DE69922679T2

DE69922679T2 - EXPRESSION UND SEKRETION VON icIL-1 REZEPTORANTAGONIST TYP II

Info

Publication number: DE69922679T2
Application number: DE69922679T
Authority: DE
Inventors: Hagit Amitai; Edith Chitlaru
Original assignee: Interpharm Laboratories Ltd; Applied Research Systems ARS Holding NV
Current assignee: Merck Serono SA; Interpharm Laboratories Ltd
Priority date: 1998-10-14
Filing date: 1999-10-14
Publication date: 2005-05-19
Anticipated expiration: 2019-10-15
Also published as: JP2002527071A; IL142505A0; SI1121448T1; ATE284964T1; WO2000022146A1; EP1121448A1; DK1121448T3; AU6226899A; IL126562A0; EP1121448B1; ES2229772T3; US20060293230A1; CA2344711A1; DE69922679D1; AU765078B2; PT1121448E

Description

Feld der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft die Expression und Sekretion von rekombinanten Proteinen, die durch DNA-Plasmidexpressionsvektoren in Säugerzellen hergestellt werden. Insbesondere betrifft diese Erfindung die rekombinante Herstellung von intrazellulärem IL-1-Rezeptorantagonist (icIL-1ra) Typ II durch kultivierte COS- und CHO-Zellen unter Verwendung von DNA-Expressionsvektoren, die die genomische DNA-Sequenz des Signalpeptids des menschlichen Wachstumshormons (human growth hormone, hGH) und die cDNA von icIL-1ra Typ II enthalten.
Hintergrund der Erfindung
IL-1 (IL-1α und IL-1β) ist ein pleiotropes Zytokin, das eine Reihe von Wirkungen auf unterschiedliche Gewebe ausübt (Dinarello, 1991). IL-1 wirkt sich auf fast jeden Zelltyp aus, entweder allein oder in Synergie mit anderen Zytokinen (Dinarello, 1996). Zwei natürliche negative Regulationswege kontrollieren strikt die potenten inflammatorischen Wirkungen von IL-1 unter physiologischen Bedingungen. Einer ist IL-1-Rezeptor Typ II, welcher ein nichtsignalisierendes IL-1-bindendes Molekül auf der Zelloberfläche ist, das als ein Köderziel für IL-1 wirkt (Colotta et al., 1993; Sims et al., 1993; Colotta et al., 1994). Der zweite ist ein einziges IL-1-Rezeptorantagonistpolypeptid (IL-1ra) (Hannum et al., 1990; Eisenberg et al., 1990; Carter et al., 1990), das beide IL-1-Oberflächenrezeptoren bindet und Signalisieren vom funktionellen IL-1-Rezeptor inhibiert.
Zwei Formen von IL-1ra wurden identifiziert. Die erste war ein löslicher IL-1ra in sekretierter Form (sIL-1ra), der ein klassisches Signalpeptid mit 25 Aminosäuren enthält (Eisenberg et al., 1990; Carter et al., 1990). Die zweite, die kein Signalpeptid enthält, wurde intrazellulärer IL-1ra (icIL-1ra) genannt (Haskill et al., 1991). Es wurde tatsächlich gefunden, dass icIL-1ra konstitutiv intrazellulär in Keratinozyten und in Epithelzellen exprimiert wurde. Es wurde gezeigt, dass icIL-1ra exogene IL-1-abhängige Antworten inhibiert (Haskill et al., 1991).
Die zwei IL-1ra-Isoformen sind vom selben Gen abgeleitet. Das icIL-1ra-Transkript stammt von einer alternativen Startstelle und von einem Spleißen eines alternativen ersten Exons in einer internen Spleißakzeptorstelle, die sich im ersten Exon von sIL-1ra befindet (Haskill et al., 1991). Diese Proteine sind daher außer an ihrem NH₂-Ende identisch, an dem das Signalpeptid von sIL-1ra mit 21 Aminosäuren durch 3 Aminosäuren in icIL-1ra substituiert ist. Der sIL-1ra und der icIL-1ra haben eine ähnliche Fähigkeit, eine IL-1-Aktivität zu inhibieren (Bertini et al., 1992), obwohl eine Expression der beiden Antagonisten unterschiedlich reguliert ist (Haskill et al., 1991).
Eine weitere Isoform von icIL-1ra, die als icIL-1ra Typ II bezeichnet wurde, wurde kürzlich identifiziert, kloniert und funktionell charakterisiert (Muzio et al., 1995, WO96/12022). Der icIL-1ra Typ II enthält eine weitere Sequenz mit 63 bp im Leseraster, die sich 3 Kodons stromabwärts des Translationsstarts von icIL-1ra befindet. Diese weitere Sequenz ist zwischen dem ersten und dem zweiten Exon der intrazellulären Form von IL-1ra inseriert. Das weitere Exon ist durch ein Extraexon kodiert, welches sich 2 kb stromabwärts des ersten icIL-1ra-spezifischen Exons befindet.
Menschliches Wachstumshormon (human growth hormone, hGH) ist ein Protein mit 191 Aminosäuren, das durch die somatotrophen Zellen der Vorderen Hypophyse synthetisiert und sekretiert wird. Das hGH-Gen enthält fünf Exons und ist von den fünf Mitgliedern der hGH-Genfamilie das am besten charakterisierte (DeNoto et al., 1981). Es wurde gefunden, dass eine in vitro-Transfektion des hGH-Gens in Säugerzellen hohe Spiegel des sekretierten Proteins proportional zu den Spiegeln zytoplasmatischer hGH-mRNA ergab. Daher scheint die Sekretion nicht der geschwindigkeitsbeschränkende Schritt für das Erscheinen von hGH im Kulturmedium zu sein (Selden et al., 1986). Das hGH-Gen schließt ein Signalpeptid mit 26 Aminosäuren ein.
Pecceu et al. (1991) offenbart einen Versuch, das Signalpeptid des menschlichen Wachstumshormons zur Schaffung eines Hybridgens mit der reifen Form von Interleukin-1β (IL-1β) zu verwenden, um Säugerzellen zu veranlassen, rekombinantes IL-1β zu sekretieren. Natürliches IL-1β wird anfänglich als ein intrazelluläres 31-kDa-Vorläuferpolypeptid exprimiert. Wenn eine proteolytische Prozessierung des Vorläufers auftritt, tritt Sekretion des reifen 17-kDa-IL-1β in einer löslichen reifen nichtglykosylierten Form auf. Pecceu offenbart, dass Fusion der reifen Form von IL-1β an die heterologe hGH-Leadersequenz erlaubte, dass das reife IL-1β in reifer Form in CHO-Zellen sekretiert wurde, obwohl die Form, die sekretiert wurde, im Gegensatz zu der nichtglykosilierten natürlichen Form eine glykosilierte Form war. Pecceu offenbart, dass die glykosilierte Form biologisch aktiv ist. Jedoch stellte Pecceu weiterhin fest, dass wenn dem biologisch aktiven Teil von IL-1β nur ein Methionin vorausging und es in CHO-Zellen synthetisiert wurde, ein nennenswerter Prozentwert des hergestellten IL-1β ganz unerwarteterweise im Kulturmedium gefunden wurde. Diese Offenbarung lässt in gewissem Umfang Zweifel zurück, ob es das hGH-Signalpeptid war, was die Expression des IL-1β in den CHO-Zellen verursachte, oder ob eine derartige Expression spezifisch für den Mechanismus war, der in dieses besondere Protein involviert war, wobei dessen reife Form natürlicherweise sekretiert wird, nachdem ein Vorläuferprotein intrazellulär exprimiert wird und dann gespalten wird, um das reife Protein zu bilden, welches sekretiert wird. Desweiteren berichtet Pecceu keine Ergebnisse, ob die nichtnatürliche glykosilierte Form von IL-1β eine immunologische Reaktion schafft, wenn sie einem Menschen verabreicht wird, oder ob sie als Selbst-Protein erkannt wird.
Spezifische Situationen, die die rekombinante Produktion von nichtsekretorischen Proteinen durch Fusion eines Signalpeptids eines anderen sekretorischen Proteins involvieren, werden in Bjorkdahl et al. (1997) und Komada et al. (1997) offenbart.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Herstellung eines rekombinanten intrazellulären Proteins icIL-1ra Typ II in Säugerzellen bereit. Insbesondere stellt die Erfindung ein Verfahren zur Konstruktion von Proteinen bereit, die durch Verwendung eines Signalpeptids sekretiert werden sollen, das aus hGH in verschiedenen Expressionsvektoren abgeleitet ist, und um die sekretierten Proteine in verschiedenen Säugerzellen herzustellen.
Beschreibung der Figuren
Die 1A–1C zeigen in 1A die genomische hGH-Signalpeptid-DNA-Sequenz (SEQ ID NO: 1), seine Aminosäuresequenz (SEQ ID NO: 2) und die Primer P1 und P2, in 1B den Anfang (SEQ ID NO: 3) und das Ende (SEQ ID NO: 5) der icIL-1ra Typ II-cDNA, ihre Aminosäuresequenzen (SEQ ID NO: 4 und NO: 6) und Primer P3 und P4, die zur Konstruktion von Fusionskonstrukten verwendet wurden, und in 1C eine schematische Darstellung von Matrizen und Primern.
P1: hGH-sp 5'-Primer, der eine HindlII-Restriktionsstelle enthält (SEQ ID NO: 7).
P2: hGH-sp 3'-Primer, der einen 3'-icIL-1ra-II-Segeuenzüberhang enthält (SEQ ID NO: 8).
P3: icIL-1ra-II 5'-Primer, der einen 5' hGH-sp-Sequenzüberhang enthält (SEQ ID NO: 9).
P4: icIL-1ra-II 3'-Primer, der zwei Stopkodons und eine BamHI-Restriktionsstelle enthält (SEQ ID NO: 10).
Die 2A–2C beschreiben in 2A die Konstruktion des pCDIC und in
2B die Konstruktion von pSGHIRA2-DNA-Vektoren, die zur Expression des icIL-1ra Typ II in Säugerzellen verwendet werden. 2C ist ein Schema von pDHFR.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Die natürliche Form vom icIL-1ra Typ II wird intrazellulär exprimiert und wird nicht durch die Zellen sekretiert, in denen es hergestellt wird. Jedoch kann dieses Protein in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung in einem rekombinanten Säugerproduktionssystem sekretiert werden, indem die DNA, die das Protein kodiert, an die DNA fusioniert wird, die das Signalpeptid des menschlichen Wachstumshormongens mit 26 Aminosäuren kodiert.
Vor der vorliegenden Erfindung konnte nicht vernünftig vorhergesagt werden, ob oder ob das hGH-Signalpeptid nicht die Expression von icIL-1ra-II in einem Säugerzellexpressionssystem in Hinblick auf die Tatsache treiben würde, dass icIL-1ra-II natürlicherweise nur intrazellulär exprimiert wird und nicht aus der Zelle sekretiert wird. Im bekannten Stand der Technik, wie durch Pecceu et al. (1991) dargestellt, wurde das hGH-Signalpeptid verwendet, um die reife Form von IL-1β zu exprimieren und zu sekretieren. Jedoch wird die reife Form von IL-1β natürlicherweise aus den Zellen sekretiert, in denen es hergestellt wird, obwohl indirekt. Zunächst wird ein Vorläuferprotein hergestellt, welches nach intrazellulärem Prozessieren aus der Zelle sekretiert wird. Jedoch offenbart Pecceu, dass wenn ein rekombinanter Vektor verwendet wird, der nur die DNA enthält, die die reife Form von IL-1β ohne jedes Signalprotein kodiert, das Protein aus CHO-Zellen sekretiert wird. Daher konnte nicht mit einem vernünftigen Grad an Sicherheit vorhergesagt werden, dass bewirkt werden könnte, dass ein Protein wie z. B. icIL-1ra-II, welches nur intrazellulär exprimiert wird und nicht natürlicherweise aus der Zelle sekretiert wird, in großen Mengen in einem rekombinanten Säugerexpressionssystem sekretiert wird, wenn es an ein hGH-Signalpeptid fusioniert wird.
Das icIL-1ra-II-Protein, das in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung hergestellt wird, ist glykosiliert, während das natürliche Protein nicht glykosiliert ist. Daher betrifft die vorliegende Erfindung weiterhin zwei neue glykosilierte Formen von icIL-1ra-II, die mittels der vorliegenden Erfindung zum ersten Mal hergestellt werden. Dies sind die glykosilierten Formen, die ein scheinbares Molekulargewicht von annähernd 27 kDa und 30 kDa haben, wie durch Commassie-Blue-Färbung von SDS-PAGE (15% Acrylamid unter reduzierenden Bedingungen) bestimmt wurde. Es konnte nicht mit vernünftigem Grad an Sicherheit vorhergesagt werden, ob die neuen glykosilierten Formen von icIL-1ra-II die biologische Aktivität von natürlichem icIL-1ra-II behalten werden und ob sie nicht immunogen sein werden, wenn sie an Menschen verabreicht werden. Experimente mit diesen zwei neuen glykosilierten Formen von icIL-1ra-II weisen nach, dass sie in der Tat biologisch aktiv und nicht immunogen sind, wenn sie an Menschen verabreicht werden.
Entsprechend ist die vorliegende Erfindung auf ein Verfahren zur rekombinanten Expression eines Proteins, das die Aminosäuresequenz von natürlichem icIL-1ra-II hat, in einem rekombinanten Zellexpressionssystem durch Verwendung eines Vektors gerichtet, welcher eine Fusion eines Signalpeptids des Signalpeptids von hGH mit 26 Aminosäuren ist, das in richtigem Leseraster mit der DNA fusioniert ist, die icIL-1ra-II kodiert. Das Verfahren umfasst Herstellung eines Expressionsvektors, enthaltend DNA kodierend icIL-1ra-II, entweder in Form von cDNA oder genomischer DNA, fusioniert in richtigem Leseraster mit DNA kodierend das hGH-Signalpeptid mit 26 Aminosäuren. Der Expressionsvektor wird dann in einen geeigneten Expressionswirt inseriert, wie z. B. CHO-Zellen. Die transformierten Wirtszellen werden dann auf eine Weise kultiviert, die den Expressionsvektor veranlasst, sein kodiertes Protein zu exprimieren, und das exprimierte und sekretierte icIL-1ra-II-Protein wird dann gesammelt und aus dem Kulturmedium gereinigt.
Es ist nicht beabsichtigt, die vorliegende Erfindung durch die spezifischen hier dargestellten Beispiele zu beschränken. Während CHO-Zellen als Wirtszellen verwendet werden, kann ein beliebiges anderes eukaryotisches Expressionssystem, vorzugsweise ein Säugerexpressionssystem, wie z. B. COS-Zellen, Hefezellen, Insektenzellen etc. verwendet werden. Die Fachleute kennen Techniken zur Schaffung von Expressionsvektoren, zu ihrer Insertion in Expressionssysteme und zur Selektion von Klonen gut, die das gewünschte Protein exprimieren und die Amplifikationstechniken einschließen.
Wie von den Fachleuten erkannt würde, können die Promotortypen, die verwendet werden, um die Transkription von icIL-1ra-II-Proteinen zu kontrollieren, beliebige in den Wirtszellen funktionale Typen sein. Beispiele von funktionalen Promotoren in Säugerzellen schließen den SV40-"early"-Promotor, den Adenovirus-"major-late"-Promotor, den Thymidinkinasepromotor von Herpes simplex (HSV), den LTR-Promotor von Rous sarcoma (RSV), den "immediate-early"-Promotor des menschlichen Cytomegalovirus (CMV), den LTR-Promotor des Maus-Mamma-Tumor-Virus (MMTV), den Interferon-β-Promotor, den Promotor des Hitzeschockproteins 70 (hsp 70) als auch viele andere im Stand der Technik gut bekannte Promotoren ein. Diese Promotoren können entweder konstitutiv oder regulierbar sein. Konstitutive Promotoren werden bevorzugt, weil ein extra Behandlungsschritt, wie z. B. eine Temperaturverschiebung, Hinzufügen von chemischen Mitteln oder Inducern etc. zur Expression von konstitutiven Promotoren nicht benötigt wird, wobei alles weitere gleich ist.
Der technische Fortschritt der vorliegenden Erfindung liegt in der Bestätigung, dass icIL-1ra-II in einem derartigen Expressionssystem sekretiert werden kann, wenn ein Signalpeptid eines menschlichen sekretorischen Proteins verwendet wird, vorzugsweise hGH. Alle anderen involvierten Techniken sind dem Fachmann wohlbekannt und können ohne unzumutbares Experimentieren ausgeübt werden, wobei nur die Kenntnisse des Fachmannes verwendet werden, die zum Zeitpunkt der vorliegenden Erfindung verfügbar waren.
Die vorliegende Erfindung ist weiterhin auf den Expressionsvektor gerichtet, welcher die icIL-1ra-II-DNA enthält, die an die DNA fusioniert ist, die ein Signalprotein des menschlichen sekretorischen Proteins hGH kodiert, und ist auf Wirtszellen gerichtet, die mit einem derartigen Expressionsvektor transfiziert sind.
Die vorliegende Erfindung ist weiterhin auf die neuen glykosilierten Formen von icIL-1ra-II gerichtet, die in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung hergestellt werden.
Die Erfindung betrifft weiterhin Verfahren zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Verminderung der Menge von IL-1 in Patienten, die ein Leiden haben, das die Überexpression von IL-1 involviert, durch die Verwendung einer der neuen glykosilierten icIL-1ra-II-Proteine in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung. Geeignete therapeutische Dosierungen zur Verminderung von IL-1 in Patienten, die ein derartiges Leiden haben, können von Fachleuten leicht empirisch bestimmt werden.
Die glykosilierten icIL-1ra-II-Proteine der vorliegenden Erfindung können durch beliebige Mittel verabreicht werden, die den beabsichtigten Zweck erzielen. Eine Verabreichung kann z. B. eine Anzahl verschiedener parenteraler Routen sein, einschließend, aber nicht beschränkt auf subkutane, intravenöse, intradermale, intramuskuläre, intraperitoneale, intracerebrale, intranasale, orale, transdermale oder bukkale Wege. Eine parenterale Verabreichung kann eine Bolusinjektion oder eine Verabreichung durch graduierte Perfusion über die Zeit sein.
Es versteht sich, dass die verabreichte Dosierung vom Alter, dem Geschlecht, der Gesundheit und dem Gewicht des Empfängers abhängt, von der Art einer gleichzeitigen Behandlung, wenn eine solche stattfindet, der Häufigkeit der Behandlung und der Art der erwünschten Wirkung. Die für jede Behandlung benötigte Gesamtdosis kann in mehrfachen Dosen oder in einer einzelnen Dosis verabreicht werden. Mit „wirksamer Menge" ist eine Konzentration von glykosiliertem icIL-1ra-II-Protein gemeint, die fähig ist, die Menge von IL-1 in Patienten zu vermindern, die ein Leiden haben, das erhöhte Spiegel von IL-1 involviert. Derartige Konzentrationen können routinemäßig durch Fachleute bestimmt werden. Fachleute erkennen ebenso, dass die Dosierung von der Stabilität des verabreichten Proteins abhängig sein kann. Ein weniger stabiles Protein kann die Verabreichung in mehrfachen Dosen notwendig machen.
Die Erfindung betrifft ebenso eine pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend das glykosilierte icIL-1ra-II-Protein der vorliegenden Erfindung mit einem pharmazeutisch akzeptablen Träger.
Präparationen zur parenteralen Verabreichung schließen sterile wässerige oder nichtwässerige Lösungen, Suspensionen und Emulsionen ein, die Hilfsmittel oder Träger enthalten können, die im Stand der Technik bekannt sind.
Pharmazeutische Zusammensetzungen, umfassend das erfindungsgemäße glykosilierte icIL-1ra-II-Protein, schließen alle Zusammensetzungen ein, worin das Protein in einer Menge enthalten ist, die wirksam ist, um den beabsichtigten Zweck zu erzielen. Desweiteren können die pharmazeutischen Zusammensetzungen geeignete pharmazeutisch akzeptable Träger enthalten, umfassend Träger und Hilfsstoffe, die die Verarbeitung der Wirkstoffe zu Präparationen erleichtern, die pharmazeutisch verwendet werden können. Geeignete pharmazeutisch akzeptable Vehikel sind im Stand der Technik gut bekannt und sind z. B. in Gennaro, Alfonso, Hrsg., Remington's Pharmaceutical Sciences, 18. Auflage, Mack Publishing Co., Easton, PA (1990) beschrieben, dass ein Standardreferenztext in diesem Feld ist. Pharmazeutisch akzeptable Vehikel können routinemäßig in Übereinstimmung mit dem Verarbreichungsmodus und der Löslichkeit und der Stabilität des Proteins ausgewählt werden. Formulierungen für eine intravenöse Verabreichung können zum Beispiel sterile wässerige Lösungen einschließen, die ebenso Puffer, Verdünner und andere geeignete Zusätze enthalten können.
Während beliebige Träger, die zur Verabreichung von therapeutischen Proteinen bekannt sind, in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, sind Träger bevorzugt, die zur intravenösen Verabreichung verwendet werden.
Geeignete Formulierungen zur parenteralen Verabreichung schließen wässerige Lösungen des Wirkstoffs in wasserlöslicher Form ein, z. B. wasserlösliche Salze. Desweiteren können Suspensionen des Wirkstoffs wie geeignete ölhaltige Injektionssuspensionen verabreicht werden. Geeignete lipophile Lösungsmittel oder Vehikel schließen Fettöle, z. B. Sesamöl, oder synthetische Fettsäureester, zum Beispiel Ethyloleat oder Triglyceride, ein. Wässerige Injektionssuspensionen, die Substanzen enthalten können, die die Viskosität der Suspension erhöhen, schließen zum Beispiel Natriumcarboxymethylcellulose, Sorbit und/oder Dextran ein. Gegebenenfalls kann die Suspension ebenso Stabilisierer enthalten.
Die Vektoren in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung können ebenso zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Verwendung in der Gentherapie verwendet werden, um geeignete menschliche Zellen zu veranlassen, icIL-1ra-II in vivo zu exprimieren, um die IL-1-antagonisierende Wirkung dieses Proteins direkt an die gewünschte Stelle zu richten. Die Neuheit dieses Verfahrens liegt in dem besonderen Vektor und in der Kenntniss der Aktivität des dadurch hergestellten glykosilierten Proteins und nicht im spezifischen Gentherapieverfahren, das Verfahren zum Einbringen eines exprimierbaren Vektors direkt in die interessierenden Zellen einschließt. Diese liegen innerhalb der Kenntnisse der Fachleute auf diesem Gebiet zu dem Zeitpunkt, als die vorliegende Erfindung gemacht wurde.
Nichtbeschränkende spezifische Beispiele der vorliegenden Erfindung folgen.
Beispiel 1: Erzeugung eines hGH-sp-icIL-ra-II-Fragmentes
Die Signalpeptidsequenz des menschlichen Wachstumshormons hGH wurde durch PCR unter Verwendung des pXGH5-Vektors als Matrize amplifiziert, welcher die genomische Sequenz des menschlichen Wachstumshormons in voller Länge kodiert (DeNoto et al., 1981). pXGH5 wurde als Matrize für eine PCR verwendet, die die Primer P1 (der eine HindlII-Restriktionsstelle und eine Kozak-Sequenz enthält) und P2 (der einen 3'-icIL-1ra-II-Sequenzüberhang hat, 1A) verwendet. Die icIL-1ra-II-cDNA wurde durch eine PCR mit den Primern P3 (der einen 5'-hGH- Signalpeptidsequenzüberhang hat) und P4 (der zwei Stoppkodons und eine BamHI-Restriktionsstelle hat, 1B) amplifiziert. Diese beiden PCR-Fragmente wurden durch ihre homologen Regionen zusammengelagert und wurden weiterhin durch PCR unter Verwendung der Primer P1 und P4 amplifiziert, um das hGH-icIL-1ra-II-Fragment zu erzeugen (1C).
Beispiel 2: Konstruktion von pCDIC
Das hGH-sp-icIL-1ra-II-Fragment wurde mit HindlII und BamHI verdaut und in die HindlII-BamHI-Stellen von pCDNA3.1 (+) (Invitrogen, San Diego, 2A) stromabwärts des CMV-Promotors kloniert. Der resultierende Vektor (pCDIC, 2A) wurde durch Restriktionsanalyse kartiert und verwendet, um COS-Zellen zu transfizieren.
Beispiel 3: Konstruktion von pSGHIRA2
Das hGH-sp-icIL-1ra-II-Fragment wurde mit HindlII und BamHI verdaut und in die HindlII-BCII-Stellen von pSVE3 (2B, Hartman et al., 1982) stromabwärts des SV-40-"early"-Promotors kloniert. Der resultierende Vektor pSGHIRA2 (2B) wurde verwendet, um CHO-DUKX-Zellen (ATCC, CRL 9010) in Kotransfektion mit dem Vektor pDHFR (2C) zu transfizieren, der das Maus-DHFR enthält, wie unten genau geschildert. Die Konstrukte wurden durch Restriktionskartieren analysiert und sequenziert.
Beispiel 4: Expressionsvektor, der das Maus-DHFR-Gen trägt
Das Plasmid pDHFR (2C) ist aus der vollständigen pBR322-Sequenz, dem SV40-"early"-Genpromotor, der 70-bp-Spleißregion des Maus-γ2a-Gens fusioniert an die Maus-DHFR-cDNA, gefolgt vom Polyadenylierungssignal des SV40-"early"-Gens zusammengesetzt.
Beispiel 5: Transiente Expression in COS-Zellen
pCDIC-DNA wurde zur Transfektion von COS-Zellen mittels des DEAE-Dextranverfahrens verwendet. Zellen wurden bei annähernd 3 × 10⁶/80 cm²-Flasche gesät und über Nacht wachsen gelassen. Am nächsten Tag wurde das gesamte Medium aus den Flaschen abgezogen, und 5 ml Transfektionsmedium wurde zu den Zellen hinzugefügt. Das Transfektionsmedium enthält 400 μg/ml DEAE-Dextran, 100 μM Chloroquin, 2 μg/ml DNA und 10% NuSerum in RPMI-Medium. Nach Inkubation für 3–4 h bei 37°C wurde das Transfektionsmedium durch Abziehen entfernt und durch 5 ml von 10% DMSO in PBS für 2 Minuten bei Raumtemperatur ersetzt. Diese Lösung wurde dann abgezogen, und das Kulturmedium, welches 10% FBS in RPMI enthält, wurde zu den Flaschen hinzugefügt. Die Kulturen wurden bei 37°C für 24 Stunden inkubiert, dann wurde das Kulturmedium mit Medium getauscht, das 2 Serum enthielt. 24 Stunden später wurde die Inkubationstemperatur auf 32°C vermindert, und Proben des Kulturüberstandes wurden auf die Anwesenheit des icIL-1ra Typ II im Kulturüberstand durch ELISA analysiert (siehe Beispiel 7). 6–7 μg/1 × 10⁶ Zellen/Lauf icIL-1ra Typ II wurden von den transfizierten COS-Zellen sekretiert. Die Produktionsspiegel waren an den Tagen 4 bis 8 nach der Transfektion am höchsten. Diese Ergebnisse zeigen an, dass eine Fusion des hGH-Signalpeptids an die intrazelluläre Form von IL-1-1ra Typ II seine Sekretion in das Kulturmedium der transfizierten Zellen ermöglicht.
Beispiel 6: Stabile Expression in CHO-Zellen
CHO-Zellen wurden mit dem pSGHIRA2-Vektor, der die Gene für icIL-1ra Typ II und mit pDHFR, der das Gen für das Maus-DHFR (beschrieben in 2C) trägt, mittels des Lipofectamine-Transfektionsverfahrens kotransfiziert.
Zellen wurden in F12-Medium, das 10% FCS enthielt, mit 1 × 10⁶/10 cm-Platte ausgesät und über Nacht wachsen gelassen. Die Zellen wurden in F12-Medium gewaschen, und 8 ml der DNA-Lipofectamine-Mischung wurde zu den Platten hinzugefügt, welche dann für 4–5 Stunden bei 37°C inkubiert wurden. Am Ende der Inkubationsperiode wurden 8 ml F12-Medium hinzugefügt, das 20% FCS enthielt, und die Platten wurden für 24 Stunden bei 37°C inkubiert. Das Kulturmedium wurde dann gegen frisches F12-Medium ausgetauscht, das 10% FCS enthielt. 72 Stunden nach der Transfektion wurden Zellkulturen entweder durch beschränkende Verdünnung oder durch Subkultur bei einer 1 : 20-Verdünnung in selektives Medium ausgesät, in welchem Thymidin und Hypoxantin vermindert war und welches 10% dialysiertes FCS enthielt, und wurden wachsen gelassen, bis einzelne Kolonien gepickt und analysiert werden konnten. Die Expression von icIL-1ra-II durch acht stabile integrierte CHO-Klone ist in Tabelle 1 zusammengefasst. Das Verfahren eignet sich zur maßstäblichen Vergrößerung durch Verfahren, die im Stand der Technik bekannt sind.
Tabelle 1 Spezifische Produktivität von icIL-1ra-II durch CHO-Klone
Die MTX-Amplifikation wurde wie folgt ausgeführt: Zellen, die in der Abwesenheit von MTX gewachsen waren, wurden in sechs T-Flaschen in Anwesenheit von verschiedenen MTX-Konzentrationen (z. B. 0, 2 nM, 5 nM, 10 nM, 20 nM, 50 nM) ausgesät. Etwa 10 Tage später wurden die Kulturen mikroskopisch beobachtet, und die Zellen wurden gezählt, um das Überleben zu bestimmen. Die MTX-Konzentration, die das Überleben von annähernd 10% der Kultur erlaubte, wurde für eine weitere Vermehrung ausgewählt. Die zweite Amplifikationsrunde wurde auf eine ähnliche Weise ausgeführt, jedoch waren die MTX-Konzentrationen höher, beginnend mit der MTX-Konzentration, die in der ersten Runde ausgewählt wurde. Das Überleben der Kulturen wurde wieder relativ zu der MTX-Kontrollkonzentration dieser Runde bewertet. Die Klone, die in Tabelle 1 dargestellt sind, wurden bei den MTX-Konzentrationen amplifiziert, die in Tabelle 2 gezeigt sind.
Tabelle 2
Beispiel 7: ELISA-Test
Mikrotiterplatten (Nunc) wurden mit 5 μg/ml Maus-anti-IL-1ra-Antikörper (gereinigter Ascitis-IgG, MCA 1467, Klon 1384, Serotec Ltd, Oxford, UK) in PBS (100 μl/Loch) für 3 h bei 37°C beschichtet und bei 40°C aufbewahrt. Die Platten wurden mit PBS gewaschen, die Tween 20 (0,05%, hier bezeichnet als Waschpuffer) enthielt und mit derselben Lösung für 1 h bei 37°C blockiert, die 1 Rinderserumalbumin (bovine serum albumin, BSA, hier bezeichnet als Blockierungslösung) enthielt. Die Platten wurden dann in Waschpuffer gewaschen. Die Proben, die analysiert werden sollten, wurden in der Blockierungslösung verdünnt und für 90 Minuten bei 37°C in die Löcher (100 μl/Loch) gegeben. Die Platten wurden dann sechsmal in Waschpuffer gewaschen, gefolgt von Hinzufügen von biotinyliertem anti-humanem IL-1-ra-Antikörper (100 μl/Loch einer 1 : 10.000-Verdünnung, MCA 1466B, Klon 1390m, Serotec, Oxford, UK). Die Platten wurden für 1 h bei 37°C inkubiert und mit Waschpuffer gewaschen. Ein Konjugat aus Meerrettichperoxidase (horseradish peroxidase, HRP) und Streptavidin (1 mg/ml Sigma, Rehovot, Israel, 100 μl/Loch verdünnt 1 : 10.000 in Blockierungspuffer) wurde dann zu den Platten gegeben und für 1,5 Stunden bei 37°C inkubiert. Die Platten wurden dann in Puffer gewaschen, und die Substratlösung (o-Phenylendiamindihydrochlorid, OPD, Sigma Rehovot, Israel, 100 μl/Loch) wurde für 10 min bei 22°C hinzugefügt. Die Reaktion wurde durch Hinzufügen von 100 μl/Loch 4 N HCl gestoppt. Die Platten wurden dann in einem automatisierten Elisa-Leser gelesen. Eine Standardpräparation von IL-1ra (Serotec, Oxford, UK, PHP080, 2–128 ng/ml) wurde als Referenz für die IL-1ra-Konzentration verwendet.
Beispiel 8: Affinitätschromatographie von icIL-1ra Typ II mit monoklonalen Antikörpern
Eine Affinitätschromatographie von icIL-1ra Typ II wurde durch Bindung von anti-humanen IL-1-ra-Antikörpern (gereinigte Ascitis IgG, MCA 1467, Klon 1384, Serotec Ltd., Oxford, UK) an CNBr-aktivierte Sepharose 4B (5 mg/ml Harz, Pharmacia, Uppsala, Schweden) ausgeführt. Kulturüberstand aus CHO-Zellen des Klons 2–88 des oben erwähnten Beispiels 6 wurde über eine 100 K-Membran diafiltriert und dann über eine 10 K-Membran konzentriert. Die konzentrierten Proteine wurden gegen 0,1 M NaHCO₃, 150 mM NaCl pH 8,2 dialysiert. Dieses Verfahren reicherte die Produktkonzentration an, verminderte das Probenvolumen (100fach) und entfernte größere Verunreinigungen. Die Ausbeute dieses Schritts beträgt etwa 85%. 30 ml des konzentrierten Proteins wurden auf eine 3,2 ml-Säule geladen, die mit 0,1 M Natriumcarbonat, 150 mM Natriumchlorid, pH 8,3 mit einer Flussrate von 2 ml/min equilibriert worden war. Der icIL-1ra wurde in 150 mM Zitronensäure, 300 mM NaCl pH 2,7 eluiert. Die eluierten Fraktionen wurden sofort mit 1 M Tris pH 9,3 neutralisiert. Die eluierte Fraktion löste sich in zwei Banden mit scheinbarem Molekulargewicht von annähernd 27 kDa bzw. 30 kDa auf, wie durch Commassie-Blue-Färbung von SDS-PAGE (15% Acrylamid unter reduzierenden Bedingungen) bestimmt wurde. Die unterschiedlichen Molekulargewichte beruhen wahrscheinlich auf Variationen bei der Glykosylierung.
Beispiel 9: Western-Blot
Das Eluat der Affinitätschromatographiesäule des oben erwähnten Beispiels 8 wurde durch Filtration über eine 3 K-Membran (Miniset, Pall Filtron, Northborough, MA) konzentriert. Fraktionen wurden über ein 15%iges Acrylamid-SDS-PAGE-Gel unter reduzierenden Bedingungen (Readygel BioRad, Hercules, CA) aufgelöst und auf eine Nitrocellulosemembran (BRL, Life Technologies, MD) elektrogeblottet. Der Blot wurde in PBS über Nacht inkubiert, die 10% fettarme Milch, 0,1% Tween 20 enthielt. Der Blot wurde dann mit anti-humanen Maus-IL1-1ra-Antikörpern (gereinigter Ascitis IgG 1 : 5.000, MCA 1467, Serotec, Ltd., Oxford, UK) für 2 Stunden bei RT inkubiert, dann dreimal für 15 min mit PBS, die 0,1% Tween 20 enthielt, gewaschen und weiterhin mit Ziege-anti-Maus-Meerrettichperoxidase-alkalischer Phosphatase (1 : 10.000 Sigma, Israel) für 1 Stunde bei RT inkubiert. Der Blot wurde dann dreimal in PBS gewaschen, die 0,1% Tween 20 enthielt, gefolgt von Detektion mit erhöhter Lumineszenz (Amersham). Zwei Proteinbanden mit annähernd 27 kDa bzw. 30 kDa, die icIL-1ra entsprechen, wurden identifiziert.
Beispiel 10: Proteinsequenzanalyse
Die gereinigte Fraktion der Immunoaffinitätschromatographiesäule aus Beispiel 8 wurde parallel sowohl auf einer PVDF-Membran (Millipore, Bedford, MA) als auch auf einer Nitrocellulosemembran für Western-Blot-Analyse, wie im oben erwähnten Beispiel 9 beschrieben, elektrogeblottet. Die zwei Banden, die durch Commassie-Blue gefärbt wurden, wurden beide als IL1-ra durch Western-Blot-Analyse erkannt. Die gereinigte Fraktion, die von der Affinitätschromatographiesäule eluiert wurde, als auch die beiden Banden, die aus der mit Commassie-Blue gefärbten PVDF-Membran ausgeschnitten wurden, wurden einer Proteinsequenzanalyse durch Edman-Abbau in dem Procise^TM-491 HT-Mikrosequenzierer (Applied Biosystems, USA) unterzogen. Die Sequenzierung der N-terminalen Aminosäuren zeigte an, dass die gereinigte Fraktion, die aus dem Kulturüberstand abgetrennt wurde, zwei Formen von icIL-1ra enthielt. Die erhaltene Aminosäuresequenz ALADLYEEGGGGGGE (SEQ ID NO: 11) veranschaulichte, dass das sekretierte Protein das reife icIL-1ra Typ II-Protein repräsentierte, das an Aminosäureposition +2 des abgeleiteten Translationsstarts des Gens begann (GENBANK, ID# X84348). Eine weitere icIL-1ra-Form, die an Aminosäure +1 vom abgeleiteten Translationsstart von icIL-1ra Typ II begann, wurde ebenfalls gefunden.
Nachdem die Erfindung nun vollständig beschrieben wurde, erkennt der Fachmann, dass dieselbe innerhalb eines weiten Bereiches äquivalenter Parameter, Konzentrationen und Bedingungen ohne unzumutbares Experimentieren ausgeführt werden kann.
Während diese Erfindung in Verbindung mit seinen spezifischen Ausführungsformen beschrieben wurde, versteht es sich, dass weitere Modifikationen möglich sind. Es ist beabsichtigt, dass diese Anwendung beliebige Variationen, Verwendungen oder Adaptionen der Erfindungen abdeckt, die im Allgemeinen den Prinzipien der Erfindung folgen und die solche Abweichungen von der vorliegenden Offenbarung einschließen, welche innerhalb der bekannten oder üblichen Praxis innerhalb des Standes der Technik, den die Erfindung betrifft, möglich sind und welche auf die vorher dargestellten wesentlichen Merkmale angewendet werden können, wie sie im Umfang der beigefügten Ansprüche folgen.
Referenzen auf bekannte Verfahrensschritte, konventionelle Verfahrensschritte, bekannte Verfahren oder konventionelle Verfahren sind auf keine Weise ein Eingeständnis, dass irgendein Aspekt, irgendeine Beschreibung oder irgendeine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung im relevanten Stand der Technik offenbart, gelehrt oder vorgeschlagen wurde.
Die vorstehende Beschreibung der spezifischen Ausführungsformen zeigt so vollständig die allgemeine Art der Erfindung, dass andere durch Anwendung von Kenntnissen innerhalb der Fähigkeiten des Standes der Technik (einschließend den Gehalt der hier zitierten Referenzen) solche spezifischen Ausführungsformen leicht ohne unzumutbares Experimentieren und ohne Abweichen vom allgemeinen Konzept der vorliegenden Erfindung modifizieren und/oder für verschiedene Anwendungen adaptieren können. Es ist daher beabsichtigt, dass derartige Adaptionen und Modifikationen, basierend auf der hier dargestellten Lehre und Anleitung, innerhalb der Bedeutung und des Bereiches von Äquivalenten der offenbarten Ausführungsformen liegen. Es versteht sich, dass die Ausdrucksweise oder Terminologie hier für den Zweck der Beschreibung und nicht für den Zweck der Beschränkung bestimmt ist, derartig, dass die Terminologie oder Ausdrucksweise der vorliegenden Beschreibung vom Fachmann im Lichte der hier dargestellten Lehren und Anleitung in Kombination mit der Kenntnis eines Fachmanns interpretiert werden soll.
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Claims

Expressionsvektor, umfassend ein DNA-Segment kodierend das Signalpeptid des menschlichen Wachstumshormons verbunden mit einem DNA-Segment kodierend den intrazellulären IL-1-Rezeptorantagonist Typ II (icIL-1ra-II) und operativ verknüpft mit einer Promotorsequenz, wobei der icIL-1ra-II von der Promotorsequenz exprimiert wird und mit der Signalsequenz, die im Leseraster mit icIL-1ra-II fusioniert ist, translatiert wird.
Wirtszelle transformiert mit dem Expressionsvektor nach Anspruch 1.
Expressionsvektor nach Anspruch 1 zur Verwendung in der Gentherapie.
Expressionsvektor nach Anspruch 3 zum Einführen in geeignete endogene menschliche Zellen an einer gewünschten Stelle, um transformierte Zellen herzustellen, die icIL-1ra-II mit der gewünschten Rate exprimieren.
Verfahren zur Herstellung eines rekombinanten icIL-1ra-II umfassend die Schritte: Kultivieren einer Wirtszelle nach Anspruch 2, um einen rekombinanten glykosilierten icIL-1ra-II zu exprimieren und herzustellen, Gewinnen des hergestellten rekombinanten glykosilierten icIL-1ra-II.
Glykosilierter icIL-1ra-II hergestellt durch ein Verfahren nach Anspruch 5.
Glykosilierter icIL-1ra-II nach Anspruch 6, der ein scheinbares Molekulargewicht von etwa 27 kDA auf SDS-PAGE unter reduzierenden Bedingungen mit 15% Acrylamid hat.
Glykosilierter icIL-1ra-II nach Anspruch 6, der ein scheinbares Molekulargewicht von etwa 30 kDA auf SDS-PAGE unter reduzierenden Bedingungen mit 15% Acrylamid hat.
Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend den glykosilierten icIL-1ra-II nach Anspruch 6 in einer therapeutisch wirksamen Menge und einen pharmazeutisch akzeptablen Träger.