DE69924681T2

DE69924681T2 - Probenhalterungselement und Verfahren zu dessen Herstellung

Info

Publication number: DE69924681T2
Application number: DE69924681T
Authority: DE
Inventors: Kenji Yokohama-shi Yamamoto; Noriko Yokohama-shi Yurino; Hisanori Yokohama-shi Nasu
Original assignee: Hitachi Software Engineering Co Ltd
Current assignee: Hitachi Software Engineering Co Ltd
Priority date: 1998-09-04
Filing date: 1999-07-30
Publication date: 2006-03-09
Anticipated expiration: 2019-07-31
Also published as: DE69924681D1; JP2000078998A; EP0983795A2; EP0983795A3; JP3445501B2; US6071702A; EP0983795B1

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft Methoden zur Herstellung eines sondentragenden Elementes, welches Sonden trägt, die der Detektion von DNA oder von Protein in einer Probe durch Hybridisierungsreaktion dienen, sowie ein Element gemäß Anspruch 1, welches mehrere flächige Körper umfasst, welche Biopolymersonden tragen.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
In der Molekularbiologie und der Biochemie werden von Organismen stammende Biopolymere wie z.B. Nukleinsäuren und Proteine identifiziert und fraktioniert, um nach nützlichen Genen zu suchen oder Krankheiten zu diagnostizieren. Als Vorbehandlung zu einer solchen Identifizierung und Fraktionierung wird häufig eine Hybridisierungsreaktion eingesetzt, in welcher ein Zielmolekül in einer Probe mit einer Nukleinsäure oder einem Protein mit bekannter Sequenz hybridisiert wird. Zu diesem Zweck wird ein als Biochip bezeichnetes sondentragendes Element verwendet, welches Sonden wie z.B. DNA, RNA, Protein o.ä. mit bekannten Sequenzen an vorbestimmten Stellen trägt.
Das sondentragende Element weist mehrere Strukturen auf, an denen jeweils verschiedene Sonden gebunden sind. Das sondentragende Element wird zusammen mit einer DNA-Probe in ein als Kammer bezeichnetes Reaktionsgefäß gebracht, so daß die fluoreszenzmarkierte DNA-Probe mit den an die Strukturen des sondentragenden Elementes gebundenen Sonden hybridisiert. Sodann wir das sondentragende Element mit Anregungslicht bestrahlt, wobei die Intensität der Fluoreszenz an sämtlichen Strukturen gemessen wird, um das Ausmaß der Bindung zwischen den jeweiligen Sonden und der DNA-Probe zu bestimmen. Die Ergebnisse können als vorteilhafte Informationen genutzt werden.
Üblicherweise wird, wie in der US 5445934 beschrieben, ein sondentragendes Element in Einzelschritten hergestellt, in denen jeweils ein Protein oder eine DNA-Sonde auf einer Struktur des sondentragenden Elementes synthetisiert wird. Diese herkömmliche Methode ist aufwändig und zeitraubend und erhöht somit die Kosten des sondentragenden Elementes.
Dies führt dazu, dass sondentragende Elemente zur allgemeinen Verwendung z.B. in Krankenhäusern zur Diagnose genetischer Krankheiten ungeeignet sind. Zudem können nicht alle Arten von DNA als Sonden verwendet werden, da die Synthese bezüglich der Herstellung langer Sonden begrenzt ist.
Die WO 95/11755 offenbart ein Substrat, auf welchem sich diskrete und isolierte Bindungsreaktionsstellen befinden.
Die vorliegende Erfindung wurde in Anbetracht obiger Probleme entwickelt und zielt auf die Bereitstellung eines sondentragendes Elementes, welches sich zur Massenproduktion eignet und eine stabile Qualität aufweist, sowie eines Verfahrens zur Herstellung des sondentragenden Elementes.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Ein nach den erfindungsgemäßen Methoden hergestelltes sondentragendes Element umfasst einen flächigen Körper mit mehreren Durchgangslöchern, deren jedes eine Biopolymersonde trägt. Der flächige Körper kann eine Dicke zwischen 100 μm und 2 mm besitzen und kann aus Glas, Acrylharz, Metall oder Kunststoff bestehen. Vorzugsweise beträgt der Durchmesser des Durchgangsloches ungefähr 10–100 μm, unter Berücksichtigung der Probenanzahl relativ zu der Größe des Elementes, der Menge der zur Hybridisierung benötigten Sonden und der Detektionsempfindlichkeit. Die Durchgangslöcher werden vorzugsweise in konzentrischen Kreisen oder in einer Spirale angeordnet.
Die Durchgangslöcher tragen jeweils verschiedene Sorten von Sonden. Mindestens eine der Sonden kann eine Länge von 200 Basen oder mehr besitzen. Die Sonde kann DNA, RNA oder ein Protein sein. Mindestens eine Oberfläche jedes der flächigen Körper kann mit einem Klebemittel versehen sein. Es ist auch möglich, daß keine der beiden Oberflächen der flächigen Körper ein Klebemittel trägt.
In einem Aspekt ist die vorliegende Erfindung eine Methode zur Herstellung eines flächigen sondentragenden Elementes mit mehreren Biopolymersonden tragenden Durchgangslöchern, welche folgende Schritte umfasst: Stapeln mehrerer flächiger Körper; Injizieren einer Biopolymersonde in jedes der Durchgangslöcher zur Erzeugung eines Elementes nach Anspruch 1; und anschließende Trennung der flächigen Körper voneinander.
In einem weiteren Aspekt ist die vorliegende Erfindung eine Methode zur Herstellung eines flächigen sondentragenden Elementes mit mehreren Biopolymersonden tragenden Durchgangslöchern, welche folgende Schritte umfasst: Erzeugung mehrerer Durchgangslöcher durch ein blockartiges Material; Injizieren einer Biopolymersonde in jedes der Durchgangslöcher; und Zerschneiden des blockartigen Materials in flächige Einheiten dergestalt, dass jede flächige Einheit die Durchgangslöcher aufweist.
Der Stapel flächiger Körper oder das Blockmaterial kann durch Laserbestrahlung mit Durchgangslöchern versehen werden. Die Durchgangslöcher werden vorzugsweise vorbehandelt, um eine Bindung zwischen den Durchgangslöchern und den Sonden zu befördern, bevor die Sonden in die Durchgangslöcher injiziert werden. Die Vorbehandlung kann durchgeführt werden, indem die Durchgangslöcher mit Poly-L-Lysin oder Carbodiimid beschichtet werden (japanische Offenlegungsschrift Nr. 8-23975 ( EP 710 666 A )).
KURZBESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 ist eine schematische Draufsicht, die ein exemplarisches erfindungsgemäßes sondentragendes Element zeigt;
2 ist eine schematische Draufsicht, die ein weiteres exemplarisches erfindungsgemäßes sondentragendes Element zeigt;
3 ist eine schematische Schnittansicht, die ein exemplarisches erfindungsgemäßes sondentragendes Element zeigt;
4 ist eine schematische Schnittansicht, die ein weiteres exemplarisches erfindungsgemäßes sondentragendes Element zeigt;
5 ist eine Perspektivansicht zur Illustration eines der Schritte in der Methode zur Herstellung eines erfindungsgemäßen sondentragendes Elementes;
6 ist eine Perspektivansicht zur Illustration eines der Schritte in der Methode zur Herstellung des erfindungsgemäßen sondentragendes Elementes;
7 ist eine Perspektivansicht zur Illustration eines der Schritte in der Methode zur Herstellung des erfindungsgemäßen sondentragendes Elementes;
8 ist eine Perspektivansicht zur Illustration eines der Schritte in der Methode zur Herstellung des erfindungsgemäßen sondentragendes Elementes;
9A und 9B sind schematische Ansichten, die ein Beispiel eines mehrere flächige Einheiten befestigenden Befestigungsgliedes zeigen;
10 ist eine schematische Ansicht, die einen der Schritte in einer weiteren exemplarischen Methode zur Herstellung eines erfindungsgemäßen sondentragenden Elementes zeigt; und
11 ist eine schematische Ansicht, die einen der Schritte in einer weiteren exemplarischen Methode zur Herstellung eines erfindungsgemäßen sondentragenden Elementes zeigt.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Im folgenden wird die vorliegende Erfindung anhand von Beispielen mit Bezug auf die beiliegenden Zeichnungen eingehender beschrieben.
1 und 2 sind schematische Draufsichten, die exemplarische, gemäß den Methoden der vorliegenden Erfindung hergestellte sondentragende Elemente 1 bzw. 2 zeigen. Das in 1 gezeigte sondentragende Element 1 hat einen kreisförmigen Hauptkörper 10 mit mehreren, in konzentrischen Kreisen angeordneten Durchgangslöchern 13. Jedes der Durchgangslöcher 13 trägt eine Biopolymersonde. Das in 2 gezeigte sondentragende Element 2 hat einen kreisförmigen Hauptkörper 11 mit mehreren, in einer Spirale angeordneten Durchgangslöchern 14. Auch hier trägt jedes der Durchgangslöcher 14 eine Biopolymersonde. Die Form des sondentragenden Elementes muß nicht wie in 1 und 2 gezeigt ein Kreis sein, sondern kann auch ein Polygon, z.B. ein Quadrat oder ein Sechseck, sein.
3 und 4 sind schematische Schnittansichten, die exemplarische, gemäß den Methoden der vorliegenden Erfindung hergestellte sondentragende Elemente 3 bzw. 4 zeigen. Das in 3 gezeigte sondentragende Element 3 hat einen flächigen Hauptkörper 15 mit mehreren durch diesen verlaufenden Durchgangslöchern 16. Das in 4 gezeigte sondentragende Element 4 hat einen flächigen Körper 17 mit mehreren durch diesen verlaufenden Durchgangslöchern 18 sowie ein Verstärkungsglied 19, welches, z.B. mittels eines Klebemittels, an der unteren Oberfläche des flächigen Körpers 17 befestigt ist.
Die flächigen Körper 15 und 17 können aus einem Material bestehen, welches bei einer Temperatur bis zu ungefähr 100°C und bei einer Luftfeuchtigkeit bis zu ungefähr 100% nicht denaturiert, beispielsweise aus Glas, einem Metall wie z.B. rostfreiem Stahl oder Aluminium, einem Kunststoff wie z.B. Polycarbonat, Polyethylen oder Polypropylen, einem Acrylharz oder ähnlichem. Die Dicke der flächigen Körper 15 und 17 beträgt geeigneterweise ungefähr 100 μm bis 2 mm. Das Verstärkungsglied 19 dient der physischen Verstärkung des flächigen Körpers 17 sowie der einfacheren Handhabung des sondentragenden Elementes 4. Das Verstärkungsglied 19 kann eine Glasplatte, eine Kunststoffplatte, eine Aluminiumplatte oder ähnliches mit einer Dicke von ungefähr 1 mm bis 5 mm sein. Das Verstärkungsglied 19 ist mit einem Klebemittel wie z.B. einem Acrylharzklebstoff, einem Ethylenvinylazetatklebstoff oder einem Elastomerklebstoff an dem flächigen Körper 17 befestigt.
Der Durchmesser der Durchgangslöcher 13, 14, 16 und 18 beträgt ungefähr 10 μm bis 100 μm. Jedes der Durchgangslöcher 13, 14, 16 und 18 trägt in seinem Inneren (Innenwand) eine Sonde, welche in der Lage ist, mit einem Biopolymer wie z.B. DNA, RNA, Protein o.ä. mit spezifischen Sequenzen zu hybridisieren. Während in einer herkömmlichen Methode die Sorten (Längen) der Sonden-DNA beschränkt sind, kann das erfindungsgemäße sondentragende Element jede Sorte von DNA unabhängig von ihrer Länge als Sonde verwenden.
Im folgenden wird exemplarisch eine Methode zur Herstellung eines erfindungsgemäßen sondentragenden Elementes beschrieben. In diesem Beispiel wird ein flächiger Körper aus Polypropylen hergestellt.
5 ist eine Perspektivansicht zur Illustration eines der Schritte in der Methode zur Herstellung des erfindungsgemäßen sondentragenden Elementes. Ungefähr einige dutzend bis einige hundert flächige Polypropylenkörper 22 (Dicke: ungefähr 100 μm) werden gestapelt und mittels einer zwischen ihnen aufgebrachten dünnen Lage Klebemittel 21 verklebt. Die Anzahl der flächigen Polypropylenkörper 22 wird abhängig von einer Sorte und einer Ausgangsleistung des für den unten beschriebenen Laserprozess verwendeten Lasers geeignet gewählt. Beispielsweise kann ein CO₂-Laser mit einer Ausgangsleistung von 0,2 kW verschiedene Harzsorten mit einer Dicke von ungefähr 3 mm schneiden. Dieser Laser kann somit ein Durchgangsloch durch maximal 30 flächige Polypropylenkörper gleichzeitig erzeugen. Das Klebemittel ist beispielsweise ein Elastomerklebstoff, der sich bei Anwendung einer äußeren Kraft leicht ablöst.
6 ist eine Perspektivansicht zur Illustration eines der Schritte in der Methode zur Herstellung des erfindungsgemäßen sondentragenden Elementes. Durch einen von einer Lasereinheit 26 ausgehenden Laserstrahl 27 werden mehrere Durchgangslöcher 28 durch den Stapel flächiger Körper 25 erzeugt. Die Lasereinheit 26 kann beispielsweise Rubinlaser, Neodymglaslaser, CO₂-Laser oder YAG-Laser verwenden. Der Durchmesser jedes der mit der Lasereinheit 26 erzeugten Durchgangslöcher 28 beträgt ungefähr 10 bis 100 μm. Die Durchgangslöcher 28 sind wie in 1 bzw. 2 gezeigt in konzentrischen Kreisen oder in einer Spirale angeordnet.
Anschließend wird der Stapel flächiger Polypropylenkörper 25 mit den Durchgangslöchern 28 vorbehandelt, um die Bindung zwischen den Innenwänden der Durchgangslöcher 28 und anzubringenden Biopolymersonden zu befördern. Die Vorbehandlung kann beispielsweise durchgeführt werden, indem die Innenwände der Durchgangslöcher 28 mit Poly-L-Lysin oder mit Carbodiimid beschichtet werden. Die Beschichtung mit Poly-L-Lysin wird wie folgt durchgeführt. Zuerst wird der Stapel flächiger Polypropylenkörper 25 fünf Minuten lang bei 18–26°C in eine Poly-L-Lysin-Lösung getaucht und geschüttelt. Dann wird der Stapel flächiger Polypropylenkörper 25 aus der Poly-L-Lysin-Lösung herausgenommen, eine Stunde lang bei 60°C in einen Ofen gestellt und schließlich auf Raumtemperatur gekühlt. Die Beschichtung mit Carbodiimid wird durchgeführt, indem der Stapel flächiger Polypropylenkörper 25 in eine Carbodiimid-Lösung getaucht und geschüttelt wird.
Anschließend wird nach irgendeiner Methode eine Biopolymersonde in jedes Durchgangsloch 28 des Stapels flächiger Polypropylenkörper 25 injiziert. Beispielsweise wird Sonden-DNA in einer Spritze mit einer dünnen Nadel aufgezogen, die in das Durchgangsloch 28 eingeführt werden kann, um dadurch die Sonden-DNA zu injizieren. Wahlweise kann die Sonden-DNA auch an der dem Einführen der Nadel gegenüberliegenden Seite durch Vakuumsog aus der Nadel herausgezogen werden.
Anschließend wird wie in 7 gezeigt der Stapel flächiger Polypropylenkörper 25 mit einer Lasereinheit, einer Drahtsäge o.ä. in einen säulenartigen Block 30 (8) mit einem Durchmesser von ungefähr 2 cm geschnitten. Der in 7 gezeigte Schneideschritt kann vor dem Schritt, in dem die Durchgangslöcher 28 vorbehandelt werden, um die Bindung zwischen den Durchgangslöchern 28 und den Biopolymersonden zu befördern, oder vor dem Schritt, in dem die Sonden in die Durchgangslöcher 28 injiziert werden, durchgeführt werden.
Schließlich werden die flächigen Polypropylenkörper 22 mit den Biopolymersonden voneinander getrennt.
Somit ist eine Massenproduktion identischer sondentragender Elemente mit verschiedenen Proben an denselben Stellen möglich. Durch Wahl der Sorte und der Ausgangsleistung des Lasers kann die Anzahl der gleichzeitig verarbeiteten flächigen Körper angepasst werden, während mehrere hundert sondentragende Elemente gleichzeitig hergestellt werden können. Der flächige Propylenkörper 22 kann selbst als sondentragendes Element verwendet werden, oder er kann wie oben mit Bezug auf 4 beschrieben zwecks physischer Verstärkung und einfacherer Handhabung auf ein Verstärkungsglied (wie z.B. eine Glasplatte, eine Kunststoffplatte oder eine Metallplatte o.ä. mit einer Dicke von ungefähr 1–5 mm) geklebt werden.
Es mag nicht notwendig sein, sämtliche der flächigen Polypropylenkörper bei der Verarbeitung miteinander zu verkleben, falls sie mit einem Befestigungsglied o.ä. mechanisch befestigt werden können. 9A und 9B sind schematische Ansichten, die ein Beispiel eines Befestigungsgliedes 40 zur Befestigung mehrerer flächiger Körper ohne Klebemittel zeigen. Das schachtelartige Befestigungsglied 40 hat einen Innenraum zur Aufnahme einer vorbestimmten Anzahl flächiger Körper 46. Das schachtelartige Befestigungsglied 40 läßt sich wie in 9A gezeigt an Ebenen 41 und 42 öffnen. Die obere Ebene 41 und die gegenüberliegende untere Ebene sind mit kreisförmigen Öffnungen 43 bzw. 44 versehen. Die Größe der kreisförmigen Öffnungen wird so bestimmt, daß die durch die Öffnungen 43 und 44 freigelegten Oberflächen der flächigen Körper größer sind als die Fläche, die mit der Lasereinheit 26 (6) mit Durchgangslöchern 28 versehen werden soll.
Im besonderen werden die Ebenen 41 und 42 ausgefaltet, um einen vorbestimmten Stapel flächiger Körper in das Befestigungsglied 40 zu bringen. Anschließend werden die Ebenen 41 und 42 wieder eingefaltet, um wie in 9B gezeigt eine Schachtel zu bilden. Eine Lasche 45 wird zur Versiegelung der Schachtel beispielsweise mit einem Klebemittel versehen, so dass die flächigen Körper 46 sich innerhalb des Befestigungsgliedes 40 nicht bewegen. Die durch die Öffnung 43 freigelegte Fläche des flächigen Körpers 46 wird der oben mit Bezug auf 6 beschriebenen Laserbearbeitung unterzogen, um mehrere Durchgangslöcher 28 in konzentrischen Kreisen oder in einer Spirale zu erzeugen. Wie oben beschrieben werden die Innenwände der Durchgangslöcher 28 mit Poly-L-Lysin oder Carbodiimid beschichtet, bevor Biopolymersonden in die Durchgangslöcher 28 injiziert werden.
10 ist eine schematische Ansicht, die einen der Schritte in einer weiteren exemplarischen Methode zur Herstellung eines erfindungsgemäßen sondentragenden Elementes zeigt. Das sondentragende Element wird aus einem säulenartigen Block aus Glas, Acrylharz, Metall oder Kunststoff hergestellt. Wie in 10 gezeigt werden mit einer Lasereinheit 51 mehrere Durchgangslöcher 52 durch den säulenartigen Block 50 erzeugt, der beispielsweise aus Polypropylen besteht. Die Durchgangslöcher 52 sind in konzentrischen Kreisen oder in einer Spirale angeordnet. Der Durchmesser der Durchgangslöcher 52 beträgt ungefähr 10–100 μm.
Die Innenwände der Durchgangslöcher 52 werden wie oben beschrieben mit Poly-L-Lysin oder Carbodiimid beschichtet. Anschließend werden Sonden wie z.B. DNA, Protein o.ä. in die Durchgangslöcher 52 injiziert, um daran gebunden zu werden. Die Sonden werden wie oben beschrieben injiziert. Wie in 11 gezeigt wird der säulenartige Polypropylenblock 50, in den die Sonden injiziert wurden, von einem Laserstrahl 54 einer Lasereinheit, einer Drahtsäge, einer Bandsäge o.ä. in flächige Körper mit einer Dicke von ungefähr 100 μm zerschnitten. Die auseinandergeschnittenen flächigen Propylenkörper 55 werden einzeln als sondentragende Elemente verwendet. Der flächige Polypropylenkörper 55 kann selbständig verwendet werden, oder er kann wie mit Bezug auf 4 beschrieben auf ein Verstärkungsglied wie z.B. eine Glasplatte, eine Kunststoffplatte oder eine Metallplatte (Dicke: 1–5 mm) geklebt werden. Somit ist eine Massenproduktion identischer sondentragender Elemente mit verschiedenen Proben an denselben Stellen möglich.
Gemäß der vorliegenden Erfindung ist eine Massenproduktion sondentragender Elemente zu geringen Kosten mit weniger Zeit und Aufwand möglich.

Claims

Element, umfassend mehrere übereinander gestapelte flächige Körper, wobei jeder dieser flächigen Körper mehrere Durchgangslöcher aufweist, wobei: einander entsprechende Löcher in besagten flächigen Körpern so zueinander positioniert sind, daß sie Durchgangslöcher bilden, die besagtes Element in der Richtung durchdringen, in der besagte flächige Körper gestapelt sind, wobei besagte Löcher in besagten flächigen Körpern je eine Biopolymersonde beinhalten.
Element aus gestapelten flächigen Körpern nach Anspruch 1, wobei die Dicke des flächigen Körpers 100 μm bis 2 mm beträgt.
Element aus gestapelten flächigen Körpern nach Anspruch 1 oder 2, wobei der flächige Körper aus Glas, Acrylharz, Metall oder Kunststoff besteht.
Element aus gestapelten flächigen Körpern nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei jedes der Durchgangslöcher einen Durchmesser von 10 μm bis 100 μm hat.
Element aus gestapelten flächigen Körpern nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die Durchgangslöcher in konzentrischen Kreisen oder in einer Spirale angeordnet sind.
Element aus gestapelten flächigen Körpern nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei mindestens eine der Sonden in den Durchgangslöchern eine Länge von 200 oder mehr Basen aufweist.
Element aus gestapelten flächigen Körpern nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei die Sonde DNA, RNA oder ein Protein ist.
Element aus gestapelten flächigen Körpern nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei mindestens eine Oberfläche des flächigen Körpers mit einem Klebemittel versehen ist.
Methode zur Herstellung eines Elementes mit mehreren Biopolymersonden tragenden Durchgangslöchern, die folgende Schritte umfasst: Stapeln mehrerer flächiger Körper; Erzeugen mehrerer Durchgangslöcher durch die gestapelten flächigen Körper; Injizieren einer Biopolymersonde in jedes der Durchgangslöcher; Trennen der flächigen Körper voneinander.
Methode zur Herstellung eines flächigen sondentragenden Elementes mit mehreren Biopolymersonden tragenden Durchgangslöchern, die folgende Schritte umfasst: Erzeugen mehrerer Durchgangslöcher durch ein blockartiges Material; Injizieren einer Biopolymersonde in jedes der Durchgangslöcher; Zerschneiden des blockartigen Materials in flächige Körper, so dass jeder flächige Körper die Durchgangslöcher aufweist.
Methode zur Herstellung eines flächigen sondentragenden Elementes nach Anspruch 9 oder 10, wobei der Schritt zur Erzeugung mehrerer Durchgangslöcher Laserstrahlung einsetzt.
Methode zur Herstellung eines flächigen sondentragenden Elementes nach einem der Ansprüche 9 bis 11, wobei vor dem Schritt des Injizierens einer Biopolymersonde in jedes der Durchgangslöcher die Durchgangslöcher zur Beförderung einer Bindung zwischen den Durchgangslöchern und der Biopolymersonde vorbehandelt werden.
Methode zur Herstellung eines flächigen sondentragenden Elementes nach Anspruch 12, wobei die Vorbehandlung durchgeführt wird, indem die Durchgangslöcher mit Poly-L-Lysin oder Carbodiimid beschichtet werden.