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Analytisches Verfahren zur Bestimmung von akzessorischen Nahrungsbestandteilen
Vorliegender
Erfindungsgegenstand bezweckt die analytische Ermittlung von akzessorischen Nahrungsbestandteilen.
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Bekanntlich hat man schon zur Bestimmung von Vitaminen eine Reihe
von Methoden ausgearbeitet, um Vitamine qualitativ und quantitativ erfassen zu können.
Es ist z. B. möglich, Vitamine in weit gereinigter Form chemisch nachzuweisen. Diese
chemischen Verfahren bieten aber erhebliche Schwierigkeiten, wenn es sich darum
handelt, diese Stoffe im natürlichen Vorkommen einwandfrei zu bestimmen.
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Auch ist es bekannt, daß als biologische Testobjekte Tauben und als
Säugetiere hauptsächlich Ratten und Mäuse herangezogen werden. Neuerdings werden
auch niedere Organismen, vor allem die Fliege Drosophila und verschiedene Pilze,
als Testobjekte vorgeschlagen.
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Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein analytisches Verfahren
zur Bestimmung von akzessorischen Nahrungsbestandteilen, wie Vitamin B1, Vitamin
B2, B2-Komplex, Ergosterin und Histidin, dadurch gekennzeichnet, daß Larven des
Reismehlkäfers, Tribolium confusum, mit einer Diät, welche aus Eiweiß, Fett, Kohlehydrat,
Mineralsalzen und akzessorischen Nahrungsbestandteilen außer den zu bestimmenden,
ferner der zu prüfenden Substanz besteht, eine bestimmte Zeitlang gefüttert und
dann das Wachstum der Larven gemessen wird.
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Die Zuchten von Tribolium confusum sind ganz mühelos zu versorgen.
In etwa 300 ccm großen Zuchtgläsern, die zu zwei Drittel mit einem Gemisch von Haferflocken
und Weizenmehl im Verhältnis 1: 1 gefüllt sind, werden die Imagines eingesetzt und
das Gefäß mit feiner Gaze verschlossen. Will man starke Vermehrung in den Zuchten
erzielen, so bringt man sie in einen Thermostaten, der eine Temperatur von 3I,5°
und eine Feuchtigkeit von etwa 700/0 hat. Diese Bedingungen sind auch für die Testversuche
die geeignetsten, und alle hier aufgeführten Angaben über die Dauer der Versuche
beziehen sich auf diese Bedingungen. Für die Testversuche braucht man nun nicht
die Imagines, sondern frisch aus den Eiern geschlüpfte Larven. Diese Tiere erhält
man am besten auf folgende Weise: In etwa 5 g Mehl sperrt man in einer kleinen Deckelschale
etwa hundert Imagines.
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Nach 24 Stunden trennt man mit Hilfe eines Doppelsiebes die Imagines
vom Mehl. Nach weiteren 5 Tagen sind die Larven geschlüpft und können aus dem Mehl
herausgelesen werden. Von je hundert Imagines erhält man auf diese Weise etwa dreißig
Larven.
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Diese Larven werden in die Diäten eingesetzt, die die zu prüfenden
Substanzen enthalten.
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Diese Versuche werden am besten in Glastuben ausgeführt. Man verwendet
pro Tube etwa I,5 g Nährsubstrat und setzt fünfzehn Tiere in jedes Gefäß. Nach I8
Tagen werden die Tiere kontrolliert. Sind sie gut gewachsen, so sind ausreichende
Mengen des gesuchten Stoffes im Futter vorhanden. Hat kein Wachstum stattgefunden,
so fehlt der gesuchte Stoff in der Nahrung oder ist in zu geringen Mengen vorhanden.
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Zur Prüfung der zu untersuchenden Stoffe muß eine bestimmte Grundkost
verwendet werden, die, da sie vitaminfrei ist, hier Mangeldiät genannt wird. Die
Fragestellungen erfordern drei verschiedene Mangeldiäten, die als MD I, MD 2 und
MD 3 unterschieden werden. Die Herstellung erfolgt durch Verreiben und Mischen im
Mörser.
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MD 1 besteht aus: 200/0 Eiweiß: Hühnereiklar (frisch), 760 Kohlehydrat:
Reisstärke (vitaminfrei), 3 Ole Salze: Kaliumbiphosphat (K2HPO4), 1 0/o Fett: Arachisöl.
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MD 2 besteht aus: 150/o Casein (vitaminfrei) in gepulverter Form,
70°/o Reisstärke (vitaminfrei), 5 0in Osborne-Mendel-Salzgemisch, 3 01o Arachisöl,
70/0 Wasser.
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MD 3 besteht aus: I50/o Casein (vitaminfrei), 700/0 Reisstärke (vitaminfrei),
5°/o Osborne-Mendel-Salzgemisch, In01, Wasser.
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Zu diesen Mangeldiäten werden die akzessorischen Nahrungsbestandteile
außer den zu bestimmenden, ferner die zu prüfende Substanz zugegeben.
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Qualitative Nachweise.
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Zunächst wird ein Schema zum qualitativen Nachweis von B1, von B1
und B-Komplex gemeinsam, von B2-Komplex bei Abwesenheit von B1 und BS und zum Nachweis
von Ergosterin und/oder Histidin auch bei Anwesenheit der genannten Stoffe angeführt.
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Das Schema lautet folgendermaßen:
| Nachweis Zusammensetzung der Grundkost, zu |
| der der die zu prüfende Substanz zugesetzt |
| von werden muß |
| Bl I,5 g MDI + 2,50/, Hefe |
| autoklaviert + zu prüfende |
| Substanz |
| B2-Komplex I,5 g MDI + 2,50/, Heferückstand |
| + 250 7 B1 + zu prüfende |
| Substanz |
| Ergosterin I,5 g MDI + 2,50/0 Hefefiltrat |
| + I mg Histidin |
| + zu prüfende Substanz |
| Histidin I,5 g MDI + 2,50/o Hefefiltrat |
| + 1 mg Ergosterin |
| + zu prüfende Substanz |
| B1+ B2-Komplex I,5 g MDI + 2,50/, Heferückstand |
| + zu prüfende Substanz |
| B1 + Ergosterin I,5 g MDI + 2,50/0 Hefefiltrat |
| (autoklaviert) + I mg Histidin |
| + zu prüfende Substanz |
| B1 + Histidin I,5 g MDI + 2,50/0 Hefefiltrat |
| (autoklaviert) + I mg Ergosterin |
| + zu prüfende Substanz |
| B2-Komplex |
| + Ergosterin I,5 g MDI + 250 7 B1 |
| + 1 mg Histidin |
| + zu prüfende Substanz |
| B2-Komplex |
| + Histidin I,5 g MDI + 250 7 B1 |
| + 1 mg Ergosterin |
| + zu prüfende Substanz |
| Ergosterin |
| + Histidin I,5 g MDI + 2,50/0 Hefefiltrat |
| + zu prüfende Substanz |
In diesem Schema sind noch mehr Kombinationen möglich, auf deren Aufzählung hier
verzichtet werden soll. Der im Schema angegebene Prozentgehalt bezieht sich auf
I,50/o MD.
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Erläuterungen zum Schema Hefe autoklaviert: Brauereitrockenhefe (I00°)
wird durch 5stündiges Autoklavieren bei 1200 und 2 atü behandelt. Dabei wird Vitamin
B1 zerstört.
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Heferückstand: Brauereitrockenhefe wird erschöpfend mit Wasser extrahiert.
Der wasserunlösliche Teil (Heferückstand) ist frei von B1 und B2-Komplex.
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Hefefiltrat: Brauereitrockenhefe, die erschöpfend mit Wasser behandelt
wird, enthält im Hefefiltrat das Vitamin B1 und die Vitamine des B2-Komplexes.
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Hefefiltrat autoklaviert: Nach 5 stündigem Autoklavieren des vorgenannten
Hefefiltrates wird Vitamin B1 zerstört, und nur die Vitamine des B2-Komplexes gelangen
zur Wirksamkeit.
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Qualitativer Nachweis des Vitamins B2 Für den qualitativen Nachweis
des B2 müssen die Mangeldiät 2 und außerdem eine mit Natronlauge behandelte Hefe
verwendet werden. Diese Behandlung
erfolgt folgendermaßen: 5 g Hefe
werden in I 1 Wasser, das mit Natronlauge auf pH etwa 9,5 gebracht wurde, 50 Minuten
gekocht. Daraufhin wird die Lösung mit Salzsäure oder Schwefelsäure neutralisiert,
filtriert, das Filtrat eingedampft (NaOH-Filtrat) und der Filterrückstand getrocknet
(Na O H-Filterrückstand).
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Der Fütterungsversuch wird nun mit der folgenden Kost durchgeführt:
I,5 g MD2 + 20/0 Na O H-Filterrückstand + 20/0 NaOH-Filtrat + 8 r B1 + zu prüfende
Substanz. Enthält nun die zu prüfende Substanz Vitamin B2, so tritt in dieser Kost
Wachstum der Tiere ein.
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Quantitative Nachweise Für den quantitativen Nachweis von Vitamin
B1 und B2 braucht man die gleiche Kost, wie sie oben für den qualitativen Nachweis
des B2 beschrieben wurde.
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Zu der Kost: I,5g MD2 + 20/0 NaOH-F.R.
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+ 20/, NaOH-Filtrat + 8y B1 muß mindestens eine Sustanzmenge zugeführt
werden, die 6 y B2 enthält, damit die Tiere wachsen und in I8 Tagen die für das
Alter entsprechende Größe erreicht haben.
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Analog dazu muß zu der Kost: I,5 g MD 2 + 20/0 NaOH-F.R. + 20/0NaOH-Filtrat
+ 6 y B2mindestens eine Substanzmenge zugeführt werden, die 6 y B enthält, damit
die Tiere normal wachsen.
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Eine weitere Möglichkeit, mit Tribolium quantitative Ergebnisse zu
erzielen, besteht darin, daß auch der Ergosteringehalt von Nahrungsmitteln z. B.
quantitativ ermittelt werden kann.
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Zur Beantwortung dieser Fragestellung wird eine Kost, bestehend aus:
I,5 g MD3 + 20/0 Hefeextrakt + I°/o mit Äther extrahiertes Eigelb (von Hühnerei)
(hergestellt, wie bei den qualitativen Nachweisen beschrieben), verwendet. Enthält
die zu prüfende Substanz, die man zu dieser Kost zugibt, mehr als IOO y Ergosterin,
so erfolgt normales Wachstum.
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Auch mit MDI ist es möglich, auf Ergosterin und Histidin allein und
in Kombination zu prüfen. Man verfüttert dann folgende Kost: MDI + Hefefiltrat +
IOO r Ergosterin + die zu prüfende Substanz.
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Enthält die Substanz mehr als 500 y Histidin, so tritt normales Wachstum
ein.
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MDI + Hefefiltrat + 500y Histidin + die zu prüfende Substanz. Enthält
die Substanz mehr als 100 y Ergosterin, so tritt normales Wachstum ein.
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MDI + Hefefiltrat + die zu prüfende Substanz.
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Enthält die Substanz mehr als I00 y Ergosterin + 500 7 Histidin, so
tritt normales Wachstum ein.
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Das oben beschriebene Verfahren bringt gegenüber den bekannten Methoden
Vorteile, da die Wirtschaftlichkeit des Verfahrens schon allein durch die Billigkeit
der Haltung der Stammzuchten gewährleistet ist und da die Testergebnisse in verhältnismäßig
kurzer Zeit (etwa I8 Tage) vorliegen. Für die Teste werden nur geringe Mengen Versuchsdiät
benötigt, so daß die Kosten unbedeutend sind. Weiterhin sprechen die Larven der
Testtiere schon auf geringe Mengen det zu prüfenden Wirkstoffe an.
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Wie am Anfang schon erwähnt, bietet der Triboliumtest auch gegenüber
den chemischen Methoden weitgehende Vorteile, da bei Tribolium der Nachweis der
Vitamine ohne weiteres, d. h. auch ohne vorherige Anreicherung der zu prüfenden
Substanzen, erfolgen kann.
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Oben wurde auch schon gesagt, daß schon bei niederen Tieren (Insekten)
die Lebensnotwendigkeit der Vitamine nachgewiesen werden konnte. Es handelt sich
dabei hauptsächlich um die Fliege Drosophila, die aber für praktisch verwertbare
Untersuchungen nicht in Frage kommt, da die Larven dieses Insekts in einer feuchten
Kost aufwachsen. Damit ist unter normalen Verhältnissen eine Sterilität der Kost
nicht gewährleistet, oder man muß zur Sterilhaltung der Kostformen besondere Vorsichtsmaßregeln
aufwenden, die erschwerend wirken und bei der vorliegenden Erfindung sich völlig
erübrigen. Außerdem ist noch ein bestimmter pH-Wert für die Kost erforderlich. Alle
diese Schwierigkeiten kommen bei Arbeiten mit Tribolium in Fortfall. Erwähnt sei
noch, daß obiges Verfahren für Nahrungsmittel, Heilmittel und Exkretstoffe anwendbar
ist.