereinigt .......... 0,-- 0,03 |
| alkoholgereinigt ...... 0,002 o,oi |
Beispiel
5
La;ngda-ueTnde Sta;bilität von Hyaluronidase bei
37'
Lösungen
von kupfergereinigter Hyaluroni-dase mit einer Aktivität von 135o TRU/mg, die eine
Enzymkonzentration von 145 TRU/ccm, o,i5 m-Natriumchlorid und einen Phosphatpuffer
von o,oi-Ioi,iellstärke in i:ic)ooo-wäßr#igem Merthioilat enthielten, wurden bei
3 7' während der a:ngegebenen Zßit-,n gelagert.
| Lösung 0/0 Aktivitätsverlust |
| 1 41 Tage go Tage 136 Tage
6 Monate Monate |
| ohne EDTA ............................. ig 33
50 55 61 |
| i mg/ccm EDTA-Na . .................... |
| 8 17 32 28 34 |
- Erläuterungen zu den Beispielen i bis
5
Aus den obigen Angaben in
den Beispielen i bis
5
können bestimmte Schlüsse gezogeh werden: i. Eine verdünnte
Lösung von Hya;l-uroiiidase in Wasser ist äußerst unbeständig und verliert ihre
gesamte Wirksamkeit in 15 Tagen bei
371. Durch Puffern auf Pii
7 mit Phosphatpuffer Wird keine Stabilisat-ion erreicht (Beispiel i).
-
2. Kleine Mengen von Natriumchlorid oder Caleium,chl-chrid verbessern
die Stabilität (Beispiel i). 3. Eine Vergrößerung der Grenzfläthe Luft-Wasser
beschleunigt die Inaktivierung (Beispiele:2 und 3).
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4. Die Anwesenheit von Schwermetaillionen (Cu und Fe) ist offensichtlich
kein steuernder Faktor (Beispiel 4).
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5. Die Zugabe von EDTA ist wirksam, um die Inaktivierungsgeschwindigkeit
in Gegenwart einer kleinen Mienge von Natrium- oder Calc-i-amchlorid während einer
längeren Zeitdauer bei einer beschleunigenden Inaktivierungstemperatur (37') bei
allen untersuchten sonstigen Bedingungen zu hemmen (Beispiele 1, 2, 3, 4
und 5).
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Diese Ergebnisse sind überraschlend..Man nahm bisher an, daß die Äthylendiamintetraessigsäure
lediglich durch Deionisieren der SchwermetaJ1verunreinigungen wirkte, und ihre Verwendung
als Schutzmittel -,var auf derartige Fälle beschränkt. Tatsächlich wurde gemäß der
einzigen Veröffentlichung von Meyer und Rapport (a. a. 0.) über ihre Verwendung
mit Hyaluron.idase festgestellt, daß sie kein wirksamer Konkurrent mit dem Enzym
für Kupfer- und Eiseenrionen wäre.
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Es sei erwähnt,daß die Prüfungen der Beispiele i bis 5 beschleunigte
Prüfungen waren, die bei 37'
durchgeführt wurden. Der du#rchschnittliche Bereich
der Lagerungstemperaturen kann bei 15 bis 30',
am häufigsten bei 2o bis :25,
angenommen werden. Da sich der Aktivitätsverlust für je 4' Temperaturanstieg etwa'
verdoppelt, so. ist es durch die vorlieg-ende Erfindung möglich geworden, klinisch
brauchbare verdünnte wäßrige Hyalu-ron.idase-Lösungen herzustellen, we-1,rJhe eine,adäquate
Aktivität während mehrerer Monate- beibehalten.
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Im folgenden ist ein Beispiel einer Durchführungsforra, welche für
die klinische Anwendung geeignet ist, angegeben.
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Bei-spiel 6
Zuerst wird eine Lösung hergestellt, die 8,5o
g Natriumchlc#riid, o,io g Merthiolat und i g EDTA
- Na2 im Liter enthält. In 1 1 dieser Lösung werden i2,2o.g wasserfreies
Na2HPOP 2,329 NaH2P04-H20 und etwa, das zehnfache an geptflverter Hyaluronidase,
welche in der endgültigen Lösung gewünscht wird, gelöst. Die Lösung wird durch ein
BakterienfilteT bei Zimmertempexatur oder darunter filtriert und die sterile Lösung
auf Aktivität geprüft. Diese Lösung wird dann mit einer weiteren Menge der zuerst
hergestellten Lösung verdünnt und gibt,die, endgültige
gewünschte
Aktivität, z. B. i5o bis 175 TRU/ccm, für den allgemeinen Gebrauch. Der pff-Wert
be, trägt ungefähr 7,3. Die fertiggestellte Lösung wird dann in Ampullen
aus wenig löslichem Glas von solcher Größe gefüllt, daß die Grenzfläche Luft-Wasser
auf einem Minfmum gehalten wird, und verschlossen. Die Ampullen können eine einfache
Dosis von i ccm oder eine mehrfache Dosis von 5 ccm oder mehr fassen. Es
wurde festgestellt, daß Mehrfachdosisampullen von 5 ccm Fassungsvermögen
für eine konzentriertere Lösung, die 3ooo TRU oder 6oo'#RU/ectn enthalten, erwünscht
sind.