DE69911062T2

DE69911062T2 - Verfahren und material zum selektiven nachweis von toxinen

Info

Publication number: DE69911062T2
Application number: DE69911062T
Authority: DE
Inventors: T. William BODENHAMER
Original assignee: Toxin Alert Inc
Current assignee: Toxin Alert Inc
Priority date: 1998-12-22
Filing date: 1999-12-09
Publication date: 2004-07-15
Anticipated expiration: 2019-12-10
Also published as: DE69911062D1; HK1044189A1; CA2356277C; EP1141700A1; AU3448100A; CA2356277A1; WO2000037934A1; TW530157B; EP1141700B1; JP2002533675A; ATE249039T1; CN1331799A; US6051388A

Description

Gebiet der Erfindung
Die Erfindung betrifft den Nachweis von pathogenen Mikroorganismen oder biologischen Materialien und insbesondere ein Bioassay-Verbundmaterial, das sich zum Nachweis von bestimmten toxischen Substanzen eignet, sowie ein Verfahren zu dessen Herstellung und dessen Verwendung, wobei sich das Verbundmaterial insbesondere für die Verpackung von Nahrungsmitteln und dergl. eignet und dazu befähigt ist, gleichzeitig eine Mehrzahl von derartigen biologischen Materialien nachzuweisen und zu identifizieren.
Hintergrund der Erfindung
Obgleich erhebliche Anstrengungen und finanzielle Aufwendungen gemacht wurden, um eine Kontrolle über nahrungsmitteltypische, pathogene Mikroorganismen auszuüben, gibt es immer noch erhebliche Sicherheitsprobleme bei der Bereitstellung von abgepackten Nahrungsmitteln. Beispielsweise haben Nahrungsmittelvergiftungen durch Nahrungsmittel, die mit Mikroorganismenstämmen von E. coli, Campylobacter, Listeria, Cyclospora und Salmonella verunreinigt waren, zu Krankheits- und sogar zu Todesfällen geführt, ganz zu schweigen, von erheblichen Einkommensverlusten für die Nahrungsmittelproduzenten. Diese und weitere Mikroorganismen können auch bei sorgfältiger Nahrungsmittelhandhabung zu einem unbeabsichtigten Verderb von Nahrungsmitteln führen. Die Möglichkeit einer zufälligen Verunreinigung allein, z. B. durch unsachgemäße Temperatureinwirkungen, rechtfertigt bereits die Anwendung von sicheren und wirksamen Diagnose- und Nachweisverfahren für biologische Materialien. Noch komplizierter wird die Situation durch die sehr realistische Möglichkeit, dass eine terroristische Vereinigung gezielt die Nahrungsmittel- oder Wasserversorgung einer Gemeinde oder sogar einer ganzen Nation angreifen kann, indem versucht wird, einen pathogenen Mikroorganismus oder eine toxische Verunreinigung zuzusetzen, die dazu befähigt ist, in breitem Umfang Krankheitsfälle oder sogar Todesfälle hervorzurufen. Wenn zufällig oder absichtlich die Nahrungsmittelversorgung einer bestimmten Bevölkerung verunreinigt werden sollte, ist es nicht nur notwendig, die Bevölkerung rasch auf die Verunreinigung hinzuweisen, sondern es ist auch erforderlich, dass die spezielle Verunreinigung rasch und genau erfasst wird, um geeignete Gegenmaßnahmen ergreifen zu können.
Wenn man somit über die Möglichkeit verfügte, in einfacher Weise herkömmliche Verpackungsmaterialien durch ein flexibles Material, das

1) zu einem raschen und einfachen Nachweis der Anwesenheit und
2) zur Anzeige der speziellen Identität einer Vielzahl von pathogenen biologischen Materialien befähigt ist, zu ersetzen, ließe sich ein seit langem bestehendes Bedürfnis befriedigen.

Beschreibung des Stands der Technik
In The Berkeley Lab Research News vom 10.12.1996 wird in dem Artikel "New Sensor Provides First Instant Test für Toxic E. Coli Organism" über eine Arbeit von Stevens und Cheng zur Entwicklung von Sensoren, die zum Nachweis des E. coli-Stammes 0157 : H7 befähigt sind, berichtet. Eine Farbänderung von Blau nach Rot signalisiert sofort die Anwesenheit des virulenten Mikroorganismus E. coli 0157 : H7. Beim Stand der Technik war eine Testprobenentnahme und eine 24-stündige Züchtungsdauer erforderlich, um die Anwesenheit des E. coli-Mikroorganismus festzustellen, wobei die Verwendung einer Vielzahl von diagnostischen Werkzeugen, einschließlich Farbstoffe und Mikroskope, erforderlich war. Eine alternative Technik, die die Anwendung der Polymerase-Kettenreaktionstechnik beinhaltet, vervielfältigt die Menge der in einer Probe vorhandenen DNA bis zum Erreichen eines nachweisbaren Niveaus. Bei diesen Tests muss man mehrere Stunden auf die Ergebnisse warten. Der Berkeley-Sensor ist kostengünstig und kann an einer Vielzahl von Materialien, wie Kunststoff, Papier oder Glas, z. B. in einem Flaschenverschluss oder Behälterdeckel, angebracht werden. Mehrfachkopien eines einzelnen Moleküls werden zu einem dünnen Film ausgebildet, der eine zweiteilige Verbundstruktur aufweist. Die Oberfläche bindet das biologische Material, während das Gerüst unter der Oberfläche das Farbänderungs-Signalsystem darstellt.
Die Berkeley-Forscher lehren aber weder das Konzept der Einverleibung eines Sensors in eine Nahrungsmittelverpackung noch ziehen sie die Einverleibung von Mehrfachsensoren in Betracht, die es einem technisch ungeübten Endanwender, z. B. einem Käufer oder Verbraucher von Nahrungsmitteln, ermöglichen, die Quelle einer pathogenen Verunreinigung nachzuweisen und zu identifizieren.
US-5 776 672 beschreibt eine einzelsträngige Nucleinsäuresonde mit einer Basensequenz, die zum nachzuweisenden Gen komplementär ist. Die Sonde ist an der Oberfläche einer optischen Faser immobilisiert und wird mit der Genprobe, die zu einer einzelsträngigen Form denaturiert ist, umgesetzt. Die Nucleinsäuresonde, die mit dem Gen hybridisiert ist, wird durch ein elektrochemisches oder optisches Nachweisverfahren nachgewiesen. Im Gegensatz zu der hier beschriebenen Erfindung legt diese Druckschrift nicht die Immobilisierung der Sonde an einem flexiblen Polyolefinfilm nahe. Sie schlägt auch nicht die Verwendung von Gelüberzügen mit variierenden Porositäten vor, die in Bezug auf die Wanderung von Antikörpern oder mikrobiellen Materialien durch das Bioassay-Testmaterial als Steuerungs- oder Begrenzungsmittel dienen oder die als Medium für eine Verstärkung des Wachstums des mikrobiellen Materials wirken.
US-5 756 291 beschreibt ein Verfahren zum Identifizieren von oligomeren Sequenzen. Das Verfahren erzeugt Aptamere, die zur Bindung an Serumfaktoren und sämtliche Oberflächenmoleküle befähigt sind. Eine Komplexbildung der Zielmoleküle mit einem Gemisch von Nucleotiden erfolgt unter Bedingungen, bei denen ein Komplex mit den spezifisch bindenden Sequenzen, jedoch nicht mit den übrigen Bestandteilen des Oligonucleotidgemisches gebildet wird. In dieser Druckschrift wird weder die Immobilisierung der Aptameren an einem flexiblen Polyolefin-Grundmaterial noch die Verwendung einer schützenden Gelüberzugsschicht nahegelegt, die als Mittel zur selektiven Steuerung der Wanderung von Antikörpern und Antigenen oder als Medium zur Verstärkung des Wachstums von mikrobiellem Material dient:
US-A-4 870 005 beschreibt ein mehrschichtiges Analysenelement vom Trockentyp zum Testen von Analyten in Körperflüssigkeiten, wobei das Element auf einem kompetitiven Immunoassay beruht und folgendes umfasst: (i) eine Verteilungsschicht (z. B. ein mit einem hydrophilen Polymeren bedeckter textiler Werkstoff), die ein freisetzbares markiertes (Detektor)-Antigen umfasst, (ii) eine poröse Mittelschicht (z. B. Polyethylen) mit einem darin immobilisierten (Abfang)-Antikörper und (iii) eine Reagenzschicht (der gleichen Art wie die poröse Mittelschicht), die sowohl für das markierte Antigen als auch für das zu analysierende Antigen durchlässig ist.
EP-A-0347839 beschreibt ein analytisches Element vom Trockentyp, das auf einem kompetitiven Enzym-Immunoassay beruht und mindestens eine wasserdurchlässige Schicht (z. B. Agarose) aufweist, die folgendes umfasst: ein in Wasser unlösliches makromolekulares Substrat, einen (Abfang)-Antikörper, der mit einem Enzym, das zur Einwirkung auf das in Wasser unlösliche makromolekulare Substrat befähigt ist, konjugiert ist, und ein "Detektor-Antigen", bei dem es sich um ein Konjugat des zu analysierenden Antigens mit einer makromolekularen Substanz handelt.
EP-A-0327918 beschreibt ein mehrschichtiges Analysenelement vom Trockentyp, das auf einem homogenen kompetitiven Immunoassay beruht und folgendes umfasst: (i) eine nicht-faserige poröse Verteilungsschicht (z. B. eine Polyolefinfolie), (ii) eine faserige poröse Reaktionsschicht (z. B. Agarose), die einen (Abfang)-Antikörper umfasst, und (iii) eine nicht-poröse Schicht, die eine makromolekulare Substanz umfasst, der das markierte (Detektor)-Antigen einverleibt ist.
US-A-4966856 beschreibt ein mehrschichtiges Analysenelement vom Trockentyp, das auf einem kompetitiven Immunoassay beruht und folgendes umfasst: (i) eine Reaktionsschicht, die eine (Abfang)-Substanz (z. B. einen Antikörper) umfasst, die zur Bindung an den nachzuweisenden Analyten (z. B. ein Antigen) und an ein Markierungs-Analyt-Konjugat befähigt ist, und (iii) eine Absorptionsschicht, die eine zweite (Detektor)-Substanz (z. B. einen zweiten Antikörper) enthält, die zur Bindung an den Markierungsteil des markierten Analyten befähigt ist. Beide Schichten können aus einem porösen Material, wie Polypropylen oder Agarose, gefertigt sein.
Die vorliegende Erfindung betrifft Verpackungsmaterialien für Nahrungsmittel und andere Produkte, sowie Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung. Die Anwesenheit von unerwünschten biologischen Materialien im verpackten Material wird vom Verbraucher, Händler, Ordnungspersonal und dergl. unter üblichen Bedingungen und ohne Verwendung einer speziellen Ausrüstung leicht festgestellt. Zahlreiche biologische Materialien stellen eine Bedrohung für unsere Nahrungsmittelversorgung dar. Die vorliegende Erfindung stellt ein besonderes Verbundmaterial bereit, das zum Nachweisen und Identifizieren von mehreren biologischen Materialien innerhalb einer einzigen Packung befähigt ist. Das Identifikationssystem für biologisches Material ist zur Einverleibung in vorhandene Typen von flexiblen Verpackungsmaterialien, wie Polyolefinfolien, konzipiert. Sein Einbau in die vorhandene Verpackungsinfrastruktur erfordert nur geringfügige oder gar keine Veränderungen der gegenwärtigen Systeme oder Verfahren. Somit erweist sich eine vielfältige Einbeziehung des erfindungsgemäßen Nachweissystems für biologisches Material sowohl als wirkungsvoll als auch als wirtschaftlich. Ein neues biologisches Testmaterial zum Nachweis der Anwesenheit einer bestimmten toxischen Substanz umfasst folgendes:
eine Grundschicht, bei der es sich um eine flexible Polyolefinfolie handelt, die eine Oberfläche aufweist, die einer Behandlungsstufe unterzogen worden ist, die eine Verstärkung der Fähigkeit der Folie zur Immobilisierung eines darauf aufgebrachten Liganden bewirkt;
einen Capture-Antikörper (Abfang-Antikörper), bei dem es sich um einen biologisch aktiven Liganden handelt, der durch seine Fähigkeit zum Erkennen eines Epitops der speziellen toxischen Substanz gekennzeichnet ist, wobei der Ligand auf der Oberfläche der Polyolefinfolie immobilisiert ist;
eine erste Agarose-Gelüberzugsschicht, die über dem Capture-Antikörper liegt, wobei die Agaroseschicht für die toxische Substanz durchlässig ist und Bestandteile zur Verstärkung des Wachstums der Substanz enthält, wobei die Schicht ferner einen Detektor-Antikörper enthält, bei dem es sich um einen biologisch aktiven Liganden handelt, der durch seine Fähigkeit zum Erkennen eines unterschiedlichen Epitops der speziellen toxischen Substanz gekennzeichnet ist, wobei ein Detektor-Antikörper/Antigen-Komplex gebildet wird; und
eine zweite Schutz-Gelüberzugsschicht, die über dem Detektor-Antikörper liegt und einen Porositätsgrad aufweist, der den Durchgang der toxischen Substanz ermöglicht und den Durchgang des Detektor-Antikörper/Antigen-Komplexes verhindert, wobei die zweite Schutz-Gelüberzugsschicht einen Grad der Abriebfestigkeit, der einen Schutz des biologischen Testmaterials bewirkt, aufweist.
Gemäß einer Ausführungsform der Erfindung druckt das Nachweissystem für biologisches Material ein Muster mit einem Gehalt an mehreren Antikörpern oder Aptameren auf ein Verpackungsmaterial, das üblicherweise vom Typ einer polymeren Folie, vorzugsweise einer Polyolefinfolie und insbesondere einer Polyethylenfolie ist, wobei die Folie einer Oberflächenbehandlung, z. B. einer Coronaentladung, unterzogen worden ist, um die Fähigkeit der Folie zur Immobilisierung der Antikörper auf ihrer Oberfläche zu verstärken. Die Mittel werden durch einen speziellen abriebfesten Gelüberzug geschützt, dessen Porosität exakt so ausgebildet ist, dass bestimmte Antikörper, toxische Substanzen und dergl. gesteuert hindurchwandern können. Jeder Antikörper ist für ein bestimmtes biologisches Material spezifisch und wird mit einer charakteristischen Bild- oder Symbolgestalt gedruckt. Das Nachweissystem kann eine Anzahl von Antikörpern umfassen, die zum Nachweisen einer Vielzahl von üblichen toxischen Nahrungsmittel-Mikroorganismen befähigt sind. Obgleich eine beliebige Anzahl von Mikroorganismen durch das hier vermittelte erfindungsgemäße Konzept identifiziert werden können, wird in der vorliegenden Beschreibung eine Beschränkung der in Frage stehenden Mikroorganismen auf E. coli, Salmonella, Listeria und Cyclospora vorgenommen.
Ein wichtiges Merkmal des Nachweissystems für biologisches Material besteht in seiner allumfassenden Gegenwart um das verpackte Produkt herum und auf dem Produkt. Da das Nachweissystem für biologisches Material als ein zu 100% integrierender Bestandteil des Verpackungsmaterials konzipiert ist und sämtliche verwendeten Oberflächen bedeckt, gibt es keinen Teil des verpackten Produkts, der nicht-nachgewiesenen Mikroorganismen ausgesetzt werden kann. In der Vergangenheit hat die Verwendung von Detektoren an einer einzigen Stelle oder von in situ-Detektoren einen Großteil der Fläche rund um oder auf dem verpackten Produkt einer Einwirkung von nicht-nachgewiesenen Mikroorganismen ausgesetzt. Dies erhöhte in erheblichem Maße die Gefahr, dass ein verdorbenes Produkt versehentlich konsumiert wurde, bevor das toxische Mittel sich bis zu der Stelle des in situ-Detektors ausgebreitet hatte. Das erfindungsgemäße Nachweissystem für biologisches Material vermeidet dieses Problem, indem eine Mehrzahl von einzelnen Detektoren pro Flächeneinheit bereitgestellt wird, wobei diese Detektoren einen positiven Nachweis von beliebigen pathogenen Mikroorganismen innerhalb des getesteten Produkts gewährleisten. Zur Gewährleistung der Wirksamkeit ist ein bestimmter Empfindlichkeitsgrad erforderlich, z. B. muss das Nachweissystem dazu befähigt sein, eine einzelne Mikroorganismenzelle in einer Fleischprobe von 25 g positiv zu identifizieren. In einer bevorzugten Ausführungsform werden 6,2 × 10³ oder mehr Detektoren pro m² (vier Detektoren pro Quadratzoll) der Oberfläche des Verpackungsmaterials eingesetzt. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform werden 1,4 × 10⁴ oder mehr Detektoren pro m² (neun oder mehr Detektoren pro Quadratzoll) der Folienoberfläche einverleibt.
Durch Verwendung des erfindungsgemäßen Nachweissystems für biologisches Material kann ein Verpacken oder Verarbeiter in unabhängiger Weise die Vielzahl und Identität der biologischen Materialien festlegen, gegen die das verpackte Produkt geschützt werden soll. Ferner ist es vorgesehen, dass der weit überwiegende Teil der mit denn biologischen Nachweismaterial behandelten Verpackung allgemein für etwa vier der gebräuchlichsten Mikroorganismen geeignet ist, wobei das System es trotzdem jedem Anwender ermöglicht, den der Öffentlichkeit angebotenen Schutz auf die Kundenbedürfnisse zuzuschneiden.
Das Nachweissystem für biologisches Material weist nicht nur die Anwesenheit von biologischen Materialien nach, sondern identifiziert auch die speziellen biologischenn Materialien, die sich in einem verpackten Produkt befinden. Dieses einzigartige Merkmal ermöglicht die sofortige Identifizierung der einzelnen bestimmten biologischen Materialien, die vorhanden sind, da die Antikörper für einen Detektor, der eine definierte Bildgestalt oder andere Identifizierungseigenschaften aufweist, spezifisch sind. Obgleich der Endverbraucher vorwiegend an der Frage interessiert ist, ob das Nahrungsmittelprodukt an sich kontaminiert ist oder nicht, ist die sofortige Möglichkeit zum Nachweis und zur Identifikation des bestimmten biologischen Materials für Händler, Verarbeiter, Prüfer und Mitarbeiter von Gesundheitsbehörden von unmessbarem Wert. Die Möglichkeit zur sofortigen Identifikation eines toxischen Materials führt zu stark verringerten Reaktionszeiten auf Bedrohtangen der Gesundheit, die durch das biologische Material hervorgerufen werden können, und setzt ferner die Verantwortlichen in erhöhtem Maße in die Lage, die Quelle für die Schwierigkeit zu lokalisieren. Das erfindungsgemäße Nachweissystem für biologisches Material weist unter normalen Betriebsbedingungen eine aktive Lagerbeständigkeit von mehr als 1 Jahr auf. Dadurch werden die Anwendungsmöglichkeiten für ein Nachweissystem für biologisches Material auf Produkte, die für eine Langzeitlagerung vorgesehen sind, erweitert. Wenn diese Produkte so gelagert werden, dass sie zum Zeitpunkt des Bedarfs sofort bereitstehen, ist es von sehr großem Wert, über die Möglichkeit zu verfügen, die Sicherheit des Produkts zum Anwendungszeitpunkt zu bestimmen.
Ein besonders wichtiges Merkmal des erfindungsgemäßen Nachweissystems für biologisches Material besteht in der Möglichkeit, die Reagenzien quantitativ zu sensibilisieren, so dass nur die biologischen Materialien, die eine vorbestimmte Konzentration oder einen Schwellenwert, die für den Menschen als schädlich angesehen werden, erreicht haben, visuell identifiziert werden.
Beispielsweise enthält fast jedes Geflügelfleisch Spurenmengen an Salmonella-Bakterien. In den meisten Fällen erreichen die Salmonellen kein schädliches Konzentrationsniveau. Die Nachweisreagenzien für biologisches Material sind so konzipiert, dass sie visuell nur die Fälle anzeigen, bei denen das Konzentrationsniveau der biologischen Materialien von den Gesundheitsbehörden als schädlich angesehen werden.
Das Verfahren zur Herstellung des Nachweissystems für biologisches Material ist so konzipiert, dass eine leichte Einverleibung in die Verpackungsinfrastruktur von vorhandenen Systemen möglich ist, ohne dass die Systeme oder die Verfahren, gemäß denen sie arbeiten, eine Unterbrechung erfahren. Das Nachweissystem für biologisches Material kann Verpackungsfolien, die vom Verpacken hergestellt werden, oder Folien, die von einem Folienhersteller geliefert werden, einverleibt werden. Die Vorrichtung, die zum Aufbringen des Nachweissystems für biologisches Material erforderlich ist, kann in einfacher Weise zu Beginn eines beliebigen kontinuierlichen Verfahrens angeordnet werden, z. B. als Druck- oder Laminationsvorgang. Die Vorrichtung arbeitet als integrierender Bestandteil eines vorhandenen Systems.
Das erfindungsgemäße Nachweissystem für biologisches Material stellt ein vollkommen neuartiges Verpackungsmaterial dar, das so konzipiert ist, dass es den Verbraucher über die Anwesenheit von bestimmten biologischen Materialien oder Pathogenen, die in Nahrungsmitteln oder anderen mit dem Nachweissystem verpackten Materialien vorhanden sind, informiert. Das System ist so konzipiert, dass die Anwesenheit eines biologischen Materials dem Verbraucher in einer deutlichen, unmissverständlichen Weise in einer für das bloße Auge leicht erkennbaren Art angezeigt wird. Der Ausbruch von E. coli-Infektionen und andere Gesundheitsgefährdungen stellten in jüngerer Zeit ernsthafte Probleme für die allgemeine Bevölkerung dar und haben Bedenken bezüglich der Sicherheit der Nahrungsmittelversorgung entstehen lassen.
Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein Nachweissystem für biologisches Material bereitzustellen, das dem Verbraucher in einer für das ungeübte Auge eindeutigen Weise sichtbare Bilder auf dem Verpackungsmaterial anzeigt, die die Anwesenheit einer Anzahl von Pathogenen im Nahrungsmittel oder anderen Materialien in einer für den Menschen schädlichen Konzentration anzeigen.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein biologisches Testmaterial bereitzustellen, bei dem ein Antikörpersystem zum Nachweis eines Antigens auf der Oberfläche einer flexiblen Polyolefinfolie immobilisiert ist.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist es, ein Nachweissystem für ein biologisches Material bereitzustellen, das in Bezug auf Erscheinungsbild und Anwendung eine so starke Ähnlichkeit aufweist, dass seine Verwendung anstelle von herkömmlichen Verpackungsmaterialien dem Nahrungsmittelverarbeitungsbetrieb oder anderen Verpackungsbetrieben nicht auffällt.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein Nachweissystem für ein biologisches Material bereitzustellen, das im Vergleich zu herkömmlichen Verpackungsmaterialien kostengünstig ist.
Weitere Ziele und Vorteile der Erfindung ergeben sich aus der nachstehenden Beschreibung in Verbindung mit der beigefügten Zeichnung, wobei hier lediglich bestimmte Ausführungsformen der Erfindung erläutert und beispielhaft belegt werden. Die Zeichnung stellt einen Teil der Beschreibung dar und umfasst beispielhafte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung, worin verschiedene Ziele und Merkmale der Erfindung erläutert werden.
Kurze Beschreibung der Zeichnung
1 ist eine Querschnittdarstellung einer Antikörper-Sandwich-Immunoassay-Vorrichtung.
2 ist eine Querschnittansicht eines Einzelliganden-Tests.
2A ist eine Querschnittansicht eines Einzelliganden-Tests unter Einschluss eines chromogenen Liganden.
3 ist eine schematische Darstellung der Funktionsweise eines Einzelliganden-Tests.
4 ist eine Querschnittansicht eines Antikörper-Sandwich-Immunoassays unter Einschluss eines Scavenger-Systems (Abfangsystems) für eine quantitative Mikroorganismenbestimmung.
5 und 6 sind schematische Darstellungen zur Erläuterung der Funktionsweise eines Sandwichtests/Scavenger-Systems.
7 ist eine Draufsicht eines Beispiels für die Anbringung und das Aufdrucken von Symbolen.
7A ist ein Beispiel für einen typischen Identifizierungscode, der für das Symbolmuster angewandt wird.
8 zeigt die Ergebnisse von Beispiel 2 und belegt beispielhaft die Erfassungsempfindlichkeit einer mit einem Einzelliganden behandelten Polyethylenfolie.
9 ist ein Blockdiagramm einer Vorrichtung zur Erläuterung der Verfahrensstufen zur Herstellung einer Sandwich-Testvorrichtung.
10 ist ein Blockdiagramm einer Vorrichtung zur Erläuterung der Verfahrensstufen zur Herstellung einer Einzelliganden-Testvorrichtung.
Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen
Gemäß 1 wird der Nachweis und die Identifizierung von verschiedenen biologischen Materialien in verpackten Nahrungsmitteln oder anderen Produkten durch Verwendung von Antikörpern erreicht, die spezifisch für das gesuchte biologische Material sind. Bei den spezifischen Antikörpern, die als Capture-Antikörper (Abfang-Antikörper) definiert sind, handelt es sich um biologisch aktive Liganden, die durch ihre Fähigkeit zur Erkennung eines Epitops der bestimmten toxischen Substanz, die getestet werden soll, gekennzeichnet sind. Diese Capture-Antikörper werden unter Materialien, wie Antikörpern, Aptameren, einzelsträngigen Nucleinsäuresonden, Lipiden, natürlichen Rezeptoren, Lectinen, Kohlenhydraten und Proteinen, ausgewählt. Gemäß einer Ausführungsform der Erfindung werden die Capture-Antikörper mit besonderen Symbolformen und in speziellen Mustern angeordnet. Diese Capture-Antikörper werden an der Polymerfolie immobilisiert. Ein Agarosegel-Überzug, der Detektor-Antikörper enthält, wird in Ausrichtung über den Capture-Antikörpern aufgedruckt. Ein Schutzgel-Überzug vervollständigt den Aufbau des Verpackungsmaterials. Der die innere Schicht darstellende Gelüberzug, z. B. die Schicht, die dem verpackten Produkt am nächsten ist, stellt einen speziellen Typ von Gelüberzug oder ein Äquivalent dazu dar, wobei eine ausreichende Porosität gegeben ist, um toxischen Molekülen, die als Antigene bekannt sind, die Wanderung durch die Schicht zu einem Antikörper, der sandwichartig zwischen der Polymerfolie und dem Gelüberzug laminiert ist, zu ermöglichen. Der spezielle Gelüberzug weist eine ausreichende Abriebfestigkeit auf, um zu verhindern, dass die Reagenzien dem Produkt ausgesetzt werden. Beim erfindungsgemäß geeigneten speziellen Gelüberzug handelt es sich um einen leicht verfügbaren Überzug, der gebräuchlicherweise in der Nahrungsmittelindustrie zur Beschichtung von Süßigkeiten und dergl. verwendet wird, z. B. für beschichtete Schokolade, um ein Schmelzen des Produkts in der Hand zu verhindern. Die Wanderung von Antigenen erfolgt aufgrund von Kapillarwirkung und erreicht normalerweise innerhalb von 72 Stunden einen Gleichgewichtszustand. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform lässt sich bei Anwendung in einem Temperaturbereich von 4–25°C eine erste positive Ablesung innerhalb von 30 Minuten erhalten, wonach sich der Testvorgang fortsetzt, bis die Ergebnisse nach etwa 72 Stunden erhalten werden. Bei der Wanderung durch den speziellen Gelüberzug gelangt das Antigen in eine Agarosegel-Folie, die Tensideigenschaften aufweist und freie Detektor-Antikörper sowie Bestandteile, die zur Verstärkung des Wachstums von mikrobiellen Materialien geeignet sind, z. B. Nährstoffe, wie Sorbit, NOVOBIOCIN, CEFIXIME und TELLURITE, die die Wachstumsgeschwindigkeit erhöhen und die Isolierung von E. coli 0157H erleichtern, enthält. Wenn das Antigen auf eine Antikörper-Spezies trifft, die für ein Epitop davon spezifisch ist, bindet es daran unter Bildung eines Detektor- Antikörper-Komplexes. Nach der Bindung ist der gebundene Antigen-Antikörper-Komplex für eine Rückwanderung durch den speziellen Gelüberzug aufgrund von dessen gegebener feinporöser Struktur zu groß. Dies stellt sicher, dass das pathogene Material nicht zurück in das zu testende Produkt wandern kann. Ein anhaltender Kapillardruck in Richtung zum Gleichgewichtszustand bewirkt tendenziell eine Bewegung des Antigens zusammen, mit einem gebundenen Antikörper durch eine zweite Gelüberzugsschicht und in einen Bereich der flexiblen Polyolefinfolie, die entsprechende Spezies von immobilisierten Capture-Antikörpern enthält. Die Schicht von immobilisierten Antikörpern ist an der äußeren Polymerfolie in vorbestimmten Mustern von einfachen Symbolen angebracht, wie am besten aus den 7 und 7A ersichtlich ist. Wenn die bestimmte Spezies von gebundenem Antigen auf eine bestimmte entsprechende Spezies eines immobilisierten Antikörpers trifft, der für ein separates und bestimmtes Epitop davon spezifisch ist, ergibt sich eine weitere Bindung. Bei der Bindung des Antigens an die beiden Antikörper taucht am äußeren Film an der Bindungsstelle eine bestimmte Symbolform auf und stellt einen visuellen Indikator bereit.
Obgleich es theoretisch möglich ist, eine unbegrenzte Anzahl von Pathogenen, die in einem verpackten Produkt vorhanden sind, nachzuweisen und anschließend diese Information in sehr klarer und unmissverständlicher Weise einem ungeübten Verbraucher zu präsentieren, bestehen in der Praxis Grenzen für die Informationsmenge, die im Nachweissystem für biologisches Material entwickelt und dargestellt werden kann. Einige der begrenzenden Faktoren sind Kosten, verfügbare Oberfläche für die Informationsanzeige, Komplexität und andere Gesichtspunkte. Somit verwendet (lediglich zu Erläuterungszwecken) das Nachweissystem für biologisches Material, das hier beispielhaft vorgestellt wird, vier separate Paare von Antikörpern, wie in den 7 und 7A dargestellt ist. Dies soll in keiner Weise ein Hinweis auf eine Begrenzung der Anzahl von Antikörpern sein, die in einem einzigen Nachweissystem für biologisches Material eingesetzt werden können.
Wie in den 7 und 7A dargestellt ist, wird die Erfindung unter Bezugnahme auf den Nachweis der folgenden vier Mikroorganismen beispielhaft erläutert:

1. E. coli
2. Salmonella
3. Listeria und
4. Cyclospora.

Jedem der vier Mikroorganismen wird eine spezielle Symbolform zugeordnet. Obgleich es eine unbegrenzte Anzahl von verwendbaren Symbolen gibt, unter Einschluss von Buchstaben, Ziffern oder auch Wörtern, haben wir für Demonstrationszwecke einfache Identifikationssymbole gewählt. Als Anfangsstufe beim Aufbau des Nachweissystems für biologisches Material unterliegt die äußere Polymerfolie oder Grundschicht einem Druckvorgang, bei dem ein Muster der vier Symbole aufgedruckt wird, wobei jedes Symbol sich einer bestimmten Spezies von immobilisierten Capture-Antikörpern bedient. Entsprechende Spezies von freien Antikörpern, die als Detektor-Antikörper bekannt sind, bei denen es sich um biologisch aktive Liganden handelt, die durch ihre Fähigkeit zur Erkennung eines unterschiedlichen Epitops der gleichen speziellen toxischen Substanz, die getestet wird, charakterisiert sind und in einer Agarosegel-Lösung, die ein Tensid und einen Nährstoff enthält, suspendiert sind, werden in Ausrichtung zu den immobilisierten Antikörpern so aufgedruckt, dass sie darüber und daneben angeordnet sind. Anschließend erfolgt eine Trocknung. Schließlich wird ein zweiter Gelüberzug auf das Präparat laminiert, dessen Porositätsgrad ausreicht, eine Passage der Detektor-Antikörper zu verhindern.
Obgleich der Nachweis von biologischen Materialien durch die Verwendung von Antikörpern bekannt ist, gibt es mehrere neue Aspekte bezüglich der Anwendung der Antikörpertechnik, die bei der Entwicklung des erfindungsgemäßen Nachweissystems für biologisches Material zur Anwendung kommen.
Hierzu gehören: 1) die Verwendung von mehrfachen Antikörpern zum Nachweisen von mehrfachen biologischen Materialien in einzelnen Packungen; 2) die Verwendung eines unterscheidungskräftigen Symbols oder einer anderen Gestalt, um die biologischen Materialien für den Verbraucher, Verkäufer, Prüfer und dergl. nicht nur nachzuweisen, sondern auch visuell zu identifizieren; 3) Sicherstellung, dass der Nachweis und die Identifikation der biologischen Materialien rechtzeitig bei jeder speziellen Anwendung erreicht werden, indem man in gezielter Weise die Porosität des Gelüberzugs kontrolliert und dabei die Ablaufgeschwindigkeit der Reaktion durch die Stärke der Kapillarwirkung steuert; 4) Einverleibung von Additiven in den speziellen Gelüberzug, um die Konzentrationen an vorhandenen Mikroorganismen zu erhöhen; 5) Einordnen des erfindungsgemäßen Nachweissystems für biologisches Material in die vorhandene Infrastruktur der Verpackungsindustrie; und 6) Bereitstellen eines biologischen Testmaterials und Verfahren zu dessen Herstellung und Verwendung, wobei die Antikörper an der Oberfläche eines flexiblen Olefins, z. B. eines oberflächenbehandelten Polyethylens, Polypropylens oder eines Gemisches davon, immobilisiert werden.
Die vorstehend erörtere Ausführungsform beruht auf einem Sandwich-Immunoassay gemäß der Darstellung in 1, bei dem spezielle Mikroorganismen gemessen werden, wobei es sich bei der speziellen toxischen Substanz um einen oder mehrere Bestandteile aus der folgenden Gruppe handelt: ein spezieller Mikroorganismus, biologische Materialien mit einem Gehalt an den genetischen Eigenschaften dieses speziellen Mikroorganismus und Mutationen davon. In einer speziellen Ausführungsform wird die toxische Substanz aus der folgenden Gruppe ausgewählt: Mikroorganismen, Nucleinsäuren, Proteine, integrierende Bestandteile von Mikroorganismen und Kombinationen davon.
Es ist darauf hinzuweisen, dass die Erfindung durch direkte Messung von Mikroorganismen mit bestimmten Typen von Antikörpern funktioniert, die aus folgender Gruppe ausgewählt sind: ein Antikörper, eine einzelsträngige Nucleinsäuresonde, ein Aptameres, ein Lipid, ein natürlicher Rezeptor, ein Lectin, ein Kohlenhydrat und ein Protein. Die biologischen Materialien können auch durch nicht-immunologische Verfahren insbesondere unter Verwendung von markierten Molekülen, wie Aptameren, die eine hohe Affinität für die biologischen Materialien haben, gemessen werden.
Die Erfindung bedient sich verschiedener Typen von Detektor-Antikörpern, z. B. von solchen, die mit Farbstoffen unter Bildung einer sichtbaren Anzeige konjugiert sind, oder alternativ photoaktiver Verbindungen, die zur Bildung einer sichtbaren Anzeige in Reaktion auf einen speziellen Typ von Belichtung gebildet werden, z. B. eines Abtastsystems, das lumineszierende Eigenschaften, die bei der Bindung von Antigen und Antikörper sichtbar gemacht werden, nachweist. Bei diesem Verfahren werden biologische Materialien direkt mit einem biologisch aktiven Liganden, z. B. einem Antikörper, einem Aptameren, einer Nucleinsäuresonde oder dergl., gemessen, was eine Konformationsänderung unter Bildung einer sichtbaren Anzeige herbeiführt.
Ferner ist darauf hinzuweisen, dass erfindungsgemäß bestimmte Polymere einverleibt werden können und dass bei Bindung eines biologischen Materials an die Oberfläche dieses Material eine molekulare Veränderung im Polymeren herbeiführt, die zu einem Symbol mit unterscheidungskräftiger Färbung führt. Gemäß den 2 und 2A ist in einer alternativen Ausführungsform ein sandwichartiger Aufbau nicht erforderlich. Wie in den 2 und 2A dargestellt ist, ermöglicht die Bereitstellung bestimmter Typen eines biologisch aktiven Liganden, z. B. von chromogenen Liganden, an die Rezeptoren gebunden werden, die visuelle Bestätigung der Bindung des Antigens an den immobilisierten Liganden.
Wie in 3 dargestellt ist, wird ein polymerer Film bereitgestellt und ein biologisch aktiver Ligand, vorzugsweise ein chromogenen Ligand, wird am polymeren Film immobilisiert. In der Vergangenheit wurden immobilisierte Liganden an starren, festen Trägermatrices, wie Kunststoff, Polystyrolkügelchen, Mikrotiterplatten, Latexkügelchen, Fasern, Metall- und Glasoberflächen und dergl., angebracht. Die immobilisierten Liganden wurden auch an flexiblen Oberflächen, wie Nitrocellulose- oder Polyesterfolien, die nicht transparent waren, angebracht. Überraschenderweise hat der Erfinder festgestellt, dass es möglich ist, biologisch aktive Liganden an der Oberfläche einer Polyolefinfolie mit entsprechenden Eigenschaften in Bezug auf Transparenz und Flexibilität anzubringen, und dass der Verbundstoff als biologischer Sensor oder Testmaterial dient. Nach Aufdrucken des reaktiven Polymerfilms durchläuft das Material eine Trocknungsstufe. Anschließend wird ein spezieller Gelüberzug oder Flüssigkeitsfilm als Schutzschicht aufgetragen. Schließlich wird das Endprodukt getrocknet.
Beispiele für Folien, die erfindungsgemäß verwendet werden können, sind Folien, die eine strukturelle Polymergrundlage mit einer behandelten Oberfläche enthalten und denen ein fluoreszierender Antikörper-Rezeptor und schließlich ein stabilisierender Gelüberzug einverleibt ist. Diese Folien werden hergestellt, indem man zunächst die Folie einer Elektronenentladungsbehandlung an ihrer Oberfläche aussetzt und anschließend einen fluoreszierenden Antikörper-Rezeptor aufdruckt. Anschließend wird die Folie zur Immobilisierung des Rezeptors einer Trocknungs- oder Erwärmungsstufe unterzogen. Sodann wird die Folie zur Entfernung von nichtimmobilisiertem Rezeptor gewaschen. Sodann wird die Folie mit einem Gel beschichtet und schließlich getrocknet. Zu Beispielen für Typen von handelsüblichen Folien, die verwendet werden können, gehören Folien aus geradkettigem Polyethylen mit einer Elektronenentladungsbehandlung, die unter der Handelsbezeichnung SCLAIR^R vertrieben werden. Die Elektronenentladungsbehandlung macht den Film gegenüber einer Immobilisierung der Antikörper an ihrer Oberfläche empfindlicher. Weitere Folien, die verwendet werden können, sind Nylon 66-Folien, z. B. DARTEK^R, eine koextrudierbare Klebefolie, wie BYNEL^R und ein Gemisch aus BYNEL^R mit einer Polyethylenfolie.
Gemäß den 4–6 besteht eines der wichtigsten Merkmale des Nachweissystems für biologisches Material in seiner Fähigkeit zur quantitativen Sensibilisierung des Antikörpers oder Aptameren, um nur die biologischen Materialien visuell zu identifizieren, die Konzentrationsniveaus erreicht haben, die für den Menschen als schädlich angesehen werden. Eine Maßnahme zur Erzielung dieser Sensibilisierung besteht im Zusatz eines Scavenger-Antikörpers, bei dem es sich um einen biologisch aktiven Liganden handelt, der durch eine im Vergleich zum Capture-Antikörper höhere Affinität für die spezielle toxische Substanz gekennzeichnet ist. Der Scavenger-Antikörper wird in einer ausreichenden Menge bereitgestellt, um eine Bindung mit der speziellen toxischen Substanz bis einschließlich einer bestimmten Schwellenkonzentration einzugehen. Auf diese Weise wird der Capture-Antikörper an einer Bindung mit dem Detektor-Antikörper gehindert, bis die Konzentration des speziellen biologischen Materials die spezifische Schwellenkonzentration übersteigt. Auf diese Weise gibt das Nachweissystem für das biologische Material visuell nur die Fälle an, bei denen die Konzentrationsniveaus von den Gesundheitsbehörden als schädlich angesehen werden.
Da das hier beschriebene Nachweissystem für biologisches Material seine Aktivität über lange Zeiträume hinweg aufrechterhalten kann, z. B. bis zu einem Jahr, ist es dazu befähigt, in Produkten mit langer Lagerbeständigkeit einen Schutz gegen Kontamination zu erreichen. Ferner werden dadurch, dass nur toxische Konzentrationen angezeigt werden, "falsche positive Ergebnisse" vermieden, wobei in einigen Fällen die Lebensdauer des Produkts verlängert werden kann.
In den 9 und 10 wird die Vorrichtung zur Herstellung des Nachweissystems für biologisches Material dargestellt. Bei diesen Ausführungsformen handelt es sich im wesentlichen um bestimmte Kombinationen von Druckern, Beschichtungsvorrichtungen und Trocknern, die dazu herangezogen werden, biologisch aktive Reagenzien auf eine dünne Polymerfolie, die sich zum Verpacken von Nahrungsmitteln und anderen Produkten eignet, aufzubringen. Diese Folien werden im Anschluss auf das Aufbringen des Nachweissystems für das biologische Material einer weiteren Behandlung unterzogen, indem man sie bedruckt, laminiert oder anderweitig verarbeitet. Die maschinelle Einrichtung ist so konzipiert, dass sie sehr dünne Folien mit recht hohen Geschwindigkeiten transportiert und verarbeitet. Ferner ist die maschinelle Einrichtung so konzipiert, dass sie in wirksamer Weise als zusätzliche Verarbeitungsstufe verwendet werden kann, wenn sie in einer bereits in Betrieb befindlichen Herstellungsanlage für Verpackungsmaterial einem kontinuierlichen Verarbeitungsbetrieb hinzugefügt wird. Die Druckmaschine ist so konzipiert, dass mindestens vier unterschiedliche, biologisch aktive Liganden in einer wässrigen Lösung in Mustern in genauer Anpassung auf die polymere Folie aufgedruckt werden können. Der Druckvorgang kann durch Sprühstrahl- oder Walzenauftrag oder durch äquivalente Druckverfahren erreicht werden. Die einzelnen Druckvorrichtungen sind zum Bedrucken mit einem detaillierten Symbol mit einer Größe von nicht mehr als 6,4 × 6,4 mm (1/4 Zoll × 1/4 Zoll) in einer minimalen Dicke befähigt. Die Musterbildung kann rechnergesteuert oder durch Walzenkalandrieren erfolgen. Es ist wichtig, die entsprechende Viskosität der aufzutragenden Lösung festzulegen, so dass erfolgreiche Druck-, Beschichtungs- und Trocknungsvorgänge vorgenommen werden können. Nach der Bedruckungsstufe müssen die Symbole geschützt werden. Dies wird durch einen letzten Auftrag eines dünnen speziellen Gelüberzugs oder eines dünnen Flüssigkeitsfilms erreicht. Diese Stufe wird unter 100%iger Beschichtung der gesamten Folie oder alternativ durch selektive Beschichtung der einzelnen Symbole in der Weise erreicht, dass sich eine 10%ige Überlappung über das Symbol hinaus in sämtliche Richtungen ergibt. Diese Beschichtungsstufe kann durch Sprühvorrichtungen oder Walzen durchgeführt werden. Die Viskosität des Beschichtungsmaterials muss optimal eingestellt werden, um eine angemessene Bedeckung bereitzusfellen. Das Nachweissystem für biologisches Material muss nach dem Drucken und erneut nach dem Beschichten getrocknet werden. Das Trocknen wird in sehr rascher Weise erreicht, so dass das Verfahren mit hohem Durchsatz durchgeführt werden kann. Verschiedene Trocknungseinrichtungen umfassen die Verwendung von Strahlungsheizquellen, Umluft und Gefriertrocknung. Es muss darauf geachtet werden, dass Trocknungstemperaturen, bei denen die aufgebrachten biologischen Reagenzien inaktiviert werden, vermieden werden. Eine polymere Folie, die einer Oberflächenbehandlung in Form einer Elektronenentladung, z. B. einer Korona-Behandlung, unterzogen worden ist, wird besonders bevorzugt. Nach der Herstellung wird die dünne Folie mit relativ hohen Geschwindigkeiten transportiert, so dass eine faltenfreie Oberfläche für Druck-, Beschichtungs- und Aufwickelvorgänge bereitgestellt wird. Ferner liefert die Vorrichtung ein vollständiges Rückgewinnungssystem für die Reagenzien, das eine vollständige Rückgewinnung der Mittel und der flüchtigen organischen Verunreinigungen ermöglicht.
Nachstehend wird die Erfindung anhand von Beispielen erläutert.
Beispiel 1
Nachweis von Antikörpern der Oberfläche einer vorbehandelten dünnen Schicht
Polyethylenfolie
Polyklonales Kaninchen-IgG wurde in 0,1 M Carbonat (Na₂CO₃)/Bicarbonat (NaHCO₃)-Puffer vom pH-Wert 9,6 auf eine Endkonzentration von 2,0 μg/ml verdünnt.
Unter Verwendung eines 5,1 × 7,6 cm (2 Zoll × 3 Zoll)-Gitters wurden 75 μl (150 ng) in Abständen von 2,5 cm (1 Zoll) auf eine Folie von vorbehandeltem Polyethylen aufgebracht.
Die mit dem Antikörper behandelte Polyethylenfolie wurde 1,5 Stunden bei einer Temperatur von 37°C getrocknet.
Die getrocknete Folie wurde sodann 3-mal mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung vom pH-Wert 7,4 gewaschen.
Mit HRP konjugiertes Ziegen-anti-Kaninchen-IgG (GaR^HRP) wurde auf eine Konzentration von 1 : 7000 in 1% Casein, 0,1 M Kaliumhexacyanoferrat(III) (K₃Fe(CN)₆), 0,1% Phosphatglas (Na₁₅P₁₃O₄₀-Na₂₀P₁₈O₅₅), pH-Wert 7,4, verdünnt.
Eine Präzisionspipette wurde zum Aufbringen von 125 μl von verdünntem G^HRP auf die mit dem Gitter gestützte Polyethylenfolie in Abständen von 2,5 cm (1 Zoll), die mit der mit dem vorher gekuppelten RαG bedeckten Fläche zusammenfiel, verwendet.
Die Folie wurde 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert.
Sodann wurde die Folie 3-mal mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung vom pH-Wert 7,4 gewaschen.
125 μl präzipitierendes TMB-Enzymsubstrat wurde auf die Testflächen gegeben.
Die Folie wurde bei Raumtemperatur inkubiert, bis die Farbentwicklung vollständig war.
Schließlich wurde die Folie 3-mal mit entionisiertem Wasser gewaschen und an der Luft getrocknet.
Beispiel 2
Vollständiger Sandwich-Immunoassay an der Oberfläche einer vorbehandelten Dünnschicht-Polyethylenfolie
Polyklonales Kaninchen-IgG wurde in 0,1 M Carbonat (Na₂CO₃)/Bicarbonat (NaHCO₃)-Puffer vom pH-Wert 9,6 auf eine Endkonzentration von 2,0 μg/ml verdünnt.
Ein Stück von 13 × 9 cm der bei der Fa. Dupont erhältlichen vorbehandelten Dünnschicht-Polyethylenfolie wurde in eine B10-RAD DOT-SPOT-Vorrichtung mit 96 Probenvertiefungen im Abstand von 1,0 cm in einem 12 × 8-Vertiefungsgitter eingesetzt.
In jede Vertiefung der Spalte 1 wurde eine 100 μl-Probe (1,0 μg) polyklonales Kaninchen-IgG gegeben.
Antikörperproben, die in die Spalten 2–12 gegeben wurden, entsprachen seriellen Verdünnungen des Antikörpers von 500 ng bis 0,5 ng.
Die mit dem Antikörper behandelte Polyethylenfolie wurde über Nacht bei 37°C getrocknet.
Die getrocknete Folie wurde 3-mal mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) vom pH-Wert 7,4 gewaschen.
Antigen wurde in mit Tris gepufferter Kochsalzlösung (PBS) mit einem Gehalt an 1% Casein vom pH-Wert 7,4 auf eine Endkonzentration von 1,0 μg/ml verdünnt.
100 μl (entsprechend 100 ng) Antigen wurden in die einzelnen Vertiefungen der Vorrichtung gegeben und 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert.
Sodann wurde die Polyethylenfolie 3-mal mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) vom pH-Wert 7,4 gewaschen.
Monoklonaler Mäuse-Detektor-Antikörper wurde mit TBS mit einem Gehalt an 1% Casein, 0,1 M Kaliumhexacyanoferrat (K₃Fe(CN)₆) und 0,1% Phosphatglas (Na₁₅P₁₃O₄₀-Na₂₀P₁₈O₅₅) vom pH-Wert 7,4 im Verhältnis von 1 : 625 verdünnt.
100 μl einer 1 : 625-Verdünnung von Detektor-Antikörper-Lösung wurde in jede Vertiefung der Reihe 1 gegeben.
Detektorproben von 100 μl, die in die Reihen 2–7 gegeben wurden, stellten serielle Verdünnungen des Antikörpers von 1 : 1250 bis 1 : 80 000 dar. Die Verdünnungen des Detektor-Antikörpers wurden 1 Stunde bei Raumtemperatur auf der Polyethylenfolie inkubiert.
Sodann wurde die Polyethylenfolie 3-mal mit phosphatgepufterter Kochsalzlösung (PBS) vom pH-Wert 7,4 gewaschen.
100 μl Ziegen-anti-Maus-IgGHRP wurden in die einzelnen Vertiefungen der DOT-SPOT-Vorrichtung gegeben und 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert.
Die Polyethylenfolie wurde 3-mal mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) vom pH-Wert 7,4 gewaschen.
100 μl des präzipitierenden TMB-Enzymsubstrats wurde auf die Testflächen gegeben.
Die Folie wurde bei Raumtemperatur bis zur vollständigen Farbentwicklung inkubiert (vergl. 8).
Schließlich wurde die Folie 3-mal mit entionisiertem Wasser gewaschen und an der Luft getrocknet.
Es ist darauf hinzuweisen, dass vorstehend bestimmte Ausführungsformen beschrieben wurden, die jedoch keine Beschränkung auf die spezielle Form oder Anordnung der hier beschriebenen und dargestellten Bestandteile bedeuten.

Claims

Biologisches Testmaterial zum Nachweis der Anwesenheit einer bestimmten toxischen Substanz, umfassend: eine Grundschicht, bei der es sich um eine flexible Polyolefinfolie handelt, die eine Oberfläche aufweist, die einer Behandlung unterzogen worden ist, die eine Verstärkung der Fähigkeit der Folie zur Immobilisierung eines darauf aufgebrachten Liganden bewirkt; einen Capture-Antikörper, bei dem es sich um einen biologisch aktiven Liganden handelt, der durch seine Fähigkeit zur Erkennung eines Epitops der speziellen toxischen Substanz gekennzeichnet ist, wobei der Ligand auf der Oberfläche der Polyolefinfolie immobilisiert ist; eine erste Agarose-Gelüberzugsschicht, die über dem Capture-Antikörper liegt, wobei die Agaroseschicht für die toxische Substanz durchlässig ist und Bestandteile zur Verstärkung des Wachstums der Substanz enthält, wobei die Schicht ferner einen Detektor-Antikörper enthält, bei dem es sich um einen biologisch aktiven Liganden handelt, der durch seine Fähigkeit zur Erkennung eines unterschiedlichen Epitops der speziellen toxischen Substanz gekennzeichnet ist, wobei ein Detektor-Antikörper/Antigen-Komplex gebildet wird; und eine zweite Schutz-Gelüberzugsschicht, die über dem Detektor-Antikörper liegt und einen Porositätsgrad aufweist, der den Durchgang der toxischen Substanz ermöglicht und den Durchgang des Detektor-Antikörper/Antigen-Komplexes verhindert, wobei die zweite Schutz-Gelüberzugsschicht einen Grad der Abriebfestigkeit, der einen Schutz des biologischen Testmaterials bewirkt, aufweist.
Biologisches Testmaterial nach Anspruch 1, wobei die flexible Polyolefinfolie aus der Gruppe Polyethylen, Polypropylen und Gemische davon ausgewählt ist.
Biologisches Testmaterial nach Anspruch 1, wobei die Polyolefinfolie einer Oberflächenbehandlung durch einen Korona-Entladungsvorgang unterzogen worden ist.
Biologisches Testmaterial nach Anspruch 1, wobei es sich bei der speziellen toxischen Substanz um eines oder mehrere Elemente handelt, die aus der Gruppe spezielle Mikroorganismen, biologische Materialien mit einem Gehalt an den genetischen Eigenschaften dieser speziellen Mikroorganismen und Mutationen davon ausgewählt sind.
Biologisches Testmaterial nach Anspruch 1, wobei die spezielle toxische Substanz aus der Gruppe Mikroorganismen, Nucleinsäuren, Proteine, integrale Komponenten von Mikroorganismen und Kombinationen davon ausgewählt ist.
Biologisches Testmaterial nach Anspruch 1, wobei der Ligand aus der Gruppe Antikörper, einzelsträngige Nucleinsäuresonden, Aptamere, Lipide, natürliche Rezeptoren, Lectine, Kohlenhydrate und Proteine ausgewählt ist.
Biologisches Testmaterial nach Anspruch 1, ferner umfassend einen Scavenger-Antikörper, bei dem es sich um einen biologisch aktiven Liganden handelt, der durch eine im Vergleich zum Capture-Antikörper höhere Affinität für die spezielle toxische Substanz gekennzeichnet ist, wobei der Scavenger-Antikörper in einer ausreichenden Menge vorhanden ist, um die spezielle toxische Substanz bis einschließlich zu einer spezifischen Schwellenkonzentration zu binden; wobei ein Capture-Antikörper an einer Bindung mit einem Detektor-Antikörper gehindert wird, bis die Konzentration des speziellen biologischen Materials die spezifische Schwellenkonzentration übersteigt.
Verfahren zum Nachweis der Anwesenheit oder Abwesenheit einer speziellen toxischen Substanz, wobei das Verfahren folgendes umfasst: a) Bereitstellen einer Grundschicht, bei der es sich um eine flexible Polyolefinfolie handelt, die eine Oberfläche aufweist, die einer Behandlung unterzogen worden ist, die eine Verstärkung der Fähigkeit der Folie zur Immobilisierung eines darauf aufgebrachten Liganden bewirkt; b) Bereitstellen eines Capture-Antikörpers, bei dem es sich um einen biologisch aktiven Liganden handelt, der durch seine Fähigkeit zur Erkennung eines Epitops der speziellen toxischen Substanz gekennzeichnet ist, wobei der Ligand auf der Oberfläche der Polyolefinfolie immobilisiert ist; c) Bereitstellen einer ersten Agarose-Gelüberzugsschicht, die über dem Capture-Antikörper liegt, wobei die Agaroseschicht für die toxische Substanz durchlässig ist und Bestandteile zur Verstärkung des Wachstums der toxischen Substanz enthält, wobei die Schicht ferner einen Detektor-Antikörper enthält, bei dem es sich um einen biologisch aktiven Liganden handelt, der durch seine Fähigkeit zur Erkennung eines unterschiedlichen Epitops der speziellen toxischen Substanz gekennzeichnet ist; d) Bereitstellen einer zweiten Schutz-Gelüberzugsschicht, die über dem Detektor-Antikörper liegt und einen Porositätsgrad aufweist, der ausreicht, um einen Durchgang des Detektor-Antikörpers zu verhindern; e) Platzieren des biologischen Testmaterials in einer Umgebung, die eine spezielle toxische Substanz enthalten kann; und f) Überwachen des biologischen Testmaterials für eine ausreichende Zeitspanne um ein visuelles Signal zu beobachten, das die Anwesenheit oder Abwesenheit der speziellen toxischen Substanz bestätigt.
Material, das zum Verpacken von Nahrungsmitteln geeignet ist und durch seine Fähigkeit zum Nachweis der Anwesenheit einer oder mehrerer toxischer Substanzen und insbesondere zu deren Identifizierung geeignet ist, umfassend: eine Grundschicht, bei der es sich um eine flexible Polyolefinfolie handelt, die eine Oberfläche aufweist, die einer Behandlung unterzogen worden ist, die eine Verstärkung der Fähigkeit der Folie zur Immobilisierung eines darauf aufgebrachten Liganden bewirkt; einen Capture-Antikörper, bei dem es sich um einen biologisch aktiven Liganden handelt, der durch seine Fähigkeit zur Erkennung eines Epitops der speziellen toxischen Substanz gekennzeichnet ist, wobei der Ligand auf der Oberfläche der Polyolefinfolie immobilisiert ist; eine erste Schutz-Agarose-Gelüberzugsschicht, die über dem Capture-Antikörper liegt, wobei die Agaroseschicht für die toxische Substanz durchlässig ist; einen Detektor-Antikörper, bei dem es sich um einen biologisch aktiven Liganden handelt, der zur Erkennung eines unterschiedlichen Epitops der speziellen toxischen Substanz befähigt ist, wobei der Detektor-Antikörper über der ersten Schutz-Gelüberzugsschicht liegt; und eine zweite Gelüberzugsschicht, die über dem Detektor-Antikörper liegt und einen Porositätsgrad aufweist, der zur Verhinderung des Durchgangs des Detektor-Antikörpers ausreicht.
Material nach Anspruch 9, wobei die flexible Polyolefinfolie aus der Gruppe Polyethylen, Polypropylen und Gemische davon ausgewählt ist.
Material nach Anspruch 9, wobei die Polyolefinfolie einer Oberflächenbehandlung durch einen Korona-Entladungsvorgang unterzogen worden ist.
Material nach Anspruch 9, wobei es sich bei der speziellen toxischen Substanz um eines oder mehrere Elemente handelt, die aus der Gruppe spezielle Mikroorganismen, biologische Materialien mit einem Gehalt an den genetischen Eigenschaften dieser speziellen Mikroorganismen und Mutationen davon ausgewählt sind.
Material nach Anspruch 9, wobei die spezielle toxische Substanz aus der Gruppe Mikroorganismen, Nucleinsäuren, Proteine, integrale Komponenten von Mikroorganismen und Kombinationen davon ausgewählt ist.
Material nach Anspruch 9, wobei der Ligand aus der Gruppe Antikörper, einzelsträngige Nucleinsäuresonden, Aptamere, Lipide, natürliche Rezeptoren, Lectine, Kohlenhydrate und Proteine ausgewählt ist.
Material nach Anspruch 9, ferner umfassend einen Scavenger-Antikörper, bei dem es sich um einen biologisch aktiven Liganden handelt, der durch eine im Vergleich zum Capture-Antikörper höhere Affinität für die spezielle toxische Substanz gekennzeichnet ist, wobei der Scavenger-Antikörper in einer ausreichenden Menge vorhanden ist, um die spezielle toxische Substanz bis einschließlich zu einer spezifischen Schwellenkonzentration zu binden; wobei ein Capture-Antikörper an einer Bindung mit einem Detektor-Antikörper gehindert wird, bis die Konzentration des speziellen biologischen Materials die spezifische Schwellenkonzentration übersteigt.
Material nach Anspruch 9, wobei eine oder mehrere Spezies von Capture-Antikörpern auf der Oberfläche der Polyolefinfolie in einer bestimmten Orientierung immobilisiert sind, wobei die eine oder mehreren Spezies durch eine besondere Gestalt charakterisiert sind; und eine oder mehrere entsprechende Spezies von Detektor-Antikörpern auf die Oberfläche der ersten Schutz-Gelüberzugsschicht in der gleichen bestimmten Orientierung wie die einen oder mehreren Spezies der Capture-Antikörper aufgetragen sind, wobei jede der einen oder mehreren Spezies immobilisiert ist, wobei ein Bild mit einer entsprechenden besonderen Gestalt entsteht; wobei eine gleichzeitige Bindung von einer der einen oder mehreren Spezies der Capture-Antikörper und einer oder mehreren entsprechenden Spezies der Detektor-Antikörper mit der speziellen toxischen Substanz, die von diesen erkannt wird, zum Auftreten eines visuellen Signals mit einer besonderen Gestalt, die der Spezies zugeschrieben wird, führt; wobei ein Betrachter auf die Anwesenheit und Identität der speziellen toxischen Substanz aufmerksam gemacht wird.