DE9305342U1 - Aminozucker, Glycoproteine und sie enthaltende Arzneimittel - Google Patents
Aminozucker, Glycoproteine und sie enthaltende ArzneimittelInfo
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Description
30
Die Erfindung betrifft neue Aminozucker (Neuraminsäure-Vorstufen-Analoga)
der nachstehend angegebenen allgemeinen Formel (II), neue Glycoproteine der nachstehend angegebenen
allgemeinen Formeln (I) und (I1), sie enthaltende pharmazeutische Mittel und ihre Verwendung zur
Stimulierung des Wachstums und der Differenzierung von menschlichen und tierischen Zellen des Immunsystems und
zur Verhinderung der Adhäsion von Leukozyten, Thrombozyten und Tumorzellen an Gefäßendothelzellen; zur Stimulierung
des Immunsystems, insbesondere von T-Lymphozyten, zur Infektabwehr, zur Behandlung von Immunschwächen, Tumorerkrankungen
einschließlich Metastasierungsprozessen,
tiiid't Atilücfu
lind i.li ti
f t üdit r Ef!:; ;ifi.:
Infektionserkrankungen (Viren, Bakterien, Parasiten,
Protozoen) und Kreislaufversagen, insbesondere Gefäßverschlüssen und Septikämien, bei Mensch und Tier; zur
Hemmung der Bindung eines Liganden an seinen sialylierten Zeiloberflächenrezeptor; zur Hemmung der Bindung eines mikrobiellen Pathogens (Virus, Bakterium, Parasit, Protozoon) oder Toxins an die Wirtszelle über einen sialylierten Rezeptor durch in vivo-Modulation von Neuraminsäuren; zur biosynthetischen Herstellung von Liganden oder Rezeptoren mit modifizierter Neuraminsäure und Verwendung derselben zur Kompetition physiologischer oder pathologischer Ligand-Rezeptor-Interaktionen; zur in vitro-Beeinflussung des Infektionsverlaufs humaner Immundefizienz-Viren (z.B. HIV-I und HIV-2) sowie zur in vivo-Prävention der Infek-
Protozoen) und Kreislaufversagen, insbesondere Gefäßverschlüssen und Septikämien, bei Mensch und Tier; zur
Hemmung der Bindung eines Liganden an seinen sialylierten Zeiloberflächenrezeptor; zur Hemmung der Bindung eines mikrobiellen Pathogens (Virus, Bakterium, Parasit, Protozoon) oder Toxins an die Wirtszelle über einen sialylierten Rezeptor durch in vivo-Modulation von Neuraminsäuren; zur biosynthetischen Herstellung von Liganden oder Rezeptoren mit modifizierter Neuraminsäure und Verwendung derselben zur Kompetition physiologischer oder pathologischer Ligand-Rezeptor-Interaktionen; zur in vitro-Beeinflussung des Infektionsverlaufs humaner Immundefizienz-Viren (z.B. HIV-I und HIV-2) sowie zur in vivo-Prävention der Infek-
tion humaner Immundefizienz-Viren (z.B. HIV-I und HIV-2);
und zur Behandlung von parasitären Erkrankungen, insbesondere von Trypanosomiasen, Leishmaniasen, Trichomoniasis,
Giardiasis, Amöbiasis, Malaria, Pneumozystose, Schistosomiasis (Bilharziose) und Echinokokkose.
Giardiasis, Amöbiasis, Malaria, Pneumozystose, Schistosomiasis (Bilharziose) und Echinokokkose.
Als Glycoproteine werden Proteine bezeichnet, die kovalent gebundene Kohlenhydrate enthalten. In tierischen Organismen
kommen Glykoproteine als wesentliche Bestandteile von Zellmembranen sowie als lösliche Komponenten von Körper-
flüssigkeiten und der extrazellulären Matrix vor. Die Kohlenhydrate
sind zu Ketten verknüpft (Oligosaccharide) und können auf unterschiedliche Weise mit dem Proteingerüst
verknüpft sein. Sie enthalten als wichtige Bestandteile
der Zellmembran Sialinsäure (Derivate der 2-Keto-3-desoxy-D-glycero-D-galacto-nonulopyranosidonsäure (KDN)), der
verknüpft sein. Sie enthalten als wichtige Bestandteile
der Zellmembran Sialinsäure (Derivate der 2-Keto-3-desoxy-D-glycero-D-galacto-nonulopyranosidonsäure (KDN)), der
eine bedeutende Rolle bei biologischen Prozessen zukommt.
Aufgrund ihres Bindungstyps werden die Oligosaccharide unterschiedlichen
Gruppen zugeordnet. Die Oligosaccharide
von Säugetierglycoproteinen sind am häufigsten N-glycosidisch an einen Asparaginrest der Polypeptidkette gebunden (N-Glycane). In dieser Gruppe finden sich einerseits se-
von Säugetierglycoproteinen sind am häufigsten N-glycosidisch an einen Asparaginrest der Polypeptidkette gebunden (N-Glycane). In dieser Gruppe finden sich einerseits se-
zernierte Glykoproteine mit unterschiedlichen Funktionen,
z.B. lösliche Enzyme, Immunglobuline und Hormone, andererseits Membranglycoproteine, z.B. Membranenzyme, Transportproteine
sowie Rezeptorproteine. Eine weitere Gruppe bilden die O-glycosidisch über einen Galactose-, N-Acetylgalactosamin-
oder Xyloserest an einen Serin- oder Threoninrest der Polypeptidkette gebundenen Oligosaccharide
(O-Glycane). Sie werden vor allem in Muzinen gefunden,
welche die Schleimepithelien des Atem-, Urogenital- und Gastrointestinaltraktes sowie von Tumorzelloberflächen
auskleiden. Zusammen mit N-Glycanen kommen sie jedoch auch in Immunglobulinen und anderen Glycoproteinen vor. Zu den
0-Glycanen gehören auch die Oligosaccharide der Proteoglycane, die sich durch einen besonders hohen Kohlenhydratanteil
auszeichnen. In diesen in der extrazellulären Matrix vorkommenden Glycokonjugaten können die Oligosaccharide
über einen Galactose-, N-Acetylgalactosamin- oder Xyloserest
an das Polypeptidgerüst gebunden sein.
Die Glycoproteine, bestehend aus Monosacchariden und Eiweiß, werden häufig mit den Glycolipiden als Glycokonjugate
zusammengefaßt. Die Zuckerkomponenten der Glycoproteine, die mit wenigen Ausnahmen weniger als 50 % des Gesamt-Glycoproteins
ausmachen, sind über durch Glycosidasen spaltbare 0- oder N-glycosidische Bindungen mit dem Peptidanteil
verknüpft. Als Kohlenhydrate finden sich in den Glycoproteinen Hexosen (Galactose, Mannose, seltener Glucose)
, N-Acetylhexosamine, N-Acylneuraminsäuren, Fucose und andere. Zur Identifizierung und Bestimmung der Glycoproteine
eignet sich in erster Linie die Affinitätschromatographie mit pflanzlichen Lectinen als Liganden (z.B.
Concanavalin A oder Weizenkeimagglutinin oder andere).
Zu den Glycoproteinen gehören fast alle Membranglycopro-5 teine, Serumproteine, Plasmaproteine, die Blutgruppensubstanzen,
viele Enzyme und Proteohormone, alle Antikörper,
die Chalone, Muzine, Lectine, Bindine, Fibronectin, der
Intrinsic-Faktor und dgl.
Als Membran- oder Oberflächenproteine spielen manche GIycoproteine
für die Pathogenität von Viren eine Rolle. Hier wie bei anderen rezeptorspezifischen zellulären Wechselwirkungen
sind die Kohlenhydrat-Komponenten für Erkennungsprozesse auf molekularer Ebene verantwortlich.
Über bestimmte Zuckerstrukturen auf Rezeptoren heften einige Bakterien und Viren an ihre Zielzellen an.
Besonders bedeutungsvoll sind Oligosaccharidstrukturen auch im Hinblick auf die Zeil-Zeil- bzw. Zell-Matrix-Interaktion.
So vermitteln die Oligosaccharide von Glycoproteinen die Adhäsion von Neuronalzellen und die Bindung von
Lymphozyten an spezifische Endothelzellen. Außerdem können Oligosaccharide als antigene Determinanten von Glycoproteinen
dienen. Auch während der Embryogenese und der Organogenese sind Kohlenhydrat-Kohlenhydrat-Wechselwirkungen
wesentlich an der spezifischen Zellerkennung beteiligt.
Die maligne Transformation von Zellen wird von charakteristischen
Veränderungen der Oligosaccharidstrukturen von Glycoproteinen begleitet. Inwieweit veränderte Oligosaccharidstrukturen
von Tumorzellen und Zellglycoproteinen Ursache oder Wirkung der Tumorentstehung und Metastasierung
sind, ist bis jetzt nicht eindeutig geklärt.
In Krankheitsfällen, in denen das Immunsystem beteiligt ist, ist die Unterstützung des Immunsystems durch Verabreichung
von Substanzen, die Zellen des Immunsystems stimulieren, erforderlich. Die Suche nach Wirkstoffen zur
Stimulierung des Immunsystems ist daher ein vordringliches Ziel pharmakologischer Forschung. Wirkungsvolle Immunstimulantien
mit möglichst wenig Nebenwirkungen sind aber bisher nicht bekannt.
Aufgabe der Erfindung war es daher, Substanzen zu finden, mit deren Hilfe es möglich ist, wirkungsvoll und spezifisch
das Immunsystem zu stimulieren. 5
Es wurde nun überraschend gefunden, daß diese Aufgabe erfindungsgemäß
gelöst werden kann mit neuen Glycoproteinen der nachstehend angegebenen allgemeinen Formeln (I) und
(I1) und neuen Aminozuckern (Neuraminsäure-Vorstufen-Analoga)
der nachstehend angegebenen allgemeinen Formel (II). Sie haben eine proliferationsstimulierende Wirkung
auf tierische und menschliche Zellen des Immunsystems.
Gegenstand der Erfindung sind neue Glycoproteine der nachstehend angegebenen allgemeinen Formeln (I) und(l') sowie
neue Aminozucker (Neuraminsäure-Vorstufen-Analoga) der nachstehend angegebenen allgemeinen Formel (II):
(Neo)Glycoproteine der allgemeinen Formel (I)
20
COOH 25
worin bedeuten:
Z -R1, -NH2, -NHR1, -NR1R1' , -N+R1R11R1,, , -OR1,
-SR1 oder -CR1R11R1,,
35
35
^l ' **1' ' ^l" ' **2' **3' ^4 un(^ ^5' ^e 9leicn oder
verschieden sein können, jeweils Wasserstoff,
einen linearen oder verzweigten Alkylrest mit 1 bis 20 Kohlenstoffatomen (c n H2n+2' n = ^ ^^s
20) , vorzugsweise 1 bis 7 Kohlenstoffatomen;
einen linearen oder verzweigten Alkenylrest mit 3 bis 20 Kohlenstoffatomen (CnH2n/ &eegr; = 3 bis 20,
Position der Doppelbindung an Cn &eegr; = 2 bis 19) ,
vorzugsweise 3 bis 10 Kohlenstoffatomen; einen linearen oder verzweigten Alkinylrest mit 3 bis
2 0 Kohlenstoffatomen (c n H2n-2' n = 3 bis 20' Po~
sition der Dreifachbindung an Cn &eegr; = 2 bis 19),
vorzugsweise 3 bis 10 Kohlenstoffatomen; einen
Alkenyl- bzw. Alkinylrest mit 2 oder mehr Doppelbindungen bzw. Dreifachbindungen mit 4 bis
20, vorzugsweise 7 bis 12 Kohlenstoffatomen; einen Arylrest mit 6 bis 20 Kohlenstoffatomen,
vorzugsweise einen Phenylrest; einen linearen oder verzweigten, gesättigten oder ein- oder
mehrfach ungesättigten Acylrest (-CO-R1) mit insgesamt 1 bis 20, vorzugsweise 1 bis 7
Kohlenstoffatomen einschließlich seiner ein-
oder mehrfach hydroxylierten Analoga; einen Aroylrest mit 6 bis 20, vorzugsweise 6 bis 10
Kohlenstoffatomen; einen Carbonylamidrest der Formel -CONH2, -CONHR1, -CONR1R1, oder CONR1R1IR1M
; einen linearen oder verzweigten,
gesättigten oder ein- oder mehrfach ungesättigten Thioacylrest (-CS-R1) mit insgesamt 1 bis
20, vorzugsweise 1 bis 7 Kohlenstoffatomen; oder einen Thiocarbamidrest der Formel -CS-NH2, -CS-
0 NHR1, -CS-NR1R1, oder -CS-NR1R11R1,,;
wobei jeder der vorgenannten Reste außer H gegebenenfalls ein- oder mehrfach substituiert
sein kann durch Halogen, insbesondere Fluor, Chlor, Brom oder Jod, Hydroxy-, Epoxy-, Amino-,
5 Mercaptan-, Phenyl-, Phenol- oder Benzylgruppen,
und
T einen Mono-, Di- oder Oligosaccharidrest mit bis zu 40 glykosidisch miteinander verknüpften, gegebenenfalls
verzweigten Zuckerresten, die Furanose- und/oder Pyranoseringe darstellen und 5 bis 230 Kohlenstoffatome enthalten und N- oder
O-glycosidisch an Polypeptide gebunden sind.
Besonders bevorzugte erfindungsgemäße Glycoproteine der
vorstehenden allgemeinen Formel (I) sind solche, in denen T steht
für einen Saccharidrest mit N-Glycan-Struktur der Formel
(Ia)
Teil einer C I °'
Polypeptid- \ Asn _<;NlLlGN£Li.MGN .
kette ) Ii \ GN-ÄLLGai-*- {la)
a 1,
Thr Fuc
oder Ser CN^-Gal-)»
5 worin bedeuten:
GaI = Galactose,
GN = N-Acetyl-D-glucosamin,
M = D-Mannose,
Fuc = Fucose,
Asn = Asparagin,
Asn = Asparagin,
X = eine beliebige Aminosäure außer Prolin, Thr = Threonin,
Ser = Serin,
* = T-Verknüpfungsstelle (1 bis 6 Molekülreste)
35
wobei beide peripheren Reste M durch 1 bis 3 Trisaccharide substituiert sein können; oder
für einen Saccharidrest mit O-Glycan-Struktur der allgemeinen
Formel (Ib):
I Ser - 0 - GaI - Oligosacchand
Teil einer |oder fhr oder
Polypeptid- / | NAcGaI
kette u
oder
10 XyI
(Ib)
worin bedeuten:
GaI = Galactose 15 Thr = Threonin Ser = Serin
XyI = Xylose NAcGaI = N-Acetyl-galactosamin
* = T-Verknüpfungsstelle, wobei in den obigen Formeln (Ia) und (Ib) die Galactose
(GaI) ersetzt sein kann durch 2-Desoxy-galactose oder 2-Desoxy-2-halogenid(F,
Cl, Br, J)-galactose;
(Neo)Glycoproteine der allgemeinen Formel (I')
für einen Glycosylphosphatidylinosit(GPI)-Anker Ö"
(I1)
6 Inosit 1
worin bedeuten:
GaI = Galactose,
Man = Mannose
Asp = Asparagin
GIcN = Glucosamin ,
GaI = Galactose,
Man = Mannose
Asp = Asparagin
GIcN = Glucosamin ,
wobei GIcN durch ein Neuraminsäure-Vorstufen-Analogon der
Erfindung (Formel II) ersetzt sein kann.
Besonders bevorzugte Glycoproteine der Erfindung sind solche der Formel (I), in denen dann, wenn T einen Saccharidrest
mit N-Glycanstruktur oder einen Saccharidrest mit O-Glycanstruktur darstellt, GN steht für einen Rest der
allgemeinen Formel (II):
(H) 20
in der R1, R2 und R3 die oben angegebenen Bedeutungen ha-5
ben und Z1 die gleichen Bedeutungen wie Z hat und neben
der äquatorialen Position auch die axiale Position einnehmen kann, und wobei außerdem bei äquatorialer Position von
Z1 der Rest -OR2 in axialer Position stehen kann.
0 Ganz besonders bevorzugte Glycoproteine der Erfindung sind
solche, worin Z bzw. Z1 steht für NHR1, worin R1 den Propanoyl-,
Butanoyl-, Pentanoyl-, Hexanoyl-, Heptanoyl- oder Crotonoylrest einschließlich seiner ein- oder mehrfach hydroxylierten
Analoga darstellt.
35
35
Ganz besonders bevorzugte Glycoproteine der Erfindung sind auch solche, in denen R2 bis R5 für H oder CH3 steht;
(ID
in der Z1 und R1, R2 und R3 die vorstehend angegebenen Bedeutungen
haben.
Die erfindungsgemäßen neuen Aminozucker der allgemeinen
Formel (II) und die daraus gebildeten (Neo)Glycoproteine der allgemeinen Formeln (I) und (I1) stellen neue
Substanzklassen dar, die als potente Wirkstoffe zur Behandlung von Krankheiten eingesetzt werden können, an
denen Zellen der spezifischen und unspezifischen Immunabwehr, Tumorzellen, Leukozyten, Thrombozyten und
Gefaßendothelzellen beteiligt sind. Die Verbindungen
können gezielt über eine Modulation Membran-ständiger Rezeptoren wirken, die an der Regulation des Wachstums und
der Differenzierung sowie der Adhäsion von Zellen des Immunsystems, von Tumoren und von Gefäßen beteiligt sind.
Eine Immunstiinulation ist notwendig beim Heilungsprozeß
infektiöser und tumorbedingter Krankheiten. Weiterhin verhindern diese Verbindungen die Adhäsion von Leukozyten
oder Tumorzellen auf Gefäßendothelzellen bei septischem Schock oder bei der Metastasierung. Die Verabreichung
dieser Substanzen, insbesondere der Substanzen der Formel (II), führt zu keinen erkennbaren Nebenwirkungen.
5 Die erfindungsgemäßen neuartigen Aminozucker (II) und
Glycoproteine (I) und (I1), die neuartige Immunstimulantien
darstellen, können als Stimulantien für Zellen des
Immunsystems eingesetzt werden. Dadurch ist eine Stärkung
des Immunsystems bei immungeschwächten Organismen möglich. Sie zeichnet sich durch hohe Zell-Spezifität und fehlende
Nebenwirkungen aus.
5
5
Die in den Formeln (I), (I1) und (II) genannten Reste
werden nachstehend näher erläutert.
Beispiele für die obengenannten Alkylreste mit 1 bis 20, vorzugsweise 1 bis 7 Kohlenstoffatomen sind beispielsweise
Propyl-, Butyl-, Pentyl-, Hexyl-, Isopropyl- und Pivalinylreste.
Beispiel für geeignete Alkenylreste sind Propenyl-, But-2-enyl-,
But-3-enyl-, Pent-2-enyl- und Pent-3-enyl-Reste.
Beispiele für geeignete Alkenylreste mit mehreren Doppelbindungen sind Pent-2,4-dienyl- und Hex-2,4-dienyl-Reste.
Beispiele für geeignete Substituentengruppen sind Chlorethyl-,
Dichlorethyl-, Trichlorethyl-, p-Chlorophenyl-, Hydroxymethyl-, 3-Hydroxypropyl- und p-Hydroxyphenylgruppen.
Die Sialinsäure ist Bestandteil des Glykoproteins (I) bzw. Aminozuckers (II) .
Beispiele für langkettige Acylreste sind Caproyl-, Octoyl-, Lauroyl-, Myristoyl-, Palmitoyl-, Stearoyl-,
Oleyl-, Linoleyl-, Linolenoyl- und Arachidonoyl-Reste
sowie deren ein- oder mehrfach hydroxylierten Analoga.
Beispiele für geeignete Monosaccharide Disaccharid- und
Oligosaccharid-Reste sind D-Glucosyl-, D-Galactosyl-, D-Mannosyl-,
Xylosyl-, Inosyl-, Ribosyl-, Arabinosyl-, Fructosyl-,
Sorbosyl-, Lactosyl-, Saccharosyl-, Trehalosyl-, Maltosyl-, Cellobiosyl- und höhere Saccharidreste, wie
Raffinosyl-, Fucosyl-, Chitobiosyl-, Chitobiosemannosyl-,
Rutinosyl- und Rhamnosyl-Reste. Es sind sowohl &Igr;&agr;- als
auch lß-Verknüpfungen möglich. Ein oder mehrere Zuckerringe können auch als Zuckeramine wie Glucosamin, Mannosamin und Galactosamin vorliegen.
auch lß-Verknüpfungen möglich. Ein oder mehrere Zuckerringe können auch als Zuckeramine wie Glucosamin, Mannosamin und Galactosamin vorliegen.
Gegenstand der Erfindung sind ferner Verfahren zur in
vivo-Herstellung der Verbindungen der vorstehend angegebenen Formeln (I), (I1) und (II) durch parenterale oder
vivo-Herstellung der Verbindungen der vorstehend angegebenen Formeln (I), (I1) und (II) durch parenterale oder
enterale Verabreichung einer 2-Desoxy-2-amino-mannose,
-glucose oder -galactose, deren Aminogruppe durch R1 substituiert
ist, vorzugsweise von N-Propanoyl-, N-Butanoyl-,
N-Pentanoyl-, N-Hexanoyl-, N-Heptanoyl- oder N-Crotonoyl-D-mannosamin,
an Mensch oder Tier.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung können die in vivo gebildeten Glycoproteine der allgemeinen Formeln
(I) und (I1)auf an sich bekannte Weise gewonnen
(abgetrennt) werden für den therapeutischen Einsatz.
(abgetrennt) werden für den therapeutischen Einsatz.
Gegenstand der Erfindung sind ferner pharmazeutische Mittel
zur Stimulierung des Immunsystems, insbesondere der T-Lyphozyten,
zur Infektabwehr, zur Behandlung von Immunschwächen, Tumorerkrankungen einschließlich Metastasierungsprozessen,
Infektionskrankheiten (Viren, Bakterien,
Parasiten, Protozoen) und Kreislaufversagen, insbesondere Gefäßverschlüssen und Septikämien, bei Mensch und Tier;
30
Parasiten, Protozoen) und Kreislaufversagen, insbesondere Gefäßverschlüssen und Septikämien, bei Mensch und Tier;
30
zur Erhöhung der zytotoxischen Aktivität Natürlicher
Killerzellen (NK-Zellen) zur Induktion einer Antitumor-Immunreaktion bei Mensch und Tier;
Killerzellen (NK-Zellen) zur Induktion einer Antitumor-Immunreaktion bei Mensch und Tier;
zur Steigerung der Phagozytose-Fähigkeit von Granulozyten und Monozyten zur Induktion einer Antitumor-Immunreaktion
bei Mensch und Tier;
zur in vivo-Beeinflussung Neuraminsäure-abhängiger biologischer
Prozesse;
zur Hemmung der Ligandenbindung an sialylierte Zeiloberflächenrezeptoren
(Endothelzellen, Thrombozyten, Leukozyten) ;
zur Hemmung der Bindung eines mikrobiellen Pathogens
(Virus, Bakterium, Parasit, Protozoon) oder Toxins an die
Wirtszelle über einen sialylierten Rezeptor durch in vivo-Modulation
von Neuraminsäuren;
die jeweils als Wirkstoff mindestens eine Verbindung der vorstehend angegebenen Formeln (I) und/oder (I1) und/oder
(II) und/oder der Produkte der vorstehend beschriebenen Herstellungsverfahren, gegebenenfalls in Kombination mit
anderen Wirkstoffen sowie üblichen pharmazeutischen Trägern und/oder Hilfsstoffen, enthalten.
20
Die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Mittel enthalten die erfindungsgemäße Verbindung(en) der Formeln (I)
und/oder (I1) und/oder (II) und/oder die Verfahrensprodukte in einer Menge von 0,01 bis 50 Gew.-%,
vorzugsweise von 0,1 bis 20 Gew.-%, insbesondere von 2 bis 10 Gew.-%, bezogen auf das Gewicht des pharmazeutischen
Mittels.
Gegenstand der Erfindung ist ferner die Verwendung der Verbindungen der allgemeinen Formeln (I) und/oder (I1)
und/oder der allgemeinen Formel (II) und/oder der Produkte der vorstehend beschriebenen Herstellungsverfahren
zur Stimulierung des Wachstums und der Differenzierung von
menschlichen und tierischen Zellen des Immunsystems und zur Verhinderung der Adhäsion von Leukozyten, Thrombozyten
und Tumorzellen an Gefäßendothelzellen;
zur Stimulierung des Immunsystems, insbesondere von T-Lyphozyten, zur Infektabwehr, zur Behandlung von Immunschwächen,
Tumorerkrankungen einschließlich Metastasierungsprozessen, Infektionserkrankungen (Viren, Bakterien, Parasiten,
Protozoen) und Kreislaufversagen, insbesondere Gefäßverschlüssen und Septikämien, bei Mensch und Tier;
zur Hemmung der Bindung eines Liganden an seinen sialylierten
Zelloberflächenrezeptor;
zur Hemmung der Bindung eines mikrobiellen Pathogens
(Virus, Bakterium, Parasit, Protozoon) oder Toxins an die Wirtszelle über einen sialylierten Rezeptor durch in vivo-Modulation
von Neuraminsäuren;
zur biosynthetischen Herstellung von Liganden oder Rezeptoren mit modifizierter Neuraminsäure und Verwendung derselben
zur Kompetition physiologischer oder pathologischer 0 Ligand-Rezeptor-Interaktionen;
zur in vitro-Beeinflussung des Infektionsverlaufs humaner
Immundefizienz-Viren (z.B. HIV-I und HIV-2);
zur in vivo-Prävention der Infektion humaner Immundefizienz-Viren (z.B. HIV-I und HIV-2); und
zur Behandlung von parasitären Erkrankungen, insbesondere von Trypanosomiasen, Leishmaniasen, Trichomoniasis, Giardiasis,
Amöbiasis, Malaria, Pneumozystose, Schistosomiasis (Bilharziose) und Echinokokkose.
Ein wichtiges Anwendungsgebiet der vorliegenden Erfindung ist die in vivo-Beeinflussung durch Neuraminsäure-Vorstufenanaloga
der vorstehend angegebenen allgemeinen Formel (II) von Rezeptor-Ligand-Interaktionen, an denen Neuraminsäuren
beteiligt sind.
Viele biologische Vorgänge beruhen auf der Interaktion von Liganden (beispielsweise
Hormone, Interleukine, Pharmaka, Zell-Zell-Erkennung) mit Rezeptoren auf
Zelloberflächen. Auch pathogene Mikroorganismen (Viren, Bakterien, Protozoen) oder
deren Toxine benutzen für ihre pathogene Wirkung häufig Zelloberflächenstrukturen als
Rezeptoren für die Interaktion mit Wirtszellen. Zell-Zell-Erkennung ist wesentlich beteiligt
an physiologischen und pathologischen (z.B. Autoimmunerkrankungen) Funktionen des
Immunsystems, bei der Gewebedifferenzierung und bei der immunologischen Kontrolle
maligner Tumorzellen.
Bei einer Vielzahl dieser Ligand-Rezeptor-Interaktionen sind Kohlenhydrat-Strukturen
wesentlich beteiligt Eine besondere Rolle spielen dabei terminate Neuraminsäuren auf
diesen Kohlenhydrat-Strukturen: Beispielsweise benutzt das Influenzavirus einen sialylierten Zelloberflächen-Rezeptor. Zur Aktivierung von T-Lymphozyten sind sialylierte
Differenzierungsantigene notwendig. Des Weiteren ist unterschiedliche Zelloberflächen-Sialylierung
als Determinante für Progession und Metastasierung maligner Tumoren
beschrieben worden.
Eine Möglichkeit, Neuraminsäure-abhängige biologische Prozesse zu beeinflußen, besteht
in der Verwendung nicht-toxischer Neuraminsäure-Vorstufen-Analoga, die von Zellen
aufgenommen werden und nach Metabolisierung anstelle von physiologischer Neuraminsäure in Kohlenhydrat-Strukturen eingebaut werden. Die eingeführte Modifikation
der Neuraminsäure kann Ligand-Rezeptor-Interaktion abschwächen, verstärken oder
unbeeinflußt lassen.
Je ein Beispiel für Abschwächung bzw. Verstärkung einer Rezeptor-Ligand-Interaktion
wird im Folgenden beschrieben:
A. Reduktion der Infizierbarkeit von humanen B-Lymphomzellen (BJA-B) für das
lymphotrope Papovavirus (LPV) durch Vorbehandlung mit N-Propanoyl-D-Mannosamin
oder N-Butanoyl-D-Mannosamin.
Der von LPV auf BJA-B-Zellen benutzte Rezeptor ist Neuraminsäure-abhängig, da
Behandlung der Zellen mit Vibrio cholerae Neuraminidase die Virusbindung und die
Infizierbarkeit um mehr als das Fünffache reduziert (eigene unveröffentlichte Ergebnisse).
B. Verstärkung der Infizierbarkeit von Affen-Nieren-Epithelzellen (Vero) für das humane
Poylomavirus BK (BKV) durch Vorbehandlung mit N-Propanoyl-D-Mannosamin.
Für die fnfektion von Vero-Zellen durch BKV ist eine Zelloberflächen-Neuraminsäure
wesentlich, da Präinkubation von Vero-Zellen mit Neuraminidase, die Infizierbarkeit
reduziert (Sinibaldi et al., Arch. Virol. 113 (1990), 291-296).
MATERIAL UND METHODEN 1. Verwendete Abkürzungen
BKV DAPI DMEM DTT EBV ELISA FITC FKS LPV LRSC mAk OD
PBS rpm RT SD SV40 TMB TRITC VP
FACS Scan
Absorption
BK Virus
41, 6-Diamidino-2-phylindol Dulbecco's modifiziertes Eagle Medium
1,4-Dithiothreitol Epstein-Barr Virus Enzymgekoppelter Immunosorbent Test
Fluorescinisothiocyanat Fötales Kälberserum Lymphotropes Papovavirus
Lisamin-Rhodamin-lsothiocyanat Monoklonaler Antikörper Optische Dichte
Phosphat-gepufferte Salzlösung Umdrehungen pro Minute Raumtemperatur Standardabweichung
Simian Virus 40 Tetramethylbenzidin Tetra-Rhodamin-Isothiocyanat Virales Strukturprotein
Fluoreszenz-aktivierter Cellsorter
Scanner
2. Zellkuiturmedien
Als Zellkuiturmedien wurden RPMI 1640 und DMEM Medium verwendet, die von
Biochrom, Berlin.als Trockensubstanz bezogen wurden. Für den Gebrauch wurden sie
nach Herstellerangaben in bidestilliertem, pyrogenfreiem H2O aufgenommen und
sterilfiltriert. Zugesetzt werden 10% FKS [30 min bei 56°C inkubiert zur Inaktivierung des
Komplementsystems], 100 U/ml Penicillin, 100 &mgr;&agr;/ml Streptomycin und 2 mM L-Glutamin.
3. Puffer
125 mM NaCI (7,2 g); 18,4 mM Na2HPO4 (3,14 g); 10,9 mM KH2PO4
(1,42 g); H2O ad 1 I (pH 7,2)
-"Extraktionspuffer" zur Herstellung von LPV- und BKV-Impfvirus aus infizierten Kulturen:
50 mM HEPES pH 7,4; 1 mM MgCI2; 0,5 mM CaCI2; 1 mM DTT; 1mM
PMSF; 2,5 &mgr;&agr;/&iacgr;&eegr;&Igr; Amphotericin B; 200 &mgr;g/ml Gentamycin; 200 U/ml
Penicillin; 200 &mgr;g/ml Streptomycin.
DTT1 PMSF1 Amphotericin B1 Gentamycin, Penicillin und Streptomycin werden dem
autoklavierten Puffer vor Gebrauch frisch zugesetzt.
4. Zellinien
Die humane B-Lymphom-Zellinie BJA-B (Menezes et al., Biomedicine 22 (1975), 276-284)
wurde als LPV-suszeptible Zellinie benutzt. Diese Zellinie ist erhältlich bei der European
Collection of Animal Cultures (ECACC), Porton Down, Salisbury (GB), hinterlegt gemäß
den Bedingungen des Budapester Vertrags unter der Nummer 86081105. Als BKV-suszeptible
Zellinie wurde die Affen-Nieren-Epithelzellinie Vero benutzt. Diese Zellinie ist
erhältlich bei der American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, Maryland (USA)
unter der Nummer ATCC CRL 1587.
5. Zellkultur
Alle Zellkulturarbeiten wurden unter einer Sicherheitswerkbank (L II) durchgeführt. Die
Zellen wurden in Brutschränken bei 37°C mit 5% CO2 und 95% Luftfeuchtigkeit gehalten.
BJA-B Zellen wurden in Glas-Erlenmeyerkolben mit Aluminiumfoliendeckel kultiviert. Bei
einer Dichte von 2x105 bis 1x106 Zellen pro ml befanden sich die Zellen in der
logarithmischen Wachstumsphase. Hatten sie eine stationäre Wachstumsphase erreicht,
wurden sie mit frischem Medium gefüttert und dabei 1:3-1:10 vedünnt (Forbes et al., Mol.
Cell. Probes 2 (1988), 245-253). Die adhärent wachsenden Monolayer-Zeliinie Vero wurde
in Zellkultur-Plastikflaschen gehalten. Bei Erreichen der Konfluenz wurde das Medium
abgenommen und der Zellrasen mit wenigen ml Trypsin-Lösung [0,1% Trypsin; 0,1%
EDTA in H2O] gespült. Nach kurzem Einwirken von Trypsin bei 37°C lösten sich die Vero
Zellen vom Untergrund ab. Dann wurden sie 1:3-1:20 mit irischem Medium verdünnt
(Mühlbach et al., Virology 186 (1992), 65-73).
Zur Zeilkonzentrationsbestimmung wurden 100 &mgr;&Igr; suspendierter Zellen mit 100 &mgr;&Igr;
Trypanblau-Lösung [0,25% Trypanblau, gelöst in PBS] gemischt und einige Tropfen
zwischen Deckglas und Kammer einer Neubauer-Zählkammer pipettiert. Tote Zellen
färbten sich blau an und konnten von hell-leuchtenden lebenden Zellen im Lichtmikroskop
unterschieden werden. Die Summe der Zellzahlen von zwei der vier Quadranten multipliziert mit 104 ergab die Zellzahl pro ml der Ausgangskultur.
6. Antiseren und monoklonale Antikörper
Benutzt wurden ein polyklonales Hamster-a-LPV-T-Antigen Serum, ein polyklonales
Kaninchen-a-LPV-VP-Serum und monoklonaler Antikörper (mAk) 456-1 aus Maus-Aszites
gegen LPV-VP1 von M. Pawlita, Heidelberg; außerdem wurden ein Maus-mAk gegen
SV40-T-Antigen (mAk SV1-3H9) von F. Mehnert, Bochum, sowie ein Kaninchen-Antiserum
gegen BKV Partikel von G. Noss, Rehlingen-Siersburg, verwendet.
7. Herstellung von Impfvirus
7.1. Herstellung von LPV-lmpfvirus
Das lymphotrope Papovavirus (LPV) ist bei der American Type Culture Collection unter
der Nummer ATCC VR-961 erhältlich. Zu 2x107 BJAB Zellen in Kultur werden 200-300 &mgr;&Igr;
einer LPV-lmpfvirus Lösung gegeben. Die Kultur wird alle drei Tage 1:5 mit frischem
Medium expandiert und ab dem 6. Tag wird über indirekte Immunfluoreszenz der Prozentsatz Virus-infizierter Zellen bestimmt; liegt dieser zwischen 30% und 60% so wurde
die Kultur geerntet. Dazu wurden die Zellen für 15 min bei 600 g abzentrifugiert, in PBS
gewaschen und das Zellsediment zur Zellyse bei -20°C eingefroren. Zur Virusextraktion
wird das Zellsediment in kaltem "Extraktionspuffer" (1/20 des Zellkulturvolumens)
resuspendiert. Die Suspension wird unter häufigem Aufwirbeln (Vortexen) für 60 min auf
Eis gehalten bevor die Zelltrümmer mit 2500 g für 10 min bei 4°C abzentrifugiert werden.
Das verbleibende Sediment wird noch dreimal mit 1/60 des ursprünglichen Zellkulturvolumens jeweils für 5-10 min nachextrahiert. Nachfolgend werden die vier
Überstände vereinigt. Durch Titration auf BJA-B Zellen wurde die Infektiosität der LPV-Suspension
bestimmt und das Impfvirus bis zur Verwendungbei -200C eingefroren.
7.2. Herstellung von BKV-Impfvirus
Das humane Polyomavirus BK (BKV) ist bei der American Type Culture Collection unter
der Nummer ATCC VR-837 erhältlich. BKV-Impfvirus wurde aus infizierten und für ca. 3
Wochen kultivierten Vero Zellen gewonnen. Die Zellen wurden mit Trypsin abgelöst und 15
min bei 600 g abzentrifugiert, in PBS gewaschen und das Zellsediment zur Zellyse bei -
20*C eingefroren. Das Zellsediment wurde zweimal einem Frieren-Tauen Vorgang
unterzogen und zur Virusextraktion in kaltem "Extraktionspuffer" (1/20 des
Zellkulturvolumens) resuspendiert. Die Suspension wurde unter häufigem Aufwirbeln
(Vortexen) für 60 min auf Eis gehalten, bevor die Zelltrümmer mit 2500 g rpm für 10 min
bei 4*C abzentrifugiert wurden. Nachfolgend wurde die Infektiosität des Überstands auf
Vero Zellen austitriert das Impfvirus bis zum Gebrauch bei -20eC eingeforen.
8. Behandlung von Zellen mit Neuraminidasen und nachfolgende Virus-Infektion
1,5x106 BJA-B Zellen wurden zweimal in PBS gewaschen, 1 h in PBS bei 37"C gehalten
und dann mit 20 mU Neuraminidase (von vibrio cholerae) in 100 &mgr;&Igr; PBS (0,2 U/ml) auf
einem Schüttler für 60 min bei 37eC inkubiert. Nach einmaligem Waschen (4"C, 400 g, 10
min) in PBS wurden die Zellen erneut mit Neuraminidase (0,2 U/ml) unter den gleichen
Bedingungen inkubiert. Nach weiteren 60 min werden die Zellen in kaltem Medium aufgenommen und 10 min bei 4*C und 2600 rpm abzentrifugiert. Das Zellsediment wurde
in 400 &mgr;&Igr; einer LPV-Impfvirus Suspension aufgenommen und bei 4eC für 3 h unter
mehrmaligem Aufwirbeln inkubiert. Das nicht-zellgebundene Virus wurde durch einmaliges
Waschen mit Medium entfernt und die Zellen nachfolgend in 2 ml frisches Medium aufgenommen und für 48 h kultiviert.
Zu ca. 50% konfluent gewachsene Vero Zellen auf Deckgläsern wurden mit PBS
gewaschen und wie oben beschrieben mit Neuraminidase (von vibrio cholerae) für
ingesamt 2 h inkubiert. Die Enzymlösung wurde mit Medium abgespült und die Zellen
nachfolgend mit BKV-Impfvirus für 3 h bei 4°C infiziert. Nicht zellgebundenes BKV wurde
von Vero Zellen durch dreimaliges Spülen mit Medium abgewaschen. Nach 48 h Kultur bei
37°C wurde der Prozentsatz Virus-infizierter Zellen mittels indirekten Immunfluorezenz
bestimmt werden.
9. Behandlung von Zellen mit N-Acyl-D-Mannosaminen und nachfolgende LPV- oder
BKV-lnfektion
BJA-B Zellen wurden in frischem Medium aufgenommen zu Zellkonzentrationen von
1x106/ml für Behandlungsdauern von 3 h und 2XiO5ZmI für 48 h Inkubation. Die
Konzentration der in PBS gelösten Neuraminsäure-Vorstufenanaloga wurde zwischen 0,01
und 10 mM in Kultur variiert. Monolayerzellen wurden dünn auf Deckgläschen ausgesät,
so daß sich ein konfluenter Zellrasen erst nach etwa vier Tagen einstellte. Nach Behandlung mit den Neuraminsäure-Vorstufenanaloga wurden die Zellen in PBS
gewaschen und für 3 h bei 4*C mit Impfvirus infiziert. Mit LPV-infizierte BJA-B Zellen
wurden dann einmal mit Medium gewaschen und abzentrifugiert, mit BKV-infizierte Vero
Zellen wurden dreimal mit Medium gespült. Nach weiteren 48 h in Kultur konnte der
Prozentsatz Virus-infizierter Zellen in der indirekten Immunfluorezenz bzw. die LPV-Permissivität
bestimmt werden.
10. Messung von Virus-Bindung und -Infektion
(i). Bestimmung des Grades der Virusinfektion
Der Grad der LPV-lnfektion in Kultur wurde sowohl über eine Bestimmung des
Prozentsatzes Virus-Antigen-produzierender Zellen mittels indirekter Immunfluoreszenz
(Forbes et al, a.a.O.) als auch über eine Quantifizierung des viralen Hauptstrukturproteins
LPV-VP1 mittels ELlSA (10.2.3.) relativ zur Gesamtproteinmenge eines Extraktes
infizierter Zellen ermittelt. Dieser Quotient (ausgedrückt als ng LPV-VP1 pro mg
Gesamtprotein) wird nachfolgend als LPV-Permissivität bezeichnet.
Der Grad der BKV-Infektion wurde ebenfalls über indirekte Immunfluoreszenz unter
Verwendung eines Kaninchen-anti-BKV-Partikel-Serums bestimmt.
(ii). LPV-Bindungstest
Die Bindung von LPV-Partikeln an BJA-B-Zellen wurde wie unter 10.3. beschrieben
gemessen.
10.1. Indirekte Immunfluoreszenz
Zur Bestimmung des Prozentsatzes Virus-infizierter Zellen wurden 5x105 BJA-B Zelllen 48
h nach Infektion abzentrifugiert und in 50 &mgr;&Igr; PBS resuspendiert (IxIO4 Zellen/&mgr;&idiagr;). 10 &mgr;&Igr;
wurden auf ein Feld eines poly-L-Lysin-beschichteten Adhäsions-Objektträgers
aufgebracht (BioRad adhesion slides, BioRad, München). In einer feuchten Kammer
konnten sich die Zellen in 30 min auf den poly-L-Lysin-beschichteten Untergrund absetzen. Nicht angeheftete Zellen wurden mit PBS abgespült und die Objektträger
anschließend in einem "kaltem" Aceton/Methanol Gemisch [Im Verhältnis 1:1, bei -200C
aufbewahrt] für 5 min fixiert.
Vero Zellen wurden auf Deckgläschen (Durchmesser 10 mm) ausgesät werden, wuchsen
dort an und wurden nach einmaligem PBS-Waschen, wie oben beschrieben, fixiert
werden.
Die fixierten Zellpräparate wurden mit je 10-30 &mgr;&Igr;/Feld monoklonalen oder polyklonalen
Erstantikörpern bei 37"C in einer feuchten Kammer für 45-60 min inkubiert. Die
Objektträger wurden anschließend in einer mit PBS gefüllten Schale mit Hilfe eines
Magnetrührers vorsichtig für 5 min gewaschen. Als Zweitreagentien dienten komerziell
erhältliche Fluorochrom-gekoppelte (FITC1 TRlTC1 LRSC) Antiimmunoglobuline (1:50-1:100
verdünnt in PBS). Den Zweitreagentien wurde DAPI zur Kernfärbung zugesetzt. Nach einer weiteren 45 bis 60-minütigen Inkubation unter Lichtausschluß und
nachfolgendem Waschen wurden die Präparate mit einer Elvanol-Lösung [20 g Elvanol
(Polyvinylalkohol), 160 ml PBS1 80 ml Glycerin. Die Elvanol-Lösung wurde bei 80eC
gehalten bis sich das Elvanol vollständig gelöst hat, dann portionsweise abgefüllt und
autoklaviert] und Deckgläsern (24x60 mm) luftblasenfrei eingebettet und bei 4"C
lichtgeschützt gelagert.
Die Fluoreszenzmikroskopie wurde an einem Vanox-T Mikroskop von Olympus, Tokio,
Japan durchgeführt.
10.2.1. Extraktion infizierter Zellen zur Bestimmung der LPV-Permissivität
Die Zellen (ca. 3-4 &khgr; 106) wurden 48 h nach Infektion geerntet, in PBS gewaschen und das
Zellsediment zur Zellyse für mindestens einen Tag bei -20°C eingefroren. Die
Virusextraktion wurde, wie unter 7.1. beschrieben, durchgeführt: Das Zellsediment wurde
in 400 &mgr;&Igr; kaltem "Extraktionspuffer" resuspendiert und unter häufigem Aufwirbeln für 60-90
min auf Eis gehalten, bevor die Zelltrümmer mit 4500 g für 10 min bei 4eC abzentrifugiert
wurden. Der Virus-haltige Überstand wurde auf seine Protein-(10.2.2.) und LPV-VP1-Konzentration
(10.2.3.) analysiert und daraus die LPV-Permissivität der infizierten Zellen
errechnet.
10.2.2. Protein-Konzentrationsbestimmung des Zellextrakts Die Proteinkonzentration des Extrakts infizierter Zellen wurde mit dem "BioRad-Micro-Assay"
entsprechend den Herstellerangaben bestimmt. Es wurde ein solches Volumen der Proteinlösungen eingesetzt, daß die Blaufärbung derjenigen von 10 oder 20 &mgr;g des vom
Hersteller mitgelieferten Proteinstandards entsprach. Die genaue Proteinkonzentration der
Proben wurde aus der Standardkurve intrapoliert.
10.2.3. LPV-VP1-ELISA
Der affinitätsgereinigte mAk 456-1 gegen LPV-VP1 wurde 1:1&ogr;4 in Kopplungspuffer [0,05
M Na2CO3 (pH 9,6)] verdünnt und jeweils 100 &mgr;&Igr; pro Napf einer ELISA-Platte (96-Napf
Platte, NUNC, Wiesbaden) zugegeben. Nach Lagerung bei 4°C über Nacht wurden die
Platten mit Waschpuffer (PBS mit 0,05% Tween 20) in einem Ultrawash Il Gerät
(Dynatech, Denkendorf) durchgespült (5x300 &mgr;&Igr; pro Napf), um nicht-gebundene Antikörper
zu entfernen. Das Blocken noch freier Bindungsstellen wurde mit 200 &mgr;&Igr; pro Napf einer
0,2% Gelatine Lösung in PBS mit 0,1% Natriumazid bei RT für 2 h durchgeführt. Die
Platten konnten dann bis zur Benutzung für mehrere Wochen bei 4°C aufbewahrt werden.
(1) Die zu vermessenden LPV-Suspensionen aus extrahierten Zellen wurden in PBS
1:2 bis 1:2000 verdünnt und 100 &mgr;&Igr; pro Napf eingesetzt. Aus einer gereinigten LPV-
Partikel Präparation (5 &mgr;&rgr; LPV-VPI/&mgr;&Igr;) wurde eine Verdünnungsreihe von 12,5 pg bis
1,6 ng LPV-VP1 pro 100 &mgr;&Igr; pro Napf angesetzt, die Standardkurve diente. Für jede
Probe wurde eine Zweifachbestimmung durchgeführt. Die Inkubation wurde bei 37eC
für 60 min durchgeführt.
(2) Die Platte wurde mit Waschpuffer gründlich gespült (9x300 &mgr;&Igr; pro Napf).
(3) Das polyklonale Kaninchen Serum gegen LPV-VP wurde 1 : 2500 in Waschpuffer
verdünnt und jeweils 100 &mgr;&Igr; pro Napf als Zweitantikörper zugegeben. Die Inkubation
fand wie oben beschrieben bei 37°C für 60 min statt.
(4) Die Platte wurde erneut mit Waschpuffer gespült (9x300 &mgr;! pro Napf).
(5) Peroxidase-gekoppeltes Ziege anti-Kanninchen IgG wurde in Waschpuffer
verdünnt (1 : 5000) und 100 &mgr;&Igr; pro Napf der ELISA-Platte zugegeben. Die Inkubation
fand bei 37°C für 60 min statt.
(6) Nach erneutem Waschen (wie (2) und (4)) wurden pro Napf 100 &mgr;&Igr; Substratlösung
[9,9 ml 0,1 M Natriumacetatpuffer (pH 6,0), 100 &mgr;&Igr; Tetramethylbenzidin (TMB)-Substrat,
2 &mgr;&Igr; 37% H2O2] zupipettiert. Die im Napf befindliche Peroxidase setzte
diese Substrat um, es entstand eine bläuliche Färbung. Nach 10-20 min wurde die Reaktion durch Zugabe von 1 M H2SO4 (50 &mgr;&Igr; pro Napf) gestoppt und bei einer
Wellenlänge von 450 nm spektrophotometrisch vermessen. Die Berechnung der
LPV-VP1 Standardkurve und Umrechnung der OD-Werte der Proben in ng LPV-VP1 wurde mit einem Programm des Photometer Titertek Multiskan Plus MKII von Flow
Laboratories, Meckenheim durchgeführt.
10.3. LPV-Bindungstest an BJA-B Zellen
Gewaschene Zellen (1x106) wurden mit gereinigten LPV-Partikeln (10 ng LPV-VP1) für 30
min bei 37°C in 500 &mgr;&Igr; PBS (2 &khgr; 106 Zellen/ml) inkubiert. Nach Zentrifugation der Zellen bei
12500 rpm für 2 min wurde das ungebundene, im Überstand befindliche Virus im LPV-VP1-ELISA
quantifiziert. LPV-Bindung wurde als Prozentsatz des zellassoziierten Virus
relativ zur eingesetzten Gesamtvirusmenge (= 100%) bestimmt.
A. Hemmung der LPV-lnfizierbarkeit durch Vorbehandlung von BJA-B-Zellen mit N-Propanoyl-oder N-Butanoyl-D-Mannosamin.
Bei einer Endkonzentration der Analoga von 10 mM und 48 h Vorbehandlungszeit von
BJA-B-Zellen war sowohl der Prozentsatz LPV-infizierter Zellen in der indirekten.
Immunfluoreszenz als auch die LPV-Permissivität zwischen 89 und 95% reduziert. Bei
gleicher Behandlungsdauer wurde mit 0.4 mM N-Propanoyl-D-Mannosamin eine 50% ige
Reduktion der LPV-Permissivität erreicht.
In Zellen, die für 48 h mit 5 mM N-Butanoyl-D-Mannosamin
vorbehandelt waren, wurde eine 80 %ige Reduktion der LPV-Bindung beobachtet.
Bei einer Endkonzentration von 10 mM und 48 h Vorbehandlung von Vero-Zellen wurde
ein Anstieg der Zahl BKV-infizierter Zellen um das Siebenfache erreicht. Behandlung der
mit Analogon vorinkubierten Zellen mit Vibrio cholerae Neuraminidase (200 mU/ml, 2 h,
370C) führte zu einer über 80 %igen Reduktion dieser Infizierbarkeit.
Ein weiteres wichtiges Anwendungsgebiet der Erfindung ist die Beeinflussung der Replikation des humanen Immundefizienz-Virus
Typ 1 (HIV-I) in MT-4 Zellen durch Neuraminsäure-Vorstufen-Analoga
(Aminozucker) der vorstehend angegebenen allgemeinen Formel (II).
1. Material und Methoden
Die humane T-Zellinie MT-4, die für HIV-1 hoch-suszeptibel ist (Harada et al., Science 229
(1985), 563-566), wurde in RPMI 1640 unter Zusatz von 10% Hitze-inaktiviertem FKS, 100
U/ml Penicillin, 100 ng/ml Streptomycin und 2 mM L-Glutamin, wie oben beschrieben,
kultiviert unter Labor-Sicherheitsbedingungen der Stufe L3.
(1985), 563-566), wurde in RPMI 1640 unter Zusatz von 10% Hitze-inaktiviertem FKS, 100
U/ml Penicillin, 100 ng/ml Streptomycin und 2 mM L-Glutamin, wie oben beschrieben,
kultiviert unter Labor-Sicherheitsbedingungen der Stufe L3.
HIV-1 (Stamm HTLV-1116)-Impfvirus (Infektiosität: 1x106 IU/ml) wurde aus dem Überstand
infizierter MT-4 Zellen gewonnen wie beschrieben in Popovic et al., 1984 (Science 224,
497-501). Das HlV-lmpfvirus wurde aliquotiert und bei -70"C gehalten. HIV-Stamm HTLV-IIIB ist bei der Division of AIDS, National Institute of Allergy and Infectious Diseases, 6003
Executive Boulevard, Bethesda, MD 20892 (catalog number 398) erhältlich.
5x105 MT-4 Zellen wurden in 2 ml Medium in 12-Napf Platten für eine Behandlungsdauer von 40 h mit N-Acyl-D-Mannosaminen kultiviert. Als Konzentration der in PBS gelösten Neuraminsäure-Vorstufen-Analoga wurden 2.5 und-5 mM in Kultur benutzt. Nachfolgend wurden die Zellen in PBS gewaschen, gezählt und IxIO6 lebende Zellen in 2 ml Medium aufgenommen und mit 100 &mgr;&Igr; HTLV-l!lB-!mpfvirus für 3 h bei 37°C infiziert. Nach einmaligem Waschen in 2 ml PBS wurden die Zellen erneut in Medium aufgenommen und für weitere 24 h kultiviert. In Überständen dieser Kulturen wurden mit Hilfe eines ELISA (Vironostika HIV-Antigen EUSA Mikrosystems, Organon, Eppelheim) nach Herstelllerangaben die HIV-1-Antigen Konzentration bestimmt.
infizierter MT-4 Zellen gewonnen wie beschrieben in Popovic et al., 1984 (Science 224,
497-501). Das HlV-lmpfvirus wurde aliquotiert und bei -70"C gehalten. HIV-Stamm HTLV-IIIB ist bei der Division of AIDS, National Institute of Allergy and Infectious Diseases, 6003
Executive Boulevard, Bethesda, MD 20892 (catalog number 398) erhältlich.
5x105 MT-4 Zellen wurden in 2 ml Medium in 12-Napf Platten für eine Behandlungsdauer von 40 h mit N-Acyl-D-Mannosaminen kultiviert. Als Konzentration der in PBS gelösten Neuraminsäure-Vorstufen-Analoga wurden 2.5 und-5 mM in Kultur benutzt. Nachfolgend wurden die Zellen in PBS gewaschen, gezählt und IxIO6 lebende Zellen in 2 ml Medium aufgenommen und mit 100 &mgr;&Igr; HTLV-l!lB-!mpfvirus für 3 h bei 37°C infiziert. Nach einmaligem Waschen in 2 ml PBS wurden die Zellen erneut in Medium aufgenommen und für weitere 24 h kultiviert. In Überständen dieser Kulturen wurden mit Hilfe eines ELISA (Vironostika HIV-Antigen EUSA Mikrosystems, Organon, Eppelheim) nach Herstelllerangaben die HIV-1-Antigen Konzentration bestimmt.
2. Ergebnisse
Die Behandlung von MT-4 Zellen mit N-Butanoyl-D-Mannosamin (40 h) führte bei einer
Konzentration des Neuraminsäure-Vorstufen-Analogons von 5 mM zu einer Reduktion von
HIV-Antigen im Überstand von 97%, bei einer Konzentration des Neuraminsäure-Vorstufen-Analogons
von 2,5 mM zu einer Reduktion von HIV-Antigen im Überstand von 85% gegenüber unbehandelten Zellen.
Als Kontrolle diente die Behandlung von MT-4 Zellen mit N-Acetyl-D-Mannosamin (40 h, 5
mM). Hier war die HIV-Antigen Konzentration im Überstand um 21% gesteigert gegenüber
unbehandeltön Zellen.
25
Angewendete Methoden
Angewendete Methoden
Aus heparinisiertem Blut von Tumorpatienten bzw. "buffy coat" von gesunden Probanden
wurden periphere Bluttymphocyten (PBL) durch eine Dichtegradientenzentrifugation nach
Böyum gewonnen.
Dazu wurden 15ml Ficoll-Paque (Dichte: 1,077 g/ml) im Zentrifugen-Röhrchen (50 ml)
mit 30 ml Blut, das vorher 1:2 bis 1:3 mit physiologischer Kochsalzlösung verdünnt wurde,
vorsichtig überschichtet.. Es wurde bei 600g 30min zentrifugiert. Bei der Zentrifugation
wandern die Erythrocyten und Granulocyten durch die Ficoll-Schicht, während sich die
mononukleären Blutleukocyten unmittelbar über dem Trennmedium anreichern. Diese
Zellschicht wurde entnommen, in Kochsalzlösung aufgenommen und fünfmal gewaschen
(20Og1 5min). Anschließend wurden die Zellen in RPMI-1640-Medium mit 10% FKS,
10"5mol/l 2-Mercaptoethanol und 2 mmol/l L-Glutamin aufgenommen und in Plastik-Kulturschalen
im Brutschrank 16h inkubiert, um adhärente Monocyten abzutrennen. Die
Suspension der nicht-adhärenten, peripheren Blutlymphocyten wurde auf eine Zelldichte
von 5 &khgr; 106/ml verdünnt.
Zur Überprüfung der Vitalität der Zellen wurde die Trypanbläufärbung angewendet. Zu einer
Zellsuspension {20\i\)\Nuraen 80&mgr;&Igr; einer 0,1 %igen Trypanblaulösung gegeben. Nach
Mischung des Testansatzes erfolgte die Auszählung vitaler Zellen in der Neubauer-Zählkamrjier.
Zur Stimulierung von Lymphocyten wurde Concanavalin A ^g/ml) zur Zellsuspension
gegeben, eine maximale Wirkung trat nach 72h ein. Für eine Kurzzeitaktivierug wurde
Con A (4 &mgr;g/ml) 1h zur Zellsuspension gegeben. Danach wurden die Zellen zweimal
gewaschen (200g, 5min).
Verwendete Zellinien:
ATCC CCL86 (Raji)
ATCC CCL 213 (Daudi)
ATCC CCL 229 (LoVo)
ATCC CCL 240 (HL-60)
ATCC CCL86 (Raji)
ATCC CCL 213 (Daudi)
ATCC CCL 229 (LoVo)
ATCC CCL 240 (HL-60)
ATCC CCL 243 (K-562)
ATCC CRL 1582 (Molt-4)
ATCC CRL 1593 (U-937)
ATCC HTB 22 (MCF-7)
ATCC HTB 38 (HT-29)
ATCC CRL 1582 (Molt-4)
ATCC CRL 1593 (U-937)
ATCC HTB 22 (MCF-7)
ATCC HTB 38 (HT-29)
Die verschiedenen Zuckeranaloga wurden der Zellsuspension in einer Konzentration
zwischen 0,05 mmol/l und 50mmol/l in Mikrotiterplatten zugesetzt. Die Inkubationszeit
betrug 1 h bis 72h.
Zur Bestimmung der Zellproliferation wurde der 3H-Thymidin-Test verwendet. Dieser Test
basiert auf der Bestimmung der 3H-Thymidin-Einbaurate in die DNS, die sich proportional
zur Zellzahl verhält.
Dazu erfolgte die Kultivierung der Zellen in Mikrotestplatten. In jede Vertiefung wurden
200&mgr;&Igr; der entsprechenden Zellsuspension gegeben. Jeweils 16h vor Beendigung der
Inkubation wurden zu jedem Testansatz 0,037 MBq ^H-Thymidin pro Vertiefung zugesetzt.
Anschließend wurden jeweils 100 &mgr;&Igr; Zellsuspension auf Filterplättchen gegeben. Die
luftgetrockneten Plättchen wurden je zweimal (30min) mit 10 %iger bzw. 5 %iger Trichloressigsäure sowie 50 %igem Ethanol gewaschen und luftgetrocknet. Die Messung der
3H-Thymidinaktivität erfolgte im Flüssigkeitsszintillationszähler.
Adhäsionsassay an extrazellulärer Matrix
Der Adhäsionsassay wird in 96-well-Mikrotiterplatten durchgeführt, die mit verschiedenen
Bestandteilen der extrazellulären Matrix (Fibronectin, Vitronectin, Collagen, Laminin) beschichtet sind.
In Abhänigkeit der einzusetzenden Zuckeranaloga soll die Adhäsionsfähigkeit von Zellen untersucht
werden. Zur Bestimmung der relativen Anzahl gebundener Zellen werden der MTT-Test, der MUH-Test
und eine Kristallviolettfärbemethode herangezogen.
Der MUH-Test beruht auf der Hydrolyse des fluorogenen Substrats MUH (4-Methylumbelliferylheptanoat)
durch Esterasen (Dotsika et al., 1987).
Der MTT-Test basiert auf der Umwandlung von Tetrazoliumsalz in farbiges Formazan durch
Dehydrogenasen aktiver Mitochondrien (Alley et al., 1988).
Endothelzellbeschichtete Mikrotiterplatten werden mit 51Cr-markierten Tumorzellen inkubiert. Zur
Bestimmung der relativen Anzahl gebundener Tumorzellen wird die Aktivität des Lysates gemessen.
Der Nachweis der Adhäsionsrezeptoren bzw. deren Modulierbarkeit durch Zuckeranaloga erfolgte
durchflußcytometrisch am FACScan mit monoclonalen Antikörpern.
Zur Bestimmung des invasiven Potentials von Tumorzellen wurden Boyden-Kammern verwendet,
deren obere Kammer mit Bestandteilen der extrazellulären Matrix beschichtet sind (Repesch, 1989).
Der Einfluß synthetischer Zuckeranaloga auf das Migrationsverhalten wurde in dieser Anordnung
untersucht.
Die Bestimmung der NK-Zellaktivität peripherer mononukleärer Blutleukocyten erfolgte in einem
Cytotoxicitätstest mit ^1Cr-markierten Targetzellen (K562-Zellen). Der Versuch wurde in
Mikrotestplatten durchgeführt. Die 51Cr-Freisetzung wurde bei verschiedenen Effektor-Targetzell-Verhältnissen
(50:1; 25:1; 12,5:1; 6,25:1) bestimmt.
Zur Bestimmung der "maximalen Freisetzung" von 51 Cr wurde den Targetzellen anstelle der
Effektorzellen Medium mit einem Gehalt von 2% Triton X-100 zugesetzt. Als "spontane Freisetzung"
bezeichnet man diejenige Menge an 51 Cr, die die Targetzellen abgeben, wenn anstelle der
Effektorzellen lediglich Kulturmedium zugesetzt wird.
Mit Hilfe eines Rechnerprogramms (Pross et al., 1984) für nichtlineare Regressionsanalysen wurden
die lytischen Einheiten berechnet. Die Regressionskurve beschreibt die Abhänigkeit der
spezifischen 51Cr-Freisetzung vom Effektor-Targetzell-Verhältnis und somit von der Menge der
Effektorzellen. Mit Hilfe dieser Regressionskurve wurden die lytischen Einheiten bestimmt. Eine
lytische Einheit (LU) entspricht derjenigen Effektorzahl, die notwendig wäre, 30% spezifische 51 Cr-Freisetzung
zu bewirken.
Monocyten wurden mit Zuckeranaloga behandelt. Als Phagocytosepartikel dienten neben Anti-D-sensibilisierten
Erythrocyten Neuraminidase-behandelte Schaferythrocyten. Ein zweiter Teil bewertete
die Fähigkeit von Granulocyten, innerhalb von einer Stunde Latexpartikel aufzunehmen.
Am Beispiel experimenteller Hepatome, insbesondere am Morris-Hepatom 7777, wurde in vivo
geprüft, ob es möglich ist, durch Behandlung von Ratten mit Zuckeranaloga und anschließender
Injektion von Hepatomzellen deren Wachstum zu hemmen bzw. zu verhindern. Andererseits wurden
Hepatomzellen mit Zuckeranaloga behandelt werden und anschließend Ratten appliziert, um deren
Tumorwachstum zu testen.
LITERATUR:
Alley, M. C, Scudiero, D. A., Monks, &Agr;., Hursey, M. L., Czerwinski, M. J., Abbott, B. J., Mayo, J. G.,
Shoemaker, R. M., Boyd, M. R.
Feasibility of drug screening with panels of human tumor cell lines using a microculture tetrazolium
assay.
Cancer Res., 4_8_, 589-601 (1988)
Böyum, A.
Separation of Blood Leukocytes, Granulocytes and Lymphocytes.
Tissue Antigens, 4, 269-274 (1974)
Dotsika, E. N.,Sanderson, C. J.
A fluorometric assay for determining cell growth in lymphocyte proliferation and lymphokine assays.
J. Immunol. Meth., lfiS, 55-62 (1987)
Pross, H. F., Marown, J-. A.
The standardisation of NK cell assays for use in studies of biological response modifiers.
J. Immunol. Meth., SS, 235-249 (1984)
Repesch, L. A.
A new in vitro assay for quantitating tumor cell invasion.
Invasion Metastasis, 9_, 192-208 (1989)
Claims (21)
1. Glycoproteine der allgemeinen Formel (I)
:ooH
"-&igr; ' &iacgr;
worin bedeuten:
Z -R1, -NH2, -NHR1, -NR1R1' , -N+R1R1IR1,, , -OR1,
-SR1 oder -CR1R11R1,,
R1 , R1, , R1,, , R2, R3, R4 und R5, die gleich oder
verschieden sein können, jeweils Wasserstoff, einen linearen oder verzweigten Alkylrest mit 1
bis 20 Kohlenstoffatomen (c n H2n+2' n = 1 1^5
20), vorzugsweise 1 bis 7 Kohlenstoffatomen;
einen linearen oder verzweigten Alkenylrest mit 3 bis 20 Kohlenstoffatomen (CnH2n, &eegr; = 3 bis 20,
Position der Doppelbindung an Cn &eegr; = 2 bis 19), vorzugsweise 3 bis 10 Kohlenstoffatomen; einen
linearen oder verzweigten Alkinylrest mit 3 bis
20 Kohlenstoffatomen (c n H2n-2' n = 3 bis 20' Po~
sition der Dreifachbindung an Cn &eegr; = 2 bis 19), vorzugsweise 3 bis 10 Kohlenstoffatomen; einen
Alkenyl- bzw. Alkinylrest mit 2 oder mehr Doppelbindungen bzw. Dreifachbindungen mit 4 bis
20, vorzugsweise 7 bis 12 Kohlenstoffatomen; einen Arylrest mit 6 bis 20 Kohlenstoffatomen,
vorzugsweise einen Phenylrest; einen linearen oder verzweigten, gesättigten oder ein- oder
mehrfach ungesättigten Acylrest (-CO-R1) mit
insgesamt 1 bis 20, vorzugsweise 1 bis 7 Kohlenstoffatomen einschließlich seiner ein-
oder mehrfach hydroxylierten Analoga; einen Aroylrest mit 6 bis 20, vorzugsweise 6 bis 10
Kohlenstoffatomen; einen Carbonylamidrest der
Formel -CONH2, -CONHR1, -CONR1R1, oder
-CONR1R1IR1H ; einen linearen oder verzweigten,
gesättigten oder ein- oder mehrfach ungesättigten Thioacylrest (-CS-R1) mit insgesamt 1 bis
20, vorzugsweise 1 bis 7 Kohlenstoffatomen; oder einen Thiocarbamidrest der Formel -CS-NH2/ -CS-NHR1,
-CS-NR1R1, oder -CS-NR1R1 ,R1,, ;
wobei jeder der vorgenannten Reste außer H gegebenenfalls ein- oder mehrfach substituiert
sein kann durch Halogen, insbesondere Fluor, Chlor, Brom oder Jod, Hydroxy-, Epoxy-, Amino-,
Mercaptan-, Phenyl-, Phenol- oder Benzylgruppen,
und
T einen Mono-, Di- oder Oligosaccharidrest mit bis zu 40 glykosidisch miteinander verknüpften, gegebenenfalls
verzweigten Zuckerresten, die Fura-
nose- und/oder Pyranoseringe darstellen und 5
bis 230 Kohlenstoffatome enthalten und N- oder O-glycosidisch an Polypeptide gebunden sind und
Glycoproteine der allgemeinen Formel (I1) für einen
Glycosylphosphatidylinosit(GPI)-Anker
worin bedeuten: GaI = Galactose, Man = Mannose Asp = Asparagin
GIcN = Glucosamin
(I1)
6 Inosit
wobei GIcN ersetzt sein kann durch ein Neuraminsäure-Vorstufen-Analogon
(Formel II) 25
2. Verbindungen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß in der allgemeinen Formel (I) T steht
für einen Saccharidrest mit N-Glycan-Struktur der Formel
(Ia)
Teil einer
Polypeptid-
kette
Asn
X I
Thr
oder Ser
a 1,6 &bgr;«&iacgr;«&ngr;
Fuc
&ogr; 1,6
M2K4_GN
(Ia)
worin bedeuten: GaI = Galactose, GN = N-Acetyl-D-glucosamin,
M = D-Mannose, Fuc = Fucose,
Asn = Asparagin, 20 X = eine beliebige Aminosäure außer Prolin,
Thr = Threonin, Ser = Serin,
* = T-Verknüpfungsstelle (1 bis 6 Molekülreste),
25 wobei beide peripheren Reste M durch 1 bis 3 Trisaccharide substituiert sein können; oder
für einen Saccharidrest mit O-Glycan-Struktur der allgemeinen
Formel (Ib):
Teil einer &Ggr; Ser - &Ogr; - Gal - Polysaccharid
Polypeptid- "(oder Thr oder
kette ' ' NACGa
oder
XyI
(Ib)
worin bedeuten:
GaI = Galactose
Thr = Threonin
Ser = Serin
XyI = Xylose
NAcGaI = N-Acetyl-galactosamin
* = T-Verknüpfungsstelle,
GaI = Galactose
Thr = Threonin
Ser = Serin
XyI = Xylose
NAcGaI = N-Acetyl-galactosamin
* = T-Verknüpfungsstelle,
wobei in den obigen Formeln (Ia) und (Ib) die Galactose (GaI) ersetzt sein kann durch 2-Desoxy-galactose oder 2-Desoxy-2-halogenid(F,
Cl, Br, J)-galactose.
3. Verbindungen nach Anspruch 1 und/oder 2, dadurch gekennzeichnet,
daß dann, wenn T einen Saccharidrest mit N-Glycanstruktur oder einen Saccharidrest mit O-Glycanstruktur
darstellt, GN steht für einen Rest der allgemeinen Formel (II):
R,O
(II)
in der R1, R2 und R3 die in Anspruch 1 angegebenen Bedeutungen
haben und Z1 die gleichen Bedeutungen wie Z hat und neben der äquatorialen Position auch die axiale Position
einnehmen kann und wobei außerdem bei äquatorialer Position von Z1 der Rest -OR2 in axialer Position stehen kann.
4 . Verbindungen nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß Z bzw. Z1 steht für
NHR1, worin R1 den Propanoyl-, Butanoyl-, Pentanoyl-,
Hexanoyl-, Heptanoyl- oder Crotonoylrest einschließlich
seiner ein- oder mehrfach hydroxylierten Analoga darstellt.
5. Verbindungen nach mindestens einem der Ansprüche 1
bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß R2 bis R5 stehen für H
oder CH3.
6. Aminozucker (Neuraminsäure-Vorstufen-Analoga) der allgemeinen Formel (II):
in der Z1 und R1, R2 und R3 die in den Ansprüchen 1 bis 5
angegebenen Bedeutungen haben.
7. Pharmazeutisches Mittel zur Stimulierung des Immunsystems, insbesondere der T-Lymphozyten, zur Infektabwehr,
zur Behandlung von Immunschwächen, Tumorerkrankungen einschließlich Metastasierungsprozessen, Infektionskrankheiten
(Viren, Bakterien, Parasiten, Protozoen) und Kreislaufversagen, insbesondere Gefäßverschlüssen und Septikämien
bei Mensch und Tier, das als Wirkstoff mindestens eine Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, 7
(Verfahrensprodukt) und 8 (Verfahrensprodukt), gegebenenfalls in Kombination mit anderen Wirkstoffen sowie übliehen
pharmazeutischen Trägern und/oder Hilfsstoffen,
enthält.
8. Pharmazeutisches Mittel zur Erhöhung der zytotoxischen
Aktivität Natürlicher Killerzellen (NK-Zellen) zur Induktion einer Antitumor-Immunreaktion bei Mensch und
Tier, das als Wirkstoff mindestens eine Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 8, gegebenenfalls in Kombination
mit anderen Wirkstoffen sowie üblichen pharmazeutischen Trägern und/oder Hilfsstoffen, enthält.
9. Pharmazeutisches Mittel zur Steigerung der Phagozytose-Fähigkeit
von Granulozyten und Monozyten zur Induktion einer Antitumor-Immunreaktion bei Mensch und Tier,
das als Wirkstoff mindestens eine Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 8, gegebenenfalls in Kombination mit
anderen Wirkstoffen sowie üblichen pharmazeutischen Trägern und/oder Hilfsstoffen, enthält.
10. Pharmazeutisches Mittel zur in vivo-Beeinflussung
Neuraminsäure-abhängiger biologischer Prozesse, das als Wirkstoff mindestens eine Verbindung nach einem der An-0
sprüche 1 bis 8, gegebenenfalls in Kombination mit anderen Wirkstoffen sowie üblichen pharmazeutischen Trägern
und/oder Hilfsstoffen, enthält.
11. Pharmazeutisches Mittel zur Hemmung der Ligandenbindung an sialylierte Zeiloberflächenrezeptoren
(Endothelzellen, Thrombozyten, Leukozyten), das als Wirkstoff mindestens eine Verbindung nach einem der Ansprüche
1 bis 8, gegebenenfalls in Kombination mit anderen Wirkstoffen sowie üblichen pharmazeutischen Trägern und/oder
Hilfsstoffen, enthält.
12. Pharmazeutisches Mittel zur Hemmung der Bindung eines mikrobiellen Pathogens (Virus, Bakterium, Parasit,
Protozoon) oder Toxins an die Wirtszelle über einen sialylierten Rezeptor durch in vivo-Modulation von Neuraminsäuren,
das als Wirkstoff mindestens eine Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 8, gegebenenfalls in Kombination
mit anderen Wirkstoffen sowie üblichen pharmazeutischen
Trägern und/oder Hilfsstoffen, enthält.
13. Pharmazeutisches Mittel nach einem der Ansprüche bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß es mindestens eine
Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 8 in einer Menge von 0,01 bis 50 Gew.-%, vorzugsweise von 0,1 bis 20 Gew.-%,
insbesondere von 2 bis 10 Gew.-%, enthält.
14. Verbindungen nach einem der Ansprüche 1 bis 8 zur
Stimulierung des Wachstums und der Differenzierung von
menschlichen und tierischen Zellen des Immunsystems und zur Verhinderung der Adhäsion von Leukozyten, Thrombozyten
und Tumorzellen an Gefäßendothelzellen.
15. Verbindungen nach einem der Ansprüche 1 bis 8 zur Stimulierung des Immunsystems, insbesondere von T-Lymphozyten,
zur Infektabwehr, zur Behandlung von Immunschwächen, Tumorerkrankungen einschließlich Metastasierungsprozessen,
Infektionserkrankungen (Viren, Bakterien, Parasiten, Protozoen) und Kreislaufversagen, insbesondere
Gefäßverschlüssen und Septikämien, bei Mensch und Tier.
5 16. Verbindungen nach einem der Ansprüche 1 bis 8 zur Hemmung der Bindung eines Liganden an seinen sialylierten
Zelloberflächenrezeptor.
17. Verbindungen nach einem der Ansprüche 1 bis 8 zur
0 Hemmung der Bindung eines mikrobiellen Pathogens (Virus, Bakterium, Parasit, Protozoon) oder Toxins an die
Wirtszelle über einen sialylierten Rezeptor durch in vivo-Modulation von Neuraminsäuren.
18. Verbindungen nach einem der Ansprüche 1 bis 8 zur biosynthetischen Herstellung von Liganden oder Rezeptoren
mit modifizierter Neuraminsäure und Verwendung derselben
zur Kompetition physiologischer oder pathologischer Ligand-Rezeptor-Interaktionen.
19. Glycoproteine nach einem der Ansprüche 1 bis 4 zur in vitro-Beeinflussung des Infektionsverlaufs humaner
Immundefizienz-Viren (z.B. HIV-I und HIV-2).
20. Verbindungen nach einem der Ansprüche 1 bis 8 zur in vivo-Prävention der Infektion humaner Immundefizienz-Viren
(z.B. HIV-I und HIV-2).
21. Verbindungen nach einem der Ansprüche 1 bis 8 zur Behandlung von parasitären Erkrankungen, insbesondere von
Trypanosomiasen, Leishmaniasen, Trichomoniasis,
Giardiasis, Amöbiasis, Malaria, Pneumozystose, Schistosomiasis (Bilharziose) und Echinokokkose.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE9305342U DE9305342U1 (de) | 1993-04-12 | 1993-04-12 | Aminozucker, Glycoproteine und sie enthaltende Arzneimittel |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE9305342U DE9305342U1 (de) | 1993-04-12 | 1993-04-12 | Aminozucker, Glycoproteine und sie enthaltende Arzneimittel |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DE9305342U1 true DE9305342U1 (de) | 1993-09-16 |
Family
ID=6891795
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DE9305342U Expired - Lifetime DE9305342U1 (de) | 1993-04-12 | 1993-04-12 | Aminozucker, Glycoproteine und sie enthaltende Arzneimittel |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| DE (1) | DE9305342U1 (de) |
-
1993
- 1993-04-12 DE DE9305342U patent/DE9305342U1/de not_active Expired - Lifetime
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