DE69839118T2 - Verfahren zur extrahierung fettlöslicher substanzen aus mikrobiellen zellen - Google Patents

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Description

  • HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • Gebiet der Erfindung:
  • Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Extrahieren der in mikrobiellen Zellen enthaltenen fettlöslichen Komponenten und insbesondere ein Verfahren zum Extrahieren und Gewinnen der in mikrobiellen Zellen enthaltenen fettlöslichen Komponenten in hochwirksamer und sicherer Weise.
  • Beschreibung der einschlägigen Technik:
  • Mikroorganismen, wie faserige Pilze, Hefe und Algen haben die Fähigkeit Lipide zu produzieren. Es sind daher eine Vielzahl Verfahren praktiziert worden, Lipide aus mikrobiellen Zellen, die mit Lipid produzierender Fähigkeit ausgestattet sind, zu extrahieren.
  • Allgemein ist Lipid in mikrobiellen Zellen angehäuft und es sind solche Verfahren bekannt, bei denen aus mikrobiellen Zellen Lipid direkt oder durch mechanische Zerstörung der Zellwände oder mithilfe von Enzymen extrahiert wird.
  • Zur Extraktion von fettlöslichem Material ist ein Verfahren auf folgendem Weg bekannt: Mikrobille Zellen mit der Fähigkeit, Öle und Fette zu produzieren, werden in Ethanol suspendiert und dann zerstört und die Suspension nachfolgend der Filtration und Zentrifugierung unterworfen, um Ethanol abzutrennen. Ein Extraktionslösungsmittel wird zur Suspendierung des Materials zugesetzt, welches dann zur Extraktion der Zerstörung unterworfen wird (wie beschrieben in z. B. offengelegter japanischer Patentanmeldung (kokai) Nr. 61-170397 , 61-227790 , 62-44170 und 62-179598 ).
  • Von diesen Verfahren bezieht sich die in der offengelegten japanischen Patentanmeldung (kokai) Nr. 61-170397 offenbarte Erfindung auf ein Mehrstufenextraktionsverfahren, bei dem jede Stufe die Verwendung einer anderen Lösungsmittelart erfordert, wie ein alkoholisches Lösungsmittel oder ein Kohlenwasserstofflösungsmittel. Darüber hinaus muss jede Stufe Hilfsmittel zur Abtrennung des organischen Lösungsmittels von den Zellen einbeziehen. Daher hat das Verfahren den Nachteil einer komplizierten Verfahrensweise.
  • Zusätzlich brauchen alle oben genannten Verfahren eine ziemlich lange Zeit, um eine ausreichende Menge an Ölen und Fetten zu gewinnen, weshalb keine effiziente Extraktion bewerkstelligt werden kann.
  • Da die Zellen weiterhin in einem organischen Lösungsmittel zerstört werden, was ein Brandrisiko mit sich bringt, schafft das Verfahren ein Sicherheitsproblem. Wenn eine Feuerlöscheinrichtung installiert werden muss, um solche Nachteile zu beheben, fallen enorme Kosten an, die das Verfahren unwirtschaftlich machen.
  • Zur Lösung dieser Probleme ist ein Verfahren vorgeschlagen worden, bei dem in Wasser dispergierte Zellen der mechanischen Zerstörung unterworfen werden und dann zur Trockne gebracht werden, gefolgt von Einführen in eine Säule, um dadurch unter Verwendung eines Lösungsmittels Öle und Fette zu extrahieren (offengelegte japanische Patentanmeldung (kokai) Nr. 5-17796 ).
  • Gemäß diesem Verfahren ist der Extraktanteil hoch und die in den mikrobiellen Zellen enthaltenen fettlöslichen Komponenten können auf sichere Weise extrahiert und gewonnen werden. Es hat jedoch einen Nachteil; fein verteilte feine Pulverpartikel setzen die Extraktionssäule zu, wodurch eine verlängerte Extraktionszeit benötigt wird. WO 97/37032 offenbart die Trennung von Lipid-Substanzen von Biomasse, einschließlich einer Pelletierstufe.
  • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Um diese mit herkömmlichen Verfahren verbundenen Probleme zu lösen, haben die Erfinder der vorliegenden Erfindung ernsthafte Forschung betrieben und haben gefunden, dass die in mikrobiellen Zellen enthaltenen fettlöslichen Komponenten in einer bemerkenswert effizienten Art und in kurzer Zeit auf dem folgenden Weg extrahiert und gewonnen werden können: getrocknete, fettlösliche Komponenten enthaltende mikrobielle Zellen werden gleichzeitig dem Zerreißen und Formen unter Verwendung eines Extruders, besonders eines Doppelschneckenextruders, unterworfen und dann die enthaltene fettlösliche Komponente unter Verwendung eines Lösungsmittels extrahiert. Die vorliegende Erfindung wurde auf der Basis dieser Erkenntnis fertiggestellt.
  • Demgemäß stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Extrahieren von fettlöslichen Komponenten, enthalten in fettlösliche Komponenten enthaltenden mikrobiellen Zellen, zur Verfügung, dadurch charakterisiert, dass die fettlösliche Komponenten enthaltenden, getrockneten, mikrobiellen Zellen dem Zerreißen und Formen unter Verwendung eines Extruders, besonders eines Doppelschneckenextruders unterworfen werden und dann die enthaltene fettlösliche Komponente unter Verwendung eines organischen Lösungsmittels extrahiert wird.
  • KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
  • 1 zeigt eine in den Beispielen verwendete Säule
  • BEVORZUGTE AUSFÜHRUNGSFORMEN DER ERFINDUNG
  • Die in der Erfindung zu extrahierenden fettlöslichen Komponenten, sind Substanzen, die in Wasser mäßig löslich, in organischen Lösungsmitteln löslich und im lebenden Körper vorhanden sind. Beispiele für solche Komponenten schließen ein 1) einfache Lipide, wie neutrale Lipide (z. B. Triglyceride), Wachse, Glyceride, fettlösliche Färbemittel, Sterine und Ester von Vitaminen; 2) komplexe Lipide, wie Phospholipide und Glykolipide; und 3) Fettsäuren, höhere Alkohole und Sterine, welche als Vorläufer oder Metabolite von obigen 1) und 2) zu betrachten sind, Carotenoide und Squalene, welche als Kohlenwasserstoffe zu betrachten sind, und Lipidderivate, die fettlösliche Vitamine umfassen.
  • Die in der vorliegenden Erfindung verwendeten fettlösliche Komponenten enthaltenden mikrobiellen Zellen werden durch Kultivieren auf gewöhnliche Weise von Mikroorganismen, welche die Fähigkeit haben, fettlösliche Komponenten zu produzieren, erhalten.
  • Beispiele für Mikroorganismen, die die Fähigkeit haben, fettlösliche Komponenten zu produzieren, schließen faserige Pilze, Algen, Hefe und Bakterien ein.
  • Beispiele für Mikroorganismen, die die Fähigkeit haben, ein γ-Linolensaure enthaltendes fettlösliches Material zu produzieren, schließen Mikroorganismen ein, die zur Gattung Mortierella, zur Gattung Mucor und zur Gattung Rhizopus gehören.
  • Beispiele für Mikroorganismen, die die Fähigkeit haben, ein Dihomo-γ-Linolensäure oder Arachidonsäure enthaltendes fettlösliches Material zu produzieren, schließen Mikroorganismen ein, die zur Gattung Mortierella, und zur Gattung Conidiobolus gehören.
  • Beispiele für Mikroorganismen, die die Fähigkeit haben, ein Linolensäure enthaltendes fettlösliches Material zu produzieren, schließen Mikroorganismen ein, die zur Gattung Yarrowia gehören.
  • Beispiele für Mikroorganismen, die die Fähigkeit haben, ein Docosahexansäure enthaltendes fettlösliches Material zu produzieren, schließen Mikroorganismen ein, die zur Gattung Crypthecodinium und zur Gattung Schizochytrium gehören.
  • Im Einzelnen schließen Beispiele für Mikroorganismen, die zur Gattung Mortierella gehören, ein: Mortierella isabell/na IFO 7824, Mortierella ramaniana Var. angrispora IFO 8187, Mortierella elongata IFO 8570, Mortierella exigua IFO 8571, Mortierella phygrophila IFO 5941 und Mortierella alpina IFO 8568, IFO 32281, ATCC 8979, ATCC 16266, ATCC 32221, ATCC 32222, ATCC 32223, ATCC 36965, ATCC 42439, CBS 250.53, CBS 343.66, CBS 527.72, CBS 529.72, CBS 608.70 und CBS 754.68.
  • Beispiele für Mikroorganismen, die zur Gattung Mucor gehören, schließen ein: Mucor circinelloides HUT 1121 (deponiert mit dem Institut für Fermentationsforschung: FERM BP-3883) und Mucor javanicus HUT 1162 (Stammkultur deponiert bei dem Institut für Fermentationsforschung: FERM BP-3884).
  • Beispiele für Mikroorganismen, die zur Gattung Ryizopus gehören, schließen Ryizopus oryzae IFO 5418 ein.
  • Beispiele für Mikroorganismen, die zur Gattung Conidiobulus gehören, schließen Conidiobolus heterosporus ATCC 12941, Conidiobolus nanodes CBS 183/62, Conidiobolus lamprauges ATCC 12585 ein.
  • Beispiele für Mikroorganismen, die zur Gattung Yarrowia gehören, schließen Yarrowia lipolytica IFO 0746 ein, Beispiele für Mikroorganismen, die zur Gattung Crypthecodinium gehören, schließen ein: Crypthecodinium cohnii 30021, 30334, 30336, 30543, 30556, 30571, 30572, 30775, 50051, 50052, 50053, 50055, 50058 und 50060 und Thraustochytrium aureum ATCC, 2821 und 34304.
  • Von diesen Mikroorganismen ist die Fähigkeit zur Produktion fettlöslicher Komponenten bekannt und sie sammeln beträchtliche Mengen fettlösliche Komponente (z. B. Trigyceride) in ihren Zellen an. Solche Mikroorganismen können in üblicher Weise kultiviert werden. Für das Kulturmedium zum Kultivieren der vorgenannten Mikroorganismen besteht keine Einschränkung, solange es die Mikroorganismen gut wachsen lässt und diese die angestrebte fettlösliche Komponente produzieren. Beispiele für die Kohlenstoffquellen des Kulturmediums schließen Glukose und Stärke ein und Beispiele für die Stickstoffquellen schließen Ammoniumsulfat, Harnstoff und die organischen Stickstoffquellen solche, wie entfettetes Sojabohnenmehl und entfettete Reiskleie ein. Metallsalze wie Phosphate, Magnesiumsalze, Mangansalze und Calciumsalze, können dem Kulturmedium, in dem die Mikroorganismen kultiviert werden, gegebenenfalls zugesetzt werden, während der pH und die Temperatur in geeigneter Weise kontrolliert werden.
  • Auf eine solche Weise können fettlösliche Komponenten enthaltende Mikroorganismen erhalten werden. Da die fettlösliche Komponente normalerweise in den Zellen angehäuft ist, werden die Zellen, nachdem die Kultur der Zellen vollständig ist, auf dem Wege der Filtration oder Zentrifugieren aus der Kulturlösung gewonnen.
  • Nachfolgend werden die erhaltenen Zellen zur Trockne gebracht, um dadurch die getrockneten, fettlösliche Komponenten enthaltenden mikrobiellen Zellen zu erhalten.
  • Die Trocknung kann unter Verwendung eines Trommeltrockners, Sprühtrockners, Puddeltrockners oder Ähnlichen durchgeführt werden.
  • Die Trocknung kann der vorliegenden Erfindung entsprechend so durchgeführt werden, dass der Feuchtigkeitsgehalt der Zellen 20 Gew.% oder weniger, bevorzugt 15 Gew.% oder weniger erreicht, d. h. die Trocknung ist nicht unbedingt vollendet. Wenn der Feuchtigkeitsgehalt der Zellen 20 Gew.% übersteigt, nimmt das Extraktionsverhältnis ab.
  • Der vorliegenden Erfindung entsprechend werden die so erhaltenen fettlösliche Komponenten enthaltenden getrockneten mikrobiellen Zellen unter Verwendung eines Extruders, insbesondere eines Doppelschneckenextruders, Zerbrechen und Formen unterworfen. Dementsprechend werden die getrockneten fettlösliche Komponenten enthaltenden mikrobiellen Zellen unter Verwendung eines Extruders, insbesondere eines Doppelschneckenextruders, zerrissen und pelletiert.
  • Die Verwendung eines Extruders, insbesondere eines Doppelschneckenextruders erlaubt das gleichzeitige mechanische Zerbrechen und Pelletieren der mikrobiellen Zellen mit dem Ergebnis der Verkürzung der Schritte. Darüber hinaus verhindert das Zerbrechen und Formen unter Verwendung eines Extruders, insbesondere eines Doppelschneckenextruders, das Zusetzen der unten beschriebenen Säule im Schritt der Extraktion unter Verwendung der Säule, wie auch den Schritt der Trennung der zerrissenen Zellen vom Extraktionslösungsmittel durch Filtration, mit dem Ergebnis einer Verkürzung der benötigten Extraktionszeit.
  • In dem Fall, in dem fettlösliche Komponenten enthaltende mikrobielle Zellen in großen Mengen behandelt werden, können Bindemittel, wie entfettete Keime zu den getrockneten mikrobiellen Zellen gegeben werden, um die Formbarkeit zu Pellets zu verbessern.
  • Die Arbeitsbedingungen (die Behandlungsbedingungen) des Extruders sollten den zu behandelnden Zellen entsprechend in geeigneter Weise ausgewählt werden und können nicht vollständig beschrieben werden. Jedoch sollte die Behandlungstemperatur im Allgemeinen etwa 20–120°C betragen, der Druck ungefähr 1–100 Kg/cm2 und die Behandlungszeit etwa 1–120 Sekunden; vorzugsweise sollte die Behandlungstemperatur etwa 50–120°C, der Druck ungefähr etwa 5–100 Kg/cm2 und die Behandlungszeit etwa 5-120 Sekunden betragen.
  • Beispiele für die Formgebung der Pellets schließen kugelförmige, pseudokugelförmige und zylindrische Formen ein, jedoch besteht keine besondere Einschränkung. In dem Fall einer kugelförmigen Gestalt des Pellets, wird die Formung vorzugsweise so durchgeführt, dass der Durchmesser in den Bereich von 1–10 mm, und unter Berücksichtigung der Durchlässigkeit für das Lösungsmittel besonders bevorzugt in den Bereich von 1–2 mm fällt. Im Fall, dass das Pellet eine andere als kugelförmige Gestalt hat, wird die Pelletierung vorzugsweise so durchgeführt, dass die größere Achse der erhaltenen Pellets vorzugsweise in einen Bereich von 1,0–100 mm, und deren kleinere Achse in den Bereich 0,5–5mm fällt, und unter Berücksichtigung der Permeabilität für das Lösungsmittel besonders vorzugsweise die größere Achse der erhaltenen Pellets in den Bereich von 2–50 mm, und deren kleinere Achse in Bereich von 1–4 mm fällt.
  • Durch Ausführen von Zerbrechen und Formen in einer solchen Weise werden zu Pellets geformte mikrobielle Zellen erhalten.
  • Der vorliegenden Erfindung entsprechend werden die in den mikrobiellen Zellen enthaltenen fettlöslichen Komponenten unter Verwendung eines organischen Lösungsmittels aus den so erhaltenen, zu Pellets geformten mikrobiellen Zellen extrahiert (extrahiert und dann gewonnen). Beispiele für das organische Lösungsmittel schließen n-Hexan, Ethanol, Aceton, Methylethylketon, Cyclohexan, Diethylether und Essigsäureethylester ein. Von diesen ist n-Hexan im Hinblick auf das Extraktionsverhältnis und Anwendung bei Lebensmitteln bevorzugt.
  • Für das Extraktionsverfahren unter Verwendung eines Lösungsmittels besteht keine besondere Beschränkung, jedoch ist die Extraktion unter Verwendung eines gepackten Turms (Säule) bevorzugt.
  • Eine exemplarische Arbeitsweise zur Extraktion und Gewinnung in mikrobiellen Zellen enthaltener fetlöslicher Komponenten unter Verwendung einer gepackten Säule, ist der Folgende.
  • Zuerst werden die zu Pellets geformten mikrobiellen Zellen (pelletierte Formlinge) in eine zylindrische gepackte Säule eingeführt und ein Extraktionslösungsmittel vom oberen Ende nach unten fließen gelassen. Nachfolgend wird das aus dem unteren Ende der gepackten Säule ausfließende Lösungsmittel aufgefangen und erneut vom oberen Ende nach unten fließen gelassen. Bei der Durchführung der Extraktion der fettlöslichen Komponenten wird dieser Vorgang wiederholt. Rückfließenlassen und Wiederverwenden des Lösungsmittel auf solche Weise, kann die zu verwendende Menge Lösungsmittel verringern.
  • Der Boden der gepackten Säule ist vorzugsweise mit einem Drahtgeflecht geeigneter Größe versehen oder mit einer Filtrierhilfe, wie Diatomeenerde oder Ähnlichen befüllt.
  • Unter Beachtung des Extraktionsverhältnisses und Wirtschaftlichkeit beträgt die Menge des bei der Extraktion zu verwendenden organischen Lösungsmittels 2–12 Liter/Kg der mikrobiellen Zellen (pelletierte Formlinge), besonders bevorzugt 3–5 Liter/Kg der mikrobiellen Zellen (pelletierte Formlinge)
  • Durch Entfernen des aus dem unteren Ende der gepackten Säule geflossenen Lösungsmittels mittels Destillation – nach ausreichender Extraktion der fettlöslichen Komponente – kann die in den mikrobiellen Zellen enthaltene fettlösliche Zielkomponente erhalten (gewonnen) werden.
  • Die Entfernung des Lösungsmittels durch Destillation kann in üblicher Weise, wie durch Konzentrieren bei vermindertem Druck, durchgeführt werden. Wenn erforderlich, kann die so erhaltene in den mikrobiellen Zellen enthaltene fettlösliche Komponente in üblicher Weise gereinigt werden.
  • Die vorliegende Erfindung kann in der oben beschriebenen Weise ausgeführt werden. Jedoch können die aus der Kulturlösung auf dem Wege der Filtration oder Zentrifugieren erhaltenen mikrobiellen Zellen zerrissen werden, bevor sie der Trocknungsbehandlung unterworfen werden.
  • Mikrobielle Zellen werden bevorzugt zerstört, während sie in Wasser dispergiert sind. Kurz gesagt, wird die Zerstörung ausgeführt, während die mikrobiellen Zellen wieder in Wasser dispergiert und suspendiert sind oder wenn sie in Wasser dispergiert oder suspendiert sind. Verwendung einer Hochdruck-Homogenisierapparatur oder Ähnlichen, die zur Emulgierung oder Homogenisierung einer pulvrigen Suspension verwendet wird, erlaubt kontinuierliche Behandlungen für die Dispersion Suspension und Zerstörung von Zellen.
  • BEISPIELE
  • Die vorliegende Erfindung, deren Gegenstand die Extraktion in Zellen enthaltenen fettlöslichen Materials ist, wird anschließend auf dem Wege über Beispiele mehr im Einzelnen beschrieben, die nicht als Begrenzung des Umfangs der Erfindung angesehen werden dürfen.
  • Bezugsbeispiel (Messung der Gesamtmenge des in Zellen enthaltenen fettlöslichen Materials):
  • Das Folgende ist ein Verfahren zur Messung der Gesamtmenge des in Zellen enthaltenen fettlöslichen Materials, welche Menge als Standard zur Berechnung des Extraktionsverhältnisses für das fettlösliche Material in den nachfolgenden Beispielen und Vergleichsbeispielen dient.
  • Zellen von Mucor circinelloides HUT 1121 (deponiert mit dem Institut für Fermentationsforschung: FERM BP-3883) wurden unter den in Tabelle 1 gezeigten Bedingungen in einem Fermentationsbad kultiviert und die resultierenden γ-Linolensäure enthaltenden Zellen durch Filtration gewonnen.
  • Die gewonnenen Zellen wurden wieder in Wasser so dispergiert, dass die Konzentration 12% betrug und ein Teil der Dispersion unter Verwendung eines Doppel- Trommeltrockners der Entwässerung unterworfen, um dadurch getrocknete Zellen mit einem Feuchtigkeitsgehalt von 4% zu erhalten.
  • Zu den so erhaltenen getrockneten Zellen (10 g) wurden n-Hexan (100 ml) und Glaskügelchen (100 ml) mit einem Durchmesser von 0,6 mm zugegeben. Das Gemisch wurde unter Verwendung eines Homogenisators (Excel Auto Homogenizer DX-3; Produkt von Nippon Seiki Co., Ltd.) bei einer Umdrehungsgeschwindigkeit von 10000 UpM 3 Minuten homogenisiert und dann zur Entfernung der Glaskügelchen und Zellfragmente der Filtration unterworfen. Nachfolgend wurde den Zellen erneut n- Hexan (100 ml) zugegeben und das Gemisch zweimal in der gleichen Weise, wie oben beschrieben, der Homogenisierung unterworfen. Das so erhaltene Filtrat wurde gesammelt und der Konzentration unter vermindertem Druck unterworfen, um dadurch ein gelbes fettlösliches Material (3,6 g) zu erhalten. Dieses Ergebnis zeigt, dass die Zellen ein fettlösliches Material in einer Menge von 36% enthalten.
  • Beispiel 1:
  • Zellen von Mucor circinelloides HUT 1121 (deponiert mit dem Institut für Fermentationsforschung: FERM BP-3883) wurden unter den in Tabelle 1 gezeigten Bedingungen in einem Fermentationsbad kultiviert und die resultierenden-Linolensäure enthaltenden Zellen durch Filtration gewonnen.
  • Die gewonnenen Zellen wurden wieder so in Wasser dispergiert, dass die Konzentration 12% erreichte und ein Teil der Dispersion unter Verwendung eines Doppel-Trommeltrockners der Entwässerung unterworfen um dadurch getrocknete Zellen mit einem Feuchtigkeitsgehalt von 4% zu erhalten.
  • Ein Teil der getrockneten Zellen wurde unter Verwendung eines Doppelschneckenextruders (TCO-75L; Produkt von Kobe Steel, Ltd.) Zerbrechen und Formen unterworfen. Die Formung wurde so durchgeführt, dass die Pellets eine größere Achse von 2–50 mm und eine kleinere Achse von 1–4 mm hatten.
  • Die so pelletierten Zellen (10 g) wurden in eine Glasssäule mit einem innneren Durchmesser von 20 mm, wie in Abb 1 gezeigt, eingeführt. N-Hexan (100 ml) wurde am oberen Ende der Säule eingegossen. Nach 30 Minuten Verweilen des Inhalts, wurde der Stöpsel am Boden geöffnet und ein n-Hexan – fettlösliches Material Gemisch eluiert und gesammelt. Dann wurde erneut n-Hexan (100 ml) der Säule zugesetzt und das Gemisch in der gleichen Weise, wie oben beschrieben, gesammelt. Durch Filtration des Gemisches und Entfernen von n-Hexan durch Destillation unter vermindertem Druck, wurde ein fettlösliches Material (3,3 g) erhalten.
  • Gemessen wurde die Zeit, die benötigt wurde, das Lösungsmittel (200 ml) von der Säule zu eluieren (Lösungsmittel-Elutionszeit). Die Lösungsmittel-Elutionszeit und das Extraktionverhältnis des fettlöslichen Materials sind in Tabelle 2 gezeigt.
  • Vergleichsbeispiel 1:
  • Es wurde die Arbeitsweise des Beispiels 1 ausgeführt, mit der Ausnahme, dass Zerbrechen und Formen mithilfe eines Doppelschneckenextruders ausgelassen wurden. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 gezeigt.
  • Der Vergleich der Ergebnisse von Beispiel 1 mit denjenigen von Vergleichsbeispiel 1 zeigt das Folgende:
    In Beispiel 1 war die Lösungsmittel-Elutionszeit so kurz wie 6 Minuten und das Extraktionsverhältnis so hoch wie 94%, wogegen im Vergleichsbeispiel 1, in welchem Zerbrechen und Formen unter Verwendung eines Doppelschneckenextruders nicht vorgenommen wurden, sondern die Arbeitsweise anders ausgeführt wurde, unter den gleichen Bedingungen wie in Beispiel 1, die Lösungsmittel-Elutionszeit auf 16 Minuten verlängert war und das Extraktionsverhältnis nur 42% betrug.
  • Die Ergebnisse beweisen, dass Zerbrechen und Formen von Zellen unter Verwendung eines Doppelschneckenextruders den Durchgang des Lösungsmittels zu den Zellen und die Extraktionswirkung erhöhen.
  • Beispiel 2:
  • Zellen von Mucor circinelloides HUT 1121 (deponiert mit dem Institut für Fermentationsforschung: FERM BP-3883) wurden unter den in Tabelle 1 gezeigten Bedingungen in einem Fermentationsbad kultiviert und die resultierenden γ-Linolensäure enthaltenden Zellen durch Filtration gewonnen.
  • Die gewonnenen Zellen wurden wieder so in Wasser dispergiert, dass die Konzentration 12% erreichte, um dadurch eine Suspension der Zellen zu erhalten.
  • Die Suspension wurde unter Verwendung eines Hochdruckhomogenisators (HV-OH-0.7-3.7S; Produkt von Izumi Food Machinery, Co.) Zerstörung bei 700 Kg/cm2 und einer Fließgeschwindigkeit von 60 Liter/Stunde unterworfen. Die zerstörten Zellen wurden unter Verwendung eines Doppel-Trommeltrockners entwässert, um dadurch getrocknete Zellen mit einem Feuchtigkeitsgehalt von 4 Gew.% zu erhalten.
  • Die getrockneten Zellen wurden der Arbeitsweise des Beispiels 1, d. h. Zerbrechen und Formen und Extraktion des fettlöslichen Materials ausgesetzt, um dadurch ein fettlösliches Material zu erhalten (3,4 g). Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 gezeigt.
  • Vergleichsbeispiel 2:
  • Die Arbeitsweise des Beispiels 2 wurde wiederholt, mit der Ausnahme, dass Zerbrechen und Formung unter Verwendung eines Doppelschneckenextruders unterblieben. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 gezeigt.
  • Der Vergleich der Ergebnisse von Beispiel 2 mit denjenigen von Vergleichsbeispiel 2 zeigt das Folgende:
    Im Vergleichsbeispiel 2, bei dem Zerbrechen und Formen unterblieben, war das Extraktionsverhältnis bei 90% zufriedenstellend, die Lösungsmittel-Elutionszeit jedoch so lange wie 38 Minuten. Dies deutet darauf hin, dass die Säule durch Zellen, die durch Homogenisieren fein zerstört worden waren, verstopft wurde.
  • Dazu im Gegensatz war in Beispiel 2, in welchem Zerbrechen und Formen durchgeführt wurden, die Lösungsmittel-Elutionszeit so kurz wie 7 Minuten und das Extraktionsverhältnis so hoch wie 96%. Dementsprechend verursachten Zellen, die in Beispiel 2 pelletiert worden waren, kein Zusetzen der Säule, das Lösungsmittel floss effektiv durch die Säule nach unten.
  • Die Ergebnisse beweisen, dass der Durchgang des Lösungsmittels zu den Zellen zunimmt und die Extraktionswirkung durch Zerbrechen und Formen unter Verwendung eines Doppelschneckenextruders nach dem Homogenisieren merklich zunimmt.
  • Beispiel 3:
  • Die Arbeitsweise von Beispiel 1 wurde ausgeführt, mit der Ausnahme, dass Mortierella ramaniana Var. angrispora IFO 8187 anstelle Mucor circinelloides HUT 1121 (deponiert mit dem Institut für Fermentationsforschung: FERM BP-3883) verwendet und unter den in Tabelle 1 gezeigten Bedingungen kultiviert wurde. Die Ergebnissse sind in Tabelle 2 gezeigt.
  • Wie in Tabelle 2 gezeigt, war in Beispiel 3 die Lösungsmittel-Elutionszeit 8 Minuten und das Extraktionsverhältnis so hoch wie 94%. Diese Werte sind nahezu die gleichen wie diejenigen in Beispiel 1.
  • Die Ergebnisse beweisen, dass das in den Zellen enthaltene fettlösliche Material bei der Arbeitsweise, bei welcher Mortierella ramaniana Var. angrispora IFO 8187 als Zellen verwendet wird, wirksam extrahiert wird.
  • Vergleichsbeispiel 3:
  • Es wurde die Arbeitsweise des Beispiels 3 ausgeführt, mit der Ausnahme dass Zerbrechen und Formen mithilfe eines Doppelschneckenextruders ausgelassen wurden. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 gezeigt.
  • Der Vergleich der Ergebnisse von Beispiel 3 mit denjenigen von Vergleichsbeispiel 3 zeigt das Folgende:
    In Vergleichsbeispiel 3, in welchem Zerbrechen und Formen unter Verwendung eines Doppelschneckenextruders nicht vorgenommen wurden, sondern die Arbeitsweise anders ausgeführt wurde unter den gleichen Bedingungen wie in Beispiel 3, war die Lösungsmittel-Elutionszeit auf 21 Minuten verlängert und das Extraktionsverhältnis nur 37%.
  • Die Ergebnisse beweisen, dass der Durchgang des Lösungsmittels zu den Zellen zunimmt und die Extraktionswirkung durch Zerbrechen und Formen der Zellen unter Verwendung eines Doppelschneckenextruders bei der Arbeitsweise, bei welcher Mortierella ramaniana Var. angrispora IFO 8187 als Zellen verwendet wird, merklich zunimmt.
  • Beispiel 4:
  • Die Arbeitsweise von Beispiel 1 wurde ausgeführt, mit der Ausnahme, dass Conidiobolus nanodes CBS 183/62, anstelle Mucor circinelloides HUT 1121 (deponiert mit dem Institut für Fermentationsforschung: FERM BP-3883) verwendet und unter den in Tabelle 1 gezeigten Bedingungen kultiviert wurde. Die Ergebnissse sind in Tabelle 2 gezeigt.
  • Wie in Tabelle 2 gezeigt, war in Beispiel 4 die Lösungsmittel-Elutionszeit 7 Minuten und das Extraktionsverhältnis so hoch wie 92%. Diese Werte sind nahezu die gleichen wie diejenigen in Beispiel 1.
  • Die Ergebnisse beweisen, dass das in den Zellen enthaltene fettlösliche Material im Fall, bei welchem Conidiobolus nanodes CBS 183/62 als Zellen verwendet wird, wie im Beispiel 1 wirksam extrahiert wird.
  • Vergleichsbeispiel 4:
  • Es wurde die Arbeitsweise des Beispiels 4 ausgeführt, mit der Ausnahme dass Zerbrechen und Formen mithilfe eines Doppelschneckenextruders unterblieben Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 gezeigt.
  • Der Vergleich der Ergebnisse von Beispiel 4 mit denjenigen von Vergleichsbeispiel 4 zeigt das Folgende:
    In Vergleichsbeispiel 4, in welchem Zerbrechen und Formen unter Verwendung eines Doppelschneckenextruders nicht vorgenommen wurden, sondern die Arbeitsweise anders ausgeführt wurde unter den gleichen Bedingungen wie in Beispiel 4, war die Lösungsmittel-Elutionszeit auf 19 Minuten verlängert und das Extraktionsverhältnis nur 39%.
  • Die Ergebnisse beweisen, dass der Durchgang des Lösungsmittels zu den Zellen zunimmt und die Extraktionswirkung durch Zerbrechen und Formen der Zellen unter Verwendung eines Doppelschneckenextruders bei der Arbeitsweise, bei welcher Conidiobolus nanodes CBS 183/62 als Zellen verwendet wird, merklich zunimmt.
  • Beispiel 5:
  • Die Arbeitsweise von Beispiel 1 wurde ausgeführt, mit der Ausnahme, dass Yarrowia lipolytica IFO 0746 anstelle Mucor circinelloides HUT 1121 (deponiert mit dem Institut für Fermentationsforschung: FERM BP-3883) verwendet und unter den in Tabelle 1 gezeigten Bedingungen kultiviert wurde. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 gezeigt.
  • Wie in Tabelle 2 gezeigt, war in Beispiel 5 die Lösungsmittel-Elutionszeit 8 Minuten und das Extraktionsverhältnis so hoch wie 92%. Diese Werte sind nahezu die gleichen wie diejenigen in Beispiel 1.
  • Die Ergebnisse beweisen, dass das in den Zellen enthaltene fettlösliche Material im Fall, bei welchem Yarrowia lipolytica IFO 0746 als Zellen verwendet wird, wie im Beispiel 1 wirksam extrahiert wird.
  • Vergleichsbeispiel 5:
  • Es wurde die Arbeitsweise des Beispiels 5 ausgeführt, mit der Ausnahme, dass Zerbrechen und Formen mithilfe eines Doppelschneckenextruders ausgelassen wurden. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 gezeigt.
  • Der Vergleich der Ergebnisse von Beispiel 5 mit denjenigen von Vergleichsbeispiel 5 zeigt das Folgende:
    In Vergleichsbeispiel 5, in welchem Zerbrechen und Formen unter Verwendung eines Doppelschneckenextruders nicht vorgenommen wurden, sondern die Arbeitsweise anders ausgeführt wurde unter den gleichen Bedingungen wie in Beispiel 5, war die Lösungsmittel-Elutionszeit auf 26 Minuten verlängert und das Extraktionsverhältnis nur 28%.
  • Die Ergebnisse beweisen, dass der Durchgang des Lösungsmittels zu den Zellen zunimmt und die Extraktionswirkung durch Zerbrechen und Formen der Zellen unter Verwendung eines Doppelschneckenextruders bei der Arbeitsweise, bei welcher Yarrowia lipolytica IFO 0746 als Zellen verwendet wird, merklich zunimmt.
    Figure 00130001
    Tabelle 2
    Doppelschneckenextruder Behandlung Elutionszeit (min) Extraktionsverhältnis (%)
    Beisp. 1 Mucor circinelloides HUT 1121 Ja 6 94
    Vergl.-Beisp. 1 Mucor circinelloides HUT 1121 Nein 16 42
    Beisp. 2 Mucor circinelloides HUT 1121 Ja, + Hochdruck-Homogenisierungs-behandlung 7 96
    Vergl.-Beisp. 2 Mucor circinelloides HUT 1121 Nein, Hochdruck-Homogenisierungs-behandlung allein 38 90
    Beisp. 3 Mortierella ramaniana var. angrispora IFO 8187 Ja 8 94
    Vergl.-Beisp. 3 Mortierella ramaniana var. angrispora IFO 8187 Nein 21 37
    Beisp. 4 Conidiobolus nanodes CBS 183/62 Ja 7 92
    Vergl.-Beisp. 4 Conidiobolus nanodes CBS 183/62 Nein 19 39
    Beisp. 5 Yarrowia lipolytica IFO 0746 Ja 8 92
    Vergl.-Beisp. 5 Yarrowia lipolytica IFO 0746 Nein 26 28
  • Beispiel 6:
  • Wasser wurde den in Beispiel 1 erhaltenen getrockneten Zellen von Mucor circinelloides HUT 1121 (deponiert bei dem Institut für Fermentationsforschung: FERM BP-3883) mit einem Feuchtigkeitsgehalt von 4 Gew.% zugesetzt, dazu den hergestellten Zellproben mit Feuchtigkeitsgehalten von jeweils 10 Gew.%, 15 Gew.%, 20 Gew.%, 25 Gew.% und 25 Gew.%.
  • Jede der Zellproben wurde Zerbrechen, Formen und Extraktion des fettlöslichen Materials unter den gleichen Bedingungen wie denen des Beispiels 1 unterworfen. Die Extraktionsverhältnisse dieser Zellproben sind in Tabelle 3 gezeigt. Tabelle 3
    Fettlösliches Materialproduzierendes Material Feuchtigkeitsgehalt der Zellen (%) Lösungsmittel-Elutionszeit Extraktions verhältnis (%)
    Beispiel 6 Mucor circinelloides HUT 1121 4 6 94
    10 6 95
    15 6 92
    20 7 87
    25 6 65
    30 6 61
  • Die in Tabelle 3 gezeigten Ergebnisse des Beispiels 6 veranschaulichen das Folgende:
    Die Lösungsmittel-Elutionszeiten der Zellproben mit den Feuchtigkeitsgehalten von 4 Gew.%, 10 Gew.%, 15 Gew.%, 20 Gew.% betrugen jeweils 6 Minuten, 6 Minuten, 6 Minuten und 7 Minuten und die Extraktionsverhältnisse jeweils 94%, 95%, 92% und 87%. Die Ergebnisse beweisen, dass das in den Zellen enthaltene fettlösliche Material wirksam extrahiert wird.
  • Dazu im Gegensatz waren die Lösungsmittel-Elutionszeiten der Zellproben mit Feuchtigkeitsgehalten von 25 Gew.% und 30 Gew.% 6 Minuten in beiden Fällen, und die Extraktionsverhältnisse jeweils so niedrig wie 65% und 61%.
  • Die Ergebnisse beweisen, dass der Feuchtigkeitsgehalt der Zellen 20 Gew.% oder weniger sein muss, um die Wirksamkeit der Extraktion des in den Zellen enthaltenen fettlöslichen Materials zu erhöhen.
  • Wie vorstehend beschrieben, werden die getrockneten mikrobiellen Zellen der Erfindung entsprechend nicht fein zerbrochen, sondern unter Verwendung eines Doppelschneckenextruders Zerbrechen und Formen zu Pellets unterworfen.
  • Damit wird Verstopfen der Säule im Extraktionsschritt unter Verwendung einer Säule vermieden, wie auch der Schritt der Trennung der gebrochenen Zellen vom Extraktionslösungsmittel durch Filtration, wodurch die zur Extraktion benötigte Zeit verkürzt wird.
  • Auch erlaubt in der Erfindung die Verwendung eines Extruders, besonders eines Doppelschneckenextruders, das gleichzeitige mechanische Zerbrechen und Pelletieren der mikrobiellen Zellen, mit dem Ergebnis einer Vereinfachung der Schritte.
  • Darüber hinaus können die in den mikrobiellen Zellen enthaltenen fettlöslichen Komponenten entsprechend der vorliegenden Erfindung bei Verwendung einer kleinen Lösungsmittelmenge und sicherer Arbeitsweise effektiv extrahiert und gewonnen werden.

Claims (3)

  1. Verfahren zum Extrahieren der in fettlösliche Komponenten enthaltenden mikrobiellen Zellen enthaltenen fettlöslichen Komponenten, umfassend Trocknen der fettlösliche Komponenten enthaltenden mikrobiellen Zellen, gleichzeitig Zerbrechen und Formen der getrockneten mikrobiellen Zellen zu Pellets unter Verwendung eines Extruders und Extrahieren der enthaltenen fettlöslichen Komponenten unter Verwendung eines organischen Lösungsmittels.
  2. Verfahren gemäß Anspruch 1, worin der Extruder ein Doppelschneckenextruder ist.
  3. Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, worin der Feuchtigkeitsgehalt der getrockneten mikrobiellen Zellen nicht mehr als 20 Gewichts% ist.
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