DE69937368T2

DE69937368T2 - Nachweis von erkrankungen der nieren und behandlung

Info

Publication number: DE69937368T2
Application number: DE69937368T
Authority: DE
Inventors: Wayne D. North Ringwood COMPER
Original assignee: Monash University
Current assignee: Nipro Corp
Priority date: 1998-12-21
Filing date: 1999-12-20
Publication date: 2008-07-17
Anticipated expiration: 2019-12-21
Also published as: US20020022236A1; US6589748B2; EP1141728A4; JP2002533680A; MXPA01006404A; WO2000037944A1; US20040106155A1; IL143892A0; AU1674400A; DK1141728T3; CA2356174A1; JP4160263B2; EP1141728B1; EP1141728A1; DE69937368D1; ATE376187T1; US20020012906A1; CN1331801A; JP2006038877A; BR9916407A

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zum Nachweis eines frühen Stadiums einer Nierenerkrankung und/oder von Nierenkomplikationen einer Erkrankung.
Hintergrund der Erfindung
Das Auftreten von überschüssigem Protein wie Albumin in dem Urin weist auf eine Nierenerkrankung hin. Eine diabetische Nephropathie ist eine solche Erkrankung. Zu dem Zeitpunkt, zu dem der Überschuss an Albumin nachgewiesen wird, ist die Nierenerkrankung fortgeschritten, möglicherweise bis zu einem Stadium, in dem sie irreversibel ist und eine Behandlung wenig Wirkung zeigt. Daher ist es eine Aufgabe der Erfindung, einen Test, der empfindlicher als der derzeit bekannte Radioimmunoassay ist, zum Nachweis solch einer Erkrankung so früh wie möglich zur Verfügung zu stellen, so dass die Erkrankung entweder verhindert werden kann oder ein Behandlungsprotokoll frühzeitig in der Erkrankung begonnen werden kann.
Eine spezifische Proteinurie und insbesondere eine (Mikro- und Makro-) Albuminurie ist ein Marker einer Erkrankung, die eine Nierenerkrankung (Glomerulonephritis, bakterielle und virale Glomerulonephritiden, IgA-Nephropathie und Henoch-Schönlein Purpura, membranproliferative Glomerulonephritis, membranöse Nephropathie, Sjögren-Syndrom, diabetische Nephropathie, nephrotisches Syndrom (Minimal-changes-Glomerulopathie, fokale Glomerulosklerose und damit in Zusammenhang stehende Störungen), akutes Nierenversagen, akute tubulointerstinale Nephritis, Pyelonephritis, Urogenitalentzündung, Präeklampsie, die Abstoßung einer transplantierten Niere, Lepra, Rückflussnephropathie, Nephrolithiase), eine genetische Nierenerkrankung (medulläre zystische, medulläre schwammartige, polyzystische Nierenerkrankung (autosomal dominante polyzystische Nierenerkrankung, autosomal rezessive polyzystische Nierenerkrankung, tuboröse Sklerose), von Hippel-Lindau-Syndrom, familiäre Erkrankung mit dünner glomerularer Basismembran, Kollagen-III-Glomerulopathie, Fibronektinglomerulopathie, Alport-Syndrom, Fabry-Krankheit, Nagel-Patella-Syndrom, kongenitale urologische Anomalien), monoklonale Gammopathien (multiples Myelom, Amyloidosis und damit in Zusammenhang stehende Erkrankungen), fiebrige Erkrankungen (familiäres Mittelmeerfieber, HIV-Infektion – AIDS), entzündliche Erkrankungen (systemische Vaskulitiden (Periarteritis nodosa, Wegener-Granulomatose, Entzündung mehrerer Arterien, nekrotisierende und Halbond-bildende Glomerulenophritis), Polymyositis-Dermatomyositis, Pankreatitis, rheumatoide Arthritis, systemischer Lupus erythematodes, Gicht), Bluterkrankungen (Sichelzellanämie, thrombotische Purpura thrombopenica, hemolytischuremisches Syndrom, akute Rindennekrose, Nierenthromboembolismus), Trauma und einen chirurgischen Eingriff (umfangreiche Verletzungen, Verbrennungen, einen abdominalen und vaskulären chirurgischen Eingriff, Einleitung einer Anästhesie), Medikamente (Penicillamin, Steroide) und Medikamentenmissbrauch, eine bösartige Erkrankung (epitelial (Lunge, Brust), Adenokarzinom (renal), Melanom, lymphoretikuläres, multiples Myelom), eine zirkuläre Erkrankung (myokardischen Infarkt, Herzversagen, periphere vaskuläre Erkrankung, Bluthochdruck, Herzkranzerkrankung, nicht-atherosklerotische kardiovaskuläre Erkrankung, atherosklerotische kardiovaskuläre Erkrankung), eine Hauterkrankung (Psoriasis, systemische Sklerose), eine Erkrankung des Respirationstrakts (COPD, obstruktive Schlafapnoe, Hypoxie in großen Höhen) und eine endokrine Erkrankung (Akromegalie, Diabetes mellitus, Diabetes insipidus) umfasst.
Eine Nierenerkrankung kann aus einer bakteriellen Infektion, Allergien, kongenitalen Defekten, Steinen, Antibiotika, Immunsuppresiva, antineoplastischen Mitteln, nicht-steroidalen entzündungshemmenden Medikamenten, Analgetika, Schwermetallen, Tumoren und Chemikalien resultieren.
Der Anmelder hat herausgefunden, dass Proteine einschließlich Albumin normalerweise als eine Mischung eines natürlichen Proteins und Fragmenten ausgeschieden werden, die spezifisch während der Passage durch die Niere produziert werden (Osicka, T. M. et al. (1996) Nephrology, 2, 199–212). Proteine werden während der Passage durch die Niere durch postglomeruläre (Basismembran) Zellen, die Röhrenzellen umfassen können, stark abgebaut. Lysosomen in Röhrenzellen der Nieren können für den Abbau von Proteinen verantwortlich sein, die während der Nierenpassage ausgeschieden werden (siehe 1). Die Abbauprodukte werden in das Röhrenlumen ausgeschieden. In normalen Individuen ist der größte Teil des Albumins in dem Urin fragmentiert.
Wenn die Aktivität der Lysosomen oder intrazelluläre Prozesse, die Substrate auf Lysosomen richten, verringert ist, dann erscheint mehr an Albumin mit hohem Molekulargewicht und im Wesentlichen voller Länge in dem Urin. Dies reflektiert ein Ungleichgewicht in den Zellprozessen in dem Nierengewebe.
Bis jetzt wurde angenommen, dass ein konventioneller Radioimmunoassay geeignet wäre, die Gesamtheit eines spezifischen Proteins in einer Probe nachzuweisen. Aber der Gesamtgehalt des Proteins kann mehr als solche umfassen, die durch bekannte Antikörper unter Verwendung eines konventionellen Radioimmunoassays (RIA) identifizierbar sind. Derzeit verfügbare Radioimmunoassays verlassen sich auf Antikörper zum Nachweis von Proteinen wie Albumin. Der Nachweis mit Antikörpern ist sehr genau bis runter zu Nanogrammengen. Jedoch beeinflusst die Spezifität der Antikörper den Nachweis des Proteins. Der Antikörper erkennt bestimmte Epitope. Wenn das spezifische Epitop auf dem Albumin fehlt, verändert oder maskiert ist, oder das Albumin in irgendeiner anderen Weise modifiziert ist, so dass der Antikörper dabei versagt, das Albumin nachzuweisen, dann können Radioimmunoassays keine genaue Darstellung der wahren Menge an Albumin liefern, die in einer Urinprobe vorhanden ist.
Verfahren zum Nachweis von frühen Anzeichen einer Erkrankung einschließlich einer Nierenerkrankung, zur Bestimmung der Neigung eines Patienten zu der Erkrankung, zum Verhindern des Entstehens einer Erkrankung und zum Behandeln der Erkrankung im frühest möglichen Stadium sowie ein Verfahren zur Bestimmung des Gesamtgehalts eines spezifischen Proteins in einer Probe sind einige der Aufgaben der Erfindung.
EP 0 514 928 offenbart ein Verfahren zum Diagnostizieren von Nierenerkrankungen durch den Nachweis von Fragmenten von Albumin in menschlichem Urin. Der Nachweis der Fragmente wird zum Beispiel mit immunologischen Verfahren oder Flüssigchromatographietechniken durchgeführt. In ähnlicher Weise offenbaren Hall, C. L. et al., Brit. Med. J. 1/5955, 22. Februar 1975, S. 419–422, den Nachweis von Fibrinogenfragmenten zum Diagnostizieren von Nierenerkrankungen wie Glomerulonephritis oder Henoch-Schönlein-Purpura.
U.S. 5,654,158 beschreibt die Entwicklung von immunometrischen Assays, die mit Urinproben durchgeführt werden, was es einem mit einer Nephropatie in Verbindung stehenden Protein (ein IgG-Molekül) ermöglicht, als ein früher und spezifischer Marker für mit der Niere in Verbindung stehenden Erkrankungen zu dienen.
DE 43 36 498 offenbart auch den Nachweis eines speziellen Proteins in Urin (MGS 160/170) unter Verwendung konventioneller Radioimmunoassays zum Diagnostizieren von Nierenerkrankungen.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung ist auf ein Verfahren zum Diagnostizieren eines frühen Stadiums einer Nierenerkrankung und/oder von Nierenkomplikationen einer Erkrankung gerichtet, umfassend:

(a) Abtrennen aller Proteine in einer Urinprobe; und
(b) Nachweisen einer modifizierten Form eines Proteins in der Probe, wobei der Nachweis des modifizierten Proteins für ein frühes Stadium einer Nierenerkrankung und/oder von Nierenkomplikationen einer Erkrankung indikativ ist und wobei die modifizierte Form eines Proteins ein Protein von im Wesentlichen voller Länge ist, welches durch konventionelle Radioimmunoassays nicht detektierbar ist.

Obwohl die Erkrankung, die man diagnostizieren möchte, auf keine bestimmte Erkrankung beschränkt ist, umfasst die Erkrankung gemäß dem Verfahren der Erfindung eine Nephropathie, Diabetes insipidus, Diabetes Typ I, Diabetes II, eine Nierenerkrankung (Glomerulonephritis, bakterielle und virale Glomerulonephritiden, IgA-Nephropathie und Henoch-Schönlein Purpura, membranproliferative Glomerulonephritis, membranöse Nephropathie, Sjögren-Syndrom, nephrotisches Syndrom (Minimal-changes-Glomerulopathie, fokale Glomerulosklerose und damit in Zusammenhang stehende Störungen), akutes Nierenversagen, akute tubulointerstinale Nephritis, Pyelonephritis, Urogenitalentzündung, Präeklampsie, die Abstoßung einer transplantierten Niere, Lepra, Rückflussnephropathie, Nephrolithiase), eine genetische Nierenerkrankung (medulläre zystische, medulläre schwammartige, polyzystische Nierenerkrankung (autosomal dominante polyzystische Nierenerkrankung, autosomal rezessive polyzystische Nierenerkrankung, tuboröse Sklerose), von Hippel-Lindau-Syndrom, familiäre Erkrankung mit dünner glomerularer Basismembran, Kollagen-III-Glomerulopathie, Fibronektinglomerulopathie, Alport-Syndrom, Fabry-Krankheit, Nagel-Patella-Syndrom, kongenitale urologische Anomalien), monoklonale Gammopathien (multiples Myelom, Amyloidosis und damit in Zusammenhang stehende Erkrankungen), fiebrige Erkrankungen (familiäres Mittelmeerfieber, HIV-Infektion – AIDS), entzündliche Erkrankungen (systemische Vaskulitiden (Periarteritis nodosa, Wegener-Granulomatose, Entzündung mehrerer Arterien, nekrotisierende und Halbondbildende Glomerulenophritis), Polymyositis-Dermatomyositis, Pankreatitis, rheumatoide Arthritis, systemischer Lupus erythematodes, Gicht), Bluterkrankungen (Sichelzellanämie, thrombotische Purpura thrombopenica, hemolytischuremisches Syndrom, akute Rindennekrose, Nierenthromboembolismus), Trauma und einen chirurgischen Eingriff (umfangreiche Verletzungen, Verbrennungen, einen abdominalen und vaskulären chirurgischen Eingriff, Einleitung einer Anästhesie), Medikamente (Penicillamin, Steroide) und Medikamentenmissbrauch, eine bösartige Erkrankung (epitelial (Lunge, Brust), Adenokarzinom (renal), Melanom, lymphoretikuläres, multiples Myelom), eine zirkuläre Erkrankung (myokardischen Infarkt, Herzversagen, periphere vaskuläre Erkrankung, Bluthochdruck, Herzkranzerkrankung, nicht-atherosklerotische kardiovaskuläre Erkrankung, atherosklerotische kardiovaskuläre Erkrankung), eine Hauterkrankung (Psoriasis, systemische Sklerose), eine Erkrankung des Respirationstrakts (COPD, obstruktive Schlafapnoe, Hypoxie in großen Höhen) und eine endokrine Erkrankung (Akromegalie, Diabetes mellitus, Diabetes insipidus).
Zudem kann das Verfahren unter Verwendung eines jeden Proteins, vorzugsweise Albumin, Globulin (α-Globulin (α₁-Globulin, α₂-Globulin), β-Globulin, γ-Globulin), Euglobulin, Pseudoglobulin I und II, Fibrinogen, α₁-Säureglykoprotein (Orosomucoid), α₁-Glykoprotein, α₁-Lipoprotein, Ceruloplasmin, α₂-19S-Glykoprotein, β₁-Transferrin, β₁-Lipoprotein, Immunoglobuline A, E, G und M, Meerrettichperoxidase, Lactatdehydrogenase, Glucoseoxidase, Myoglobin, Lysozym, einem Proteinhormon, einem Wachstumshormon, Insulin oder parathyroidem Hormon, durchgeführt werden.
Das Verfahren kann unter Verwendung von Mitteln durchgeführt werden, die keine Antikörper sind, und zwar unter Verwendung solcher Verfahren wie Chromatographie, Elektrophorese oder Sedimentation, die zusätzlich solche Verfahren wie die Verteilungschromatographie, Adsorptionschromatographie, Papierchromatographie, Dünnschichtchromatographie, Gas-Flüssigkeits-Chromatographie, Gelchromatographie, Ionenaustauschchromatographie, Affinitätschromatographie oder Hydrophobchromatographie, wandernde Grenzflächenelektrophorese, Zonenelektrophorese oder isoelektrische Fokussierung umfassen.
Insbesondere ist das Verfahren der Erfindung auf die Verwendung einer Hydrophobchromatographie in einem Hochdruckflüssigkeitschromatographen (HPLC) gerichtet.
Die vorliegende Erfindung ist auch auf ein Nachweisverfahren mit einem Antikörper zum Diagnostizieren eines frühen Stadiums einer Nierenerkrankung und/oder von Nierenkomplikationen einer Erkrankung gerichtet. Das Verfahren der Erfindung wird durch das Untersuchen auf ein intaktes/modifiziertes Protein verwirklicht, das normalerweise unter Verwendung konventioneller Mittel nicht in Urin identifizierbar ist. Das intakte/modifizierte Protein der Erfindung ist in der Urinprobe einer erkrankten Person oder einer Person, die für eine Erkrankung prädisponiert ist, vorhanden, bevor das native Protein nachgewiesen werden kann. Daher zeigt der Nachweis eines intakten/modifizierten Proteins in einer Urinprobe in einem frühen Stadium an, dass der Patient entweder erkrankt oder für die Erkrankung prädisponiert ist, sogar obwohl der Patient ansonsten normal erscheint. Ein Assayverfahren der Erfindung umfasst den Nachweis eines intakten/modifizierten Proteins durch einen Antikörper, der spezifisch für sowohl die modifizierten wie auch unmodifizierten Formen des Proteins ist. Vorzugsweise ist der Antikörper für das modifizierte Protein spezifisch. Der Antikörper kann an eine enzymatische, radioaktive, fluoreszierende oder chemilumineszierende Markierung gebunden sein, wobei der Nachweisschritt einen Radioimmunoassay, einen immunoradiometrischen Assay, einen fluoreszierenden Immunoassay, einen enzymverknüpften Immunoassay oder einen Protein A-Immunoassay umfasst.
In dem Verfahren der Erfindung wird das frühe Stadium der Erkrankung diagnostiziert, wenn das modifizierte Protein in dem Urin in sich mit der Zeit erhöhenden Mengen vorhanden ist und durch einen konventionellen Radioimmunoassay nicht detektierbar ist.
Zudem ist die vorliegende Erfindung auch auf ein Verfahren zum Bestimmen eines Behandlungsmittels für eine Nierenerkrankung und/oder Nierenkomplikationen einer Erkrankung gerichtet, umfassend:

(a) Erhalten einer Urinprobe von einer Person, die eine Behandlung mit einem Mittel erfährt, von dem man glaubt, dass es in der Lage ist, die Erkrankung zu behandeln; und
(b) Suchen nach einer modifizierten Form eines Proteins in der Probe, wobei entweder die Anwesenheit oder das Fehlen der modifizierten Form des Proteins in dem Urin oder eine abfallende Menge der modifizierten Form des Proteins mit der Zeit in dem Urin darauf hinweisen, dass das Mittel ein Behandlungsmittel für die Nierenerkrankung und/oder Nierenkomplikationen einer Erkrankung ist.

Es ist eine andere Aufgabe der Erfindung, den Gesamtgehalt eines bestimmten Proteins in einer Probe zu bestimmen, umfassend:

(a) Abtrennen aller Proteine in der Probe;
(b) Nachweisen von modifizierten und unmodifizierten Formen des bestimmten Proteins; und
(c) Zusammenfügen der modifizierten und unmodifizierten Formen des bestimmten Proteins, um den Gesamtgehalt des bestimmten Prote ins in der Probe zu bestimmen, wobei die modifizierte Form des bestimmten Proteins so ist, wie es hierin definiert wird.

Vorzugsweise ist die Probe eine biologische Probe wie Urin.
Diese und andere Aufgaben der Erfindung werden aus der folgenden Beschreibung der Erfindung, den hier angefügten Zeichnungen, auf die Bezug genommen wird, und den angefügten Ansprüchen besser verstanden werden.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 zeigt den Verlauf von gefiltertem intakten Albumin in Röhrenzellen und den Abbau von Albumin zur Bereitstellung ausgeschiedener Albuminfragmente.
2a und 2b zeigen ein repräsentatives Profil von (³H) HSA in (a) Urin und (b) Plasma, das von normalen, gesunden Freiwilligen durch Größenausschlusschromatographie gesammelt wurde. Der Urin enthält hauptsächlich fragmentiertes Albumin. Und Plasma enthält hauptsächlich intaktes Albumin.
3 zeigt Urin von einem normalen, gesunden Freiwilligen nach Größenausschlusschromatographie, der eine Spitze mit fragmentiertem Albumin, aber keine Spitze mit intaktem Albumin zeigt.
4 zeigt Urin aus einem diabetischen Patienten, der Spitzen von sowohl intaktem wie auch fragmentiertem Albumin nach Größenausschlusschromatographie zeigt.
5 zeigt ein HPLC-Profil von Albumin allein.
6 zeigt das HPLC-Profil von Plasma aus einem normalen, gesunden Freiwilligen, das Spitzen von Albumin zeigt.
7 zeigt das HPLC-Profil von Urin aus einem normalen, gesunden Freiwilligen mit fragmentierten Produkten von Albumin, aber keine Spitze mit intaktem Albumin.
8 zeigt das HPLC-Profil einer Urinprobe aus einem Diabetespatienten mit Normalbumin, das Albuminabbauprodukte und eine kleine Spitze von modifiziertem Albumin bei einer Retentionszeit von ungefähr 39–44 zeigt.
9 zeigt das HPLC-Profil von Urin aus einem Diabetespatienten mit Normalbumin, der Anzeichen eines Nierenversagens und das Vorhandensein der charakteristischen Albuminspitze mit Spikes bei einer Retentionszeit von ungefähr 39–44 zeigt.
10 zeigt ein HPLC-Profil eines Diabetespatienten mit Normalbumin, der Anzeichen eines Nierenversagens und das Vorhandensein der charakteristischen Spitze von modifiziertem Albumin mit Spikes bei einer Retentionszeit von ungefähr 39–44 zeigt.
11 zeigt ein HPLC-Profil eines Diabetespatienten mit Makroalbuminurie, der große Mengen des normalen Albumins sowie das charakteristische Erscheinungsbild bei einer Retentionszeit von ungefähr 39–44 zeigt.
12 zeigt eine Langzeitstudie eines Patienten, bei dem das modifizierte Protein zu einem Zeitpunkt vor dem Beginn einer diabetischen Nephropathie nachgewiesen wurde, was eine Prädisposition für eine diabetische Nephropathie sowie die Verzögerung in der Behandlung, die durch das sich Verlassen auf konventionelle RIA-Verfahren ausgelöst wird, zeigt.
13 zeigt eine Langzeitstudie eines Patienten, bei dem das modifizierte Protein zu einem Zeitpunkt vor dem Beginn einer diabetischen Nephropathie nachgewiesen wurde, was eine Prädisposition für eine diabetische Nephropathie sowie die Verzögerung in der Behandlung, die durch das sich Verlassen auf konventionelle RIA-Verfahren ausgelöst wird, zeigt.
14 zeigt eine Langzeitstudie eines Patienten, bei dem das modifizierte Protein zu einem Zeitpunkt vor dem Beginn einer diabetischen Nephropathie nachgewiesen wurde, was eine Prädisposition für eine diabetische Nephropathie sowie die Verzögerung in der Behandlung, die durch das sich Verlassen auf konventionelle RIA-Verfahren ausgelöst wird, zeigt.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Der Anmelder hat herausgefunden, dass wenn Proteine einschließlich wichtiger Plasmaproteine wie Albumin und Immunglobulin durch die Niere filtriert werden, sie anschließend durch Zellen in der Niere abgebaut werden, bevor das Material ausgeschieden wird. Es ist wahrscheinlich, dass filtrierte Proteine durch Röhrenzellen aufgenommen werden. Röhrenzellen liegen hinter dem Nierenfilter und kommen mit dem Primärfiltrat in direkten Kontakt. Wenn Proteine durch die Röhrenzellen internalisiert werden, dann werden sie den Lysosomen zugeführt, wo sie zum Teil in Fragmente mit verschiedenen Größen abgebaut werden und dann wieder aus der Zelle ausgestoßen werden. Diese wieder ausgestoßenen Fragmente, von denen es wenigstens 60 unterschiedliche Fragmente geben kann, die von einer bestimmten Art von Protein generiert werden, werden dann in den Urin ausgeschieden.
Der Anmelder hat herausgefunden, dass bei einer Nierenerkrankung die Fragmentierung der Proteine gehemmt wird. Dies bedeutet, dass gefilterte Proteine mit im Wesentlichen voller Länge von einer Person ausgeschieden werden, die an einer Nierenerkrankung leidet. Dieser Übergang von einer Fragmentierung zu einer Hemmung der Fragmentierung von ausgeschiedenen Proteinen ist eine Basis für die Entwicklung neuer Medikamente und diagnostischer Assays. Zum Beispiel stehen die anfänglichen Veränderungen, die mit dem Auftreten von Nierenkomplikationen bei Diabetes zustande kommen, mit einer Änderung in dem Fragmentierungsprofil von ausgeschiedenem Albumin in Verbindung. Dies führt zu einer erkennbaren Mikroalbuminurie, die mit der Entwicklung einer diabetischen Nephropathie synonym ist. Es ist unwahrscheinlich, dass dies durch eine Hemmung in der lysosomalen Aktivität von Röhrenzellen in Diabetes bedingt ist.
Somit können Medikamente formuliert werden, um die lysosomale Aktivität in Diabetes anzuschalten, wenn Nierenkomplikationen auftreten. Die Medikamente können auch bei anderen Nierenerkrankungen nützlich sein, bei denen lysosomale Aktivitäten betroffen sind, oder bei Diabetes ohne Nierenkomplikationen in solchen Situationen, bei denen eine lysosomale Aktivität in Nicht-Nierengewebe abgeschaltet ist. Solche Medikamente umfassen antiproliferative Medikamente wie Antikrebsmedikamente.
Der Anmelder hat einen einzigartigen Assay zum Nachweis modifizierter Formen von bestimmten Proteinen entdeckt, die in dem Urin von bestimmten Patienten nachgewiesen werden, bevor die nicht modifizierte Form des bestimmten Proteins durch die Verwendung konventioneller Assays wie Radioimmunoassays nachgewiesen wird. Der Nachweis des modifizierten Proteins sagt eine Prädisposition für eine Nierenerkrankung voraus.
Definitionen
„Fragmentiertes Protein oder fragmentiertes Albumin" umfasst postglomeruläre Abbauprodukte nach chemischem, enzymatischem oder physikalischem Abbau, der während der Passage durch die Niere zustande kommt. Diese Komponenten haben eine verringerte Größe und/oder können eine veränderte Hydrophobizität aufweisen.
„Intaktes Albumin, modifiziertes Albumin oder eine modifizierte Form von Albumin", wie sie hierin verwendet werden, bedeuten eine Verbindung mit einer ähnlichen Größe und Struktureigenschaften wie natives Albumin, wobei die Aminosäuresequenz im Wesentlichen die gleiche wie die von nativem Albumin ist. Sie ist vorzugsweise ein filtriertes intaktes Protein. Es eluiert bei der Hochdruckflüssigkeitschromatographie (HPLC) an oder in der Nähe der gleichen Position wie natives Albumin (5). Jedoch wurde die Struktur entweder durch eine kleinere enzymvermittelte Modifikation oder eine Addition zu seiner Basisstruktur biochemisch modifiziert und/oder physikalisch durch eine Änderung in seiner dreidimensionalen Struktur, so dass es dem Nachweis durch konventionell verwendete Antikörper gegen Albumin entkommt. Eine biochemische Modifikation kann durch Enzyme wie Endo- oder Exopeptidasen durchgeführt werden. Die 3-D-Struktur von Albumin kann in irgendeiner Weise verändert worden sein. Liganden können an Albumin gebunden haben oder es kann irgendeine Kombination von diesen sein. Das modifizierte Albumin, das in dem Verfahren der Erfindung nachgewiesen wird, ist nicht durch derzeitige und konventionelle Radioimmunoassays unter Verwendung verfügbarer Antikörper nachweisbar.
Konventionelle Antikörper gegen Albumin können käuflich von einem Lieferanten von Immunochemikalien erworben werden. Zum Beispiel können die monoklonalen Antikörper mit den Katalognummern A6684 (Klon Nr. HSA-11) und A2672 (Klon Nr. HSA-9) sowie flüssiges Gesamtserum, lyophilisierte Fraktionen, eine flüssige IgG-Fraktion und die monoklonalen Antikörper in der flüssigen Form von Ascitesflüssigkeiten von Sigma, St. Louis, MO, erhalten werden, wie sie in dem Abschnitt für Immunochemikalien auf den Seiten 1151–1152 in dem Katalog von Sigma-Biochemicals Organic Compounds for Research and Diagnostic Reagents von 1994 zu finden sind.
Wie es hierin verwendet wird, umfasst intaktes/modifiziertes Albumin solches Albumin, das im Wesentlichen die volle Länge hat, chemisch modifiziert ist oder physikalisch modifiziert ist. Wie es hierin verwendet wird, ist unter intaktem/modifiziertem Albumin gemeint, dass es Albumin anzeigt, das weniger als, das gleiche wie oder mehr als das Molekulargewicht des Albumins in voller Länge hat und bei oder in der Nähe der Position von nativem Albumin in einem Trennmedium wie einer Chromatographie, vorzugsweise HPLC und am meisten bevorzugt einer Hydrophob-HPLC, eluiert.
Der Nachweis des Vorhandenseins von intaktem/modifiziertem Albumin ist ein Anzeichen für eine Prädisposition einer Nierenerkrankung.
„Intaktes Protein, modifiziertes Protein oder modifizierte Form eines Proteins", wie sie hierin verwendet werden, umfassen solche Formen von Protein mit im Wesentlichen voller Länge, die durch konventionelle Radioimmunoassays nicht nachweisbar sind. Das Protein umfasst, ist aber nicht beschränkt auf, Albumine, Glo buline (α-Globulin (α₁-Globulin, α₂-Globulin), β-Globuline, γ-Globuline), Euglobuline, Pseudoglobulin I und II, Fibrinogen, α₁-Säureglycoprotein (Orosomucoid), α₁-Glycoprotein, α₁-Lipoproteine, Cerulplasmin, a₂-19S-Glycoprotein, β₁-Transferrin, β₁-Lipoprotein, Immunglobuline A, E, G und M, Proteinhormone einschließlich Wachstumshormon, Insulin, parathyroides Hormon und andere Proteine einschließlich Meerrettichperoxidase, Lactatdehydrogenase, Glucoseoxidase, Myoglobin und Lysozym.
„Nierenerkrankung", wie es hierin verwendet wird, umfasst jede Fehlfunktion der Niere. Eine Nierenerkrankung kann durch das Vorhandensein von intaktem oder modifiziertem Albumin in dem Urin identifiziert werden. Vorzugsweise kann eine frühe Diagnose der Nierenerkrankung durch den Nachweis des Vorhandenseins eines modifizierten Proteins in dem Urin oder einer Erhöhung in dem modifizierten Protein in dem Urin mit der Zeit nachgewiesen werden.
„Niedrige Lysosomenaktivität", wie es hierin verwendet wird, wird mit normalen Mengen von Lysosomenaktivität und/oder der Lysosomenmaschinerie verglichen, die Protein zu dem Lysosom in einem normalen Individuum liefert. Die Aktivität ist für das Lysosom unzureichend, um Proteine zu fragmentieren, so dass intaktes Protein in einer größeren Menge als den normalen niedrigen Mengen ausgeschieden wird.
„Lysosomen aktivierende Verbindung", wie es hierin verwendet wird, bezieht sich auf eine Verbindung, die zur Reaktivierung des Lysosoms vorteilhaft ist. Die Verbindung kann direkt oder indirekt an dem Lysosom wirken, was in einer Aktivierung der lysosomalen Funktion resultiert. Diese Verbindungen können aus der Gruppe ausgewählt werden, umfassend, nicht aber beschränkt auf, Antikrebsverbindungen, Antiproliferationsverbindungen, Paracetamol, Vitamin A (Retinsäure) oder Derivate von Retinol.
„Makroalbuminurie" ist ein Zustand, bei dem ein Individuum mehr als 200 μg Albumin/Min. in den Urin ausscheidet, wie es durch einen konventionellen Radioimmunoassay (RIA) gemessen wird.
„Mikroalbuminurie” ist ein Zustand, bei dem ein Individuum wenigstens 20 μg Albumin/Min. in den Urin ausscheidet, wie es durch einen konventionellen Radioimmunoassay (RIA) gemessen wird. Der RIA misst bis runter auf 15,6 ng/ml und ist in der Lage, Albumin im Urin von normalen Probanden zu messen, die eine Ausscheidung von weniger als 6 μg/Min. haben. Jedoch ist, wenn die Albuminausscheidung 20 μg/Min. überschreitet, die Behandlung der Nierenerkrankung beschränkt und eine vollständige Erholung ist unter diesem Gesichtspunkt schwierig.
„Mit Mikroalbuminurie", wie es hierin verwendet wird, ist ein Zustand, bei dem Albumin in dem Urin mit einer Ausscheidungsgeschwindigkeit von wenigstens 20 μg/Min. nachgewiesen wird, wie es durch einen konventionellen RIA gemessen wird.
Wie sie hierin verwendet werden, werden „nativ" und „unmodifiziert" austauschbar verwendet, um ein Protein zu beschreiben, das natürlicherweise in einem Organismus, vorzugsweise in einem Menschen, zu finden ist, das nicht durch den Filterprozess der Glomeruli der Nieren modifiziert wurde.
„Normales Individuum", wie es hierin verwendet wird, ist ein Individuum, das keine Erkrankung aufweist, bei der intaktes Protein im Urin als ein Indikator der Erkrankung zu finden ist. Vorzugsweise ist die Erkrankung eine Nierenerkrankung.
„Normale Mengen an Lysosomenaktivität" sind Mengen an Lysosomenaktivität, die in einer nicht erkrankten Niere eines normalen Individuums zu finden sind.
„Normalbumin", wie es hierin verwendet wird, bedeutet einen Zustand, bei dem Albumin in den Urin ausgeschieden wird und nicht durch RIA nachweisbar ist oder weniger als 20 μg/Min. (wie es durch RIA gemessen wird) ausgeschieden wird.
„Anfälligkeit für eine Erkrankung", wie es hierin verwendet wird, bedeutet, dass sich in einem Individuum eine Erkrankung ergeben kann, wie es durch eine Bestimmung des Vorhandenseins und der Ausscheidungsgeschwindigkeit eines modifizierten Proteins wie modifizierten Albumins beurteilt wird.
„Proteinurie", wie es hierin verwendet wird, ist das Vorhandensein eines Proteins in dem Urin, üblicherweise in der Form von Albumin, eines Proteins, das in Wasser löslich ist und durch Wärme koaguliert werden kann. Damit verwandt ist „spezifische Proteinurie", die sich auf das Vorhandensein eines bestimmten Proteins in dem Urin bezieht.
„Radioimmunoassay", wie er hierin verwendet wird, ist ein Verfahren zum Nachweis und zur Messung von Substanzen unter Verwendung von radioaktiv markierten spezifischen Antikörpern oder Antigenen.
„Reaktivierung des Lysosoms", wie es hierin verwendet wird, umfasst eine Aktivierung der Lysosomenaktivität, vorzugsweise derart, dass der Abbau von Proteinen, insbesondere von Albumin, im Vergleich zu einem inaktivierten Zustand des Lysosoms erhöht ist.
„Wiederherstellen", wie es hierin verwendet wird, bedeutet vollständiges oder teilweises Wiederherstellen, so dass die wiederhergestellte Komponente eine verbesserte Funktion im Vergleich zu ihrer vorherigen Funktion aufweist.
„Gesamtprotein", wie es hierin verwendet wird, bezieht sich auf ein bestimmtes filtriertes Protein, das in nativer, unmodifizierter, modifizierter oder fragmentierter Form vorhanden ist, das im Urin ausgeschieden wird. Es umfasst Protein, das nicht durch einen konventionellen Radioimmunoassay oder durch konventionelle Verfahren, die derzeit verfügbar sind, um das Protein nachzuweisen, nachgewiesen wird. Vorzugsweise ist das Protein Albumin.
Gemäß der vorliegenden Erfindung umfassen die zu behandelnden Erkrankungen, sind aber nicht beschränkt auf, eine Nierenerkrankung (Glomerulonephritis, bakterielle und virale Glomerulonephritiden, IgA-Nephropathie und Henoch-Schönlein Purpura, membranproliferative Glomerulonephritis, membranöse Nephropathie, Sjögren-Syndrom, nephrotisches Syndrom (Minimal-changes- Glomerulopathie, fokale Glomerulosklerose und damit in Zusammenhang stehende Störungen), akutes Nierenversagen, akute tubulointerstinale Nephritis, Pyelonephritis, Urogenitalentzündung, Präeklampsie, die Abstoßung einer transplantierten Niere, Lepra, Rückflussnephropathie, Nephrolithiase), eine genetische Nierenerkrankung (medulläre zystische, medulläre schwammartige, polyzystische Nierenerkrankung (autosomal dominante polyzystische Nierenerkrankung, autosomal rezessive polyzystische Nierenerkrankung, tuboröse Sklerose), von Hippel-Lindau-Syndrom, familiäre Erkrankung mit dünner glomerularer Basismembran, Kollagen-III-Glomerulopathie, Fibronektinglomerulopathie, Alport-Syndrom, Fabry-Krankheit, Nagel-Patella-Syndrom, kongenitale urologische Anomalien).
In einem Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren zur Bestimmung einer Anfälligkeit für eine oder einer frühen Diagnose einer Nierenerkrankung und/oder von Nierenkomplikationen einer Erkrankung zur Verfügung gestellt. Das Verfahren umfasst das Bestimmen einer Veränderung in dem Albumingehalt in einer Urinprobe. Die Erkrankung kann eine Nierenerkrankung sein, obwohl sie nicht notwendigerweise auf eine Nierenerkrankung beschränkt ist.
In dem Verfahren der Erfindung wird Albumin hierin nur als ein Beispiel eines Proteins, das in Urin nachzuweisen ist, verwendet. Wenn das Albumin in einem Patienten durch einen konventionellen RIA analysiert wird, dann wird erwartet, dass ein Patient mit Normalbumin oder ein normales Individuum Albumin in dem Urin in dem Bereich von 3–10 μg/Min. bei jungen Menschen oder mehr bei älteren Menschen haben würde. Jedoch zeigen Patienten mit Normalbumin auch Mengen an Albumin im Urin, wenn es durch HPLC gemessen wird. Der Anmelder hat herausgefunden, dass diese Mengen in der Größenordnung von 5 μg/Min. sein können. Wenn die Nierenerkrankung fortschreitet, wird sich die Menge an intaktem/modifiziertem Albumin auf Mengen einer Mikroalbuminurie in der Größenordnung von 20–200 μg/Min. erhöhen, wie es durch einen RIA bestimmt wird. Diese wird viel höher sein, wenn man sie durch HPLC oder ein Verfahren bestimmt, das das gesamte Albumin einschließlich modifiziertes Albumin bestimmt. Durch Überwachung der Erhöhung an intaktem/modifiziertem Albumin können frühe Anzeichen einer Nierenerkrankung nachgewiesen werden. Jedoch sind diese Mengen nicht durch die Verfahren nachweisbar, die derzeit verfügbar sind, wie Radioimmunoassays unter Verwendung von Antikörpern, die derzeit käuflich verfügbar sind, und zwar möglicherweise aus dem Grund, dass Antikörper bestimmte Epitope nachweisen. Wenn das Albumin in irgendeiner Weise modifiziert wird, wie es oben beschrieben wird, dann kann das Epitop zerstört werden, wodurch das modifizierte Albumin als nicht nachweisbar zurückbleibt.
Ein Patient, der in Verdacht steht, eine diabetische Nierenerkrankung zu haben, wird keine Anzeichen einer Nierendegeneration bis nach mehr als gut 10 bis 15 Jahren zeigen, wenn Albumin durch die derzeitig verfügbaren Verfahren wie RIA-Verfahren nachweisbar wird. Es können durch einen RIA Ausscheidungsgeschwindigkeiten von Urin von wenigstens 20 μg/Min. nachgewiesen werden, wenn ein Individuum einen Zustand mit Mikroalbuminurie erreicht. Wiederum kann durch das Überwachen der Ausscheidung von modifiziertem Albumin eine Veränderung in der Niere und möglicherweise der Beginn einer Nierenerkrankung nachgewiesen werden.
Ein Proband mit Normalbumin oder ein Diabetespatient mit Normalbumin können für viele Jahre eine niedrige Ausscheidungsgeschwindigkeit von Albumin von weniger als 20 μg/Min., wie es durch einen RIA bestimmt wird, aufweisen. Das Vorhandensein von Albumin in dem Urin ist ein Anzeichen, dass die Funktionen der Niere beeinträchtigt sein können. Sobald sich diese Menge zu ändern beginnt, kann die Behandlung gestartet werden.
In einem normalen Individuum ist eine kleine Menge an Albumin in dem Urin nachweisbar. Gesamtes filtriertes Albumin erscheint im Urin hauptsächlich als fragmentiertes Albumin. Es kann ein wenig Albumin in Individuen mit Normalbumin nachgewiesen werden. Jedoch kann die Ausscheidungsgeschwindigkeit von Albumin im Urin von einem Individuum mit Normalbumin so niedrig wie 5 μg/Min. sein. Diese Menge ist im Allgemeinen durch einen RIA nachweisbar.
Das modifizierte Protein der Erfindung kann durch eine Reihe von Verfahren nachgewiesen werden, die auf dem Gebiet wohlbekannt sind, einschließlich, nicht aber beschränkt auf, Chromatographie, Elektrophorese und Sedimentation oder eine Kombination von diesen, die in Karger BL, Hancock WS (Hrsg.) High Resolu tion Separation and Analysis of biological Macromolecules. Part A Fundamentals in Methods in Enzymology, Bd. 270, 1996, Academic Press, San Diego, Kalifornien, USA; Karger BL, Hancock WS (Hrg.) High Resolution Separation and Analysis of biological Macromolecules. Part B Applications in Methods in Enzymology, Bd. 271, 1996, Academic Press, San Diego, Kalifornien, USA, oder in Harding SE, Rowe AJ, Horton JC (Hrsg.), Analytical Ultracentrifugation in Biochemistry and Polymer Science, 1992, Royal Soc. Chemistry, Cambridge, UK, beschrieben werden.
Das Elektrophoreseverfahren umfasst, ist aber nicht beschränkt auf, wandernde Grenzflächenelektrophorese, Zonenelektrophorese und isoelektrische Fokussierung.
Das Chromatographieverfahren umfasst, ist aber nicht beschränkt auf, Verteilungschromatographie, Adsorptionschromatographie, Papierchromatographie, Dünnschichtchromatographie, Gas-Flüssigkeits-Chromatographie, Gelchromatographie, Ionenaustauschchromatographie, Affinitätschromatographie und Hydrophobchromatographie. Vorzugsweise ist das Verfahren eine Gelchromatographie nach Größe und eine Hydrophobchromatographie. Mehr bevorzugt ist das Verfahren eine Hydrophobchromatographie unter Verwendung einer HPLC-Säule.
Der Anmelder hat herausgefunden, dass unter Diabetikern ein Diabetespatient mit Normalbumin fast nicht nachweisbare Mengen an Albumin aufweist, wenn er durch einen konventionellen RIA analysiert wird. Sie scheinen normal zu sein. Wenn jedoch der Urin durch HPLC getestet wird, dann sind die Mengen an modifiziertem Albumin viel größer als man es in einem normalen Individuum findet. Dieser Unterschied in Albumin kann auf die Unfähigkeit von konventionellen RIAs zurückgeführt werden, das gesamte Albumin (Gesamtalbumin) in intakten oder modifizierten Formen geeignet nachzuweisen. Somit ist eine HPLC zur Generierung eines Fragmentierungsprofils bevorzugt. Ein Fragmentierungsprofil auf der HPLC ist durch eine Serie von Spitzen gekennzeichnet, die eine Anzahl von Spezies von Albumin in intakten oder modifizierten Formen darstellen.
In einem bevorzugten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird das Verfahren zur Bestimmung einer Anfälligkeit für oder einer frühen Diagnose einer Nierenerkrankung in einem Probanden bestimmt, bevor der Proband eine Mikroalbuminurie bekommt.
Das Messen des Albumingehalts in einer Probe durch ein HPLC-Verfahren der vorliegenden Erfindung kann Ergebnisse zur Verfügung stellen, die sich von der Messung durch einen konventionellen RIA unterscheiden. Bei der HPLC-Technik wird eine niedrige Menge an Albumin in normalen Individuen beobachtet. Wenn die Menge an modifiziertem Albumin nachgewiesen wird und sich erhöht und in Richtung einer Mikroalbuminurie fortschreitet, dann kann für einen Patienten bestimmt werden, dass er eine Anfälligkeit für eine Nierenerkrankung aufweist.
In einem normalen Individuum ist das durch HPLC generierte Fragmentierungsprofil durch die Abwesenheit einer Spitze in einem Bereich gekennzeichnet, bei dem natives Albumin in voller Länge eluiert. Stattdessen ist mehrfach fragmentiertes Albumin nachweisbar. Ein reines Proteinprodukt (nicht modifiziert) produziert im Wesentlichen eine einzelne Spitze. Zum Beispiel wurde bei Verwendung einer Hydrophob-HPLC beobachtet, dass Albumin in dem Bereich von 39–44 Minuten eluiert (5). Somit würde ein normales Individuum ein eindeutiges Fragmentierungsprofil zur Verfügung stellen, das für das Fehlen einer Nierenerkrankung oder einer Anfälligkeit für eine Nierenerkrankung indikativ ist. Wenn jedoch eine Nierenerkrankung fortschreitet, dann ist zuerst eine steigende Menge an modifiziertem Albumin und dann später die native Form nachweisbar. Das Fragmentierungsprofil beginnt sich zu verändern und mehr Produkte in dem Bereich des Albumins mit voller Länge manifestieren sich als zusätzliche Spitzen oder eine vergrößerte Spitze, die mehr intaktes/modifiziertes Albumin in dem Urin anzeigt.
In einem durch HPLC generierten Fragmentierungsprofil einer Urinprobe kann das modifizierte Albumin in einem Bereich erscheinen, in dem natives Albumin eluiert, sich aber als mehrere Spitzen manifestieren kann, was das Vorhandensein mehrerer Formen von modifiziertem Albumin anzeigt.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform kann die Anfälligkeit für eine Nierenerkrankung durch das Bestimmen des Vorhandenseins von oder das Identifizieren von wenigstens einer Spezies von modifiziertem Albumin gemessen werden. Dies kann durch das Vorhandensein einer spezifischen Spitze auf einem HPLC-Profil bestimmt oder identifiziert werden, wobei die Spitze vorzugsweise in dem Positionsbereich vorliegt, der der Elutionsposition des nativen Albumins entspricht.
Eine HPLC-Säule zur Bestimmung von modifiziertem Albumin oder unmodifiziertem Albumin kann eine Hydrophobsäule wie Zorbax 300 SB-CB (4,6 mm × 150 mm) sein. Es kann eine Probenschlaufe von 50 μl verwendet werden. Es können Lösungsmittel zur Elution, die für HPLC bei dem Nachweis von Albumin und seinen Abbauprodukten geeignet sind, übliche Elutionslösungsmittel wie Lösungsmittel mit Acetonitril verwendet werden. Vorzugsweise kann ein Puffer aus Wasser/1% Trifluoressigsäure (TFA) gefolgt durch einen Puffer aus 60% Acetonitril/0,09% TFA verwendet werden. Es wurde von einem Gradienten aus 0 bis 100% von 60% Acetonitril/0,09% TFA herausgefunden, dass er geeignet ist.
Geeignete HPLC-Bedingungen für eine Hydrophobsäule können die Folgenden sein:
Lösungsmittel A H₂O, 1% Trifluoressigsäure
Lösungsmittel B 60% Acetonitril, 0,09% TFA
Lösungsmittel A2 99,96 > 00,00 : 49,58 Min.
Druck 9,014 MPa (~ 1.100 psi)
Lösungsmittel B2 0,04 > 100,0 : 49,58 Min.
Druck 7,154 MPa
Die bei der HPLC verwendete Wellenlänge kann ungefähr 214 nm sein.
Modifiziertes Albumin kann zwischen 39–44 Minuten (5) eluieren. Fragmente von Albumin können viel früher, hauptsächlich bei weniger als 20 Minuten, eluieren.
Das Verfahren zur Bestimmung der Anfälligkeit für eine Nierenerkrankung ist auf jedes Individuum anwendbar. Eine Nierenerkrankung kann durch eine Anzahl von Faktoren ausgelöst werden, einschließlich einer bakteriellen Infektion, Allergien, kongenitalen Defekten, Steinen, Tumoren, Chemikalien oder durch Diabetes. Vorzugsweise ist das Verfahren zur Bestimmung einer Anfälligkeit für eine Nierenerkrankung auf Diabetespatienten anwendbar, bei denen eine Nierenerkrankung fortschreiten kann. Vorzugsweise ist das Individuum ein Diabetespatient mit Normalbumin. Jedoch können normale Individuen auf eine Anfälligkeit für die Erkrankung durch die Bestimmung erhöhter Mengen an intaktem oder modifiziertem Albumin in dem Urin überwacht werden.
Das Verfahren der Erfindung kann unter Verwendung von Trennverfahren ohne Antikörper, wie sie oben beschrieben werden, durchgeführt werden. Jedoch können auch Antikörper, die für modifiziertes Protein spezifisch sind, verwendet werden, um das Vorhandensein des modifizierten Proteins nachzuweisen.
Der Antikörper für das modifizierte Protein kann unter Verwendung des folgenden Verfahrens erhalten werden. Die Prozedur wird nur im Wege eines Beispiels spezifisch für Albumin beschrieben und kann leicht auf die Antikörperproduktion gegen jedes andere Protein in Urin angewendet werden. Das Verfahren bemüht sich, zu bestimmen, welches modifizierte Albuminmolekül der empfindlichste Marker zur Identifizierung von Diabetespatienten ist, bei denen zum Beispiel Nierenerkrankungen fortschreiten.
Das modifizierte Albumin ist dadurch gekennzeichnet, dass man eine quantitative Trennung der modifizierten Albuminmoleküle wie mit einer präperativen HPLC durchführt. Die modifizierten Proteine werden auf Ligandenbindung wie eine Glycosylierung analysiert. Anschließend wird die Aminosäuresequenz des einzelnen modifizierten Proteins bestimmt, und zwar vorzugsweise durch Massenspektroskopie unter Verwendung von Verfahren, die in Karger BL, Hancock WS (Hrsg.) High Resolution Separation and Analysis of biological Macromolecules. Part A Fundamentals in Methods in Enzymology, Bd. 270, 1996, Academic Press, San Diego, Kalifornien, USA, beschrieben werden. In einer bevorzugten Ausführungsform können ungefähr 3 bis 4 modifizierte Albuminspezies vorhanden sein.
Das Verfahren zur Generierung eines Antikörpers gegen das modifizierte Albumin bemüht sich, einen diagnostischen Immunoassay für das modifizierte Albumin zu entwickeln, der solche Diabetespatienten voraussagt, die zum Beispiel zu Nierenkomplikationen fortschreiten. Um dies zu erreichen, werden ausreichende Mengen an modifiziertem Albumin durch HPLC hergestellt. Es werden Antikörper durch aufeinander folgende Injektionen des modifizierten Albumins in ein Tier wie ein Kaninchen zur Generierung eines guten Titers hergestellt, und die Antikörper werden unter Verwendung konventioneller Techniken unter Verwendung von Verfahren hergestellt, die zum Beispiel in Goding JW, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice. Production and Application of Monoclonal Antibodies in Cell Biology, Biochemistry and Immunology, 2. Ausgabe 1986, Academic Press, Londen, UK; oder Johnstone A, Thorpe, R, Immunochemistry in Practice, 3. Ausgabe 1996, Blackwell Science Ltd., Oxford, UK, beschrieben werden, wobei diese Dokumente hierin durch Bezugnahme in ihrer Gesamtheit aufgenommen werden. Die erhaltenen Antikörper können polyklonale Antikörper oder monoklonale Antikörper sein.
Vorzugsweise wird wenigstens eine Spezies eines modifizierten Albumins zur Verwendung bei der Bestimmung einer Anfälligkeit für eine Nierenerkrankung isoliert und identifiziert. Die isolierte Spezies kann verwendet werden, um Antikörper zur Verwendung in Immunoassays zu generieren. Die Antikörper können mit einer enzymatischen, radioaktiven, fluoreszierenden oder chemilumeszierenden Markierung markiert werden. Das Nachweisverfahren kann das Folgende umfassen, ist aber nicht darauf beschränkt, einen Radioiummunoassay, einen immunradiometrischen Assay, einen fluoreszierenden Immunoassay, einen enzymverknüpften Immunoassay oder einen Protein-A-Immunoassay. Die Assays können in der Weise durchgeführt werden, wie sie zum Beispiel in Goding JW, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice. Production and Application of Monoclonal Antibodies in Cell Biology, Biochemistry and Immunology, 2. Ausgabe 1986, Academic Press, Londen, UK; Johnstone A, Thorpe, R, Immunochemistry in Practice, 3. Ausgabe 1996, Blackwell Science Ltd., Oxford, UK; oder Price CP, Newman DJ (Hrsg.), Principles and Practice of Immunoassay. 2. Ausgabe, 1997, Stockton Press, New York, NY, USA, beschrieben werden.
Die Komponenten zur Durchführung der vorliegenden Erfindung, die als ein Gegenstand oder als ein Kit (nicht die Erfindung) bereitgestellt werden, werden zur schnellen und genauen, je nach Wunsch quantitativen oder nicht quantitativen, Bestimmung des Vorhandenseins oder des Fehlens eines modifizierten Proteins wie eines modifizierten Albumins in einer Probe verwendet. Jede Komponente des Kits kann einzeln in ihrem eigenen geeigneten Behälter verpackt werden. Der einzelne Behälter kann auch in einer Weise markiert werden, die die Inhaltsstoffe identifiziert. Zudem können die einzeln verpackten Komponenten in einen größeren Behälter platziert werden, der in der Lage ist, alle gewünschten Komponenten zu halten. Mit dem Kit können Instruktionen in Verbindung stehen, die erklären, wie man den Kit benutzt. Diese Instruktionen können auf dem Kit geschrieben oder an dem Kit befestigt sein.
Die Erfindung ist auch auf ein Verfahren zum Bestimmen eines Behandlungsmittels für eine Nierenerkrankung und/oder Nierenkomplikationen einer Erkrankung gerichtet, umfassend:

Das Behandlungsmittel kann ein Lysosomen aktivierendes Mittel sein, das direkt oder indirekt die Aktivierung von Lysosomen bewirken kann und dadurch bewirkt, dass das Lysosom postglomerulär filtrierte Proteine verdaut, welches ein Anzeichen einer gesunden Niere ist.
Das Verfahren des Schleusens von Proteinen zu den Lysosomen spielt eine Rolle in dem Mechanismus einer Albuminurie bei Diabetes. Ein intrazelluläres Molekül, das in das Schleusen involviert ist, ist die Proteinkinase C (PKC). Es wird vorge schlagen, dass ein Medikament oder Mittel formuliert werden kann, das das lysosomale Schleusen aktiviert oder die PKC hemmt.
Lysosomen können mit dem Abbau von Proteinen, insbesondere Albumin, in der Niere in Verbindung stehen. In Fällen einer Mikroalbuminurie entkommen wesentliche Mengen an Albumin dem lysosomalen Abbau möglicherweise bedingt durch ein deaktiviertes Lysosom. Die Wiederherstellung des lysosomalen Abbaus kann das Gleichgewicht von zellulären Prozessen und Gewebeumsatz in der Niere wiederherstellen.
Eine Lysosomen aktivierende Verbindung kann eine Verbindung sein, die direkt oder indirekt auf das Lysosom einwirkt. Durch indirektes Einwirken kann die Verbindung auf eine Komponente einwirken, die die Aktivität des Lysosoms beeinflusst. Nichtsdestotrotz resultiert das Ergebnis in einer Aktivierung des Lysosoms, wodurch ein verstärkter Proteinabbau zur bereitgestellt wird.
In einem anderen Aspekt der Erfindung wird eine Lysosomen aktivierende Komponente als eine Zusammensetzung zur Verfügung gestellt, die eine Lysosomen aktivierende Verbindung und einen Träger (entspricht nicht der Erfindung) enthält.
Die Zusammensetzung kann eine physiologisch verträgliche oder pharmazeutisch verträgliche Zusammensetzung sein. Jedoch wird es eine Zusammensetzung sein, die eine stabile Lagerung der Lysosomen aktivierenden Verbindung ermöglicht. Wenn die Zusammensetzung eine pharmazeutisch verträgliche Zusammensetzung ist, dann kann sie zur Verwendung in einem Verfahren zur Verhinderung oder Behandlung einer Nierenerkrankung geeignet sein.
Ein Verfahren zur Verhinderung oder Behandlung einer Nierenerkrankung (entspricht nicht der Erfindung) kann die Verabreichung einer wirksamen Menge einer Lysosomen aktivierenden Verbindung an einen Probanden umfassen.
Wie es oben beschrieben wird, kann die Lysosomen aktivierende Verbindung durch das Reaktivieren des Lysosoms wirken, so dass zelluläre Prozesse und der Gewebeumsatz vollständig oder teilweise wiederhergestellt werden, was dazu führt, dass die Niere teilweise oder vollständig wiederhergestellt wird. In jedem Fall kann die Verabreichung einer Lysosomen aktivierenden Verbindung an ein Tier mit einer Nierenerkrankung die Lysosomenaktivität vollständig oder teilweise wiederherstellen.
Verfahren zur Verabreichung können oral oder parenteral sein. Oral kann eine Verabreichung mit Tabletten, Kapseln, Pulvern, Sirupen, etc. umfassen. Die parenterale Verabreichung kann intravenöse, intramuskuläre, subkutane oder intraperitoneale Wege umfassen.
Die veränderte Aktivität des Lysosoms ist vorzugsweise eine Veränderung, die die Aktivität des Lysosoms derart verstärkt, dass der Albuminabbau verbessert wird. Die Fähigkeit, nicht nur Lysosomen zu aktivieren, sondern auch zelluläre Prozesse und/oder den Gewebeumsatz zu verbessern, ist eine Eigenschaft der am meisten wünschenswerten Lysosomen aktivierenden Verbindungen. Bevorzugt wird es gewünscht, die Lysosomen aktivierende Verbindung zu verwenden, um die Nierenfunktion wiederherzustellen.
Ein Verfahren zur Verhinderung einer Nierenerkrankung in einem Probanden (entspricht nicht der Erfindung) kann das Folgende umfassen:

(a) Messen des Gesamtgehalts an Albumin in einer Urinprobe;
(b) Bestimmen einer Veränderung in der Menge an intaktem Albumin in dem Urin, das modifiziert wurde, so dass es nicht mehr durch konventionelle RIA-Verfahren nachweisbar ist, wobei die Änderung eine Anfälligkeit für eine Nierenerkrankung anzeigt, und das Behandeln des Tieres auf eine Nierenerkrankung, wenn eine Änderung bestimmt wird.

Die folgenden Beispiele werden im Wege einer Erläuterung der vorliegenden Erfindung und nicht im Wege einer Beschränkung angeboten.
BEISPIELE
Beispiel 1: Größenausschlusschromatographie von menschlichem Serumalbumin (HSA)
Normale, gesunde Freiwillige wurden verwendet, um Urin zur Analyse der Verteilung von Albumin in deren Urin zur Verfügung zu stellen.
³H[HSA] (menschliches Serumalbumin) wurde in gesunde Freiwillige injiziert und Urin und Plasma wurden gesammelt und durch Größenausschlusschromatographie unter Verwendung einer G-100-Säule analysiert. Die Säule wurde mit PPS (pH = 7,4) bei 20 ml/h bei 4°C eluiert. Das Leervolumen (V₀) der Säule wurde mit Blue Dextran T2000 und das Gesamtvolumen mit tritiertem Wasser bestimmt.
Die Radioaktivität des Tritiums wurde in wässrigen Proben von 1 ml mit 3 ml Szintillationsflüssigkeit bestimmt und es wurde auf einem Flüssigkeitsszintillationzähler Wallac 1410 (Wallac Turku, Finnland) gemessen.
2 zeigt die Verteilung von Albumin in Urin und in Plasma.
Beispiel 2: Albuminausscheidung in einem normalen, qesunden Freiwilligen und in einem Diabetespatienten
³H[HSA], so wie es in Beispiel 1 verwendet wurde, wurde in einen normalen, gesunden Freiwilligen und in einen Diabetespatienten injiziert. Es wurden Proben des Urins gesammelt und ³H[HSA] wurde wie in Beispiel 1 bestimmt.
Der normale, gesunde Freiwillige (3) zeigt die Ausscheidung von Fragmenten von Albumin auf einer Größenausschlusschromatographie, wie sie in Beispiel 1 durchgeführt wird.
Der diabetische Patient (4) zeigt das Vorhandensein von Albumin mit im Wesentlichen voller Länge und von fragmentiertem Albumin auf einer Größenausschlusschromatographie. Jedoch lagen die Geschwindigkeiten der Ausscheidung des Albumins, die durch diese Verfahren nachweisbar sind, in der Größenordnung von 5 μg/Min. (Kontrolle) und 1,457 μg/Min. (Diabetes).
Beispiel 3: Bestimmung von Gesamtalbumin und intaktem/modifiziertem Albumin durch HPLC
Es wurden Urinproben von einem normalen, gesunden Freiwilligen, Diabetespatienten mit Normalbumin und Patienten mit Makroalbuminurie gesammelt. Mittelstrahlurin wurde in Probebehältern von 50 ml für Urin gesammelt. Der Urin wurde bis zur weiteren Verwendung eingefroren. Vor der HPLC-Analyse wurde der Urin bei 5.000 g zentrifugiert.
Die Proben wurden mit HPLC unter Verwendung einer Hydrophobsäule Zorbax 300 SB-CB (4,6 mm × 150 mm) analysiert. Es wurde eine Probenschlaufe mit 50 μl verwendet.
Die Proben wurden von den Säulen unter Verwendung der folgenden Bedingungen eluiert.
Lösungsmittel A H₂O, 1% Trifluoressigsäure
Lösungsmittel B 60% Acetonitril, 0,09% TFA
Lösungsmittel A2 99,96 > 00,00 : 49,58 Min.
Druck 9,014 MPa (~ 1.100 psi)
Lösungsmittel B2 0,04 > 100,0 : 49,58 Min.
Druck 7,154 MPa
Es wurde eine Wellenlänge von 214 nm verwendet.
Ergebnisse
Die 5 zeigt ein HPLC-Profil von Albumin allein. Im Wesentlichen wurde eine einzelne Spitze erhalten, die bei einer Retentionszeit von ungefähr 39–44 Minuten eluiert.
6 zeigt ein HPLC-Profil von Plasma, das eine deutliche Albuminspitze bei ungefähr 39–44 Minuten sowie andere Spitzen, die anderen Plasmaproteinen entsprechen, zeigt.
7 zeigt ein HPLC-Profil eines normalen, gesunden Freiwilligen, das keine Albuminspitze in der Urinprobe zeigt. Dieses Individuum baut das Albumin ab, das in den Urin ausgeschieden wird, möglicherweise durch ein aktives Lysosom. Es waren wesentlich fragmentierte Produkte vorhanden, die eine Bedeutung anderer Spezies, insbesondere einer Spezies bei ungefähr etwas weniger als 14,5 Minuten Retentionszeit, zeigen.
Wenn Urin aus einem Diabetespatienten mit Normalbumin (mit einer Ausscheidungsgeschwindigkeit von Albumin von 8,07 μg/Min., wie es durch RIA gemessen wird) analysiert wird (8), dann sind kleine Mengen an modifiziertem Albumin, die bei ungefähr 39–44 Minuten Retentionszeit eluieren, erkennbar. Obwohl ein konventioneller Test das Vorhandensein von < 6 mg/l Albumin in der Urinprobe anzeigt, zeigte das Verfahren der Erfindung, dass der wahre Albumingehalt 26,7 mg/l betrug. Die Behandlung der Erkrankung hätte bei diesem Individuum bereits beginnen sollen. Es sind Albuminnebenprodukte oder fragmentiertes Albumin wie in dem normalen, gesunden Freiwilligen vorhanden.
Es wurde eine andere Urinprobe aus einem Diabetespatienten mit Normalbumin (mit einer Ausscheidungsgeschwindigkeit von Albumin von 17,04 μg/Min.) analysiert (9). Die RIA-Tests zeigten, dass Albumin in den Urin des Patienten ausgeschieden wurde. Jedoch ist mit HPLC (9) eine Albumin- oder modifizierte Albuminspitze bei ungefähr 39–44 Minuten Retentionszeit zu erkennen. Obwohl ein konventioneller Test das Vorhandensein von < 6 mg/l Albumin in der Urinprobe anzeigt, zeigte das Verfahren der Erfindung, dass der wahre Albumingehalt in der Urinprobe 81,3 mg/l war. Die Behandlung der Erkrankung hätte bei diesem Individuum bereits begonnen haben sollen. Diese Spitze beginnt, eine Spitze mit mehreren Spitzen zu zeigen. Eine kleinere Spitze, die intaktem Albumin entspricht, zeigt, dass modifiziertes Albumin die Spitze bei 39–44 Minuten darstellen könnte. Das Vorhandensein dieser Albuminspitze im Vergleich zu dem Profil eines normalen, gesunden Freiwilligen ohne Albuminspitze zeigt eine Veränderung in den nachweisbaren Mengen von intaktem/modifiziertem Albumin. Dies kann eine Anfälligkeit für eine Nierenerkrankung signalisieren.
Es wurde eine weitere Urinprobe von einem Diabetespatienten mit Normalbumin (mit einer Ausscheidungsgeschwindigkeit von Albumin von 4,37 μg/Min.) analysiert und das HPLC-Profil wird in 10 gezeigt. Wiederum wurde modifiziertes Albumin bei einer Retentionzeit von ungefähr 39–44 Minuten nachgewiesen, das mehrere Spitzen zeigt. Dieser Patient hatte durch RIA wiederum normales Albumin. Obwohl der konventionelle Test das Vorhandensein von < 6 mg/l Albumin in der Urinprobe anzeigt, zeigte das Verfahren der Erfindung, dass der wahre Albumingehalt in der Urinprobe 491 mg/l war. Die Behandlung der Erkrankung für dieses Individuum hätte bereits beginnen sollen. Es ist klar, dass die Untersuchung des modifizierten Albumins notwendig ist, um diese Veränderungen zu identifizieren. Für diesen Patienten hätte man festgestellt, dass eine Anfälligkeit für eine Nierenerkrankung vorliegt. Wenn die Nierenerkrankung fortschreitet, dann wird sich die Spitze des modifizierten Albumins weiter vergrößern.
Dies wird in 11 gezeigt, wo eine Urinprobe eines Patienten mit Makroalbuminurie analysiert wurde. Es war eine recht deutliche Albuminspitze, die mehrere Spitzen zeigte, bei ungefähr 39–44 Minuten Retentionszeit zu erkennen. Der Albumingehalt des Patienten war 1796 mg/l. Die Behandlung für dieses Individuum läuft bereits.
Das Verfahren der Erfindung resultiert in einem frühen Nachweis einer Anfälligkeit für eine Nierenerkrankung, wie es durch die Langzeitstudien in den 12–14 dargestellt wird. Die 12–14 zeigen Situationen, in denen die Behandlung mit einem ACE-Hemmer für Diabetes später begonnen wurde, als sie hätte beginnen sollen, wenn das Nachweisverfahren für modifiziertes Albumin der Erfindung verwendet worden wäre. Der Nachweis von modifiziertem Protein unter Verwendung des Verfahrens gemäß der Erfindung ist ein wirksameres Verfahren zur Voraussage des Beginns einer Nierenerkrankung als die Verwendung eines konventionellen RIA.

Claims

Ein Verfahren zum Diagnostizieren eines frühen Stadiums einer Nierenerkrankung und/oder von Nierenkomplikationen einer Erkrankung, umfassend: (a) Abtrennen aller Proteine in einer Urinprobe; und (b) Nachweisen einer modifizierten Form eines Proteins in der Probe, wobei der Nachweis des modifizierten Proteins für ein frühes Stadium einer Nierenerkrankung und/oder von Nierenkomplikationen einer Erkrankung indikativ ist und wobei die modifizierte Form eines Proteins ein Protein von im Wesentlichen voller Länge ist, welches durch konventionelle Radioimmunoassays nicht detektierbar ist.
Das Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Erkrankung Nephropathie, Diabetes insipidus, Diabetes Typ I, Diabetes II, eine Nierenerkrankung (Glomerulonephritis, bakterielle und virale Glomerulonephritiden, IgA-Nephropathie und Henoch-Schönlein Purpura, membranproliferative Glomerulonephritis, membranöse Nephropathie, Sjögren-Syndrom, nephrotisches Syndrom (Minimal-changes-Glomerulopathie, fokale Glomerulosklerose und damit in Zusammenhang stehende Störungen), akutes Nierenversagen, akute tubulointerstinale Nephritis, Pyelonephritis, Urogenitalentzündung, Präeklampsie, die Abstoßung einer transplantierten Niere, Lepra, Rückflussnephropathie, Nephrolithiase), eine genetische Nierenerkrankung (medulläre zystische, medulläre schwammartige, polyzystische Nierenerkrankung (autosomal dominante polyzystische Nierenerkrankung, autosomal rezessive polyzystische Nierenerkrankung, tuboröse Sklerose), von Hippel-Lindau-Syndrom, familiäre Erkrankung mit dünner glomerularer Basismembran, Kollagen-III-Glomerulopathie, Fibronektinglomerulopathie, Alport-Syndrom, Fabry-Krankheit, Nagel-Patella-Syndrom, kongenitale urologische Anomalien), monoklonale Gammopathien (multiples Myelom, Amyloidosis und damit in Zusammenhang stehende Erkrankungen), fiebrige Erkrankungen (familiäres Mittelmeerfieber, HIV-Infektion – AIDS), entzündliche Erkrankungen (systemische Vaskulitiden (Periarteritis nodosa, Wegener-Granulomatose, Entzündung mehrerer Arterien, nekrotisierende und Halbond-bildende Glomerulenophritis), Polymyositis-Dermatomyositis, Pankreatitis, rheumatoide Arthritis, systemischer Lupus erythematodes, Gicht), Bluterkrankungen (Sichelzellanämie, thrombotische Purpura thrombopenica, hemolytisch-uremisches Syndrom, akute Rindennekrose, Nierenthromboembolismus), Trauma und einen chirurgischen Eingriff (umfangreiche Verletzungen, Verbrennungen, einen abdominalen und vaskulären chirurgischen Eingriff, Einleitung einer Anästhesie), Medikamente (Penicillamin, Steroide) und Medikamentenmissbrauch, eine bösartige Erkrankung (epitelial (Lunge, Brust), Adenokarzinom (renal), Melanom, lymphoretikuläres, multiples Myelom), eine zirkuläre Erkrankung (myokardischen Infarkt, Herzversagen, periphere vaskuläre Erkrankung, Bluthochdruck, Herzkranzerkrankung, nicht-atherosklerotische kardiovaskuläre Erkrankung, atherosklerotische kardiovaskuläre Erkrankung), eine Hauterkrankung (Psoriasis, systemische Sklerose), eine Erkrankung des Respirationstrakts (COPD, obstruktive Schlafapnoe, Hypoxie in großen Höhen) und eine endokrine Erkrankung (Akromegalie, Diabetes mellitus, Diabetes insipidus) umfasst.
Das Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Protein Albumin, Globulin (α-Globulin (α₁-Globulin, α₂-Globulin), β-Globulin, γ-Globulin), Euglobulin, Pseudoglobulin I und II, Fibrinogen, α₁-Säureglykoprotein (Orosomucoid), α₁-Glykoprotein, α₁-Lipoprotein, Cerulplasmin, α₂-19S-Glykoprotein, β₁-Transferrin, β₁-Lipoprotein, Immunoglobuline A, E, G und M, Meerrettichperoxidase, Lactatdehydrogenase, Glucoseoxidase, Myoglobin, Lysozym, ein Proteinhormon, ein Wachstumshormon, Insulin oder ein parathyroides Hormon umfasst.
Das Verfahren nach Anspruch 3, wobei das Protein Albumin ist.
Das Verfahren nach Anspruch 1, wobei das modifizierte Protein mit Mitteln detektiert wird, die keine Antikörper sind.
Das Verfahren nach Anspruch 5, wobei das Mittel, das kein Antikörper ist, die Chromatographie, Elektrophorese oder Sedimentation umfasst.
Das Verfahren nach Anspruch 6, wobei das Mittel, das kein Antikörper ist, die Verteilungschromatographie, Adsorptionschromatographie, Papierchromatographie, Dünnschichtchromatographie, Gas-Flüssigkeits-Chromatographie, Gelchromatographie, Ionenaustauschchromatographie, Affinitätschromatographie oder Hydrophobchromatographie, wandernde Grenzflächenelektrophorese, Zonenelektrophorese oder isoelektrische Fokussierung umfasst.
Das Verfahren nach Anspruch 7, wobei das Hilfsmittel, das kein Antikörper ist, Hydrophobchromatographie umfasst.
Das Verfahren nach Anspruch 8, wobei die Hydrophobchromatographie in einem Hochdruckflüssigkeitschromatographen (HPLC) ausgeführt wird.
Das Verfahren nach Anspruch 1, wobei das modifizierte Protein durch einen Antikörper nachgewiesen wird, der sowohl für unmodifzierte als auch für modifizierte Formen des Proteins spezifisch ist.
Das Verfahren nach Anspruch 10, wobei der Antikörper für das modifizierte Protein spezifisch ist.
Das Verfahren nach Anspruch 11, wobei der Antikörper mit einer enzymatischen, radioaktiven, fluoreszierenden oder chemilumineszierenden Markierung verbunden ist, wobei der Nachweisschritt einen Radioimmunoassay, einen immunoradiometrischen Assay, einen fluoreszierenden Immunoassay, einen enzymverknüpften Immunoassay oder einen Protein-A-Immunoassay umfasst.
Das Verfahren nach Anspruch 1, wobei ein frühes Stadium der Erkrankung diagnostiziert wird, wenn das modifizierte Protein in dem Urin in mit der Zeit steigenden Mengen vorliegt.
Ein Verfahren zum Bestimmen eines Behandlungsmittels für eine Nierenerkrankung und/oder Nierenkomplikationen einer Erkrankung, umfassend: (a) Erhalten einer Urinprobe von einer Person, die eine Behandlung mit einem Mittel erfährt, von dem man glaubt, dass es in der Lage ist, die Erkrankung zu behandeln; und (b) Suchen nach einer modifizierten Form eines Proteins, wie es in Anspruch 1 definiert ist, in der Probe, wobei entweder die Anwesenheit oder das Fehlen der modifizierten Form des Proteins in dem Urin oder abfallende Menge der modifizierten Form des Proteins mit der Zeit in dem Urin darauf hinweisen, dass das Mittel ein Behandlungsmittel für die Nierenerkrankung und/oder Nierenkomplikationen einer Erkrankung ist.
Ein Verfahren zum Bestimmen des Gesamtgehaltes eines bestimmten Proteins in einer Probe, umfassend: (a) Abtrennen aller Proteine in der Probe; (b) Nachweisen von modifizierten und unmodifizierten Formen des bestimmten Proteins; und (c) Zusammenfügen der modifizierten und unmodifizierten Formen des bestimmten Proteins, um den Gesamtgehalt des bestimmten Proteins in der Probe zu bestimmen, wobei die modifizierte Form des bestimmten Proteins wie in Anspruch 1 definiert ist.
Das Verfahren nach Anspruch 15, wobei die Probe eine biologische Probe ist.