DE69931381T2

DE69931381T2 - Aus vaccinium gewonnener bestandteil der die mikrobielle adhesion verhindert

Info

Publication number: DE69931381T2
Application number: DE69931381T
Authority: DE
Inventors: Itzhak Ofek; Ervin Weiss; Yoel Kashman; Janina Goldhar; Nathan Sharon
Original assignee: Ramot at Tel Aviv University Ltd
Current assignee: Ramot at Tel Aviv University Ltd
Priority date: 1998-09-24
Filing date: 1999-09-17
Publication date: 2007-04-12
Anticipated expiration: 2019-09-18
Also published as: MXPA01003056A; EP1115387A2; WO2000016732A3; WO2000016732A2; US20020048611A1; EP1115387A4; EP1115387B1; EA200100259A1; ATE326229T1; US6303125B1; IL142183A0; US6843993B2; DE69931381D1; CA2345242A1; AU5992799A

Description

TECHNISCHES GEBIET
Gegenstand der Erfindung sind Pflanzenextrakte mit therapeutischen und anderen Anwendungen, und spezifischer ist es ein Extrakt von Saft aus Beeren der Pflanzengattung Vaccinium mit einer gegen Mikroorganismen wirkenden Antiadhäsionsaktivität.
HINTERGRUND DES STANDES DER TECHNIK
Die Adhäsion der Bakterien aneinander (intraspezifisch) und an andere bakterielle Spezies (intergenerische Coaggregation) sowie an Wirtsgewebe und -zellen trägt maßgeblich zur Progression und Pathologie einer Erkrankung bei, beispielsweise bei Zahnkaries und Zahnplaque sowie der Persistenz der Infektion mit Helicobacter pylori. Daher wäre es nützlich, Verbindungen zu haben, die die mikrobielle Adhäsion und Aggregation unterbrechen können.
Es wurde gezeigt, dass chronische Geschwüre durch Helicobacter pylori verursacht werden und dass das Vorhandensein von chronischen Geschwüren häufig mit Komplikationen in Verbindung gebracht wird, die zu Magenkrebs führen [Cover und Blaser, 1995]. H. pylori, zuerst 1983 aus einer Probe von Gastritis isoliert, ist ein gramnegativer, spiralförmiger, mikroaerophiler, schwer kultivierbarer Organismus. Im Allgemeinen weisen alle Patienten mit Magengeschwüren H. pylori auf und der Eradikation der Bakterien folgt der Rückgang der Gastritis [Cover und Blaser, 1995; Blaser, 1996]. Es wird angenommen, dass die Infektion mit H. pylori das Risiko von Magenkrebs ungefähr um das Sechsfache erhöht. Epidemiologische Studien zeigten, dass etwa 50% der Weltbevölkerung mit H. pylori infiziert sind (80% und 40% der Erwachsenen in Entwicklungsländern bzw. Industrieländern), doch nur ein Teil der infizierten Bevölkerung entwickelt klinische Symptome.
Die einzigartige Eigenschaft von Infektionen mit H. pylori ist die Persistenz des Erregers innerhalb des Magenschleims. Die Immunantwort auf die Infektion ist nicht in der Lage, die Infektion auszumerzen [Dunn et al., 1997]. Eine histologische Untersuchung zeigt, dass die Bakterien in naher Verbindung mit der Schleimschicht und darunter liegenden Magenzellen sind [Lee et al., 1993]. Die Mikroorganismen produzieren eine Anzahl an Adhäsinen, die die Anlagerung der Bakterien an die entsprechenden Rezeptoren, die sich im Magenschleim und im Epithelgewebe befinden, vermitteln [Boren und Falk, 1995; Dunn et al., 1997]. Sie agglutinieren Erythrozyten und es wurde gezeigt, dass die Fähigkeit des Anhaftens an das Magenepithel mit ihrer Fähigkeit korreliert, rote Blutzellen zu agglutinieren. Die Adhäsion zu Magenepithelzellen und zur Schleimschicht, die derartige Oberflächen überzieht, wird als der wichtigste Faktor angesehen, der dem Erreger ermöglicht eine persitente Infektion zu verursachen [Boren und Falk, 1995]. Daher ist es ein erfindungsgemäßes Ziel, Antiadhäsionsverbindungen zur Antiadhäsionstherapie, die eine Alternative zur konventionellen antibiotischen Behandlung sein kann, bereitzustellen.
Die bakterielle Aktivität von über 500 verschiedenen Bakterien wurde sowohl mit der menschlichen Zahnplaque als auch Zahnkaries (Kavitäten) in Verbindung gebracht. Die Adhäsion der Bakterien aneinander (intraspezifisch) und an andere bakterielle Spezies (intergenerische Coaggregation) sowie an orale Oberflächen ist einer der Hauptfaktoren, die zu Zahnplaque sowie Zahnkaries und Parodontalerkrankungen führen.
Es wäre von Nutzen, zusätzliche Antiaggregationsarzneimittel zur Verwendung in der Mundhygiene zu haben. United-States Patent 5 362 480, Spalten 1-3, liefert eine Diskussion über bakterielle Adhäsionen und Mundhygiene. Ofek und Doyle, 1994, liefern eine allgemeine Diskussion der bakteriellen Adhäsion, die hierin unter Bezugnahme in ihrer Gesantheit eingeschlossen ist.
Kurz, mikrobielle Akkumulationen an den Zahnoberflächen, als Zahnplaque bezeichnet, sind die Ursachen von sowohl Zahnkaries als auch Parodontalerkrankungen [Slots, 1977; Socransky et al., 1982; Savit und Socransky, 1984; Dzink et al., 1985, 1988]. Die Adhäsion von Bakterien an die pellikel-überzogene Zahnoberfläche scheint der erste Schritt bei der Bildung von Zahnplaque zu sein [Gibbons und van Houte, 1975; van Houte, 1980]. Orale Streptococci und zum Teil Actinomyces sp. sind die herausragenden frühen Besiedler der Zahnoberflächen [Nyvad und Kilian, 1990] und lagern sich offensichtlich an Makromoleküle an, die selektiv an den Zahnoberflächen adsobiert sind [Gibbons et al., 1991].
Mikroorganismen, die danach im Gebiet der Zahnfleischfurche zunehmend akkumulieren, meistens gramnegative anaerobe Bakterien, sind die späten Besiedler und es wird angenommen, dass sie eine zentrale Rolle bei der Initiierung und Progression von Parodontalerkrankungen spielen. In diesem zweiten Schritt coaggregieren die Bakterien oder haften aneinander. Die Hauptbestandteile von Zahnplaque sind Bakterien in einem Gerüst, das aus extrazellulären bakteriellen Polymeren und Speichelprodukten besteht. Die bakteriellen Spezies, die in der Zahnplaque vorliegen, sind heterogen und sie verändern sich zunehmend, wenn der klinische Zustand von normaler Gesundheit über Gingivitis zu fortgeschrittenen Stadien der Periodontitis verläuft [Moore und Moore 1994].
In-vitro-Studien der Coaggregation unter oralen Bakterien zeigten, dass Coaggregation im Wesentlichen das Ergebnis von Adhäsion ist, die durch spezifische Wechselwirkungen zwischen sich ergänzenden Molekülen an den Oberflächen der beteiligten Bakterien vermittelt wird [Kolenbrander et al., 1993]. Es wurde gefunden, dass mehrere hunderte von oralen bakteriellen Paaren an dieser Art multigenerischer Coaggregationsreaktionen in vitro beteiligt sind, doch der molekulare Mechanismus wurde nur für eine Hand voll an Paaren charakterisiert [Ofek und Doyle, 1994]. In vielen Fällen schließt die Coaggregation eine Lectin-Kohlenhydrat-Wechselwirkung ein, wobei die Zuckerreste an einem bakteriellen Partner mit einem Lectin an der Oberfläche des anderen bakteriellen Partners wechselwirken.
Basierend auf der Fähigkeit von einfachen und komplexen Zuckern zur Inhibierung der Coaggregation, wird nun eine Anzahl an ausgeprägten Spezifitäten erkannt, einschließlich Lactose-, Sialinsäure-, Rhamnose- und Fucose-inhibierbare Coaggregationen. Es sollte jedoch zur Kenntnis genommen werden, dass dennoch eine große Zahl an coaggregierenden Paaren durch keines der getesteten Kohlenhydrate inhibiert wird und daher könnten sie eine ausgeprägte Spezifität besitzen, die andere Oberflächenbestandteile als Lectin und ein Kohlenhydrat einschließt [Ofek und Doyle, 1994].
Daher ist es ein erfindungsgemäßes Ziel, Verbindungen bereitzustellen, die die interbakterielle Coaggregation oder Adhäsion von oralen Bakterien inhibieren oder vorhandene Coaggregation umkehren.
Derzeit liegen Einzelberichte und wissenschaftliche Nachweise vor, dass Preiselbeersaft oder einige Fraktionen davon, bakterielle Infektionen der Blase [Avorn et al., 1994], beschränkt auf Bakterien mit P-Fimbrien, inhibieren oder eindämmen. Zurzeit wird angenommen, dass diese Wirkung durch die Unterbrechung der Adhäsion der Bakterien mit P-Fimbrien an Säugetierzellen verursacht wird.
United-States Patente 5 002 759 und 5 362 480 offenbaren Antiadhäsionszusammensetzungen, die bei der Behandlung von oralen Bakterien verwendet werden können. Jedoch keines dieser Patente offenbart Zusammensetzungen aus Vaccinium und insbesondere aus der Preiselbeere oder Blaubeere und sie stellen nicht die erfindungsgemäße Zusammensetzung dar.
Das United-States Patent 5 185 153 stellt eine Zusammensetzung für die Verwendung in oralen Zusammensetzungen zur Lyse und Tötung von oralen Bakterien bereit. Das Patent 5 185 153 erlangt das Mittel nicht aus Preiselbeeren und es ist nicht die erfindungsgemäße Zusammensetzung.
Das United-States Patent 5 474 774 an Walker et al., ausgestellt am 12. Dezember 1995, offenbart einen Extrakt aus Preiselbeeren, das für eine Aktivität angereichert ist, die bakterielle Adhäsion an Oberflächen inhibiert. Jedoch ist der Extrakt nicht die erfindungsgemäße Zusammensetzung, wie hierin nachstehend im Vergleichsbeispiel 5 gezeigt ist. Weiter veranlasst das Verfahren des Patents 5 474 774 die Extraktion aus ganzen Preiselbeeren mit Mehrfachextraktionsschritten. Veröffentlichte Anmeldung PCT/US96/03978 (WO 96/30033) offenbart weiter einen Extrakt/eine Zusammensetzung. Jedoch wie hierin nachstehend gezeigt ist, ist die Zusammensetzung von PCT/US96/03978 nicht die erfindungsgemäße Zusammensetzung, wie hierin nachstehend im Vergleichsbeispiel 5 gezeigt ist.
Das United-States Patent 4 857 327 an Virdalm offenbart eine Zubereitung, die aus dem Rest der Beeren, nachdem das Fruchtfleisch entfernt wurde, isoliert wird. In der Technik der Saftherstellung wird das Material aus Virdalms Patent 4 857 327 als „Filterkuchen" bezeichnet, der nicht zur Herstellung von Saft verwendet wird. Saft stammt aus dem „Fruchtfleisch". Da folglich das Produkt aus Virdalms Patent 4 857 327 aus dem Rest nach dem Verwerfen des Fruchtfleisches und damit des Safts stammt [sic].
Das United-States Patent 5 683 678 an Heckert et al. offenbart eine orale Zusammensetzung, die aus Preiselbeeren isolierte Anthocyanine enthält. Jedoch ist der Extrakt nicht die erfindungsgemäße Zusammensetzung, wie hierin nachstehend im Vergleichsbeispiel 5 gezeigt ist.
Es ist ein erfindungsgemäßes Ziel, gewerblich hergestellten Saft oder hergestelltes Konzentrat aus Beeren der Pflanzengattung Vaccinium als Ausgangsquelle der Isolierung mit minimalen Extraktionsschritten einer Anticoaggregations-/-adhäsionsfraktion zu verwenden.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Erfindungsgemäß wird eine Nichtnahrungsmittelzusammensetzung bereitgestellt, die einen geeigneten Träger und eine wirksame Menge einer aus Saft von Beeren der Pflanzengattung Vaccinium isolierten aggregations-/adhäsionsinhibitorischen Fraktion umfasst. In einer Ausführungsform ist die Antiaggregationsfraktion aus Preiselbeersaft isoliert. Weiter ist erfindungsgemäß ein Verfahren zur Inhibierung von interbakterieller Adhäsion, einschließlich Schleimadhäsion von Helicobacter pylori, Coaggregation von oralen Bakterien und zur Umkehrung der Adhäsion von oralen Bakterien durch die Behandlung mit der isolierten Fraktion aus Preiselbeersaft und einem pharmazeutisch verträglichen Träger eingeschlossen.
Die Antiaggregations-/-adhäsionsfraktion im Wasserextrakt ist als polymerisch und folgendermaßen charakterisiert: mit einem Molekulargewicht ≥14 000; einer Elementaranalyse von Kohlenstoff 43–51%, Wasserstoff 4–5%, keinem Stickstoff, keinem Schwefel und keinem Chlor; einem NMR-Linienspektrum wie in den 2A und 2B ersichtlich ist; und einem Ultraviolettspektrum mit einem Absorptionspeak bei 280 nm in einer Lösung mit neutralem oder saurem pH, der in Alkalilösungen nicht vorhanden ist. Diese Fraktion zeigt adhäsionsinhibitorische Aktivität gegen Bakterien mit P-Fimbrien, orale Bakterien sowie eine Umkehrung der Aggregation/Adhäsion von oralen Bakterien und adhäsionsinhibitorische Aktivität gegen Helicobacter pylori.
Erfindungsgemäß wird weiter ein Verfahren zur Extraktion der erfindungsgemäßen Zusammensetzung bereitgestellt.
KURZE BESCHREIBUNG DER ABBILDUNGEN
Andere erfindungsgemäße Vorzüge werden leicht anerkannt werden, wenn die Erfindung durch Bezugnahme zu der folgenden detailierten Beschreibung in Verbindung mit der Betrachtung der begleitenden Abbildungen besser verstanden wird, worin:
1 eine schematische Darstellung der Isolierung der adhäsionsinhibitorischen aktiven Fraktion aus Preiselbeersaft darstellt, worin die Ausgangsmenge 1,5 Liter Preiselbeersaft-Cocktail oder 25 ml konzentrierten Preiselbeersaft beträgt.
2A–2C NMR-Linienspektren der adhäsionsinhibitorischen aktiven Fraktion aus Preiselbeersaft darstellen, worin (A) PF-1 darstellt (Protonen-NMR), (B) PF-1 nach der Entfernung von gebundenem Eisen darstellt (Protonen-NMR), und (C) ein Produkt der Säurehydrolyse darstellt (Kohlenstoff-NMR);
3 eine schematische Darstellung eines ELISA zur Bestimmung der Antiadhäsionsaktivität von Preiselbeerfraktionen gegen Bakterien mit P-Fimbrien darstellt;
4 eine schematische Darstellung eines Verfahrens zur Bestimmung der Umkehrung der Adhäsion (Coaggregation) und eines Verfahrens zum Anzeigen der Inhibierung der Adhäsion (Coaggregation) von oralen Bakterien darstellt;
5 ein Diagramm zur Darstellung der Ergebnisse von einem Anti-PF-1-Antikörper in einer ELISA-Titration darstellt;
6 ein Diagramm der Ergebnisse aus dem Stand der Technik darstellt, das eine Korrelation zwischen der Inhibierungsaktivität gegen Adhäsion von E. coli mit Typ-1-Fimbrien und dem Fructosegehalt verschiedener Säfte zeigt;
7 eine Standardkurve zur Bewertung der Zahl an Bakterien pro Well aus den ELISA-Werten darstellt; und
8 ein Diagramm darstellt, das die prozentuale Inhibierung der Adhäsion von E. coli mit P-Fimbrien an Erythrozytenmembrane (Ghosts) durch PF-1 zeigt.
9 ein Diagramm darstellt, das die Inhibierung der Adhäsion von H. pylori an menschliches Magenmuzin durch NDM zeigt. Menschliches Muzin (0,1 ml, 1 mg/ml Protein in Kochsalzlösung) wurde am Boden von Mikrotiterplatten immobilisiert und einer Helicobacter-Suspension in PBS oder PBS, das 0,1 mg/ml NDM enthält, ausgesetzt. Nach dem Herauswaschen von nichtgebundenen Bakterien wurde die Menge der am Muzin anhaftenden Bakterien durch Überwachung der Urease-Aktivität dieser Bakterien im Zeitablauf, wie durch einen kalorimetrischen Assay der Harnstoff-Hydrolyse bei OD 660 bestimmt wurde, quantifiziert.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Erfindungsgemäß wird eine Nichtnahrungsmittelzusammensetzung bereitgestellt, die einen geeigneten Träger und eine wirksame Menge der isolierten adhäsionsinhibitorischen Fraktion im Wasserextrakt aus Saft, der aus dem Fruchtfleisch von Beeren der Pflanzengattung Vaccinium isoliert ist, als den Wirkstoff zur Verwendung in der Mundhygiene und als ein gastrointestinales/enterisches Therapeutikum, umfasst. In einer Ausführungsform wird die isolierte adhäsionsinhibitorische Fraktion als PF-1 bezeichnet und ist durch Folgendes charakterisiert:
dass sie eine polymere Verbindung mit einem Molekulargewicht ≥14 000 ist; und
dass sie adhäsionsinhibitorische Aktivität gegen orale Bakterien, H. pylori, und einschließlich Coaggregationsinhibition und Umkehr der Coaggregation zeigt.
Die aktive Fraktion ist weiter durch Folgendes charakterisiert:
dass sie eine Elementaranalyse von Kohlenstoff 43–51%, Wasserstoff 4–5%, keinem Stickstoff, keinem Schwefel und keinem Chlor aufweist;
dass sie ein charakteristisches NMR-Linienspektrum, wie in den 2A und 2B ersichtlich ist, aufweist;
dass sie ein Ultraviolettspektrum mit einem Absorptionspeak bei 280 nm in einer Lösung mit neutralem oder saurem pH aufweist, der in Alkalilösungen nicht vorhanden ist; und
dass sie eine adhäsionsinhibitorische Aktivität für Mikroorganismen zeigt.
Die erfindungsgemäße Zusammensetzung kann an einen Patienten mit Bedarf für eine derartige Zusammensetzung zur Behandlung von Infektionen mit H. pylori (siehe hierin Beispiel 9 und 10) als ein Wirkstoff und ein pharmazeutisch verträglicher Träger oder ein pharmazeutisch verträgliches Verdünnungsmittel, sowie zur Mundhygiene verabreicht werden. Gewöhnlich liegt die Konzentration der isolierten adhäsionsinhibitorischen Fraktion zwischen 1 μg und 10 mg pro Milliliter.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Fraktion aus Preiselbeersaft oder -saftkonzentrat zubereitet. Jedoch können andere Spezies der Pflanzengattung Vaccinium bei der erfindungsgemäßen Anwendung verwendet werden, wie zum Beispiel, doch nicht auf diese beschränkend, Heidelbeere und Blaubeeren [Ofek et al., 1993, Seite 198, Tabelle 2].
Mundhygiene bezieht sich auf die Kontrolle von Zahnplaque, Zahnkaries und Parodontalerkrankungen (Gingivitis und Periodontitis).
Anti-H. pylori-Therapeutikum bezieht sich auf die Kontrolle der Mageninfektion mit H. pylori durch Antiadhäsionsverbindungen zur Antiadhäsionstherapie. Es bezieht sich weiter auf die Inhibierung der Adhäsion von H. pylori an menschliches Muzin, wie hierin in den Beispielen gezeigt ist.
Adhäsion bezieht sich auf die allgemeine Aggregation von Bakterien aneinander, an andere Zelloberflächen und an Nichtzelloberflächen, gewöhnlich durch Adhäsionsmoleküle an der Oberfläche der Bakterien. Weiter, wie hierin verwendet, bezieht sich Coaggregation auf die Aggregation/Adhäsion von zwei oder mehreren Bakterien, einschließlich Bakterien von verschiedenen Spezies, und Coaggregationsumkehr bezieht sich auf die Umkehrung der Aggregation oder Adhäsion (4) zwischen den Bakterien. Die Inhibierung von Coaggregation oder Adhäsion bezieht sich gewöhnlich auf die Prävention der anfänglichen Adhäsion oder Aggregation der Bakterien. Gewöhnlich wird Antiaggregation verwendet, um sich auf entweder eins von beiden oder sowohl auf Inhibierung als auch Umkehr der Coaggregation zu beziehen, sowohl bei intra- als auch interbakteriellen Spezies, wie durch den Rahmen der Verwendung angezeigt ist.
Coaggregationsinhibierung, wie hierin unter Bezugnahme zu oralen Bakterien verwendet, wird die in-vivo-Wirkung von Folgendem aufweisen: (i) Prävention der Ablagerung von neuen Organismen an die bereits gebildeten Aggregate in der Zahnplaque und (ii) Prävention der Reakkumulation und Rekolonisierung der Bakterien, die gerade durch die Zahnbürste oder andere Mittel entfernt wurden, durch die die Beseitigung aus der Mundhöhle durch den Speichelfluss/Spülung ermöglicht wird. Wenn dem nicht vorgebeugt wird, können sie sich wieder an die saubere Zahnoberfläche und/oder verbliebener Zahnplaque anlagern.
Die Umkehr der Coaggregation, wie hierin unter Bezugnahme zu oralen Bakterien verwendet, wird die in-vivo-Wirkung aufweisen, die vorhandene Zahnplaque sowohl an der Zahnoberfläche als auch an den Schleimoberflächen aktiv zu unterbrechen/lösen oder zu zerstreuen.
Coaggregationsinhibierung und Umkehr der Coaggregation, wie hierin unter Bezugnahme zu H. pylori verwendet, werden die in-vivo-Wirkung von Folgendem aufweisen: (i) Prävention der Ablagerung von neuen Organismen an die bereits gebildeten Aggregate und (ii) Prävention der Reakkumulation und Rekolonisierung der Bakterien an Schleimoberflächen und (iii) Störung der Adhäsion der Bakterien mit der Schleimschicht und darunter liegenden Magenzellen und Störung ihrer Adhäsine, die die Anlagerung der Bakterien an die entsprechenden Rezeptoren, die sich im Magenschleim und im Epithelgewebe befinden, vermitteln.
P-Fimbrien-Adhäsionsmoleküle binden spezifisch an eine Gruppe von Rezeptoren, die als P-Blutgruppen-Antigene identifiziert wurden. Der/Die Rezeptor(en) liegt/liegen an der Oberfläche verschiedener Typen von menschlichen Zellen vor, unter anderem vom Epithelgewebe des Urogenitaltrakts und von roten Blutzellen, und vermittelt/vermitteln die Anlagerung der Bakterien und die anschließende Kolonisierung des Epithelgewebes des Urogenitaltrakts. E. coli mit P-Fimbrien verursachen die Agglutination (HA) von menschlichen roten Blutzellen (RBC) [Ofek und Doyle; 1994].
Die isolierte adhäsionsinhibitorische Fraktion PF-1 ist in Butanol und Ethylacetat unlöslich und ist mit Säure ausfällbar. Sie kann erneut in Wasser ohne Verlust von Aktivität gelöst werden. Die Fraktion verliert nach Erhitzen in sauren Lösungen teilweise Aktivität. Sie zeigt eine positive Reaktion in einem Phenol-Schwefelsäure-Test, wie hierin in den nachstehenden Beispielen gezeigt ist.
Erfindungsgemäß wird ein Verfahren zur Inhibierung und Umkehrung der intergenerischen Coaggregation/Adhäsion von Bakterien durch Behandlung mit PF-1 (oder PF-2 oder NDM) und einem pharmazeutisch verträglichen Träger bereitgestellt. Die Konzentration von PF-1 im Träger liegt zwischen 1 μg/ml und 10 mg/ml, mit einer bevorzugten Ausführungsform zwischen 10 μg/ml und 250 μg/ml. Es wurde gezeigt, dass zur Inhibierung der Coaggregation ein Bereich zwischen 10 μg/ml und 100 μg/ml wirksam ist. Es wurde gezeigt, dass zur Umkehr der Coaggregation ein Bereich zwischen 100 μg/ml und 250 μg/ml wirksam ist. Für NDM werden die äquivalenten PF-1-Einheiten, die in der Zubereitung enthalten sind, bestimmt und die Konzentration wird entsprechend eingestellt. Für PF-2 wird die vergleichbare PF-1-Einheit bestimmt und die Konzentration wird entsprechend eingestellt (Siehe Tabelle 8).
Die Behandlung von oralen Bakterien mit den erfinderischen Zusammensetzungen kann einen Bestandteil einer Zahnpaste, Zahncreme oder -gel, Zahnpulver oder Mundwasser darstellen und während dem regelmäßigen Bürsten angewendet werden oder die Zusammensetzungen können als eine getrennte Behandlung formuliert und verpackt sein und getrennt vor, nach und/oder zwischen den regelmäßigen Zeiten des Putzens angewendet werden. Die Zusammensetzungen können durch Bürsten, Spülen, Kauen und mit wirksamen oralen Spülungssystemen und jedweden anderen Mitteln, die nach dem Stand der Technik bekannt sind, angewendet werden. Weiter können Kaugummis und Lutschtabletten, wie sie nach dem Stand der Technik bekannt sind, verwendet werden.
Bei der Behandlung der Infektion mit H. pylori bei Patienten mit derartigen Infektionen oder mit anderen bakteriellen Infektionen, die aus der Zusammensetzung Nutzen ziehen würden, kann die Antiadhäsionsfraktion, PF-1, PF-2 oder NMD, auf verschiedenen Wegen, die für die gastrointestinale Therapie geeignet sind, verabreicht werden. Es sollte zur Kenntnis genommen werden, dass sie als die Verbindung oder als pharmazeutisch verträgliches Salz verabreicht werden kann und allein oder als ein Wirkstoff in Kombination mit pharmazeutisch verträglichen Trägern, Verdünnungsmitteln, Hilfsmitteln und Vehikeln verabreicht werden kann. Die Zusammensetzung wird gewöhnlich oral verabreicht werden. Konventionelle Verfahren, wie zum Beispiel die Verabreichung der Verbindungen in Tabletten, Suspensionen, Lösungen, Emulsionen, Kapseln, Pulver, Sirupen und dergleichen, sind verwendbar. Bekannte Methoden, die die Antiadhäsionszusammensetzung oral oder intravenös austragen und die biologische Aktivität beibehalten, sind bevorzugt.
Formulierungen, die subkutan, topisch oder parenteral oder durch intrathekale Methoden und Infusionsmethoden verabreicht werden können, werden erfindungsgemäß auch erwogen, sowie Suppositorien und Implantate. Die pharmazeutisch verträglichen Träger, Verdünnungsmittel, Hilfsmittel und Vehikel sowie Implantat-Träger bezeichnen gewöhnlich inerte, nichttoxische feste oder flüssige Füllstoffe, Verdünnungsmittel oder verkapselndes Material, die nicht mit dem erfindungsgemäßen Wirkstoff reagieren. Die pharmazeutischen Formulierungen, die zur Injektion geeignet sind, schließen sterile wässrige Lösungen oder Dispersionen und sterile Pulver zur Wiedereinsetzung in sterilen injizierbaren Lösungen oder Dispersionen ein. Der Träger kann ein Lösungsmittel oder dispersierendes Medium sein, das beispielsweise folgende enthält: Wasser, Ethanol, Polyol (zum Beispiel Glycerol, Propylenglycol, flüssiges Polyethylenglycol und desgleichen), geeignete Mischungen davon und pflanzliche Öle.
Ein richtiges Fließvermögen kann beispielsweise durch die Verwendung einer Beschichtung, wie zum Beispiel Lecithin, durch die Beibehaltung der erforderlichen Partikelgröße im Fall einer Dispersion und durch die Verwendung von oberflächenaktiven Stoffen aufrechterhalten werden. Nichtwässrige Vehikel, wie zum Beispiel ein Baumwollsamenöl, Sesamöl, Olivenöl, Sojaöl, Maiskeimöl, Sonnenblumenöl oder Erdnussöl und Ester, wie zum Beispiel Isopropylmyristat, können auch als Lösungsmittelsysteme für Verbindungszusammensetzungen verwendet werden. Zusätzlich können verschiedene Additive, die die Stabilität, Sterilität und Isotonie der Zusammensetzungen fördern, einschließlich antimikrobieller Konservierungsmittel, Antioxidationsmittel, Chelatbildner und Puffer, zugegeben werden. Die Prävention der Wirkung von Mikroorganismen kann durch verschiedene antibakterielle Mittel und Antipilzmittel, beispielsweise Parabene, Chlorbutanol, Phenol, Sorbinsäure und desgleichen, gewährleistet werden. In vielen Fällen wird es wünschenswert sein, isotonische Mittel, beispielsweise Zucker, Natriumchlorid und desgleichen, einzuschließen. Ein anhaltende Absorption der injizierbaren pharmazeutischen Form kann durch die Verwendung von Mitteln bewirkt werden, die die Absorption verzögern, beispielsweise Aluminiummonostearat und Gelatine. Erfindungsgemäß müsste jedoch jedwedes verwendete Vehikel, Verdünnungsmittel oder Additiv mit den Verbindungen verträglich sein.
Beispiele von Zuführungssystemen, die erfindungsgemäß nützlich sind, schließen Folgende ein: US-Patent Nummern 5 225 182; 5 169 383; 5 167 616; 4 959 217; 4 925 678; 4 487 603; 4 486 194; 4 447 233; 4 447 224; 4 439 196 und 4 475 196. Viele andere derartige Implantate, Zuführungssysteme und Module sind der Fachperson gut bekannt.
In Beispiel 1, wie hierin nachstehend ersichtlich ist, ist ein Verfahren zur Isolierung einer Fraktion aus Preiselbeersaft, als die exemplarische Spezies von Vaccinium, beschrieben, die adhäsionsinhibitorische Aktivität gegen Bakterien mit P-Fimbrien und orale Bakterien zeigt. Das Verfahren schließt die Schritte des gründlichen Dialysierens von Preiselbeersaft oder eines Saftkonzentrats gegen bidestilliertes Wasser unter Verwendung eines Dialyseschlauchs mit einem Cut-off des Molekulargewichts von 12 000-14 000 ein. Das nicht-dialysierbare Material (NDM), das im Dialyseschlauch verbleibt, wird dann lyophilisert. Das lyophilisierte NDM wird dann an einer Polyacrylamid-Harzsäule fraktioniert und die aktive Fraktion wird mit Wasser von der Säule eluiert, lyophilisiert und als PF-1 gekennzeichnet, wie in 1 gezeigt ist. In den Beispielen hierin wird entweder die NDM- oder die PF-1-Fraktion, wie angegeben, verwendet.
Weiter werden in Beispiel 8 zusätzliche Zubereitungs-/Reinigungsschritte bereitgestellt. Bei der Eluierung der Harzsäule kann 0,1 M Ammoniak verwendet werden. Antragsteller haben ermittelt, dass einige Harz-Chargen bessere Ausbeuten bereitstellen, wenn mit Ammoniak anstelle von Wasser eluiert wird, wie in der Technik bekannt ist.
NDM, wie in den Beispielen gezeigt ist, kann erfindungsgemäß zur Inhibierung oder Umkehrung der intergenerischen Coaggregation/Adhäsion von oralen Bakterien und in einem pharamzeutisch verträglichen Träger verwendet werden. Die Konzentration von NDM in dem Träger beträgt jedoch zwischen 25 μg/ml und 100 mg/ml. Zur Inhibierung der Coaggregation kann ein Bereich zwischen 0,05 mg/ml und 0,4 mg/ml verwendet werden. Zur Umkehr der Coaggregation kann ein Bereich zwischen 1 mg/ml und 4 mg/ml verwendet werden.
Erfindungsgemäß wird auch ein Antikörper bereitgestellt, der gegen eine isolierte adhäsionsinhibitorische Fraktion, PF-1, aus Preiselbeersaft gerichtet ist. Der Antikörper kann entweder polyklonal oder monoklonal sein.
Die Antikörper sind gegen die isolierte PF-1 (oder Teile von PF-1, die auch aus NDM und PF-2 isoliert werden können), das als Immunogen verwendet wird, hergestellt. Das Material kann zur Herstellung von Antikörpern durch die Standard-Technologie zur Herstellung von Antikörpern verwendet werden, die der Fachperson gut bekannt ist, wie allgemein beschrieben in: Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1988 und Borrebaeck, Antibody Engineering – A Practical Guide, W.H. Freeman and Co., 1992.
Zur Herstellung von polyklonalen Antikörpern wird ein Wirt, zum Beispiel ein Kaninchen oder eine Ziege, mit PF-1, im Allgemeinen mit einem Hilfsmittel und, falls nötig, an einen Träger gekoppelt immunisiert; die Antikörper gegen PF-1 werden aus den Sera gesammelt. Spezieller wurden die Antikörper gegen PF-1 in Kaninchen durch Beimpfung mit Mischungen hergestellt, die mit Formalin getötete Bakterien von E. coli mit P-Fimbrien (Stamm IHE-1002, in einigen Berichten wird der Stamm als IHE oder IHI bezeichnet) und PF-1 enthielten. Die Mischungen werden 1 Stunde bei 37°C inkubiert, um den Bakterien die Absorption der Substanz zu ermöglichen. Die Immunisierung wurde durch intravenöse Injektionen der Mischungen, die ansteigende Konzentrationen von Bakterien und PF-1 (10⁸–10⁹ Bakterien und 0,25–5 mg/ml PF-1/Injektion) enthielten, dreimal in einer Woche über vier Wochen ausgeführt. Zwei Wochen nach der letzten Injektion wird das Serum gesammelt und durch ELISA analysiert.
Zur Herstellung von monoklonalen Antikörpern schließt die Methode die Hyperimmunisierung eines geeigneten Spenders mit der PF-1, wie vorstehend, im Allgemeinen einer Maus, und die Isolierung der Milzzellen, die den Antikörper produzieren, ein. Diese Zellen sind an eine Zelle fusioniert, die unsterblich ist, wie zum Beispiel eine Myelomazelle, um einen fusionierten Zellhybrid bereitzustellen, der unsterblich ist und den benötigten Antikörper absondert. Die Zellen werden dann im Ganzen kultiviert und die monoklonalen Antikörper werden aus den Zellmedien zur Verwendung geerntet.
Der Antikörper kann an ein Substrat an einem festen Träger gebunden sein oder mit einer detektierbaren Einheit konjugiert sein oder sowohl gebunden als auch konjugiert sein, wie in der Technik gut bekannt ist. (Für eine allgemeine Diskussion zur Konjugation von fluoreszierenden oder enzymatischen Einheiten siehe Johnstone & Thorpe, Immunochemistry in Practice, Blackwell Scientific Publications, Oxford, 1982.) Das Binden von Antikörpern an ein Substrat an einem festen Träger ist ebenfalls gut in der Technik bekannt. (für eine allgemeine Diskussion siehe Harlow & Lane Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Publications, New York, 1988 und Borrebaeck, Antibody Engineering – A Practical Guide, W.H. Freeman and Co., 1992) Die erfindungsgemäß erwogenen detektierbaren Einheiten können Folgende einschließen, sind aber nicht auf diese beschränkt: fluoreszierende, metallische, enzymatische und radioaktive Marker, wie zum Beispiel Biotin, Gold, Ferritin, alkalische Phosphatase, β-Galaktosidase, Peroxidase, Urease, Fluorescein, Rhodamin, Tritium, ¹⁴C und Iodierung.
ELISAs sind Immunassays, die zur Identifizierung und Titrierung des Anti-PF-1-Antikörpers sowie der Menge von PF-1 in einer Zubereitung eingesetzt werden können. ELISA-Assays sind Fachpersonen gut bekannt. Es können sowohl polyklonale als auch monoklonale Antikörper im ELISA-Assay eingesetzt werden. Wo es angebracht ist, können auch andere Immunassays, wie zum Beispiel Radioimmunassays (RIA) und Immunoblots, verwendet werden, wie sie den Fachpersonen gut bekannt sind. Erhältliche Immunassays sind ausgiebig im Patent und in der wissenschaftlichen Literatur beschrieben. Siehe beispielsweise United-States Patente 3 791 932; 3 839 153; 3 850 752; 3 850 578; 3 853 987; 3 867 517; 3 879 262; 3 901 654; 3 935 074; 3 984 533; 3 996 345; 4 034 074; 4 098 876; 4 879 219; 5 011 771 und 5 281 521 sowie Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Springs Harbor, New York, 1989.
Erfindungsgemäß wird eine Zusammensetzung bereitgestellt, die eine Wirkungsmenge einer isolierten adhäsionsinhibitorischen Fraktion aus Vaccinium, in einer bevorzugten Ausführungsform die isolierte adhäsionsinhibitorische Fraktion aus Preiselbeersaft, PF-1, und einen pharmazeutisch verträglichen Träger, der nicht mit den erfindungsgemäßen Wirkstoffen reagiert und der die erfindungsgemäße biologische Aktivität nicht erniedrigt, umfasst.
Die Zusammensetzung wird gemäß der guten medizinischen Praxis verabreicht und dosiert, wobei der klinische Zustand des einzelnen Patienten, die Stelle und das Verfahren der Verabreichung, die Zeitplanung der Verabreichung, das Alter, Geschlecht, Körpergewicht und andere Faktoren des Patienten, die dem Arzt bekannt sind, berücksichtigt werden. Die pharmazeutisch „wirksame Menge" für Zwecke hierin wird durch derartige Betrachtungen, wie sie in der Technik bekannt sind, bestimmt. Die Menge muss zum Erzielen einer Verbesserung wirksam sein, einschließlich, doch nicht auf diese beschränkt, Inhibierung und/oder Umkehr von oraler intra- und interbakterieller Coaggregation der Spezies, wie sie in den hierin nachstehenden Beispielen beschrieben sind, und Verbesserung oder Eliminierung von Symptomen und anderen Indikatoren, die von Fachpersonen als geeignete Maße ausgewählt sind.
Erfindungsgemäß wird eine Nichtnahrungsmittelzusammensetzung bereitgestellt, die einen geeigneten Träger und eine isolierte adhäsionsinhibitorische Fraktion aus Vaccinium umfasst. In einer bevorzugten Ausführungsform wird eine wirksame Menge der isolierten adhäsionsinhibitorischen Fraktion PF-1 verwendet. Jedoch kann in einer alternativen Ausführungsform NDM verwendet werden.
Die bevorzugten erfindungsgemäßen Zusammensetzungen zur Mundhygiene liegen in Form von Zahnpaste (Zahncreme, -gel oder Zahnpulver) vor, sowie als Mundwasser, Spülungsformulierungen für vor und nach dem Putzen, Kaugummis und Lutschtabletten.
Inhaltsstoffe, die üblicherweise in Zahnpasten und Gelen eingeschlossen sind, können in erfindungsgemäßen Zahnpaste- und Gelzusammensetzungen, wie in der Technik bekannt ist, verwendet werden. Geeignete Inhaltsstoffe schließen Schmirgelstoffe, Schäumungsmittel, Geschmackstoffe, Befeuchtungsmittel, Bindemittel, Süßungsmittel und Wasser ein und sind im Allgemeinen nachstehend hierin beschrieben.
Mundwässer bestehen üblicherweise aus einer Wasser/Alkohol-Lösung, Aroma, Befeuchtungsmittel, Süßstoff, Schaummittel und Farbstoff.
Schmirgelstoffe, die in den erfindungsgemäßen Zusammensetzungen verwendet werden können, schließen Aluminiumoxid und Hydrate davon, wie zum Beispiel alpha-Aluminiumoxid-Trihydrat, Magnesiumtrisilikat, Magnesiumcarbonat, Aluminiumsilikate, wie zum Beispiel kalziniertes Aluminiumsilikat und Aluminiumsilikat, Calciumcarbonat, Zirkoniumsilikat, Polymethylmethacrylat, pulvriges Polyethylen, Kieselsäure-Xerogele, -Hydrogele und -Aerogele und desgleichen ein. Als Schmirgelstoffe sind auch Folgende geeignet: Calciumpyrophosphat, unlösliches Natriummetaphosphat, Calciumcarbonat, Dicalciumorthophosphat, partikuläres Hydroxyapatit und desgleichen. In Abhängigkeit von der Form, als die die orale Zusammensetzung zu nehmen ist, kann der Schmirgelstoff in einer Menge von 0 bis 70 Gewichts-% vorliegen, bevorzugt 1 bis 70 Gewichts-%, bevorzugter von 10 bis 70 Gewichts-%, insbesondere für Zahnpasten.
Für die erfindungsgemäße Verwendung erwogene Befeuchtungsmittel schließen Glycerol, Polyol, Sorbitol, Polyethylenglycole, Propylenglycol, hydrierte, teilweise hydrolysierte Polysaccharide und desgleichen ein. Die Befeuchtungsmittel liegen im Allgemeinen in Mengen von 0 bis 80 Gewichts-% vor, bevorzugt 5 bis 70 Gewichts-%, insbesondere für Zahnpasten. Verdickungsmittel können in Zahnpaste-Cremes und -Gelen zu 0,1 bis 20 Gewichts-% vorliegen.
Für die Verwendung in erfindungsgemäßen Zusammensetzungen geeignete Bindemittel schließen Hydroxyethylcellulose (Natrosol^®), Natriumcarboxymethylcellulose und Hydroxypropylcellulose (Klucel^®), sowie Xanthan Gummi, irisches Moos und Tragant-Gummi ein. Bindemittel können in der erfindungsgemäßen Zahnpaste in Höhe von 0,01 bis 10% vorliegen.
Geeignete Schaummittel schließen Seife, anionische, kationische, nichtionische, amphotere und/oder zwitterionische oberflächenaktive Mittel ein. Diese können in Höhe von 0 bis 15 Gewichts-%, bevorzugt 0,1 bis 15 Gewichts-%, bevorzugter 0,25 bis 10 Gewichts-% vorliegen.
Bestimmte Pyrophosphat- und andere Polyphosphatsalze wurden in US-Patent Nr. 4 515 772 und 4 627 977 als nützliche Mittel gegen Zahnstein offenbart. Diese schließen Di- und Tetraalkalimetallpyrophosphate ein, worin die Alkalimetalle bevorzugt aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus Natrium und Kalium besteht. Polyphosphatsalze können im Allgemeinen in der Menge eingeschlossen sein, sodass sie mindestens 0,5% Polyphosphatanionen bereitstellt, das obere Niveau etwa 10% ist, bevorzugt etwa 7,5% ist.
Verschiedene anionische Polymere können als Mittel gegen Zahnstein und/oder Plaque eingesetzt werden. Geeignete Polymere schließen Carboxylatpolymere, Sulfonatpolymere, Polymere, die eine Sulfonat- und eine Carboxylat-Einheit enthalten, Carboxylatpolymere, die Phosphinat-Einheiten enthalten, und Mischungen davon ein. Einige, in den vorliegenden Zusammensetzungen geeignete Carboxylatpolymere sind von Gaffar et al., US-Patent Nr. 4 808 400, beschrieben, die hierin unter Bezugnahme eingeschlossen sind. Andere Carboxylatpolymere, die mono- und disubstituierte Hypophosphit-Einheiten entlang der Polymerhauptkette enthalten, sind in einem US-Patent Nr. 5 011 682 beschrieben, die hierin unter Bezugnahme eingeschlossen sind. Die anionischen Polymere können in einer Höhe von etwa 0,01 bis etwa 10%, bevorzugt von etwa 0,05 bis etwa 5%, eingeschlossen sein.
Zinksalze sind als Mittel gegen Zahnstein und gegen Plaque im US-Patent Nr. 4 100 269 und in den US-Patenten Nr. 4 416 867, 4 425 325 und 4 339 432 offenbart. Bevorzugte erfindungsgemäße Zusammensetzungen schließen Zinksalze, insbesondere Zinkcitrat ein. Die Zinkverbindungen können in den Zusammensetzungen in Mengen vorliegen, die ausreichend sind, um etwa 0,01% bis etwa 4% Zink, oder bevorzugt etwa 0,05% bis etwa 1% Zinkionen zu liefern.
In Zahnpasten verwendete Fluoridquellen, wie zum Beispiel Natriumfluorid, Zinnfluorid, Natriummonofluorphosphat, Zinkammoniumfluorid, Zinnammoniumfluorid, Calciumfluorid und Cobaltammoniumfluorid, können zur Unterstützung gegen Karies eingeschlossen werden und werden bevorzugt eingeschlossen. Bevorzugte erfindungsgemäße Zusammensetzungen schließen die Fluoridquelle ein. Fluoridionen werden üblicherweise in einer Höhe von 0 bis 1500 ppm bereitgestellt, bevorzugt 50 bis 1500 ppm, obwohl höhere Niveaus bis zu etwa 3000 ppm verwendet werden können.
Zur Verwendung im vorliegenden Zahnpflegemittel geeignete Süßstoffe, bevorzugt in Höhen von etwa 0,1% bis 5%, können Saccharin und andere nichtkalorische Süßstoffe, wie sie in der Technik bekannt sind, einschließen. Aromen sind gewöhnlich in niedrigen Mengen, wie zum Beispiel von 0,01 bis etwa 5 Gewichts-%, vorzugsweise von 0,1% bis 5%, in Zahnpasten eingeschlossen. Titandioxid ist ein geeigneter Weißmacher, doch andere, die in der Technik bekannt sind, können verwendet werden. Für Zahnpflegemittel geeignete Färbemittel/Farbstoffe, d.h. FD&C Blau Nr. 1, FD&C Gelb Nr. 10, FD&C Rot Nr. 40, usw., oder andere in der Technik bekannte, können in den erfindungsgemäßen Zahnpflegemitteln eingesetzt werden.
Wasserlösliche antibakterielle Mittel, wie zum Beispiel Chlorhexidindigluconat, Hexetidin, Alexidin, antibakterielle quartäre Ammoniumverbindungen und wasserlösliche Quellen bestimmter Metallionen, wie zum Beispiel Zink, Kupfer, Silber und Zinn (z.B. Zink-, Kupfer- und Zinnchlorid und Silbernitrat) können auch eingeschlossen sein.
Verschiedene andere optionale Inhaltsstoffe können in den erfindungsgemäßen Zusammensetzungen eingeschlossen sein, wie zum Beispiel Konservierungsmittel, Vitamine, wie zum Beispiel Vitamin C und E, andere Mittel gegen Plaque, wie zum Beispiel Zinnsalze, Kupfersalze, Strontiumsalze und Magnesiumsalze. Es können auch den pH einstellende Mittel, Mittel gegen Karies, wie zum Beispiel Harnstoff, Calciumglycerophosphat, Natriumtrimetaphosphat, Silikonpolymere, Pflanzenextrakte, Desensibilisierungsmittel für empfindliche Zähne, wie zum Beispiel Kaliumnitrat und Kaliumcitrat, und Mischungen davon eingeschlossen sein.
Casein und/oder seine Hydrolysate können als Mittel gegen Karies eingeschlossen sein, z.B. in einer Höhe von 0,01 bis 20 Gewichts-%, bevorzugt 0,1 bis 10 Gewichts-%.
Die vorstehend aufgeführten, entsprechenden Verbindungen, die in Zahnpasten verwendet werden, sind im Allgemeinen innerhalb der vorstehenden Bereiche auch für Mundwässer geeignet. Das Mundwasser kann Ethanol in einer Höhe von 0 bis 60 Gewichts %, bevorzugt von 5 bis 30 Gewichts-%, einschließen.
Erfindungsgemäß wird auch eine angereicherte Nahrungsmittelzusammensetzung zur Mundhygiene bereitgestellt, die einen geeigneten Nahrungsmittelträger und eine wirksame Menge einer isolierten adhäsionsinhibitorischen Fraktion aus Vaccinium umfasst. In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Nahrungsmittelträger ein Fruchtsaft und die isolierte adhäsionsinhibitorische Fraktion ist PF-1. Der Nahrungsmittelträger ist so ausgewählt, dass er nicht die erfindungsgemäße biologische Aktivität erniedrigt. Die Konzentration der adhäsionsinhibitorischen Fraktion in dem Nahrungsmittelträger beträgt zwischen 10 μg/ml und 10 mg/ml oder das Äquivalentgewicht/die Volumenkonzentration für nichtflüssige Nahrungsmittel.
Die Fähigkeit von Preiselbeerprodukten, die Adhäsion von E. coli an Oberflächen, wie zum Beispiel Blasenzellen, zu inhibieren, wurde bereits 1984 von Sobota [Sobota, 1984; Schmidt und Sobota, 1988] gezeigt. Antragsteller haben diese Ergebnisse mit Ocean Spray Preiselbeersaft-Cocktail bestätigt [Zafriri et al., 1989; Ofek et al., 1991; Ofek et al., 1993]. Antragsteller bestätigten, dass Fructose die durch Typ-1-Fimbrien vermittelte Adhäsion von E. coli inhibiert (6 [Ofek et al., 1993].
Es wurde auch ein Inhibitor, PF-1, gefunden, der eine polymere Substanz ist, die die Mannose-resistente Adhäsion von Urogenital-Isolaten von E. coli an Oberflächen, wie zum Beispiel menschlichen Erythrozyten, inhibiert. Die Spezifität der Adhäsion von einigen dieser Isolate wurde durch P-Fimbrien vermittelt. PF-1 hat jedoch keinen Einfluss auf die Adhäsion von diarrhoischen Isolaten von E. coli.
Die Spezifität der Adhäsion von E. coli unterscheidet sich von der der oralen Bakterien [Ofek und Doyle, 1994; Offek, 1996]. Beispielsweise sind viele der charakteristischen oralen Adhäsine gegenüber Mannose resistent, während sie für Galactose oder andere Kohlenhydrate empfindlich sind. Daher ist es unmöglich, aus den mit E. coli durchgeführten Inhibierungsstudien auf die Reaktion der Preiselbeerzubereitung in Untersuchungen, die orale Bakterien einschließen, zu schließen. Es war daher unerwartet, dass PF-1 eine Aktivität gegen orale Bakterien zeigte.
In einer anfänglichen Arbeit wurde PF-1 auf ihre Fähigkeit zur Inhibierung (durch Zugabe der PF-1-Zubereitung zu einem Partner der bakteriellen Paare vor dem Mischen mit dem anderen) oder Umkehrung (durch ihre Zugabe zu einer gebildeten Coaggregation) der Coaggregation von ausgewählten bakteriellen Paaren, einschließlich der Mitglieder der folgenden bakteriellen Spezies getestet: Gemella morbillorum; Streptococcus oralis; Streptococcus sanguis; Actinomyces israelii, Actinomyces naeslundii; Capnocytophaga ochracea, Capnocytophaga sputigena; Prevotella intermedius, Porphyromonas gingivalis; Fusobacterium nucleatum und Actinobacillus actinomycetemcomitans. Für die meisten Paare lag die zur Inhibierung nötige, niedrigste Konzentration von PF-1 im Bereich von 50 bis 10 μg/ml, während sie zur Umkehr der Coaggregation im Bereich von 125 bis 200 μg/ml lag. Die Coaggregation von mehreren Paaren (z.B. F. nucleatum und A. naeslundii) wurde durch PF-1 aus Preiselbeere umgekehrt, obwohl sie gegen alle getesteten Kohlenhydrate resistent waren. Das aus Saft stammende Material kehrte die Coaggregation einer Anzahl an getesteten Paaren nicht um, einschließlich der Mitglieder von Streptococcus, Fusobacteria, Capnocytophaga und Actinomyces, was die Spezifität des Inhibitors anzeigt.
Wie in Tabelle 4 gezeigt ist, zeigte die umfangreichere Testung mit nicht-dialysierbarem Material (NDM) aus Preiselbeere (PF-1 ist darin enthalten) das gleiche Muster. Von insgesamt 37 getesteten bakteriellen Paaren zeigten 29 (78,1%) eine Umkehr von intergenerischer oral-bakterieller Adhäsion (Coaggregation) durch NDM. Das NDM wurde bei einer Konzentration von ≤2500 μg/ml verwendet. Dreizehn (36%) zeigten keine Umkehr der Coaggregation.
Die vorstehende Diskussion liefert die faktische Grundlage für die Herstellung und das Verwendungsverfahren einer isolierten adhäsionsinhibitorischen Fraktion aus Preiselbeersaft. Die mit der vorliegenden Erfindung verwendeten Verfahren und der erfindungsgemäße Nutzen kann durch die folgenden uneingeschränkten Beispiele und begleitenden Figuren gezeigt werden.
BEISPIELE
ALLGEMEINE VERFAHREN:
Reagenzien: Preiselbeersaft, wie er gewerblich erhältlich ist, wird verwendet und konzentriertes Material der Preiselbeere (CCM), das direkt von Ocean Spray Cranberries Inc., Lackeville-Middleboro MA 02349, erhalten wird, wird zur Isolierung von PF-1 verwendet. Verwendete bakterielle Stämme stammen aus der menschlichen Zahnfleischfurche (P. Kolenbrander, NIDR, NIH). Alle Bakterien wuchsen bei 37°C unter anaeroben Bedingungen (GasPack Anaerobic System, BBL) in Schaedler-Broth, mit der Ausnahme von F. nucleatum PK1594, das entweder in Schaedler-Broth oder Hirn-Herz-Bouillon (BBL) wächst. Die Zellen werden geerntet, mit Coaggregations-Puffer (CAB: 0,001 M Tris, 0,0001 M CaCl₂, 0,0001 M MgCl₂, 0,15 M NaCl, 0,02% NaN₃, auf pH 8,0 eingestellt) gewaschen und bis zur Verwendung bei 4°C aufbewahrt.
Visueller Coaggregations-Assay [Kolenbrander, 1988; Kolenbrander et al., 1989; Kolenbrander et al., 1993; Weiss et al., 1987]: Die Zellsuspensionen werden auf eine optische Dichte von 1,5 bei 400 nm (UV-Vis-Spektrophotometer, Shimadzu) eingestellt, was ungefähr 10⁸ Zellen/ml entspricht. Die entsprechenden Partner (siehe Tabelle 4; 4) zu jeweils 50 μl werden 10 Sekunden heftig zusammen gemischt. Es wird eine visuelle Beurteilungsskala von 0 bis 4 verwendet, um die Reaktionen einzuteilen. 0 = gleichmäßig trübe Suspension ohne sichtbare Aggregate, zeigt keine Coaggregation an; 1 = einige Coaggregate; 2 = gebildete Coaggregate verbleiben in Suspension; 3 = Aggregate bilden große Klumpen und fallen aus der Lösung aus, doch die Flüssigkeit bleibt lichtundurchlässig; und 4 = maximales Klumpen mit einem verbleibenden klaren Überstand.
Visueller Coaggrregations-Assay zur Testung von Coaggregationsinhibitoren:
Die Testung der Inhibierung von Coaggregation erfolgte durch Vorinkubieren von 40 μl von einer der zwei bakteriellen Testspezies mit 20 μl der Reihenverdünnungen der Preiselbeerfraktion für 30 Minuten, woran sich die Zugabe von 40 μl der anderen bakteriellen Spezies anschloss. Die Coaggregation wurde, wie vorstehend beschrieben, beurteilt.
Die Testung der Umkehr der Coaggregation erfolgte durch Inkubieren von 40 μl der bakteriellen Suspension von einer Spezies mit 40 μl Bakterien der anderen Spezies. Die Mischung wird unter konstanter Bewegung 30 Minuten inkubiert, woran sich die Zugabe von 20 μl der Reihenverdünnungen der Preiselbeerfraktion anschließt. Nach weiterem Inkubieren für 15 Minuten wird die Coaggregation beurteilt.
Hämagglutination (HA): P-Fimbrien exprimierende E. coli IHE, die auf TSA-Agar 48 Stunden bei 37°C wuchsen, werden in PBS-Puffer geerntet und die bakterielle Suspension wird in 96-Well (U-förmig) Mikrotiterplatten (50 μl/Well) zweifach reihenverdünnt. In jedes Well werden 25 μl einer 5% menschlichen Erythrozyten(Gruppe A)-Suspension verteilt. Nach Inkubieren von 30 Minuten bei Raumtemperatur wird die größte Verdünnung der bakteriellen Suspension, die HA verursacht, bestimmt, sodass die kleinste HA-Einheit zur Verwendung in Testproben bestimmt wird.
Zu zweifach reihenverdünnten Proben (50 μl/Well der Mikrotiterplatte) werden 50 μl der bakteriellen Suspension (6 kleinsten HA-Einheiten) zugegeben und die Mischung wird bei 37°C inkubiert. HA wird auf Glassobjektträgern durch Mischen von 50 μl der Proben-Bakterien-Mischung aus jedem Well mit 25 μl einer 5% Suspension von menschlichen Erythrozyten der Gruppe A getestet. HA wurde nach 5 Minuten bei Raumtemperatur erfasst. HA-Inhibierung (die höchste Verdünnung, die zur vollständigen Inhibierung von HA notwendig ist) wird im Vergleich zur Kontrolle, die PBS anstelle der getesteten Probe enthält, erfasst.
ELISA zur Bestimmung der adhäsionsinhibitorischen Aktivität von Preiselbeerfraktionen gegen Bakterien mit P-Fimbrien erfolgt wie in 3 und in Beispiel 2 hierin nachstehend beschrieben.
NMR wurde unter Verwendung von Brucker AMX-360 und ARX-500 Spektrometern durchgeführt.
BEISPIEL 1
ISOLIERUNG VON PF-1
Als ein Model wurde die Isolierung einer antimikrobiellen adhäsionsinhibitorischen Fraktion (PF-1) aus Preiselbeersaft (Cocktail oder Konzentrat) im Allgemeinen wie in 1 schematisch dargestellt, durchgeführt.
Isolierung aus Preiselbeersaftkonzentrat
Konzentriertes Material der Preiselbeere (CCM; 500 ml), als Saftkonzentrat bekannt, wird gegen 5 Liter destilliertes Wasser (zweimal täglich auswechseln) für acht Tage dialysiert. Die gewerbliche Quelle war im Allgemeinen Ocean Spray, doch es können andere gewerblich erhältliche Quellen verwendet werden. Der Dialyseschlauch ist von Spectrum Medical Industries, Inc., 60916 Terminal Annex, Los Angeles 90054. Antragsteller verwendeten einen Cut-off des Molekulargewichts von 12000-14000, einen Durchmesser von 28,6 cm (6,4 Vol./cm; Katalog-Nr. 132680).
Das im Dialyseschlauch verbleibende Material (nicht-dialysierbares Material – NDM) wird gesammelt und zu einem Pulver lyophilisiert, im Allgemeinen ergibt es 20 g. Das NDM wird in einigen Beispielen, wie hierin beschrieben, verwendet. Das NDM wird mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), pH 7,5, 0,00 M Phosphat aufgelöst.
BioGel P-60 Kügelchen (BioRad; 16 Gramm mit PBS für 2 Tage bei Raumtemperatur vorgequollen) werden zum Aufbau einer Säule von 2,4 × 100 cm verwendet. Die Säule wird gewaschen. Das Hohlraumvolumen der Säule beträgt 350 ml und die Säule wird mit 750 ml PBS äqulibriert. Es werden drei Gramm von trockenem NDM in 150 ml PBS gelöst und auf die Säule geladen.
Farbiges Material in NDM wird durch die Kügelchen gebunden. Die Säule wird ausgiebig mit PBS gewaschen, wodurch farbiges Material und Polysaccharide entfernt werden. Dann wird destilliertes Wasser (750 ml) zugegeben und das ganze eluierte Material wird gesammelt, gegen destilliertes Wasser dialysiert und lyophilisiert. Das eluierte Material wird als gereinigte Fraktion 1 (PF-1) bezeichnet. Im Allgemeinen werden etwa 300 mg Trockengewicht an PF-1 erhalten. Sie wird bei Raumtemperatur aufbewahrt. In einer alternativen Ausführungsform wird das Material mit Ammoniak (100 ml, 0,1 M) eluiert und die gereinigte Fraktion wird als PF-2 bezeichnet und wie PF-1 dialysiert. Wie in Tabelle 8 gezeigt ist, verhält sich PF-2 in den Assays ähnlich wie PF-1, doch sie ergab eine höhere Ausbeute als PF-1 und PF-2 zeigte eine 2,5- bis 5-fache Zunahme im Vergleich zu NDM.
Isolierung aus Preiselbeersaft-Cocktail
Das Ausgangsmaterial war ein gewerblich erhältlicher Preiselbeersaft oder ein gewerblich erhältliches Preiselbeersaftkonzentrat. Die gewerbliche Quelle war im Allgemeinen Ocean Spray, doch es können andere gewerblich erhältliche Saftquellen verwendet werden. Das Verfahren ähnelt der Isolierung aus Konzentrat.
Etwa 1,5 Liter des Saftes (oder 25 ml des Konzentrats) werden 6 Tage bei Raumtemperatur im Dialyseschlauch mit einem Cut-off des Molekulargewichts von 12 000 bis 14 000 gegen bidestilliertes Wasser dialysiert. Das Dialysat wird lyophilisiert und es wird ungefähr ein Gramm eines nicht-dialysierbaren Materials (NDM) erhalten.
Das NDM wird in 150 ml PBS bei pH 7,0 gelöst, durch Zentrifugieren geklärt und auf eine Säule (4 × 10 cm) geladen. Ein Polyacrylamid-Harz, BioGel P-60, wird verwendet.
Die „Durchlauf-"Fraktion mit PBS (enthält Polysaccharide) wird verworfen und die aktive Fraktion wird mit Wasser von der Säule eluiert. Diese eluierte wässrige, salzfreie Fraktion wird lyophilisiert und ergibt ein rötliches Pulver, PF-1. Gewöhnlich beträgt die Ausbeute an PF-1 ungefähr 100 mg. Bei Eluierung mit Ammoniak wird die Fraktion als PF-2 bezeichnet.
Die Isolate von PF-1 und/oder PF-2 werden durch ihre Antiadhäsions-/-aggregationsaktivität unter Verwendung des Hämagglutinations-Assays, ELISA und des visuellen Coaggregations-Assays standardisiert.
BEISPIEL 2
ANALYSE DER AKTIVITÄT
Nach der Isolierung der Fraktion PF-1 (und oder NDM, PF-2) wird ihre Antiadhäsions-/-aggregationsaktivität unter Verwendung des Hämagglutinations-Assays, ELISA und des visuellen Coaggregations-Assays analysiert/quantifiziert, wodurch sowohl eine funktionelle Bestimmung als auch eine antigene Bestimmung ermöglicht wird. Diese Assays bestimmen die minimale Konzentration der Fraktion (Verdünnung), die vom Material (Fraktion) nötig ist, um eine Inhibierung der Adhäsion von Bakterien mit P-Fimbrien an menschliche Erythrozyten (HA) oder der Coaggregation der oralen Bakterien bereitzustellen. Tabelle 1 stellt exemplarische Daten bereit. (Siehe auch Tabelle 8)
Die Aktivität wird auch durch Einsatz einer Quantifizierung der Inhibierung unter Verwendung eines modifizierten ELISA-Protokolls (3), wie hierin nachstehend beschrieben, gemessen.
Material
Mikrotiterplatten (flacher Boden, Costar); Menschliche Erythrozyten „Koscielak Ghosts", hergestellt nach dem von D.J. Anstee & M.J.A. Tanner (1974) beschriebenen Verfahren. 3,5 ml Material wird aus 10 ml gepackten Erythrozyten erhalten, in Aliquoten aufgeteilt und bei -70°C bis zur Verwendung aufbewahrt.
Bakterien: P-Fimbrien exprimierende E. coli IHE, die 48 Stunden bei 37°C auf TSA-Agar wuchsen, werden in PBS-Puffer geerntet und die Konzentration wird nach der optischen Dichte (OD) bestimmt. Die bakterielle Suspension wird in Aliquoten bei -20°C bis zur Verwendung aufbewahrt.
Antiserum vom Kaninchen gegen E. coli IHE wird, wie hierin vorstehend beschrieben, hergestellt. Anti-Kaninchen IgG Antikörper, zu Meerrettich-Peroxidase konjugiert, vom Esel (Amersham). Substrat-OPD-Tabletten (Sigma). PBS – phosphatgepufferte Kochsalzlösung, Rinderserumalbumin (BSA), Methylalkohol (analytisch) H₂O₂.
Methode
A. Bestimmung von bakterieller Bindung

1. Ghosts werden in Wells einer Mikrotiterplatte verteilt (100 μl) und über Nacht bei 37°C getrocknet. Die Konzentrationen entsprechen der Titrationskurve.
2. Blockieren mit BSA in PBS (200 μl/Well) für 1 Stunde bei 37°C. 2 × waschen mit PBS.
3. Binden der Bakterien: Verschiedene Konzentrationen der bakteriellen Suspension in BSA-PBS werden in die Wells verteilt (100 μl/Well) und für 1 Stunde bei 37°C inkubiert. 5 × waschen mit PBS (sanft).
4. Fixierung: Methanol (100 μl/Well) zugeben und 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. 1 × waschen mit PBS.
5. Antiserum entsprechend der Titrationskurve, in BSA-PBS, entsprechend der Titration, 100 μl/Well, verdünnen, 30 Minuten bei 37°C inkubieren. 5 × waschen mit PBS.
6. Konjugierter anti-Kaninchen IgG Antikörper entsprechend der Anleitung des Herstellers verdünnen, 100 μl/Well, 30 Minuten bei 37°C inkubieren. 5 × waschen mit PBS.
7. Substrat: 1 Tablette in 25 ml Puffer (entsprechend der Anleitung des Herstellers), 10 μl 30% H₂O₂ enthaltend, 100 μl/Well, inkubieren bei 37°C, gefolgt von 10-15 Minuten bei Raumtemperatur.

B. Titration des Inhibitors
Eine bakterielle Suspension mit einer der Titrationskurve entsprechenden Konzentration wird 1 Stunde bei 37°C mit verschiedenen Konzentrationen eines potentiellen Inhibitors (in Wasser verdünnt) inkubiert (Vol/Vol) und die Mischungen werden in Wells verteilt (100 μl/Well), wie hierin vorstehend im Schritt 3 der Methode beschrieben ist.
Bakterien, die mit PBS anstelle eines Inhibitors inkubiert werden, dienen als Kontrolle.
Erfassung der Ergebnisse
OD-Werte, die nach Abziehen der OD-Werts der Antiserum-Kontrolle (alle Bestandteile des Assays, außer der Bakterien) abgelesen werden, sind zur Anzahl der gebundenen Bakterien logarithmisch proportional.
Der Prozentsatz der Inhibierung wird aus der Differenz zwischen der Anzahl der gebundenen Bakterien in Gegenwart und in Abwesenheit des Inhibitors berechnet.
Die minimale Konzentration des Inhibitors, die 50% Inhibierung verursacht, wird nach der linearen Regressionsanalyse der Ergebnisse berechnet. Für die verwendete Methode zur „Übersetzung" der OD-Werte in die Anzahl der gebundenen Bakterien/Well siehe Athamna und Ofek (1988).
Testen des Systems
Es wurde die Titration der in Mikrotiterplatten getrockneten Bakterien in verschiedenen Konzentrationen (in Wasser) mit verschiedenen Konzentrationen von Antiserum (AS) untersucht. Für weitere Experimente wurde AS, das zu 1:150 verdünnt wurde, verwendet. Die minimale Anzahl an Bakterien, die detektiert werden kann, war 5 × 10⁴/Well.
Bestimmung der optimalen Konzentration der Ghosts
Ghosts in Mengen von 100, 50, 20, 10, 5 und 2,5 μl in einem Endvolumen mit Wasser von 100 μl/Well wurden über Nacht getrocknet (siehe Schritt 1 der Methode). Eine bakterielle Suspension mit einer Anfangskonzentration von 1 × 10¹⁰/ml (OD 1,5 der Suspension, die zu 1:10 verdünnt wurde) wurde reihenverdünnt und inkubiert, wie im Schritt 3 der Methode beschrieben.
Die ELISA-Werte waren von der Menge der in den Mikrotiterplatten immobilisierten Ghosts abhängig. Es wurde der Bereich von 10-50 μl getestet. Das Bindungssignal war bei Ghosts zu 20 μl gering und bei 10 μl/Well geringer; 50 μl war optimal.
Titration der Bindung der Bakterien an 50 μl Ghosts.
Die bakterielle Titration ist in 7 gezeigt, wo bekannte Mengen an Bakterien am Boden der Mikrotiterplatten immobilisiert wurden. ELISA wird, wie vorstehend beschrieben, ausgeführt und OD-Einheiten können als eine Funktion der log-Anzahl an Bakterien in jedem Well aufgetragen werden. Es kann eine lineare Regressionskurve verwendet werden, die nur Werte einschließt, die proportional zur Anzahl der Bakterien ansteigen. Eine derartige Standardkurve wird dann zur Berechnung der Anzahl von Bakterien, die mit und ohne Behandlung mit PF-1 oder anderen Fraktionen an Erythrozyten-Ghosts haften, aus den im Experiment erhaltenen ELISA-Werten verwendet.
Inhibierung der Bindung von Bakterien mit PF-1 2. Entsprechend 7 können 5 × 10⁴ bis 5 × 10⁸ Bakterien detektiert werden. Die optimale, im Test zu verwendende Konzentration der Bakterien beträgt 1 × 10⁸/Well. Antragsteller stellten fest, dass PF-1 die Bindung der Bakterien mit P-Fimbrien in einer dosisabhängigen Weise inhibiert, wo 90-100% Inhibierung der Bindung mit 2 mg/ml PF-1 erhalten wurde (8). Für eine größere Empfindlichkeit werden die Bedingungen des Assays modifiziert, sodass 50% Inhibierung durch niedrigere Konzentrationen von PF-1 erzielt werden können.
BEISPIEL 3
ANALYSE VON PF-1
PF-1 ist in 2 N HCl durch Säure ausfällbar und kann ohne Verlust an Aktivität wieder in Wasser gelöst werden. Jedoch führt die Behandlung mit Säure (0,01 N HCl, 100°C, 30 Minuten) zu verringerter Aktivität und nicht zu vollständigem Verlust. Es wird selbst in 2 N HCl nach 4 Stunden bei 100°C nicht hydrolysiert.
Die Elementaranalyse (Chemical Services, Organic Chemistry Department, Hebrew University of Jerusalem) von PF-1 nach Trocknen im Vakuum bei 60°C ergab die folgende Reihe:
Kohlenstoff 43–51%
Wasserstoff 4–5%
kein Stickstoff, Schwefel oder Chlor
PF-1 gibt eine positive Reaktion im Phenol-Schwefelsäure-Test [Dubois et al., 1956], was auf die Gegenwart von Kohlenhydraten zu etwa 15 Gewichts-%, bei Verwendung von D-Glucose als Standard, hindeutet.
BEISPIEL 4
WEITERE ANALYSE VON PF-1
PF-1 wurde, wie in Beispiel 1 beschrieben und in 1 zusammengefasst, erhalten. Sie zeigte adhäsionsinhibitorische Aktivität gegenüber Bakterien mit P-Fimbrien und oralen Bakterien bis zu einer Konzentration von 10–25 μg/ml.
Frühere Versuche, PF-1 durch hochauflösende Kernresonanz (NMR) zu analysieren, waren auf Grund der starken Linienverbreiterung in den Spektren (2A) ohne Erfolg. In einem Versuch, ein interpretierbares Spektrum zu erhalten, wurden die folgenden Experimente durchgeführt.
Ein Grund für die beobachtete Verbreiterung könnte die Gegenwart von gebundenem Eisen sein. Daher wurden Versuche unternommen, gebundenes Eisen aus PF-1 zu entfernen. Zu diesem Zweck wurde PF-1 (100 mg/ml) in einer 10%-igen Lösung von Methanol gelöst, 8-Hydroxychinolin (ein Eisen-Chelatbildner) wurde zugegeben (5 mg/ml) und die Mischung wurde 3 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Der gebildete Niederschlag wurde durch Filtrieren oder Zentrifugieren entfernt und die wässrige Methanol-Lösung wurde verdampft. Der Rückstand wurde in DMSO-d6 (10 mg/0,5 ml) gelöst und durch NMR untersucht.
Es wurde ein scharfes Linienspektrum erhalten (2B). Es zeigt, dass gebundenes Eisen, wie vermutet, die Auflösung der Verbindungen im NMR maskierte. Das eisenfreie Material wurde der sauren Methanolyse unterworfen, um Spaltprodukte mit niedrigem Molekulargewicht zu erhalten. Das NMR-Spektrum der Produkte zeigte, dass PF-1 unter anderem Phenylringe (z.B. Phenolringe), Phenyl-CO-Gruppen, Doppelbindungen, CH₂-Ketten und Hydroxymethine und Methylene (1C) enthält.
Es wurde eine weitere Analyse von PF-1 (100 mg) durch Extraktion mit Butanol (10 ml) und dann mit Ethylacetat (10 ml) unternommen. Es wurden keine Rückstände nach Verdampfung der organischen Phasen gefunden. Die Untersuchung von getrocknetem Material, dass aus der wässrigen Phase erhalten wurde, durch NMR ergab ein Spektrum, das mit dem des Ausgangsmaterials qualitativ und quantitativ identisch war. Diese Daten zeigen, dass PF-1 keine Fraktion enthält, die in den vorstehenden organischen Lösungsmitteln löslich ist.
PF-1 wurde in einer 10%-igen Lösung von Methanol gelöst und auf Sephadex LH-20, P-10 oder Dianion HP-20 Säulen geladen. Das gesamte Material in PF-1 adsorbierte an den Kügelchen der Säulen und konnte nicht mit Wasser eluiert werden.
PF-1 (50 mg) wurde durch Zugabe von Pyridin (2 ml) und Acetanhydrid (2 ml), gefolgt von warmer Ultraschallbehandlung für 2 Stunden, acetyliert. Nach Inkubierung über Nacht bei Raumtemperatur wurden die Lösungsmittel verdampft und es wurde die polyacetylierte PF-1 erhalten. Das NMR-Spektrum des Produkts zeigt, dass die Acetylierung aus einigen Verbindungen gebundenes Eisen entfernte, und die Gegenwart von Acetylgruppen (Peaks bei etwa 2 ppm). Während das nichtacetylierte Ausgangsmaterial an der Kieselsäule verblieb, lief das acetylierte Produkt durch die Säule, jedoch wurde keine einzelne Verbindung erhalten.
Die saure Methanolyse von PF-1 wurde durch Erhitzen von PF-1 (50 mg) in Methanol (10 ml) und Trifluoressigsäure (2 ml) bei Rückflusstemperatur für 5 bis 10 Stunden durchgeführt. Die Lösungsmittel wurden dann durch Verdampfung entfernt, das sauer methanolysierte Produkt wurde in einer 10%-igen Lösung von Methanol gelöst und das Eisen wurde, wie vorstehend beschrieben, entfernt. Das NMR-Spektrum des eisenfreien Methanolyse-Produkts zeigt scharfe Linien, die Saccharid-artige Einheiten anzeigen, was darauf hindeutet, dass die saure Methanolyse Veränderungen im Molekül verursacht. (Siehe auch Tabelle 7 für Antiadhäsions-/-aggregationsaktivität dieser Fraktionen.)
BEISPIEL 5
VERGLEICHSANALYSEN
Wie hierin vorstehend diskutiert, offenbart das United-States Patent 5 474 774 an Walker et al., ausgestellt am 12. Dezember 1995, einen Extrakt aus Preiselbeeren, das für eine Aktivität, die bakterielle Adhäsion an Oberflächen inhibiert, angereichert ist. Antragsteller haben PF-1 mit dem Material des Patents 5 474 774 verglichen und erhielten die folgenden Ergebnisse.
Wie in Beispiel 3 beschrieben, wurde PF-1 in einer 10%-igen Lösung von Methanol in Wasser gelöst und auf Sephadex LH-20, P-10 oder Dianion HP-20 Säulen geladen. Das gesamte Material in PF-1 adsorbierte an den Kügelchen einer der Säulen und konnte nicht mit Wasser und Wasser-Methanol-Mischungen eluiert werden. Die Ergebnisse deuten an, dass sich das aktive Material in PF-1 von dem in Preiselbeerextrakten gefundenen, das durch Patent 5 474 774 beschrieben und in den 1 und 10 des Patents 5 474 774 und Tabelle 1 des Patents 5 474 774 gezeigt ist, unterscheidet.
Die Verbindungen aus Preiselbeerfrucht zur Adhäsionsinhibierung, wie sie im Patent 5 474 774, sowie WO 96/30033, beschrieben sind, haben niedrige Molekulargewichte, lösen sich leicht in organischen Lösungsmitteln (1 und 10, Patent 5 474 774). Um zu untersuchen, ob derartige antiadhäsive Verbindungen in Preiselbeersaft vorliegen, setzten die Antragsteller konzentriertes Material der Preiselbeere (CCM; aus Ocean Spray erhalten) ein, das sowohl die Verbindungen mit hohen als auch die mit niedrigen Molekulargewichten, die im Preiselbeersaft gefunden werden, enthält.
Lyophilisiertes CCM (100 mg) wurde mit Butanol und Ethylacetat, wie für PF-1 beschrieben (siehe vorstehendes Beispiel 1), extrahiert. Das meiste der adhäsionsinhibitorischen Aktivität verbleibt in der wäsrigen Phase. Die NMR-Spektren der CCM-Fraktionen, die in den organischen Lösungsmitteln gelöst waren und die in der wässrigen Phase verblieben, wurden aufgenommen. Gut aufgelöste, scharfe Peaks von verschiedenen Verbindungen mit niedrigem Molekulargewicht werden in der Butanol- und Ethylacetat-Fraktion beobachtet. Diese Fraktionen wiesen keine adhäsionsinhibitorische Aktivität auf (Tabelle 2). Die Inhibierung wurde, wie zuvor beschrieben (Zafriri et al., 1989), unter Verwendung von E. coli mit P-Fimbrien und menschlichen Erythrozyten als Zielzellen für Adhäsions-Assays getestet. Für jede, in Tabelle 1 und 2 aufgelistete Fraktion wurde die zur Inhibierung von Hämagglutination von Meerschweinchen-Erythrozyten, die durch E. coli mit P-Fimbrien verursacht wird, und von Coaggregation von oralen Bakterien notwendige Konzentration in μg/ml bestimmt. NDM und PF-1 wurden, wie in Beispiel 1 beschrieben, erhalten.
Das in der wässrigen Phase verbliebene Material enthielt auch gut aufgelöste, Verbindungen mit niedrigem Molekulargewicht sowie (eine) Substanz(en) mit einem Spektrum mit sehr breiten Linien, das an das von PF-1 beobachtete erinnerte. Die Ergebnisse bestätigen die frühere Schlussfolgerung der Antragsteller, dass die adhäsionsinhibitorische Aktivität in CCM nicht in organischen Lösungsmitteln löslich ist.
In Tabelle 3 sind die Unterschiede zwischen der vorliegenden Erfindung und dem Material des Patents 5 474 774 zusammengefasst.
Weiter offenbart die veröffentlichte Anmeldung PCT/US96/03978 (WO 96/30033) an Walker auch den Extrakt aus Preiselbeere, der für eine Aktivität gegen Anhaften von Bakterien angereichert ist. Jedoch liefert die Analyse der Zusammensetzung von PCT/US96/03978 eine weitere Bestätigung, dass sie nicht die erfindungsgemäße Zusammensetzung, PF-1, ist. Die Zusammensetzung der Anmeldung PCT/US96/03978 scheint Tannine darzustellen, das ungefähre Molekulargewicht der offenbarten Zusammensetzungen beträgt 5000, obwohl ihr Massenspektrum einen Wert von 577 liefert. Die NMR-Spektren (Protonen- und Kohlenstoff-) unterscheiden sich von denen, hierin für die vorliegende Erfindung gezeigten.
Wie hierin vorstehend diskutiert, offenbart das United-States Patent 5 683 678 an Heckert et al. eine orale Zusammensetzung, die aus Preiselbeeren isolierte Anthocyanine enthält, und eine Zusammensetzung mit Anti-Glucosyltransferase-Aktivität. Antragsteller haben die erfindungsgemäße Zusammensetzung analysiert und sie ist kein Anthocyanin und besitzt keine Anti-Glucosyltransferase-Aktivität.
Diese Hinweise beschreiben Zusammensetzungen, die reich an Polyphenolen, die gewöhnlich in Tanninen und Anthocyaninen vorkommen, und Molekülen mit einem Molekulargewichtsbereich von 200-10 000 sind.
Polyphenol-Assay: Ein modifizierter Folin-Denis-Test [Folin und Denis, 1912] wurde zur Detektion aller hydroxylierter phenolischer Verbindungen eingesetzt [Mehansho et al., 1987]. Als ein Kontrollstandard wurde gewerblich erhältliches Tannin und Anthocyanin von Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO) erhalten. Der Test war für Konzentrationen phenolischer Verbindungen bis zu 0,02 mg/ml Tannin in Standardkurven empfindlich.
Ergebnisse: NDM zeigte bei einer Konzentration von 0,1 mg/ml (zweimal wiederholt) weniger als 0,02 mg/ml phenolische Rückstände. Somit enthält NDM keine phenolischen Rückstande, die durch diesen Test üblicherweise in Tanninen und Anthocyaninen gefunden werden.
Anti-Glucosyltransferase-Assay: Dieser Assay basiert auf der Bildung eines Saccharose-Polymers (Dextran) aus Saccharose, das in Methanol unlöslich ist. Falls NDM Anti-Glucosyltransferase-Aktivität besitzt, wird es den Assay stören. Reagenzien: Die Glucosyltransferase-Enzymlösung wurde aus S. sobrinus, die vier verschiedene Glucosyltransferasen produzieren, wie folgt hergestellt. S. sobrinus 6715 Bakterien wuchsen 16-18 Stunden in definiertem Medium [Terleckyj et al., 1975]. Die Zellen wurden durch Zentrifugieren entfernt und die Überstände wurden aufbewahrt. Die Überstände, auf Eis, wurden mit Ammoniumsulfat zu 65% gesättigt und über Nacht behutsam gerührt. Die Niederschläge wurden gesammelt und in entweder 50 mM NaCl (pH 5,7) oder 20 mM PO₄, 150 mM NaCl (pH 7,2) gelöst. Diese Niederschlagproben liefern eine rohe Enzymzubereitung. Die Proben werden gegen PBS dialysiert und auf den Proteingehalt untersucht und zur Verwendung als Enzymlösung auf 1 mg/ml eingestellt. Radioaktiv markierte Saccharose-[¹⁴C] wurde von ICN (Irvine, CA) erworben. Die Saccharose wurde bis zur Verwendung in Wasser gefroren aufbewahrt. Für den Assay wurde ein Aliquot entnommen und mit nichtmarkierter Saccharose verdünnt, um eine Endkonzentration von 50 mM Saccharose zu erhalten.
Assay: Es wurde der von Germaine et al. [1974] beschriebene Assay mit folgender Modifizierung verwendet. Die Enzymlösung wurde in Reaktionsgefäße (0,8 ml) verteilt und 15–20 Minuten auf 37°C erwärmt. Zu einer Reihe der Reaktionsgefäße wurde NDM zu einer Endkonzentration von 1 mg/ml zugegeben. In einer parallelen Reihe von Kontrollgefäßen wurde kein NDM zugegeben. Es wurde zu allen Reaktionsgefäßen Saccharose-¹⁴C (0,2 ml) zugegeben und die Reaktionsgefäße wurden bei 37°C inkubiert. Zu Zeitabschnitten wurden Aliquoten (0,1 ml; 1 Minute, 2 Minuten, 5, 10, 15, 20, 25, 30 Minuten) aus den Reaktionsgefäßen mit NDM und den Kontrollgefäßen entnommen und auf eine Whatman 3MM Filterscheibe gegeben. Die Filterscheiben wurden zur Entfernung der Saccharose 15 Minuten in kaltes Methanol gegeben, das Waschen mit Methanol wurde wiederholt und die Scheiben wurden an der Luft getrocknet und in einem Szintillationszähler analysiert.
Ergebnisse: In zwei getrennten Assays wurde kein Unterschied zwischen den Kontrollgefäßen und den Reaktionsgefäßen mit NDM festgestellt. Die Glucosyltransferase-Aktivität, die die Synthese von Polysaccharid aus Saccharose katalysiert, wurde durch die Gegenwart von NDM nicht verändert.
BEISPIEL 7
WIRKUNG VON PF-1 AUF DIE ADHÄSION VON ORALEN BAKTERIEN
Die meisten Mitglieder der bakteriellen Gattungen in der Zahnplaque sind durch spezifische Mechanismen zur Wechselwirkung miteinander in der Lage und von diesen Bakterien-Bakterien-Wechselwirkungen wird jetzt angenommen, dass sie für die Entwicklung von Zahnplaque von höchster Bedeutung sind [Kolenbrander et al., 1993]. Die vorliegende Erfindung der Antragsteller stellt bereit, dass dieser Eingriff in die Coaggregation zwischen einer bakteriellen Spezies und einer anderen die Entwicklung von Zahnplaque erschweren wird und dass daher PF-1 in einer Ausführungsform als ein Arzneimittel bei der Vorsorge und/oder Behandlung von Plaque, wie hierin im Beispiel nachstehend gezeigt ist, eingesetzt werden kann.
Die Mundhöhle von Säugetieren und insbesondere Menschen wird selten durch E. coli besiedelt, noch ist von dieser bakteriellen Spezies bekannt, dass sie zu irgendeiner Erkrankung der Mundhöhle führt. Daher wurden zur Untersuchung der Wirkung von PF-1 auf Bakterien der Mundhöhle Bakterien, wie nachstehend beschrieben, verwendet, von denen bekannt ist, dass sie die Mundhöhle besiedeln.
Zunächst wurde die Beziehung zwischen der Antiadhäsionsaktivität von PF-1 für P-Fimbrien von uropathogenen E. coli und der Antiaggregationsaktivität ausgewählter coaggregierender Bakterienpaare festgestellt. Coaggregierende Paare wurden ausgewählt, um die Bakterien, die in den verschiedenen Stadien der Entwicklung und Reifung von Zahnplaque involviert sind, zu repräsentieren. Sie schließen folgende Vertreter ein: der frühen Besiedler (S. oralis 34 und A. naeslundi T14V); des Übergangs zwischen frühen und späten Besiedlern (A. naeslundii PK984 und F. nucleatum PK1909); und potentiell periopathogener Bakterien (P. gingivalis und F. nucleatum PK1594).
In der ersten Experimentreihe wurde NDM (das PF-1 enthält) getestet, um seine Wirkung auf die Adhäsion oraler Bakterien zu bestimmen. In diesen Assays wurden 40 Bakterienpaare getestet, von denen gezeigt wurde, dass sie in der Mundhöhle leben. Den Paaren wurde ermöglicht, durch Bildung von Aggregaten aneinander zu haften, woran sich die Zugabe von NDM zur Bestimmung der minimalen Konzentration, die zur vollständigen Umkehr der Coaggregation (Adhäsion; siehe 4) erforderlich ist, anschloss. Die Ergebnisse der durchgeführten Experimente sind hierin nachstehend in Tabelle 4 zusammengefasst.
Wie in Tabelle 4 gezeigt ist, war die Coaggregation einiger oraler Bakterien für NDM hoch empfindlich. Die Coaggregation wurde durch Konzentrationen so niedrig wie 1250 μg/ml umgekehrt.
Die Coaggregation anderer bakterieller Paare war weniger empfindlich oder unempfindlich (die Coaggregation wurde durch Konzentrationen so hoch wie 5000 μg/ml nicht umgekehrt.). Diese Ergebnisse zeigen, das die verschiedenen Bakterien den Inhibitor zu verschiedenen Affinitätsgraden binden. Es existiert ein breiter Bereich der Rezeptorspezifität der von oralen Bakterien getragenen Adhäsine, der durch dieses Ergebnis wiedergegeben wird.
In der zweiten Experimentreihe wurde PF-1 eingesetzt und die Ergebnisse sind in Tabelle 5 zusammengefasst. Wie in Tabelle 5 gezeigt ist, war PF-1, auf einer Gewichtsbasis, etwa zehnmal aktiver bei der Umkehrung der Coaggregation zwischen A. naeslundii und F. nucleatum im Vergleich zu NDM, was zeigt, dass sich die meiste inhibierende Aktivität von NDM in PF-1 befindet. Die Adsorption von PF-1 an E. coli mit P-Fimbrien verringerte die Fähigkeit der adsorbierten Fraktion zur Umkehrung der Coaggregation des oralen Bakterienpaars.
Tabelle 5 zeigt auch, dass alkalische Behandlungen von PF-1 oder eine saure Behandlung die Coaggregationsaktivität von PF-1 verringert, während Erhitzen auf 100°C keine Wirkung zeigt. Frühere Studien haben gezeigt, dass eine saure Behandlung von PF-1 keine Wirkung auf ihre Antiadhäsionsaktivität für E. coli hat. Säuremodifizierte PF-1 verliert ihre Fähigkeit, an orale Bakterien zu binden, doch behält ihre Fähigkeit, E. coli mit P-Fimbrien zu binden.
Tabelle 6 zeigt, dass bedeutend weniger Mengen an NDM notwendig sind, um die Coaggregation durch Vorinkubieren der Fraktion mit einer der bakteriellen Spezies des Bakterienpaars von F. nucleatum PK1909 und A. naeslundii PK984 zu inhibieren, im Vergleich zu denen, die notwendig sind, um aufgetretene Coaggregation zwischen dem Bakterienpaar umzukehren. Die Ergebnisse zeigen auch, dass die Affinität des Inhibitors in NDM (das PF-1 enthält) zu F. nucleatum die gleiche wie die zu A. naeslundii ist, da die gleichen Konzentrationen an NDM notwendig waren, um die Coaggregation durch Vorinkubierung von NDM mit einer der bakteriellen Spezies zu inhibieren. Im Gegensatz dazu war NDM bei der Inhibierung der Coaggregation zwischen A. naeslundii und C. sputigena aktiver, wenn es mit dem Letzteren vorinkubiert wurde, im Vergleich zu seiner Inhibierungsaktivität, wenn es mit dem Ersteren vorinkubiert wurde.
In Tabelle 7 ist die Antiadhäsions-/-aggregationsaktivität der Fraktionen aus Beispiel 3 bereitgestellt. Die minimale Inhibierungsaktivität in μg/ml gegen Bakterien mit P-Fimbrien wird für jede Fraktion mit oralen Bakterien verglichen. Im Allgemeinen lag eine Übereinstimmung vor. Jedoch, wie vorstehend diskutiert, wies die in Methanol eluierte Fraktion keine Antiinhibierungsaktivität auf.
Zusammenfassend wird die Adhäsion (Coaggregation) von 29 aus 37 getesteten Paaren vollständig umgekehrt, was zeigt, dass PF-1 die Zahnplaque stören wird. Es kann eine Hypothese für die vorstehenden Beobachtungen aufgestellt werden, doch es darf nicht als Beschränkung der vorliegenden Erfindung auf diese eine Wirkungsweise gedeutet werden. Die Ergebnisse stehen im Einklang mit der Vorstellung, dass die polymere PF-1 ihre Inhibierungsaktivität auf einen definierten Bereich von bakteriellen Adhäsionen richtet. Diese Vorstellung ist auch aus der Analyse der Ergebnisse von spezifischen Paaren von oralen Bakterien offensichtlich. Beispielsweise wird die Adhäsion von allen 8 Partnern an Fusobacterium nucleatum PK 1904 durch NDM umgekehrt, während die von nur der Hälfte der Partner an einen anderen Stamm (PK 1594) der gleichen Spezies durch NDM umgekehrt wird. Diese Ergebnisse entsprechen denen von E. coli, die mehrere Adhäsine produzieren und nur einige von denen, vor allem die, die von Uropathogenen produziert werden, werden durch NDM inhibiert.
BEISPIEL 8
Weiteres Verfahren zur Reinigung
Zur zusätzlichen Reinigung von PF-1 unter Verwendung von Gelfiltration wurde das hierin vorstehend beschriebene Verfahren wie folgt modifiziert:
Preiselbeersaftkonzentrat (UPC Nr. 94040 Lot Nr. 95071), das von Ocean Spray erhalten wurde, (200 ml) wurde sieben Tage gegen destilliertes Wasser (das Wasser zweimal täglich auswechseln) unter Verwendung eines Dialyseschlauchs mit einem Cut-off des Molekulargewichts von 12–15 kDa dialysiert. Das Retentat wurde zu einer Ausbeute von 3,44 g (1,7% w/v) von nicht-dialysierbarem Material (NDM), wie hierin beschrieben, lyophilisiert.
Das NDM wurde dann an Bio-Gel P-60 Kügelchen (BioRad, 130 ± 40 mm, Ausschlussgrenze von 60 kDa) fraktioniert. Die Kügelchen wurden in PBS über Nacht eingeweicht und in eine Säule von 20 cm × 2,5 cm gepackt und die Säule wurde mit 20 ml (10 mg/ml in PBS) NDM beladen. Das gesamte Material wurde in den oberen, etwa 5 cm der Säule gebunden. Die Säule wurde mit 100 ml PBS gewaschen (bei einer Flussrate von 1 ml/min) und das Wassereluat wurde verworfen. Mit dem Durchlaufen von 100 ml 0,1 M NH₄OH durch die Säule wurde eine zweite Fraktion eluiert. Sie wurde 24 Stunden gegen destilliertes Wasser (1 Liter) dialysiert, lyophilisiert und das Produkt wurde als PF-2 bezeichnet. Die minimale Konzentration von PF-2 zur Inhibierung der Hämagglutination von E. coli betrug 60-125 μg/ml, ähnlich der von PF-1, und stellt eine erhöhte, etwa 2,5- bis 5-fache Ausbeute im Vergleich zu NDM dar. Die Ausbeute von PF-2 betrug 20–40% (w/w), die wesentlich höher als die von PF-1 ist, die, wie hierin beschrieben, etwa 10% betrug.
BEISPIEL 9
Inhibierung der Hämagglutination zwischen H. pylori und menschlichen Erythrozyten durch NDM.
Es wurde in den hierin berichteten Experimenten der H. pylori Stamm 25 verwendet. Er ist ein klinisches Isolat, das aus dem Ezra Health Laboratory (Haifa, Israel) erhalten wurde. Der Stamm wird durch Wachsen auf Columbia-Agar (Oxoid Ltd., Basingstoke, Hants, GB), dem Hefeextrakt 0,2% und 10% Eigelb-Emulsion zugesetzt wurde, in Platten unter mikroaerophilen Bedingungen in anaeroben Gefäßen (CampyPakPlus, Beckton Dickinson Microbiology System, Cockeysville, MD) bei 37°C aufrechterhalten. Nach drei Tagen werden die Bakterien zur Verwendung von den Agar-Platten geerntet. Die Bakterien werden in PBS zu 1,0 OD bei 660 nm suspendiert, was ungefähr 5 × 10⁸ KBE/ml entspricht.
Wie für den Hämagglutinations-Assay beschrieben wurde, wuchsen die Bakterien für drei Tage auf Agar, sie wurden vom Agar abgekratzt und in phosphatgepufferter Kochsalzlösung zu einer Dichte von 1,0 OD suspendiert. Die Hämagglutinationsaktivität und ihre Inhibierung durch NDM erfolgte wie zuvor beschrieben (Zafriri et al., 1989). Die Ergebnisse sind in Tabelle 9 gezeigt und demonstrieren, dass NDM die Hämagluttination durch H. pylori inhibieren wird.
BEISPIEL 10
Inhibierung der Adhäsion von Helicobacter pylori an menschlichen Magenschleim durch NDM
Herstellung von Mikrotiterplatten, die immobilisierten menschlichen Schleim enthalten: Menschliches Muzin (S-11/97) wurde vom Department of Pathology, RamBam Hospital, Haifa, erhalten. Das Muzin wurde in 0,1 M NaCl gelöst, um eine 10%-ige (V/V) Lösung zu erhalten. Es wurde 1 M NaOH zugegeben, um pH 7,0 zu erreichen und bei 4°C über Nacht inkubiert. Die Suspension wurde dann 10 Minuten bei 10 000 × g zentrifugiert und zum Muzin-Bodensatz wurde Ethanol 60% (V/V) zugegeben. Nach 30 Minuten bei 4°C setzte sich der Schleim durch Zentrifugieren ab und wurde erneut in 0,1 M NaCl zu einer Konzentration von 1 μg/ml Protein gelöst. Das Beschichten der Wells mit Muzin erfolgte durch Zugabe von 0,1 ml Muzin in jedes Well der 96-Mikrotiterplatten, Inkubieren für 24 Stunden bei 37°C und Waschen mit 20 mM phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) [Burger et al., 1998].
Bestimmung der Adhäsion von H. pylori an immobilisiertes Muzin und ihre Inhibierung durch NDM: Es wurde 0,01 ml NDM (1 mg/ml) in PBS oder nur PBS zu 0,1 ml Bakteriensuspension gegeben und die Mischung wurde in die Wells, die das immobilisierte menschliche Muzin enthielten, überführt. Nach 90 Minuten Inkubieren wurden die nichtanhaftenden Bakterien aus den Wells gewaschen und die Menge an Bakterien, die weiter haften, wurde durch Messung der Urease-Aktivität der gebundenen Bakterien bestimmt. Die Urease-Aktivität wurde über eine Zeit von drei Stunden durch Zugabe von Phenolrot (7 mg/ml) und Harnstoff (330 micro mol/ml) zu jedem Well zu der gewünschten Zeit und die anschließende Aufnahme der Entwicklung der Farbe bei 560 nm, überwacht. Kontrollexpereimente zeigten, dass NDM keinen Einfluss auf die Urease-Aktivität der Bakterien hat und dass das Vorinkubieren der Muzinschicht mit NDM, gefolgt vom Herunterwaschen von überschüssigem NDM keine Wirkung auf die Adhäsion von H. pylori hatte.
Die Ergebnisse (9) zeigen die Urease-Aktivität von an Muzin gebundenen H. pylori nach Inkubieren mit und ohne NDM, wie vorstehend beschrieben ist. Es ist ersichtlich, dass sehr wenig Aktivität in den Wells detektiert wurde, die mit den Bakterien in Gegenwart von 0,1 mg/ml NDM inkubiert wurden. Somit lag eine verminderte Adhäsion der H. pylori an das menschliche Muzin vor.
In dieser gesamten Anmeldung wird zu verschiedenen Veröffentlichungen, einschließlich United-States Patenten, durch Zitierung oder Nummer Bezug genommen. Vollständige Zitierungen für die Veröffentlichungen sind nachstehend aufgelistet.
Die Erfindung wurde auf erläuternde Weise beschrieben und es sollte zur Kenntnis genommen werden, dass die Terminologie, die verwendet wurde, in der Art der Wörter zur Beschreibung eher als zur Beschränkung liegen soll.
Offensichtlich sind viele erfindungsgemäße Modifizierungen und Variationen angesichts der vorstehenden Ausführungen möglich. Es soll daher zur Kenntnis genommen werden, dass die Erfindung im Rahmen der angefügten Patentansprüche anderweitig ausgeführt werden kann, als es spezifisch beschrieben wurde. TABELLE 1 Studien zur Inhibierung von Coaggregation/Adhäsion

* Verdünnung oder Konzentration (μg/ml), die zur vollständigen Inhibierung von Hämagglutination (HA) oder Coaggregation (Coag) von oralen Bakterien notwendig ist.

* Siehe Legende von Tabelle 1

*> bei 2,50 mg/ml nicht vollständig inhibiert

* keine Inhibierungsaktivität bei 1,25 mg/ml

LITERATUR

Anstee und Tanner, 1974. The distribution of blood-group antigens on butanol extraction of human erythrocyte "Ghosts", Biochem. J., 138:381-386.
Aronson, et al., 1979. Prevention of E. coli colonization of the urinary tract by blocking bacterial adherence with α-methyl-D-mannopyranoside. J. Infect. Dis. 139:329-332.
Athaman und Ofek, 1988. Enzyme-linker immunosorbent assay for quantitation of attachment and ingestion stages of bacterial phagocytosis Infect. Immun., 26:62-66.
Avorn et al. 1994. Reduction of bacteriuria and pyuria After Ingestion of Cranberry Juice. JAMA 271(10):751-754.
Blaser, 1996. The Bacteria Behind Ulcers. Scientific American, February, S. 104-107.
Boren, et al., 1993. Attachment of Helicobacter pylori to human gastric epithelium mediated by blood group antigen. Science 262:1892-1895.
Boren und Falk, 1995. Helicobacter pylori binds to blood group antigens. Scientific American Science and Medicine. September/October 28-37.
Burger et al., 1998. High Molecular weight constituent of cranberry juice inhibits the adhesion of Heliobacter Phlori to human gastric mucin. Abstract, 11^th Mediterranean Congress of Chemotherapy, TelAviv.
Cover und Blaser, 1995. Helicobacter pylori: a bacterial cause of gastritis, peptic ulcer disease, and gastric cancer. A.S.M. News 61:21-26.
DeMan, et al., 1987. Receptor specific agglutination tests for detection of bacteria that bind globoseries glycolipids. J. Clin. Microbiol. 25:401-406.
Dubois et al. 1956. Colorimetric Method for Determination of Sugars and Related Substances. Anal. Chem. 28:350-356.
Duguid, J. P. und Old, D.C. 1980. Adhesive properties of enterobacteriaceae. In: Bacterial Adherence. (Beachey E.H., Hrsg.), Receptors and Recognition, Serie B, Vol. (Band) 6, S. 187-217, Chapman and Hall Ltd., London.
Dunn et al., 1997. Helicobacter pylori. Clin. Microbiol. Rev. 10:720-741.
Dzink et al., 1988. The predominant cultivable microbiota of active and inactive lesions of destructive periodontal diseases. J Clin Periodontol. 15:316-323.
Dzink et al., 1985. Gram-negative species associated with active destructive periodontal lesions. J Clin Periodontol 12:648-659.
Firon, et al., 1984. Carbohydrate-binding sites of the mannose-specific fimbrial lectins of enterobacteria. Infect. Immun. 43:1088-1090.
Folin und Denis, 1912. On phosphotungstic-phophomolybdic compounds as color reagents. J. Biol. CHem. 12:239-243.
Germaine et al., 1974. Rapid filter paper assay for the dextransucrase activity from Streptococcus mutans. J. Dent. Res. 53(6):1355-1360.
Gibbons, et al., 1991. Delineation of a segment of adsorbed salivary proline-rich proteins which promotes adhesion of Streptococcus gordonii to apatitic surfaces. Infect Immun 59:2948-2954.
Gibbons und van Houte, 1975. Bacterial adherence in oral microbial ecology. Ann Rev Microbiol 29:19-44.
Goldhar, 1995. Erythrocytes as target cells for detection and characterization of bacterial adhesins. Vol. (Band) 253. In: Methods of Enzymology. Adhesion of Microbial Pathogens. R.J. Doyle und I. Ofek, Hrsg. Academic Press Inc. S. 43-50.
Grunberg, et al., 1994. Blood group NN dependent phagocytosis mediated by NFA-3 heamagglutinin of Escherichiae coli. Immunol. & Infect. Dis. 4:28-32.
Helrich (Herausgeber), 1990. Official Methods of Analysis of the Association of Official Analytical Chemists. S. 703, Abschnitt 952.03.
Lee A, Fox J und Hazell S. 1993. pathogenicity of Helicobacter pylori: a perspective. Infect. Immun. 61:1601-1610.
Kolenbrander, 1988. Intergeneric coaggregation among human oral bacteria and ecology of dental plaque. Annu. Rev. Microbiol. 42:627-656.
Kolenbrander et al., 1989. Coaggregation of Fusobacterium nucleatum, Selenomonas flueggei, Selenomonas infelix, Selenomonas noxia, and Selenomonas sputigena with strains from 11 genera of oral bacteria. Infect. Immun., 57:3194-3203.
Kolenbrander et al., 1993. Coaggregation: Specific adherence among human and plaque bacteria. FASEB J 7:406-413.
Kolenbrander und London, 1993. Adhere today, here tomorrow: Oral bacterial adherence. J Bacteriol 175:3247-3252.
Leibusor et al., 1996. Cranberry juice inhibits coaggregation of oral bacteria. Presented at the annual meeting of the International Association of Dental Research (IADR), San Francisco, CA, 14.-17. März 1996.
Lynn, et al., 1982. Factors affecting excretion of human urinary Tamm-Horsfall glycoprotein. Clinical Science 62:21-26.
Mehansho et al., 1987. Dietary tannins and salivary prolin-rich proteins: Interactions, induction, and defense mechanisms. Ann. Rev. Nur. 7:423-440.
Moore und Moore, 1994. The bacteria of periodontal diseases. Periodontol 2000 5:66-77.
Nyvad und Kilian, 1990. Comparison of the initial streptococcal microflora on dental enamel in caries-active and in caries-inactive individuals. Caries Res 24:267-272.
Ofek, 1995. Enzyme-linked immunosorbent based adhesion assays. In: Doyle, R. und I. Ofek. (Hrsg.) Adhesion of Microbial Pathogens. Methods in Enzymology. 253: 528-536. Academic Press, N.Y.
Ofek und Doyle, 1994. Bacterial Adhesion to Cells and Tissues, Chapman and Hall Ltd., London. S. 357-365.
Ofek et al., 1991. Anti-Escherichia coli adhesion activity of cranberry and blueberry juices. New Eng. J. Med. 324: 1599.
Ofek et al., 1993. Effect of various juices on activity of adhesins expressed by urinary and nonurinary isolates of Escherichiae coli. In America's Foods Health Messages and claims: Scientific, Regulatory, and Legal Issues (J. Tilloston, Hrsg.) CRC press, Inc. S. 193-201.
Ofek, et al., 1996. Toward anti-adhesion therapy for microbial diseases. Trends Microbiol. 4: 297-299
Parkkinen, et al., 1988. Identification of factors in human urine that inhibit the binding of Escherichia coli adhesins. Infect. Immun. 56:2623-2630.
Savitt und Socransky, 1984. Distribution of certain subgingival microbial species in selected periodontal conditions. J Periodontal Res. 19:111-123.
Schmidt und Sobota, 1988. An examination of the anti-adherence activity of cranberry juice on urinary and nonurinary bacterial isolates. Microbios 55:173-181.
Slots, 1977. Microflora in the healthy gingival sulcus in man. Scand J Dent Res. 85:247-254.
Sobota, 1984. Inhibition of bacterial adherence by cranberry juice: Potential use for treatment of urinary tract infection. J. Urol. 131:1031-1016.
Socransky, et al., 1982. Present status of studies on microbial etiology of periodontal diseases. In Genco R, Mergenhagen SE. (Hrsg.). Host-parasite Interactions in Periodontal Disease. American Society for Microbiology, Washington, DC.
Terleckyj, et al., 1975. Growth of several cariogenic strains of oral streptococci in a chemically defined medium. Infect. Immun. 11(4):649-655.
van Houte, 1980. Bacterial specificity in the etiology of dental caries. Int Dent J. 30:305-326.
Wadstrom, 1995. An update on Helicobacter pylori. Curr. Opinions in Gastroenterol. 11:69-75,
Weiss, et al., 1990. Identification of the rhamnose-sensitive adhesion of Capnocytophaga ochracea ATCC 33596. Archs Oral Biol 35 Anhang:127S-1305.
Weiss, et al., 1989. Fimbriae-associated adhesion of Bacteroides loescheii that recognizes receptors on prokaryotic and eucaryotic cells. Infect Immun. 57:2912-2913.
Weiss et al., 1987. Characterization of lectin-like surface components on Capnocytophaga ochracea ATCC33596 that mediate coaggregation with gram-positive oral bacteria. Infect. Immun. 55:1198-1202.
Zafriri et al., 1989. Inhibitory activity of cranberry juice on adherence of type I and type P fimbriated Escherichia coil to eucaryotic cells. Ant. Microbial Agt. Chem. 33:92-98.

Claims

Pharmazeutische gegen Mikroorganismen wirkende Antiadhäsionszusammensetzung zur Verabreichung an einen Patienten mit Bedarf daran, umfassend eine wirksame Menge einer isolierten adhäsionsinhibitorischen Fraktion aus Vaccinium-Saft als einen Wirkstoff und einen pharmazeutisch verträglichen Träger oder ein pharmazeutisch verträgliches Verdünnungsmittel, wobei die isolierte Fraktion Folgendes aufweist: (a) Ein Molekulargewicht von ≥14 000; (b) Antiadhäsionsaktivität gegen H. pylori; (c) eine Elementaranalyse von Kohlenstoff – 43–51%, Wasserstoff – 4–5%, keinem Stickstoff, keinem Schwefel und keinem Chlor; (d) ein Kernresonanz-Linienspektrum (NMR-Linienspektrum) wie in den 2A und 2B ersichtlich ist; (e) ein Ultraviolettspektrum mit einem Absorptionspeak bei 280 nm in einer Lösung mit neutralem oder saurem pH, der in Alkalilösungen nicht vorhanden ist; (f) Coaggregationsumkehr- und Coaggregationsinhibitionsaktivität gegen orale Bakterien; und (g) eine adhäsionsinhibitorische Aktivität gegen Bakterien mit P-Fimbrien, worin die isolierte Fraktion in Butanol und Ethylacetat unlöslich ist und worin die Konzentration der isolierten adhäsionsinhibitorischen Fraktion zwischen 1 μg und 10 mg pro Milliliter (ml) liegt.
Verwendung einer Zusammensetzung nach Anspruch 1 bei der Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung einer Infektion mit H. pylori.
Verfahren zur Isolierung einer Fraktion im Wasserextrakt aus Saft von Beeren der Pflanzengattung Vaccinium (wie zum Beispiel Preiselbeersaft oder Heidelbeersaft), die eine adhäsionsinhibitorische Aktivität gegen Bakterien aufweist, mittels der Schritte von: (a) Gründliches Dialysieren des Saftes gegen bidestilliertes Wasser unter Verwendung eines Dialyseschlauchs mit einem Cut-off des Molekulargewichts bei 14 000; (b) Lyophylisieren des Dialysats; (c) Fraktionieren des lyophilisierten Dialysats auf einer Polyacrylamid-Harzsäule; und (d) Eluieren der Fraktion aus der Säule mit Wasser.
Verfahren nach Anspruch 3, worin die Fraktion aus der Säule mit Ammoniak eluiert wird.
Verfahren nach Anspruch 4, worin die in Schritt (d) eluierte Fraktion durch die Passage über eine Fractogelsäule weiter gereinigt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 5, worin der Preiselbeersaft eine gewerblich erhältliche Zubereitung darstellt, die aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus Saft und Saftkonzentrat.
Antikörper, der gegen eine isolierte adhäsionsinhibitorische Fraktion im Wasserextrakt aus Preiselbeersaft gerichtet ist, die Folgendes aufweist: (a) Ein Molekulargewicht von ≥14 000; (b) eine Elementaranalyse von Kohlenstoff – 43–51%, Wasserstoff – 4–5%, keinem Stickstoff, keinem Schwefel und keinem Chlor; (c) ein Kernresonanz-Linienspektrum (NMR-Linienspektrum) wie in den 2A und 2B ersichtlich ist; (d) ein Ultraviolettspektrum mit einem Absorptionspeak bei 280 nm in einer Lösung mit neutralem oder saurem pH, der in Alkalilösungen nicht vorhanden ist; (e) eine adhäsionsinhibitorische Aktivität gegen Bakterien mit P-Fimbrien; und (f) Coaggregationsumkehr- und Coaggregationsinhibitionsaktivität gegen orale Bakterien.
Antikörper nach Anspruch 9, der einen monoklonalen oder polyklonalen Antikörper darstellt.
Angereicherte Nahrungsmittelzusammensetzung, die eine gegen Mikroorganismen wirkende Antiadhäsionsaktivität bereitstellt, umfassend einen geeigneten Nahrungsmittelträger und eine wirksame Menge einer isolierten adhäsionsinhibitorischen Fraktion im Wasserextrakt aus Vaccinium, die Folgendes aufweist: (a) Ein Molekulargewicht von ≥14 000; (b) Coaggregationsumkehr- und Coaggregationsinhibitionsaktivität gegen orale Bakterien; (c) eine Elementaranalyse von Kohlenstoff – 43–51%, Wasserstoff – 4–5%, keinem Stickstoff, keinem Schwefel und keinem Chlor; (d) ein Kernresonanz-Linienspektrum (NMR-Linienspektrum) wie in den 2A und 2B ersichtlich ist; (e) ein Ultraviolettspektrum mit einem Absorptionspeak bei 280 nm in einer Lösung mit neutralem oder saurem pH, der in Alkalilösungen nicht vorhanden ist; und (f) eine adhäsionsinhibitorische Aktivität gegen Bakterien mit P-Fimbrien, worin die isolierte Fraktion in Butanol und Ethylacetat unlöslich ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 9, worin der Nahrungsmittelträger einen Fruchtsaft, wie zum Beispiel Preiselbeersaft, darstellt.