DE69904010T2

DE69904010T2 - Verwendung von vip zur erstellung eines medikamentes zur behandlung des endotoxischen schocks in säugetieren

Info

Publication number: DE69904010T2
Application number: DE69904010T
Authority: DE
Inventors: Mario Delgado Mora; Javier Leceta Martinez; Carmen Martinez Mora; Rosa Perez Gomariz
Original assignee: Universidad Complutense de Madrid
Current assignee: Universidad Complutense de Madrid
Priority date: 1998-04-17
Filing date: 1999-04-16
Publication date: 2003-08-21
Anticipated expiration: 2019-04-17
Also published as: ATE228006T1; PT1002542E; CA2294980A1; US6429188B1; EP1002542B1; WO1999053944A1; ES2138561B1; EP1002542A1; ES2138561A1; AU3148699A; JP2002507224A; DE69904010D1

Description

Ein endotoxischer Schock ist immer noch die Haupttodesursache in Krankenhäusern. Strategien zur Bekämpfung der Wirkungen des endotoxischen Schocks zentrieren sich auf die Bekämpfung der bakteriellen Agenzien, die für diese Wirkungen verantwortlich sind, die Wiederherstellung hämodynamischer Parameter, die Verhinderung zellulärer Aktivierung und das Modifizieren der Wirkung des Verteidigungsmechanismus (Boyd O., Current Opinion in Anaesthesiology, 1996, 9: 98).
Es ist derzeit akzeptiert, dass die entzündliche Reaktion auf bakterielle Produkte direkt zum endotoxischen Schock beiträgt (Parillo J. E., New England Journal of Medicine, 1993, 328: 1471). Toxische bakterielle Produkte und diejenigen, die während der Gewebeschädigung freigesetzt werden, aktivieren die Verteidigungsmechanismen mit Implikationen auf Zellen, wie Neutrophile, Monozyten, Makrophagen und endotheliale Zellen, und von Mediatoren, wie Cytokine, Plättchenaktivierungsfaktor, Metabolite der Arachidonsäure und Stickstoffoxid, was zu hämodynamischen Änderungen und Organläsionen für den Wirt führt (Moldawer L. L., Critical Care Medicine, 1994, 22: 3). Es wurden viele Cytokine als Marker für die Schwere der Entwicklung von septischem Schock vorgeschlagen. Die Mengen an zirkulierendem TNF, IL-1, IL-6 und IL-8 wurden mit der Wahrscheinlichkeit des Überstehens einer septischen Episode korreliert. TNF und IL-1, die Menschen oder experimentellen Tieren verabreicht wurden, produzieren viele der hämodynamischen Signale eines septischen Schocks (Tracey K. J. et al., 1986, Science, 234: 470). Deren Hemmung durch Injektion von antagonistischen Rezeptoren und blockierenden monoklonalen Antikörpern wurde mit einem weiten Bereich an Ergebnissen untersucht (Fisher C. J. et al., 1994, Critical Care Medicine, 22: 12). Von den immunologischen Markern sind die Mengen an zirkulierendem IL-6 die besten Indikatoren der Schwere der Sepsis und der Möglichkeiten, diese Episode zu überstehen (Liaw Y. S. et al., 1997, Journal of the Formosan Medical Association, 96: 685). Trotz der Fortschritte im Wissen um die Mechanismen und den technischen und pharmazeutischen Fortschritt, gibt es immer noch wenige Ergebnisse bezüglich einer Verbesserung in den Daten für die Motalitätsrate. Diese Rate korrespondiert mit 200.000 Todesfällen pro Jahr in den Vereinigten Staaten und Europa (Vicent J.-L. und Chamlou R., Current Opinion in Anaesthesiology, 1996, 9: 146).
Das gastrointestinale Neuropeptide (VIP) ist ein Grundpeptid von 28 Aminosäureeinheiten, dessen Sequenz (Mutt V. und Said S. I., European Biochemistry, 1974, 42: 581):
His-Ser-Asp-Ala-Val-Phe-Thr-Asp-Asn-Tyr-Thr-Arg-Leu-Arg-Lys-Gln-Met-Ala-Val-Lys- Lys-Tyr-Leu-Asn-Ser-Ile-Leu-Asn-NH&sub2;
ist.
Es wurde ursprünglich aus dem Dünndarm von Schwein isoliert und später in dem Gehirn und Endpunkten des peripheren Nervensystems identifiziert. Es wurde als ein Neuropeptid mit neuromodulierenden Eigenschaften etabliert (Fahrenkrug J., Pharmacology and Toxicology, 1993, 72: 354). Sein Name ist aus seinen peripheren vasodilatorischen Eigenschaften abgeleitet. VIP wurde auch in Rattenmastzellen und in Granulomas identifiziert (Cutz E. et al., Nature, 1978, 275: 661). Immunologische Studien, die an histologischen Schnitten von Thymus, Milz und lymphatischen Ganglien aus Ratten durchgeführt wurden, identifizierten das immunaktive VIP in den Lymphozyten dieser Organe (Leceta et al., Advances In Neuroimmunology, 1996, 6: 29).
VIP übt seine biologischen Wirkungen durch Membranrezeptoren aus, die zur Superfamilie von sieben hydrophoben Domänen gehören, die an G-Proteine gekoppelt sind, welche Information zu den endgültigen Effektormolekülen transduzieren (Laburthe M. y Couvineau A., Annals of the New York Academy of Sciences, 1988, 527: 296). Die Rezeptoren für VIP wurden in verschiedenen Geweben, wie Leber- und u. a. Fettgewebe, charakterisiert. Diese korrespondieren zu zwei Arten, dem so genannten VIP1-R (Ischihara T. et al., Neuron, 1992, 8: 811) und VIP2-R (Lutz E. et al., FEBS Letters, 1993, 334: 3). In dem Immunsystem wurden spezifische Rezeptoren für VIP in einer Reihe von Immunzellen charakterisiert, die menschliche periphere Lymphozyten, menschliche Monozyten, Ratten- und Mauslymphozyten, Ratten-alveolare Makrophagen und peritoneale Makrophagen von Ratte und Maus umfassen (Delgado M. et al., Regulatory Peptides, 1996, 62: 161). VIP moduliert eine große Vielfalt von Immunfunktionen, wie eine Phagozytenfunktion in jedem Stadium des Prozesses, die proliferative Reaktion, die Produkti on von Immunglobulin, NK-Aktivität und Cytokinproduktion (Ganea et al., Advances in Neuroimmunology, 1996, 6: 61).
Der Peptidaktivator der hypophysären Adenylatcyclase (PACAP) ist ein Mitglied der Familie der Peptide von Sekretin/VIP/Glucagon, von denen zwei molekulare Formen bekannt sind, namentlich PACAP-38 und PACAP-27, deren Sequenzen wie gezeigt sind (Ogi K. et at., Biochemical and Biophysical Research communication, 1993, 196: 1511):

PACAP-38

His-Ser-Asp-Gly-Ile-Phe-Thr-Asp-Ser-Tyr-Ser-Arg-Tyr-Arg-Lys-Gln-Met-Ala-Val-Lys-Lys- Tyr-Leu-Ala-Ala-Val-Leu-Gly-Lys-Arg-Tyr-Lys-Gln-Arg-Val-Lys-Asn-Lys-NH&sub2;

PACAP-27

His-Ser-Asp-Gly-Ile-Phe-Thr-Asp-Ser-Tyr-Ser-Arg-Tyr-Arg-Lys-Gln-Met-Ala-Val-Lys-Lys- Tyr-Leu-Ala-Ala-Val-Leu-NH&sub2;
Beide Peptide sind in dem zentralen und peripheren Nervensystem weitverbreitet.
Es gibt auch PACAP-produzierende Zellen in der Lunge, in pankreatischen B-Zellen und in dem Darm (Arimura A., Regulatory Peptides, 1992, 37: 287). In dem Immunsystem wurde ein großes Vorkommen von PACAP-positiven Zellen in zentralen und peripheren Lymphorganen beschrieben (Gaytan F. et al., Cell and Tissue Research, 1994, 276: 233). Für PACAP wurden drei Arten von Rezeptoren beschrieben (Shivers B. D. et al., Endocrinology, 1991, 128: 3055; Inagaki N. y col., Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 1994, 91: 2679): der PACAP-Typ I-Rezeptor (PACAP-R-I) mit einer gleichen Affinität für PACAP-38 und PACAP-27, der aber eine um 300- bis 1000-fach geringere Affinität für VIP aufweist; der PACAP-TYP II-Rezeptor (PACAP-R-II), der mit der gleichen Affinität VIP, PACAP-38 und PACAP-27 erkennt und somit der typische Rezeptor von VIP-PACAP ist und mit dem Rezeptor VIP VIP1-R und dem PACAP-TYP III-Rezeptor (PACAP-R-III) korrespondiert, welcher mit dem Rezeptor VIP VIP2-R korrespondiert. Bis jetzt gab es wenige Studien bezüglich der biologischen Wirkungen von PACAP auf das Immunsystem. Die Wirkungen von PACAP sind oft ähnlich mit denen von VIP, das die Phagozytenfunktion und proliferativen Reaktionen moduliert.

Beschreibung der Erfindung

Die Aufgabe der Erfindung ist die Verwendung des gastrointestinalen Neuropeptids (VIP) und der Analoga davon als therapeutische Agenzien zur Herstellung eines Medikaments, das zur Behandlung eines Endotoxinschocks bei Säugetieren vorgesehen ist.
Die Behandlung besteht aus der Verabreichung einer wirksamen Menge eines Agenz, das die Produktion des Tumornekrosfaktors (TNF) hemmt, in einem verträglichen pharmazeutischen Träger an Säugetiere, die dessen bedürfen.
VIP und PACAP haben entzündungshemmende Wirkungen und hemmen die Produktion von IL-1, IL-6 und TNF in Tiermodellen zur Induktion von endotoxischen Schocks. Da diese Cytokine eine wichtige Rolle in der Entwicklung besagter Syndrome spielen, können VIP und PACAP verwendet werden, um deren Produktion zu regulieren.
Es ist bekannt, dass die meisten dieser Wirkungen des endotoxinen Schocks durch die Aktivierung des Immunsystems und die entzündlichen Mechanismen des Wirts als Reaktion auf bakterielle Produkte vermittelt werden. Makrophagen spielen eine Schlüsselrolle in diesem Prozess, da nach deren Aktivierung Faktoren wie Stickstoffoxid, Prostaglandine und Cytokine, die für Symptome wie Fieber, Bluthochdruck, gestreute Mikrokoagulation, Multiorganversagen und letztendlich Tod, folgen. In ähnlicher Weise wurden große Mengen von zirkulierendem TNF, IL-1 und IL-6, die mit Endotoxämie assoziiert sind, beschrieben. In Tiermodellen werden diese Symptome sowohl durch Verabreichung bakterieller Endotoxine (LPS) wie auch durch die Injektion von TNF und IL-1 reproduziert. Andere Studien haben den diagnostischen Wert bezüglich der Wahrscheinlichkeit des Überlebens, die durch die Menge an zirkulierendem IL-6 repräsentiert wird, unterstrichen.
Der Tumornekrosefaktor (TNF) wird von verschiedenen Arten von Zellen produziert, die Monozyten und Makrophagen, T- und B-Lymphozyten, Neutrophile, Mastzellen, Tumorzellen und Fibroblasten umfassen. Er ist ein wichtiger regulatorischer Faktor in anderen pro-entzündlichen Cytokinen, wie IL-1β, IL-6 und IL-8. TNFα induziert die Expression von Adhäsionsmolekülen in endothelialen Zellen, aktiviert Leukozyten zur Zerstörung der Mikroorganismen, wirkt auf die Hepatozyten zur Erhöhung der Synthese von Se rumproteinen, die zur akuten Phasenreaktion beitragen, und aktiviert das Koagulationssystem. Eine Überproduktion davon führt zu immunpathologischen Krankheiten, Autoimmunität und Entzündung.
IL-6 ist ein multifunktionelles Cytokin, das sowohl durch Lymphozyten wie auch nichtlymphoide Zellen produziert wird. Es reguliert verschiedene Aspekte der Immunantwort, wie die Produktion von Proteinen, die die akute Phase vermitteln, und die Hämatopoese. Des Weiteren wirkt es als Mediator in einer entzündlichen Reaktion. Seine Produktion wird durch verschiedene Faktoren reguliert, die TNFα, IL-1 und bakterielles Endotoxin (LPS) umfassen.
Strategien zur Neutralisation dieser Cytokine wurden in der Behandlung von endotoxischem Schock untersucht, aber die Ergebnisse zeigen nicht an, dass es eine erhöhte langfristige Überlebensrate gibt. Eine Behandlung, die die Produktion von TNF und IL-6 hemmt, würde eine beachtliche Verbesserung in der Evolution von endotoxischem Schock und in den Wahrscheinlichkeiten eines Überlebens darstellen.
Die Verabreichung von VIP in Tiermodellen erzielt diese Wirkungen und unsere Erfindung besteht aus der Verwendung dieses Neuropeptids zur Herstellung eines Medikaments zur Verbesserung der Überlebensrate in Fällen von endotoxischem Schock.

Beschreibung der Figuren

Fig. 1 zeigt die Produktion von TNFα durch murine Makrophagen in Kultur (5 · 10&sup5; Zellen/ml), die mit 10 ng/ml LPS in der Gegenwart oder Abwesenheit von 10&supmin;&sup8; M VIP oder PACAP über einen Zeitraum von 24 Stunden stimuliert wurden.
Fig. 2 zeigt die Produktion von TNFα durch murine Makrophagen in Kultur (5 · 10&sup5; Zellen/ml) nach 6 Stunden Kultur mit 10 ng/ml LPS und zu denen 10&supmin;&sup8; M VIP oder PACAP zu verschiedenen Zeiten hinzugefügt wird.
Fig. 3 zeigt die Produktion von IL-6 durch murine Makrophagen in Kultur (5 · 10&sup5; Zellen/ml), die mit 10 ng/ml LPS in der Gegenwart oder Abwesenheit von 10&supmin;&sup8; M VIP oder PACAP über einen Zeitraum von 24 Stunden stimuliert wurden.
Fig. 4 zeigt die Produktion von IL-6 durch murine Makrophagen in Kultur (5 · 10&sup5; Zellen/ml) nach 6 Stunden Kultur mit 10 ng/ml LPS und zu denen 10&supmin;&sup8; M VIP oder PACAP zu verschiedenen Zeitpunkten hinzugefügt wird.
Fig. 5 zeigt die Northern-Blot-Analyse auf das Vorhandensein von mRNA, die mit TNFα und IL-6 in Makrophagen korrespondiert, die mit LPS in der Gegenwart oder der Abwesenheit von VIP oder PACAP (18S zeigt die korrespondierende rRNA als eine Kontrolle der Gesamtmenge der RNA-Menge) stimuliert wurden.
Fig. 6 zeigt die Überlebensrate von Mäusen, die mit 400 ug LPS injiziert wurden, entweder gleichzeitig oder nach 30 Minuten, 1 oder 4 Stunden, mit 5 nmol VIP oder PACAP. A: Kontrolle; B: VIP bei 0 h; C: VIP bei 0,5 h; D: VIP bei 1 h; E: VIP bei 4 h.

Ausführungsform der Erfindung

Die Beispiele, die folgen, dienen nur der Illustration der erhaltenen Ergebnisse und schränken die Verwendung der Erfindung nicht ein. Diese Verwendung wird in den spezifizierten Ansprüchen im Detail aufgezeigt.

Beispiel 1

VIP und PACAP hemmen die Produktion von TNFα in Makrophagen, die mit LPS stimuliert wurden

In Experimenten, die in vitro durchgeführt wurden, hemmen VIP und PACAP die Produktion von TNFα in peritonealen murinen Makrophagen, die mit LPS stimuliert wurden. Der höchste Grad an Hemmung erreicht einen Werte nahe 60% und kommt bei stimulatierenden Dosen zwischen 1 und 10 ng/ml LPS vor. Die IC&sub5;&sub0; liegt um 80 pM, sowohl für VIP wie auch für PACAP, und die Wirkung wurde bis zum Ende des Experiments beobachtet (siehe Fig. 1). Die hemmende Wirkung ist die gleiche, wenn beide Neuro peptide bis zu 1 Stunde nach Stimulierung der Makrophagen mit LPS hinzugefügt werden, obwohl sie sich progressiv verringert, bis sie verschwindet, wenn diese nach 4 Stunden hinzugefügt werden (siehe Fig. 2).

Beispiel 2

VIP und PACAP verringern die Mengen an zirkulierendem TNFα nach Injektion mit LPS

In einem mit Mäusen durchgeführten Experiment erreichen die Mengen an zirkulierendem TNFα 2 Stunden nach der Injektion von 25 ug LPS 4 ng/ml. Die gleichzeitige Verabreichung von 5 nmol VIP oder PACAP verringert besagte Mengen um 60%.

Beispiel 3

VIP und PACAP hemmen die Produktion von IL-6 in Makrophagen, die mit LPS stimuliert wurden

In in vitro durchgeführten Experimenten hemmen VIP und PACAP die Produktion von IL-6 in peritonealen murinen Makrophagen, die mit LPS stimuliert wurden. Der höchste Grad an Hemmung erreicht Werte nahe 90% und kommt bei stimulierenden Dosen von 10 ng/ml LPS vor. Die IC&sub5;&sub0; ist 8,6 pM, sowohl für VIP wie auch PACAP und die Wirkung wird bis zum Ende des Experiments beobachtet (siehe Fig. 3). Die Wirkung wird auch beobachtet, wenn die Neuropeptide nach der Stimulation mit LPS hinzugefügt werden, obwohl der Grad der Hemmung progressiv weniger wird (siehe Fig. 4).

Beispiel 4

VIP und PACAP verringern die Mengen an zirkulierendem IL-6 nach Injektion von LPS

In einem mit Mäusen durchgeführten Experiment erreichen die Mengen an zirkulierendem IL-6 2 Stunden nach Injektion von 25 ug LPS 1,5 ng/ml. Die gleichzeitige Verabrei chung von 5 nmol VIP oder PACAP verringern besagte Mengen jeweils um 60% und 75%.

Beispiel 5

VIP und PACAP regulieren die Produktion von TNFα und IL-6 auf einer transkriptionalen Ebene

Mausmakrophagen wurden den experimentellen Bedingungen der Beispiele 1 und 3 ausgesetzt und ihre mRNA isoliert. Diese wurde dann unter Verwendung der Northem- Blot-Technik analysiert zum Nachweis von mRNA von TNFα und IL-6. Fig. 5 zeigt die Abwesenheit von Transkripten für TNFα oder IL-6, wenn die mit LPS aktivierten Makrophagen auch VIP oder PACAP ausgesetzt wurden.

Beispiel 6

VIP und PACAP schützen gegen die letalen Wirkungen von LPS

Es wurde ein Experiment durchgeführt, in welchem die Überlebensrate über einen 4-Tageszeitraum in Mäusen untersucht wurde, die mit 400 pg LPS injiziert worden waren. Die Ergebnisse werden in Fig. 6 gezeigt. Die Motalität unter diesen Umständen betrug 100% nach 36 Stunden. Bei gleichzeitiger Verabreichung von 5 nmol VIP oder PACAP wurde eine Überlebensrate von 60% am Ende des Experiments erreicht. Die Verabreichung von Neuropeptiden bis zu 1 Stunde nach Injektion mit LPS ergab immer noch Überlebensraten nahezu 50%.

Claims

1. Benutzung des gastrointestinalen Neuropeptids (VIP) für die Zubereitung eines Medikaments für die Behandlung eines Endotoxinschocks bei Säugetieren.

2. Benutzung nach Anspruch 1 eines Fragments oder Derivats des gastrointestinalen Neuropeptids (VIP) nach Anspruch 1.