DE69838143T2

DE69838143T2 - Antimikrobielle peptide

Info

Publication number: DE69838143T2
Application number: DE69838143T
Authority: DE
Inventors: Eric Charles North Balwyn REYNOLDS; Stuart Geoffrey Hawthorn DASHPER; Neil Martin Brunswick O'BRIEN-SIMPSON; Gert Hoy Viewbank TALBO; Marina Nunawading MALKOSKI
Original assignee: University of Melbourne
Current assignee: Dairy Australia Ltd
Priority date: 1997-11-24
Filing date: 1998-11-24
Publication date: 2008-04-10
Anticipated expiration: 2018-11-25
Also published as: JP2002503641A; DE69838143D1; CA2311389A1; US7588752B2; ATE368053T1; JP4940439B2; ZA9810679B; EP1032592A1; AUPP051497A0; EP1032592B1; WO1999026971A1; EP1032592A4; US20030195150A1; CA2311389C; HK1030551A1

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf neuartige antimikrobielle Peptide, die aus dem Milchprotein Casein erhalten werden können oder chemisch synthetisiert oder durch rekombinante DNA Technologie hergestellt werden können. Diese Peptide können in Nahrungsmitteln als antimikrobielle Konservierungsstoffe, in Zahlpflegeprodukten (z.B. Zahnpasta, Mundspülung, Zahnseide) für die Kontrolle von Zahnplaque und Suppremierung von Pathogenen, die mit Zahnkaries und periodontalen Krankheiten assoziiert sind, verwendet werden. Die antimikrobiellen Peptide können auch in pharmazeutischen Zubereitungen für die topische oder parenterale Anwendung oder orale Verabreichung zur Kontrolle von oropharyngealen und gastro-intestinalen Pathogenen wie auch systemischen oder lokalen Infektionen verwendet werden.
Hintergrund der Erfindung
Periodontale Krankheiten sind bakterienassoziierte inflammatorische Krankheiten der unterstützenden Gewebe der Zähne und sind ein Hauptproblem der öffentlichen Gesundheit. Fast die gesamte menschliche Bevölkerung ist durch periodontale Krankheiten bis zu einem gewissen Grad betroffen. In einer kürzlich vorgenommenen Untersuchung in Melbourne (Spencer et al., 1985) benötigten nur 20% der adulten Zahnmaterialprobe keine periodontale Behandlung, während 62% unmittelbare Behandlung benötigten und 18% eine komplexe Behandlung benötigten. Brown et al. (1989) berichteten aus einer umfangreichen US Zahlgesundheits-Untersuchung, dass nur 15% der untersuchten Bevölkerung frei von periodontalen Krankheiten war. Die Hauptform der periodontalen Erkrankung ist Gingivitis, die mit der nichtspezifischen Anhäufung dentaler Plaque an dem Zahnfleischrand assoziiert ist. Im Gegensatz dazu, ist die weniger prävalente, destruktive Form der periodontalen Erkrankung (Parodontose) mit einer subgingivalen Infektion mit spezifischen Gram-negativen Bakterien assoziiert. Parodontose ist die Hauptursache für Zahlverlust bei australischen Erwachsenen. Obgleich Gingivitis nicht einer notwendige Vorbedingung für die Entwicklung von Parodontose sein braucht (Christersson et al. 1989) prädisponiert Gingivitis wahrscheinlich anfällige Stellen für schwerere Formen der periodontalen Erkrankungen, da die spezifischen Gram-negativen Bakterien, die bei Parodontose vorherrschen, die aber nicht im gesunden Zahnfleische detektierbar sind, in geringen Anteilen bei Gingivitis nachgewiesen wurden (Moore et al., 1987). Weiterhin werden die Umweltbedingungen, die sich während Gingivitis entwickeln, wahrscheinlich die nachfolgende Kolonisierung oder das Wachstum mit bzw. von Spezies fördern, denen bei der Parodontose eine Rolle zugesprochen wird. Die Kontrolle der supragingivalen Plaque wird daher als ein wichtiger Teil einer präventiven Strategie zur Kontrolle von periodontalen Erkrankungen betrachtet und tatsächlich erwiesen sich zahlreiche Plaquekontrollprogramme als erfolgreich bei der Prävention von periodontalen Krankheiten (Loesche, 1976). Bei der Mehrzahl der Individuen ist die übliche Mundhygiene-Methode des Zähneputzens für gewöhnlich alleine nicht ausreichend, um über längere Perioden ein Niveau der Plaquekontrolle bereitzustellen, das mit der Zahngesundheit verträglich ist. Konsequenterweise wurde die Aufnahme von animikrobiellen Agenzien in Dentalprodukte als ein Hilfsmittel, um die Zahnplaque und Gingivitis zu kontrollieren befürwortet (Addy, 1988); Marsh, 1991) und ist für Zahnpasta- und Mundwasserunternehmen von beträchtlichem Interesse. Eine Anzahl von Agenzien wurden als Antiplaque Zahnpastazusätze vorgeschlagen (z.B. Bisbiguanide, Phenole, Metallionen, quaternäre Ammoniumsalze), besitzen aber entweder eine vernachlässigbare intraorale Aktivität, unerwünschte Nebenwirkungen (z.B. mukosale Reizung, Zahnverfärbung), und/oder sind mit den Zahnpastaformulierungen inkompatibel. Triclosan (2,4,4'-Trichlor-2'-Hydroxydiphenylether), ein antimikrobielles Agens, das häufig in Deodorants, Seifen und anderen dermatologischen Zubereitungen verwendet wird, wird gegenwärtig als ein Antiplaque Zahnpastazusatz in einigen Ländern verwendet, es gibt jedoch ein beträchtliches Interesse ein klinisch wirksames, sicheres und natürliches Antiplaque-Agens zu finden.
Antimikrobielle Peptide sind in der Natur weit verbreitet und spielen eine Rolle in der Wirtsverteidigung von Pflanzen und Tieren (Boman und Hultmark, 1987); Bevins und Zasloff, 1990). Zu ihnen gehören, neben anderen, die amphiphatische Kanäle bildenden Peptide, zum Beispiel, die Cecropine, aus der Cecropia-Motte isoliert werden (Boman und Hultmark, 1987), die Magainine, die aus den Hautsekreten des afrikanischen Krallenfrosches Xenopus lavis isoliert werden (Bevins und Zasloff, 1990), die Dermaseptine, aus der Haut des Waldfrosches isoliert werden (Mor und Nicolas, 1994) und Bombinine, die aus der Haut von Bombina variegata (Simmaco et al., 1991) lavis isoliert werden. Andere antimikrobielle Peptide schließen die zyklischen kationischen Peptide ein, die ein intramolekulares Disulphid enthalten, zum Beispiel, Ranalexin aus der Haut des Bullenfrosches (Clark et al., 1994) und Bactenecin aus bovinen Neutrophilen (Romeo et al., 1988). Prolin enthaltende antimikrobielle Peptide wurden auch identifiziert und diese schließen die Apidaecine aus der Lymphflüssigkeit der Honigbiene ein (Casteels et al., 1989) und das Schweine myeloide antimikrobielle Peptid PMAP-23 ein (Zanetti et al., 1994).
Es wird jetzt allgemein angenommen, dass das Milchprotein Casein nicht nur als ein Nahrungsmittel, sondern auch als gegen bakterielle Infektion der Mucosa von Neugeborenen schützende Agens angesehen werden sollte, da bei spezifischen Peptide, die durch tryptischen oder in situ Verdau freigesetzt wurden, gezeigt wurde, dass sie eine merkliche biologische Aktivität besitzen. Diese bioaktiven Peptide sind relativ resistent gegenüber weiterem proteolytischem Abbau und wurden im distalen Abschnitt des Dünndarms und im Blut von Menschen nach Aufnahme von Kuhmilch entdeckt (Svedberg et al., 1985). Migliore-Samour et al. (1989) zeigten, dass die Peptide β-Casein (63-68) PGPIPN und α_s1-Casein (194-199) TTMPLW bei Konzentrationen so niedrige wie 0.1 μM einen signifikanten schützenden Effekt in Mäusen gegen Klebsiella pneumoniae Infektion vermitteln, wenn sie bei 0.3 mg/kg intravenös, vor dem letalen Infektionstest, injiziert werden. Ein antibakterielles Peptid aus bovinem α_s2-Casein [α_s2-Casein (f172-203)], das durch Behandlung von Milch mit Eisessigsäure freigesetzt wurde, wurde vor kurzem charakterisiert, und es wurde gezeigt, dass es das Wachstum von Escherichia coli und Staphylococcus carnosus (Zucht et al., 1995) inhibierte.
Antimikrobielle Peptide, die Aktivität gegen einen breite Anzahl von Gram-positiven und Gram negativen Bakterien besitzen, besitzen Potential in dem Gebiet der Zahnpflege, funktionalen Lebensmittel, Nahrungskonservierungsmittel und Pharmazeutika. Zahnpflegeprodukte schließen Zahnpasta, Mundwasser, Zahnseide, und professionell angewendete Materialien ein. Funktionale Nahrungsmittel, schließen Kaugummi, Süßwaren, Frühstückscerealien, Nahrungsmittel für Neugeborene, Getränke, Pastillen usw. ein. Nahrungsmittelkonservierungsmittel könnten Milchprodukte, Suppen, Salatdressings, verarbeitetes Fleisch, Backwaren, Soßen usw. einschließen. Die pharmazeutische Verwendung würde systemisch und topisch angewendete Antibiotika und Anti-Infektionsmittel und Medikamente für die Behandlung von Geschwüren und anderen Erkrankungen des gastrointestinalen Trakts einschließen.
Bei Nahrungsmittelanwendungen werden natürliche antimikrobielle Mittel typischerweise für den Erhalt und die Verlängerung der Haltbarkeit von Soßen, nassen Salaten, Backwaren und Kuchen, verarbeitetem Fleisch, gekühlten Milchprodukten, Salatsoßen und Seifen verwendet. Nisin besitzt eine begrenzte Anwendung als ein Nahrungskonservierungsmittel wegen eines relativ engen Spektrums der antimikrobiellen Aktivität und hoher Kosten. Nahrungsmittelhersteller, die antimikrobielle Peptide von Casein als ein Konservierungsmittel verwenden, können „rein natürlich" Etikettenangaben verwenden, die nicht erlaubt sind, falls künstliche oder chemische Konservierungsmittel verwendet werden. Ein Haupttrend in der Nahrungsmittelindustrie ist der ansteigende Bedarf nach Produkten mit geringem Fettgehalt, die im Allgemeinen dazu neigen, einen erhöhten Feuchtigkeitsgehalt zu besitzen. Dies erzeugt einen Bedarf nach besseren Nahrungsmittelkonservierungssystemen, wie die Aufnahme von natürlichen antimikrobiellen Substanzen.
Der globale Markt für Medikamente für Wundheilung, Behandlung von Geschwüren des oberen Darmbereichs und entzündungsbasierte Krankheiten stellt einen Hauptmarkt für Pharmazeutika dar. Klinikärzte, die in dem Gebiet der duodenalen und gastrischen Geschwüre arbeiten, konzentrieren sich gegenwärtig auf das Bakterium Helicobacter pylori als das verursachende Agens bei Geschwüren der oberen Verdauungstraktes. Kanal bildende antimikrobielle Peptide, die es H⁺ ermöglichen, in die Bakterienzelle zu treten, besitzen das Potential H. pylori Infektionen durch Verstärkung der Sensitivität des Bakteriums gegenüber den Säureausscheidungen des Magens zu behandeln.

Adeo et al., Biochemie, 1977; 59: 375-379 offenbaren die Aminosäuresequenz einer natürlich vorkommenden Caseins aus dem italienischem Büffel.
Datenbank Uniprot P79093, 1997 offenbarte ein Kappa-Casein Fragment aus dem amerikanischem Bison.
Datenbank Uniprot P79094, 1997 offenbarte ein Kappa-Casein Fragment aus Bos gaurus.
Nagaune et al., Agric. Biol. Chem., 1988; 52(10): 2577-2581 offenbarte ein Peptid von 184 bis 202 Resten von β-Casein, das an einen monoklonalen Antikörper gegen β-Casein binden kann.

Zusammenfassung der Erfindung
Die Erfinder haben hier neue Peptide entwickelt, die antimikrobielle Aktivität besitzen. Diese Peptide können jedoch synthetisch hergestellt werden; sie können auf sehr einfache Weise von Casein abgeleitet werden.
Entsprechend besteht in einem ersten Aspekt die vorliegende Erfindung aus einem antimikrobiellem Peptid, wobei das Peptid nicht glykosyliert ist, weniger als ungefähr 100 Aminosäuren besitzt, vorzugsweise weniger als ungefähr 70 Aminosäuren, und eine Aminosäuresequenz enthält, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus:
AVESTVATLEAΣPEVIESPPE,
AVESTVATLEDΣPEVIESPPE.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung besteht das Peptid aus einer Aminosäuresequenz, die ausgewählt ist, aus der Gruppe bestehend aus:
AVESTVATLEAΣPEVIESPPE und AVESTVATLEDΣPEVIESPPE
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung enthält das Peptid eine Aminosäuresequenz, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus:
In einer noch weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das Peptid ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus:
Wie für diejenigen, die in diesem Gebiet Fachleute sind, kann das Peptid der vorliegenden Erfindung mit anderen Molekülen konjugiert werden, wie Acylderivaten, um das Verabreichungsprofil oder die Pharmacokinetiken des Peptids zu ändern. Solche Konjugate werden in PCT/AU90/00599 beschrieben.
In einem zweiten Aspekt besteht die vorliegende Erfindung aus einer chimären Verbindung, wobei die Verbindung das Peptid des ersten Aspektes der vorliegenden Erfindung enthält, das mit einem Nicht-Peptid Molekül konjugiert ist. Es ist bevorzugt, dass das Nicht-Peptidmolekül Acylgruppen beinhaltet.
In einem dritten Aspekt stellt die Erfindung eine antimikrobielle Zusammensetzung bereit, die das Peptid des ersten Aspekts der vorliegenden Erfindung zusammen mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger enthält. Solche Zusammensetzungen können dentale, intraorale Zusammensetzungen, therapeutische gegen Infektionen gerichtete Zusammensetzungen für die topische und systemische Anwendung sein. Dentale Zusammensetzungen oder therapeutische Zusammensetzungen können in der Form eines Gels, einer Flüssigkeit, eines Feststoffes, Puders, Creme oder Pastille sein. Therapeutische Zusammensetzungen können auch in der Form von Tabletten oder Kapseln sein.
In einem vierten Aspekt wird die Verwendung eines Peptids gemäß der Erfindung bereitgestellt, für die Herstellung eines Medikaments, das in einem Verfahren zum Behandeln oder Verhindern von Zahnkaries oder einer periodontalen Krankheit in einem Subjekt zu verwenden ist, wobei das Verfahren den Schritt des Verabreichens eines Peptids oder Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung an die Zähne oder den Gaumen eines Subjektes umfasst, dass solcher Behandlungen bedarf. Topische Verabreichung des Peptids ist bevorzugt.
Ohne an wissenschaftliche Theorien gebunden zu sein, wird angenommen, dass die Peptide der vorliegenden Erfindung ihr antimikrobielle Wirkung mittels ihrer amphiphatischen Natur ausüben. Es wird angenommen, dass die Peptide in die Bakterienmembran aufgenommen werden, in der sie Aggregate bilden. Diese Aggregate stellen Poren oder Kanäle durch die Membran bereit oder bilden solche, durch die Ionen hindurch treten können. Der unkontrollierte Durchtritt von Ionen durch die Bakterienmembran resultiert in dem Tod der Bakterienzelle. Σ ist ein Phophoserylrest.
Die Peptide der vorliegenden Erfindung haben eine Reihe von Anwendungen, zum Beispiel, können sie in Nahrungsmitteln als antimikrobielle Konservierungsstoffe, in Mundpflegeprodukten (Zahnpasten und Mundspülungen) zur Kontrolle der Zahnplaque und Unterdrückung von Pathogenen verwendet werden, die mit Zahnkaries und Parodontosekrankheiten assoziiert sind. Die antimikrobiellen Peptide der vorliegenden Erfindung können auch in pharmazeutischen Zubereitungen verwendet werden (z.B. topischen und systemischen gegen Infektionen gerichteten Medikamenten).
Überall in dieser Beschreibung wird das Wort „umfassen" oder Variationen wie „umfasst" oder „umfassend" das Einschließen eines angeführten Elements oder einer Gesamtheit oder Gruppe von Elementen oder der gesamten Elemente bedeuten aber nicht den Ausschluss irgendeines anderen Elementes oder Gesamtheit oder Gruppe von Elementen oder der gesamten Elemente.
Eingehende Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf die neuartigen antimikrobiellen Peptdide. Diese Peptide wurden anfangs von Casein, κ-Casein (106-169) und β-Casein (184-202) [Tabelle 1] abgeleitet. Diese Peptide besitzen das Potential für die folgenden Mikroorganismen inter alia verwendet zu werden.
Streptococcus mutans
Staphylococcus aureus
Streptococcus sanguinis
Escherichia coli
Salmonella typhimurium
Pseudomonas aeruginosa
Porphyromonas gingivalis
Campylobacter jejuni
Listeria monocytogenes
Helicobacter pylori
Clostridium botulinum
Streptococcus pyogenes
Streptococcus pneumoniae
Candida albicans
Die antimikrobiellen Peptide Ser(P)¹⁴⁹ ϰ-Casein B (106-169) und Ser(P)¹⁴⁹ ϰ-Casein B (117-169) besaßen beide eine minimale inhibitorische Konzentration (MIC) von 2.4 μM gegen die oralen Pathogene Streptococcus mutans und Streptococcus sobrinus und eine zehnfache niedrigere Konzentration (0.24μM) inhibierte das Wachstum dieser Bakterien um 41%.

Die antimikrobiellen Peptide Ser(P)¹⁴⁹ ϰ-Casein (117-169) und Ser(P)¹²⁷, Ser(P)¹⁴⁹ ϰ-Casein (117-169) und β-Casein (184-202) können aus einem tryptischen Verdau von bovinem Casein mittels Standart-chromatographischer Verfahren wie Anionenaustauscher und reverser Phase Chromatographie (HPLC) aufgereinigt werden. Ser(P)¹⁴⁹ ϰ-Casein (106-169) und Ser(P)¹²⁷, Ser(P)¹⁴⁹ ϰ-Casein (106-169) können auch aus Käsemolke und Labmolke hergestellt werden, indem die Molkeproteine durch Ultrafiltration, oder saurer Fällung gefolgt von reverser Phase HPLC Aufreinigung der Phosphopeptide entfernt werden. Die Peptide können aus Casein anderer Spezies, z.B. Ziege, Schaf usw. hergestellt werden. Tabelle 1: Antimikrobielle Casein-Peptide

Peptid	Sequenz^a
Ser(P)¹⁴⁹ κ-Casein B (106-169)	MAIPPKKNQDKTEIPTINTIASGEPTSTPTIEAVESTVA TLEAZPEVIESPPEINTVQVTSTAV
Ser(P)¹²⁷, Ser(P)¹⁴⁹ κ-Casein B (106-169)	MAIPPKKNQDKTEIPTIAΣGEPTSTPTIEAVESVA TLEAΣPEVIESPPEINTVQVTSTAV
Ser(P)¹⁴⁹, κ-Casein A (106-169)	MAIPPKKNQDKTEIPTIASGEPTSTPTTEAVESTVA TLEDΣPEVIESPPEINTVQVTSTAV
Ser(P)¹²⁷, Ser(P)¹⁴⁹ κ-Casein A (106-169)	MAIPPKKNQDKTEIPTINTIAΣGEPTSTPTTEAVESTV ATLEDΣPEVIESPPEINTVQVTSTAV
Ser(P)¹⁴⁹ κ-Casein B (117-169)	TEIPTINTIASCEPTSTPTIEAVESTVATLEAΣPEVIESPP EINTVQVTSTAV
Ser(P)¹²⁷, Ser(P)¹⁴⁹ x-Casein B (117-169)	TEIPTINTIAΣGEPTSTPTIEAVESTVATLEAΣPEVIESP PEINTVQVTSTAV
Ser(P)¹⁴⁹ x-Casein A (117-169)	TEIPTINTIASGEPTSTPITTAVESTVATAEDΣPEVIESP PEINTVQVTSTAV
Ser(P)¹²⁷, Ser(P)¹⁴⁹ κ-Casein A (117-169)	TEIPTINTIAΣGEPTSTPTTEAVESTVATLEDΣPEVIESP PEINTVQVTSTAV
a. Sequenz wurde unter Verwendung des Einbuchstaben-Aminosäurecodes identifiziert, wobei Σ = Ser(p)

Das Peptid κ-Casein (106-169) liegt in Käsemolke oder Labmolke in zahlreichen verschiedenen Formen vor. Das Peptid hat zwei genetische Hauptvarianten (A und B) und wird durch Glykosylierung und Phosphorylierung postranslational modifiziert. Die glykosylierten Formen, bekannt als das Kappa-Caseino-Glycopeptid oder Glycomacropeptid wurde durch Neeser [ US Patent Nr. 4,992,420 und 4,994,441 ] wegen der Oligosaccharidketten, die mit den Threoniresten des Peptids verbunden sind, als Antiplaque- und Antikariesagenzien beschrieben. Neeser behauptet, dass die Oligosaccharidketten des Glycopeptids durch spezifische Bindung an plaquebildende orale Bakterien das Anheften dieser Bakterien an den speichelbedeckten Zahnschmelz blockieren. Die glykosylierten Formen von κ-Casein (106-169) können von den nicht-glykosylierten Formen durch Chromatographie (z.B. Anionenaustausch und reverse Phase HPLC) oder durch selektive Fällung oder Ultrafiltration getrennt werden. Nur die nicht-glykolisierten Formen von κ-Casein (117-169) oder κ-Casein (106-169) zeigten antimikrobielle Aktivität. Da die Glykosylierung die antimikrobielle Aktivität zerstört ist es wünschenswert die Glyco- und Aglycoformen von κ-Casein (117-169) oder κ-Casein (106-169) zu trenne, was mit Chromatographie, selektiver Fällung oder Ultrafiltration erreicht werden kann. Phosphorylierung von Ser¹⁴⁹ und zu einem geringeren Ausmaß von Ser¹²⁷ sind wichtig für die antimikrobielle Aktivität und die phosphorylierten Formen der zwei genetischen Hauptvarianten (A und B) scheinen gleiche Aktivität zu besitzen [Tabelle 1]. Die Neeser Patente offenbaren weder die antimikrobielle Aktivität von κ-Casein (106-169) noch die Verwendung der nicht-glykolysierten Formen des Peptids zur Unterdrückung von bakteriellen Pathogenen.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird das antimikrobielle Peptid in Zahnputzmittel wie Zahnpasta, Mundspülungen oder Formulierungen für den Mund aufgenommen, um bei der Prävention und/oder Behandlung von Zahnkaries und periodontalen Krankheiten zu helfen. Das Peptid kann 0.01-50 Gewichts-% der Zusammensetzung enthalten, vorzugsweise 0.1-10 Gewichts-%. Für orale Zusammensetzungen wird es bevorzugt, dass die Menge des verabreichten Peptids 0.01-50 Gewichts-% ist, vorzugsweise 0.1-10 Gewichts-% der Zusammensetzung. Die orale Zusammensetzung dieser Erfindung, die die oben genannten Peptide enthält kann in zahlreichen Formen, die für den Mund geeignete sind hergestellt und verwendet werden, wie einem Zahnputzmittel, einschließend Zahnpasten, Zahnpuder und flüssige Zahnputzmittel, Mundspülungen, Tabletten, Kaugummis, dentalen Pasten, gingivalen Massagecremen, Gurgeltabletten, Pastillen, Milchprodukten und anderen Nahrungsmitteln. Die orale Zusammensetzung gemäß dieser Erfindung kann weiterhin zusätzliche bekannte Inhaltsstoffe beinhalten abhängig vom Typ und der Form einer bestimmten oralen Zusammensetzung.
In bestimmten hoch bevorzugten Formen der Erfindung kann die orale Zusammensetzung im Wesentlichen flüssige Eigenschaften besitzen, wie eine Mündreinigungslösung oder Spülung. In solche einer Zubereitung ist das Vehikel typischerweise eine Wasser-Alkoholmischung wünschenswerter weise ein Feuchthaltemittel wie unter beschrieben enthaltend. Im Allgemeinen ist das Gewichtsverhältnis von Wasser zu Alkohol im Bereich von ungefähr 1:1 bis ungefähr 20:1. Die Gesamtmenge der Wasser-Alkoholmischung bei diesem Typ der Zubereitung ist typischerweise in dem Bereich von ungefähr 70 bis ungefähr 99.9 Gewichts-% der Zubereitung. Der Alkohol ist typischerweise Ethanol oder Isopropanol. Ethanol wird bevorzugt.
Der pH solcher flüssiger oder anderer Zubereitungen er Erfindung ist im Allgemeinen im Bereich von ungefähr 4.5 bis ungefähr 9 und typischerweise von ungefähr 5.5 bis 8. Der pH ist vorzugsweise in dem Bereich von ungefähr 6 bis ungefähr 8.0, vorzugsweise 7.4. Der pH kann mit Säure (z.B. Zitronensäure oder Benzosäure) oder Base (z.B. Natriumhydroxid) kontrolliert werden oder gepuffert sein (wie mit Natriumcitrat, Benzoat, Carbonat, oder Bicarbonat, Dinatrium-Hydrogenphosphat, Natrium-Dihydrogenphosphat, usw.).
In anderen wünschenswerten Formen der Erfindung kann die orale Zusammensetzung im Wesentlichen feste oder pastige Eigenschaften besitzen, wie Zahnpuder, ein Dentaltablette oder ein Zahnputzmittel, das eine Zahnpaste (Zahncreme) oder Gelzahnputzmittel ist. Das Vehikel solcher festen oder pastigen oralen Zubereitungen enthält im Allgemeinen zahnverträgliches polierendes Material. Beispiele für polierende Materialien sind wasserunlösliches Natrium-metaphosphat, Kalium-metaphosphat, Trikalzium-phosphat, Kalzium-phosphat-dihydrat, wasserfreies Dikalzium-phosphat, Kalzium-pyrophosphat, Magnesium-orthophosphat, Trimagnesium-phosphat, Kalzium-carbonat, Aluminiumhydrat, calciniertes Aluminium, Aluminium-silicat, Zirconium-silicat, Kieselerden, Bentonit, und Mischungen davon. Andere geeignete polierende Materialien beinhalten die partikuläre hitzehärtbaren Harze wie Melamin-, Phenol und Harnstoffe-Formaldehyde, und quervernetzte Polyepoxide und Polyester. Bevorzugte polierende Materialen beinhalten kristaline Kieselerden mit Partikelgrößen bis zu ungefähr 5 Micron, einer Durchschnitspartikelgröße von bis zu ungefähr 1.1 Micron, und einer Oberfläche von bis zu 50,000 cm²/gm., Kieselerden-Gel oder kolloidale Kieselerde, und komplexe amorphe Alkalimetall Aluminiumsilikate.
Wenn durchsichtige Gele eingesetzt werden, sind ein polierendes Agens oder kolloidale Kieselerden, wie diejenigen, die unter der Handelsmarke SYLOID wie Syloid 72 und Syloid 74 oder unter der Handelsmarke SANTOCEL wie Santocel 100, Alkalimetall-Aluminiumsilikat-Komplexe besonders nützlich, da sie Brechungsindizes besitzen, die nahe den Brechungsindizes gelierender Agens-Flüssigkeit-Systeme (, die Wasser und/oder Feuchthaltemittel enthalten,) sind, die gewöhnlich in Zahnputzmitteln verwendet werden.
Viele der so genannten „wasserunlöslichen" polierenden Materialien besitzen anionische Eigenschaften und beinhalten auch kleine Mengen löslichen Materials. Somit kann unlösliches Natrium-metaphosphat auf jede geeignete Weise gebildet werden, wie in Thorpe's Dictionary of Applied Chemistry, Band 9, 4te Ausgabe, S. 510-511 veranschaulicht. Die Formen unlöslichen Natrium Metaphosphats, bekannt als Madrells Salz und Kurrols Salz, sind weitere Beispiele geeigneter Materialien. Diese Metaphosphatsalze weisen nur eine geringe Löslichkeit in Wasser auf, und werden daher gemeinhin als unlösliche Metaphosphate (IMP) bezeichnet. Es gibt darin ein geringe Menge löslichen Phosphatmaterials wie Unreinheiten, gewöhnlich ein paar Prozent bis zu 4 Gewichts-%. Die Menge des gelösten Phosphatmaterials, von der man annimmt, dass ein lösliches Natrium-trimetaphosphat im Fall von unlöslichem Metaphosphat beinhaltet, kann durch Waschen mit Wasser reduziert oder eliminiert werden, wenn das gewünscht ist. Das unlösliche Alkalimetall-metaphosphat wird typischerweise in Puderform einer Partikelgröße eingesetzt, so dass nicht mehr als 1% des Materials größer als 37 Micron sind.
Das polierende Material wird im Allgemeinen in den festen oder pastrigen Zusammensetzungen in Gewichtskonzentrationen von ungefähr 10% bis ungefähr 99% eingesetzt. Vorzugsweise liegt es in Mengen von 10% bis ungefähr 75% in Zahnpasta, und von ungefähr 70% bis ungefähr 99% in Zahnpuder vor. In Zahnpasten liegt, wenn das polierende Material siliziumartig ist, es im Allgemeinen in einer Menge von ungefähr 10-30 Gewichts-% vor. Andere polierende Materialien liegen typischerweise in einer Menge von ungefähr 30-75 Gewichts-% vor. In einer Zahnpaste kann das flüssige Vehikel Wasser und ein Feuchthaltemittel typischerweise in einer Menge im Bereich von ungefähr 10 Gewichts-% bis ungefähr 80 Gewichts-% der Zubereitung enthalten. Glyzerin, Propylene-Glykol, Sorbitol und Polypropylen-glykol sind Beispiele für geeignete Feuchthaltemittel/Träger. Vorteilhaft sind auch flüssige Mischungen von Wasser, Glyzerin und Sorbitol. Bei klaren Gelen, bei den der Brechungsindex eine wichtige Erwägung ist, werden ungefähr 2.5-30% w/w Wasser, 0 bis ungefähr 70% w/w Glyzerin und ungefähr 20-80% w/w Sorbitol vorzugsweise eingesetzt.
Zahnpaste, Cremes, und Gele enthalten typischerweise ein natürliches oder synthetisches Verdickungsmittel oder gelierendes Agens in Verhältnissen von ungefähr 0.1 bis ungefähr 10, vorzugsweise ungefähr 0.5 bis ungefähr 5% w/w. Ein geeignetes Verdickungsmittel ist synthetisches Hectorit, ein synthetischer kolloidaler Magnesium-Alkalimetallsilikatkomplex-Lehm, der zum Beispiel als Laponit (z.B. CP, SP 2002, D) verfügbar ist, der von Laporte Industries Limited vertrieben wird. Laponit D besteht aus ungefähr 58.00 Gewichts-% SiO₂, 25.40 Gewichts-% MgO, 3.05 Gewichts-% Na₂O, 0.98 Gewichts-% Li₂O, und etwas Wasser und Spurenmetalle. Seine wahre Schwerkraft ist 2.53 und es hat eine apparente Bruttodichte von 1.0 g/ml bei einem Feuchtigkeitsgehalt von 8%.
Andere geeignete Verdickungsmittel beinhalten irisches Moos, Iota Carrageenan, Tragantgummi, Stärke, Polyvinylpyrrolidon, Hydroxyethylpropylzellulose, Hydroxybutyl-methyl-zellulose, Hydroxypropyl-methyl-zellulose, Hydroxyethyl-zellulose (z.B. erhältlich als Natrosol), Natrium-carboxymethyl-zellulose, und kolloidale Kieselerde wie fein gemahlenes Syloid (z.B. 244). Solubilisierende Agenzien können auch aufgenommen werden, wie Feuchthaltemittel Polyole wie Propylen-glycol, Dipropylen-glycol und Hexylen-glycol, Cellosolve wie Methyl-cellosolve und Ethyl-cellosolve, pflanzliche Öle und Waxe, die mindestens ungefähr 12 Kohlenstoffatome in gerader Kette enthalten, wie Olivenöl, und Petrolatum und Ester wie Amyl-acetat, Ethyl-acetat und Benzyl-benzoat.
Es versteht sich, dass, wie es üblich ist, die oralen Zubereitungen in geeignet etikettierten Verpackungen verkauft oder auf andere Weise vertrieben werden sollen. Somit wird ein Glas mit einer Mundspülung ein Etikett haben, das es inhaltlich als eine Mundspülung oder Mundreinigungsmittel beschreibt und Anweisungen für seinen Gebrauch enthält; und eine Zahnpasta, Creme oder Gel wird gewöhnlich in einer zusammendrückbaren Tube sein, typischerweise aus Aluminium, überzogenem Blei oder Plastik, oder in einer anderem Drück-, Pump- oder unter Druck stehendem Spender zum Abmessen seiner Inhaltsstoffe, mit einem Etikett, das es inhaltlich als eine Zahnpasta, Gel oder Dentalcreme beschreibt.
Organische oberflächenaktive Substanzen werden in den Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung verwendet, um eine erhöhte prophylaktische Wirkung zu erreichen, dabei zu helfen, eine durchdringende und vollständige Verteilung des aktiven Agens überall in der Mundhöhle zu erreichen und um die vorliegenden Zusammensetzungen kosmetisch verträglicher zu machen. Das organische oberflächenaktive Material ist vorzugsweise anionisch, nicht ionisch oder ampholytisch, und denaturiert nicht das antimikrobielle Peptid der Erfindung, und es ist bevorzugt als das oberflächenaktive Agens ein reinigendes Material einzusetzen, das der Zusammensetzung reinigende und schäumende Eigenschaften verleiht, während es das Peptid nicht denaturiert. Geeignete Beispiel für anionische oberfächenaktive Stoffe sind wasserlösliche Salze von höheren Fettsäure-Monoglyzerid-Monosulfaten, wie dem Natriumsalz des einfach sulfatiertem Monoglycerids von gehärteten Kokusnussölfettsäuren, höheren Alkylsulfaten wie Natrium-lauryl-sulfat, Alkyl-aryl-sulfonaten wie Natrium-dodecyl-benzen-sulfonat, höheren Alkylsulfo-Acetaten, höheren Fettsäureestern von 1,2-Dihydroxy-propan-sulfonat, und die im Wesentlichen gesättigten höheren aliphatischen Acyl-amide von niedrigen aliphatischen Amino-Carbonsäure-Verbindungen wie denjenigen, die 12 bis 16 Kohlenstoffatome in der Fettsäure besitzen, Alkyl- oder Acylradikale und dergleichen. Beispiele der zuletzt erwähnten Amide sind N-lauroyl-sarcosin, und die Natrium, Kalium und Ethanoamindsalze von N-lauroyl-, N-myristoyl-, or N-palmitoyl-sarcosin, die im Wesentlichen frei von Seife oder ähnlichen höheren Fettsäurematerialien sein sollten. Die Verwendung dieser Sarconit-Verbindungen in den oralen Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung ist besonders vorteilhaft, da diese Materialien einen andauernden merklichen Effekt bei der Inhibierung von Säurebildung in der Mundhöhle wegen dem Abbau von Kohlenhydraten aufweisen zusätzlich zu dem Aufweisen einer gewissen Reduktion in der Löslichkeit des Zahnschmelzes in sauren Lösungen. Beispiele für wasserlösliche nicht ionische oberflächenaktive Substanzen, die für die Verwendung mit den Peptiden geeignet sind, sind Kondensationsprodukte von Ethylenoxid mit zahlreichen reaktiven Wasserstoff enthaltenden Verbindungen, die mit diesen reaktiv sind, mit langen hydrophoben Ketten (z.B. aliphatische Ketten von ungefähr 12 bis 20 Kohlenstoffatomen), wobei diese Kondensationsprodukte („Ethoxamere") hydrophile Polyoxyethylen-Einheiten enthalten, wie Kondensationsprodukte von Poly(Ethylenoxid) mit Fettsäuren, Fettalkoholen, Fettamiden, polyhydrischen Alkoholen (z.B. Sorbitan-monostearat) und Polypropylenoxid (z.B. pluronischen Materialien).
Das oberflächenaktive Agens liegt typischerweise in einer Menge von ungefähr 0.1-5 Gewichsts-% vor. Es ist anzumerken, dass das oberflächenaktive Agens beim Lösen des Peptids der Erfindung helfen kann und dadurch die Menge des benötigten solubisierenden Feuchthaltemittels reduziert.
Zahlreiche andere Materialien können in die oralen Zubereitungen dieser Erfindung aufgenommen werden, wie weißmachende Agenzien, Konservierungsstoffe, Silikone, Chlorophyllverbindungen und/oder Ammonium enthaltendes Material wie Harnstoff, Diammonium-phosphat, und Mischungen davon. Diese Adjuvanzien, wenn vorhanden, werden in die Zubereitungen in Mengen aufgenommen, die nicht im Wesentlichen die gewünschten Eigenschaften und Charakteristika beeinflussen.
Jegliches geeignete aromatisierende oder süßende Material kann auch verwendet werden. Beispiele für geeignete aromatisierende Bestandteile sind aromatisierende Öle, z.B. Öl der grünen Mime, Pfefferminze, des Immergrüns, Sassafras, der Nelke, des Salbeis, Eucalyptus, Marjorams, Zimt, der Zitrone und Orange und des Methyl-salicylats. Geeignete süßende Agenzien beinhalten Saccharose, Lactose, Maltose, Sorbitol, Xylitol, Natrium-cyclamat, Perillartin, AMP (Aspartyl-phenyl-alanin, Methyl-ester), Saccharin und ähnliche. In geeigneter Weise können Aroma und süßende Agenzien jeweils oder zusammen von ungefähr 0.1% bis 5% der Zubereitung ausmachen.
Bei der bevorzugten Ausübung dieser Erfindung wird eine orale Zusammensetzung gemäß dieser Erfindung wie ein Mundreinigungsmittel oder Zahnputzmittel, die die Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung enthalten, vorzugsweise regelmäßig am Gaumen und den Zähnen angewendet, d.h. jeden Tag oder jeden zweiten oder dritten Tag oder vorzugsweise 1 bis 3 Mal täglich, bei einem pH von ungefähr 4.5 bis ungefähr 9, im Allgemeinen von ungefähr 5.5 bis ungefähr 8, vorzugsweise von ungefähr 6 bis 8, für mindestens 2 Wochen bis zu 8 Wochen oder mehr bis zu ein Leben lang.
Die Zusammensetzungen dieser Erfindung können in Pastillen aufgenommen sein, oder in Kaugummi oder andere Produkte, z.B. durch Rühren in einer warme Gummibasis oder Beschichten der äußeren Oberfläche einer Gummibasis, für die zur Veranschaulichung genannt werden können Jelutong, Gummitlatexs, Vinylitharz usw., wünschenswerterweise zusammen mit konventionellen Weichmachern oder Weichmachern, Zucker oder anderen Süßstoffen wie Glucose, Sorbitol und ähnliche.
In einer anderen Ausführungsform ist das Peptid der Erfindung in Nahrungsmitteln formuliert, um als ein Konservierungsmittel zu wirken, wobei es 0.01-10% w/w, noch bevorzugter 0.1-5% w/w, am meisten bevorzugt 1-5% und insbesondere 2% w/w enthält.
Die vorliegende Erfindung stellt Zusammensetzungen bereit, die pharmazeutische Zusammensetzungen umfassen, die antimikrobielle Peptide zusammen mit, wie beschrieben, einem pharmazeutisch verträglichen Träger enthalten. Solche Zusammensetzungen können aus der Gruppe ausgewählt sein bestehend aus dentalen, intraoralen Zusammensetzungen, therapeutischen gegen Infektionen gerichtete Zusammensetzungen für topische und systemische Anwendung. Dentalzusammensetzungen oder therapeutische Zusammensetzungen können in der Form eines Gels, einer Flüssigkeit, eines Feststoffs, Puders, einer Creme oder Pastille sein. Therapeutische Zusammensetzungen können auch in der Form von Tabletten oder Kapseln sein. Die topische Verabreichung des Peptids wird bevorzugt.
Die Erfindung stellt auch ein Verfahren bereit zum Herstellen des antimikrobiellen Peptids aus Casein oder Molke. κ-Casein (106-169) kann aus Käse oder Labmolke durch Ultrafiltration oder saure Fällung gewonnen werden. Ultrafiltration von Molke durch einen Membranfilter mit einem nominalen Molekulargewichtsausschluss (NMCO) von 10,000-30,000 bei neutralem oder bevorzugt saurem pH (3-5) behält die Mehrzahl der Molkeproteine zurück, wobei ein Permeat produziert wird, das reich an Casein-Peptiden, Lactose und Minerealien ist. Ultrafiltration und Konzentration des Permeats mit einem 1000 NMCO Membranfilter produziert eine Fraktion, die reich an κ-Casein (106-169) ist. Diese Fraktion wird dann mit Trypsin inkubiert und das resultierende Hydrosulat wird reverser Phase HPLC unterzogen, wobei eine relativ reines κ-Casein (106-169) Peptid hergestellt wird. Alternativ können die Peptide κ-Casein (117-169) und 13(184-202) aus einem tryptischen Verdau von Casein mit reverser Phase HPLC gewonnen werden. Peptid κ-Casein (138-158) kann durch einen partiellen Verdau von κ-Casein (106-169) mit endo-Glu-C gewonnen werden, gefolgt von Aufreinigung mit reverser Phase HPLC.
Es wird klar verstanden werden, dass, obwohl diese Beschreibung sich spezifisch auf Anwendungen bei Menschen bezieht, die Erfindung auch bei veterinären Zwecken nützlich ist. Somit ist die Erfindung in allen Aspekten nützlich für domestizierte Tiere wie Vieh, Schafen, Pferden und Geflügel; für Haustiere wie Katzen und Hunde; und für Zootiere. Um zu erreichen, dass das Wesen der vorliegenden Erfindung besser verstanden werden kann, werden bevorzugte Ausführungsformen von ihr nun unter Bezug auf die folgenden nicht beschränkenden Beispiele beschrieben.
Legenden der Figuren
1. Reverse Phase HPLC eines tryptischen Verdaus eines Molkeproteinkonzentrats (WPC). Der tryptische WPC Verdau (8 mg) wurde auf eine Brownlee RP-300 C8 Säule aufgetragen. Die Probe wurde mit einem linearen Stufengradienten mit 0-20% B für 2 Min. gefolgt von 20-45% B für 40 Min. bei einer Flussrate von 1 ml/min eluiert. Eluant A war 0.1% (v/v) TFA in Wasser und Eluant B war 80% (v/v) Acetonitril in 0.1% (v/v) TFA in Wasser.
2. Anionenaustauscherchromatographie von Peak 9 von der RP-HPLC des tryptischen WPC Verdaus. Peak 9 wurde auf eine Mono Q Säule, die an ein SMART^TM System angeschlossen war, aufgebracht und mit 0-75% Elutant B für 40 Min. bei einer Flussrate von 100 μl/min eluiert. Elutant A war 20 mM Tris-HCl pH 8.0, 10 mM KCl und Elutant B war 20 mM Tris-HCl pH 8.0, 500 mM KCl.
3. Bestimmung des MIC von ϰ-Casein A Ser(P)¹⁴⁹ (f117-169) für Streptococcus mutans Ingbritt. Der MIG war 2.4 μM.
4. Analytische reverse Phase HPLC Elutionsprofil von UF-Molke. Eine Probe der UF-Molke wurde in Lösungsmittel A gelöst und auf eine analytische Säule aufgebracht (C18) und mit einem linearen Gradienten von 0-35% Lösungsmittel B für 5 Min. gefolgt von 35%-80% Lösungsmittel B für 40 Min bei einer Flussrate von 1.0 ml/min eluiert. Lösungsmittel A bestand aus 0.1% TFA in Wasser und Lösungsmittel B enthielt 90% Acetonitril (v/v/0.1% TFA in Wasser). Die Peaks wurden bei 215 nm detektiert, per Hand bei 215 nm gesammelt und lyophilisert.
5. Aufreinigung von Peak 4 (von der RP-HPLC) mit Gelfiltration. Peak 4 wurde auf eine Gelfiltrationssäule aufgebracht, die mit einem ABI System verbunden war. Material wurde mit 30% Acetonitril (v/v)/0.1% TFA bei einer Flussrate von 1 ml/min eluiert und bei 215 nm beobachtet.
6. Aufreinigung von Peptiden, die durch Hydrolyse von TCA-löslicher UF-Molke durch Endopeptidase Glu-C erzeugt wurden. Eine Probe wurde in Lösungsmittel A gelöst (0.1% TFA v/v in Wasser) und auf eine analytische Säule aufgebracht (C18). Die Peaks wurden mit einem Gradienten aus 0-20% Lösungsmittel B (90% Acetonitril v/v/0.1% TFA in Wasser) für 4 min gefolgt von 20%-40% Lösungsmittel B für 40 min eluiert. Peaks wurden bei 215 nm beobachtet.
Spezifische Beispiele für Formulierungen, die das antimikrobielle Peptid der Erfindung enthalten, werden unten angeführt.
Beispiel 1
Zubereitung von antimikrobiellen Peptiden aus einem tryptischen Verdau von Molkeproteinkonzentrat
Molkeproteinkonzentrat (50 mg/ml) in Wasser (pH 8.0) wurde mit Novo trypsin (1 mg/ml) bei 50°C für 2 h hydrolysiert, wobei ein pH von 8.00 ± 0.01 durch die Zugabe von 1N NaOH beibehalten wurde. Die Hydrolyse wurde durch Zugabe von 1 M HCl auf pH 4.6 beendet. Das Hydrolysat wurde zentrifugiert (11,600 g für 10 min) und dann durch ein 0.2 μm PVDF Filter filtriert bevor es auf eine 7 μm C8 (Brownlee) reverse Phase Säule (4.6 × 220 mm) aufgebracht wurde. Die Probe wurde mit einem „Applied Biosystems 140 A Solvent Delivery System" eluiert, um einen linearen Stufengradienten mit 0-20% B für 2 Min. gefolgt von 20-45% B für 40 Min. bei einer Flussrate von 1 ml/min zu erzeugen. Eluant A war 0.1% (v/v) TFA in Wasser und Eluant B war 80% (v/v) Acetonitril in 0.1% (v/v) TFA in Wasser. Das Eluant wurde mit einem „Applied Biosystems 1000S Diode Array" Detektor bei einer primären Wellenlänge von 215 nm beobachtet. Das Chromatogram wird in 1 gezeigt. Die Peaks wurden gesammelt und auf antimikrobiellen Aktivität hin getestet. Die antimikrobiellen Assays wurden in flüssigem Anzuchtmedium unter Verwendung von Platten mit 96 Nocken durchgeführt, wobei jede Nocke eine Kapazität von 300 μl besitzt. Das Anzuchtmedium bestand aus Todd Hewit Brühe (36.4 g/L), Hefextract (5.0 g/L) mit 100 mmol/L Kalium-phosphat Puffer. Routinemäßig wurde der pH in dem Anzuchtmedium auf 6.3 eingestellt. Ein Inoculum von ungefähr 1.5 × 10² Zellen (Streptococcus sanguis, Streptococcus mutans, Porphyromonas gingivalis), das während der exponentiellen Wachstumsphase geerntet worden war, wurde zu jeder Nocke hinzugegeben. Das Ionophor Gramicidin (40 μmol/L Endkonzentration) wurde zu einer Reihe von Nocke als Negativkontrolle hinzugegeben. Positivkontrollen enthielten nur das Inoculum und Anzuchtmedium. Das Wachstum wurden über eine 30 Stunden Periode nach Animpfung bestimmt, indem die optische Dichte der Zellsuspensionen bei einer Wellenlänge von 650 nm (OD650) mit einem Mikroplattenleser (Biorad, Modell 450) gemessen wurde. Wachstum wurde bestimmt, indem die Anfangsmessung, genommen unmittelbar nach Animpfung von der Endmessung abgezogen wurde (maximale Kultur-OD).
Antimikrobielle Assays wurden auch auf Agarplatten durchgeführt, die geeignetes Anzuchtmedium enthielten, das mit einem Rasen der Test-Bakterienspezies angeimpft war. Papierfilterscheiben (6 mm Durchmesser), zu denen 50 μl der Peptidlösung hinzugegeben waren, wurden auf der Oberfläche der Agarplatte platziert. Der Durchmesser der Zone der Wachstumsinhibierung um jede Scheibe wurde nach drei Tagen Inkubation bestimmt und mit einer Kontrolle verglichen, bei der nur Puffer hinzugefügt worden war. Die Anzuchtsbedingungen hingen von der getesteten Bakterienspezies ab, jedoch wurden sie routinemäßig in einer anaeroben Arbeitsstation bei 37°C kultiviert. Nur Peak 9 aus 1 zeigte antimikrobielle Aktivität. Analyse dieses Peaks mittels Aminosäuresequenz-Analyse (ein automatischer Hewlett Packard Proteinsequenzierer) und Massenanalyse (Perseptive Voyager MALDI-TOF Massenspektrometer) enthüllten, dass der Peak heterogen war und daher wurde die Probe Anionenaustauscherchromatographie auf einer Mono Q PC 1.6/5 (10 μm) Säule unterzogen, die mit einem SMART^TM (Pharmacia) System verbunden war. Die Probe wurde mit einem linearen Gradienten aus 0-75% Eluant B für 40 Min. bei einer Flussrate von 100 μl/min eluiert. Eluant A war 20 mM Tris-HCl pH 8.0, 10 mM KCl und Elutant B war 20 mM Tris-HCl pH 8.0, 500 mM KCl. Das Eluant wurde bei 215 und 280 nm mit dem μ Peak Monitor beobachtet. Das Anionenaustaucher-Chromatogram für Peak 9 von der RP-HPLC wird in 2 gezeigt. Die Peaks wurden gesammelt und auf antimikrobielle Aktivität hin getestet und nur Peaks 9, 10 und 11 zeigten Aktivität. N-terminale Sequenz- und Massenanalysen enthüllten, dass Fraktion 9 Ser(P)¹⁴⁹ ϰ-Casein A (113-169) enthielt, Fraktion 10 Ser(P)149 ϰ-Casein A (124-169) enthielt and Fraktion 11 Ser(P)149 ϰ-Casein A (117-169) enthielt. Massenanalyse enthüllte, dass keines der Peptide glykosyliert war. Die minimale inhibitorische Konzentration (MIC) des reinen Ser(P)¹⁴⁹ ϰ-Casein A (117-169) wurde dann für das Bakterium Streptococcus mutans bestimmt und ist in 3 gezeigt. Die erhaltene MIC war 2.4 μM.
Beispiel 2
A. Zubereitung von antimikrobiellen Peptiden aus Käsemolke
Käsemolke wurde durch eine Membran mit einem Molekulargewichtsausschluss von 20,000 ultrafiltriert (UF). Das Filtrat wurde gesammelt und die Proteine wurden durch Zugabe von Trichloressigsäure (TCA) auf eine Endkonzentration von 11% w/v zu gefällt. Die gefällten Proteine wurden durch Zentrifugation (10,000g, 5 min) entfernt und der neutralisierte Überstand wurde lyophilsiert. Die getrocknete TCA lösliche UF Molke wurden in 0.1% TFA in Wasser gelöst und RP-HPLC unterzogen. Die Probe wurde auf eine analytische Brownlee-Aquapore- (C18) reverse Phase Säule (220 × 4.6 mm) oder eine Brownlee (C18) präparative Säule (25 cm × 10 mm) aufgebracht. Lösungsmittel B enthielt 90% Acetonitril enthaltend 0.1% v/v TFA und Lösungsmittel A bestand aus 0.1% TFA in Wasser. Das Eluant wurden mit einem Applied Biosystems Incorporated (ABI; Melbourne, Vic., Australien) 1000S Diodenarraydetektor bei einer Wellenlänge von 215 nm beobachtet.
Die Probe wurde auf die Brownlee analystische Säule aufgebracht und mit einem Gradienten von 0-35% Lösungsmittel B für 2 min., 35% Lösungsmittel B für 2. Min. gefolgt von 35%-80% Lösungsmittel B für 40 Min. bei einer Flussrate von 1.0 ml/min. eluiert. Die Fraktionen wurden gesammelt und auf antibakterielle Aktivität getestet. Die Fraktionen wurden auf die Gram-positiven Bakterien Streptococcus mutans Ingbritt, Streptococcus sanguinis (früher S. sanguis), Streptococcus sobrinus 6715 WT15, Staphylococcus aureus ATCC 25923 und das Gram-negative Bakterium, Escherichia coli NCTC 10418, Salmonella typhimurium ATCC 13311, und Pseudomonas aeruginosa ATCC 25619 getestet. Die Bakterien wurden in 30% Glyzerinbrühen bei –20°C aufbewahrt. Der antibakterielle Assay wurde in sterilen Platten mit 96 Nocken durchgeführt (Becton Dickinson, Melbourne, Australien). Das Anzuchtmedium für die Gram-positiven Bakterien bestand aus Todd Hewitt Brühe (TH; 36.4 g/l), Hefeextract (YE; 5 g/l) und 100 mM Kaliumhosphat, pH 6.28 (TYPB). Das Medium für Gram-negative Bakterien bestand aus Nährbrühe bei pH 6.28 und für P. gingivalis, aus "Brain Heart Infusion" Medium (mit 1 μg/ml Haem und 0.5g/l Cystein) bei pH 7.0. Ein Inoculum wurde durch Verdünnen von exponentiell wachsenden Zellen in Anzuchtmedium hergestellt, so dass das Inoculum ungefähr 2.7 × 10⁴ lebende Zellen/ml enthielt. Zu jeder Nocke wurden 250 μl Medium, das das Peptid in variierenden Konzentrationen und 50 μl des Bakteriuminoculums enthielt. Kontrollassays enthielten alle Komponenten außer dem Peptid. Die Nocken der Negativkontrolle enthielten jeweils 250 μl Medium, 50 μl Inoculum und 5 μl Gramicidin D (2.5 mM). Wachstum des Bakteriums wurde als Differenz zwischen der finalen und anfänglichen optischen Dichte (OD) 650 nm Messungen mit einem Mikroplatten Messgerät (BIORAD, Modell 450, NSW, Australien) bestimmt. Die finale OD stellte die maximale Kultur OD dar und wurde normalerweise 20-30 h nach Inokulierung aufgezeichnet, wobei während dieser Zeit die Zellen bei 37°C unter aeroben Bedingungen inkubiert wurden mit der Ausnahme von P. gingivalis, das bei anaeroben Bedingungen bei der gleichen Temperatur inkubiert wurde. Die minimale inhibitorische Konzentration (MIC) wurde bei der geringsten Konzentration des Peptids bestimmt, die benötigt wird, um das Wachstum des Bakteriums zu inhibieren. Die Peptidkonzentration variierte zwischen 0.05 μM-500 μM.

Die antimikrobielle Aktivität des neutralisierten Ausgangsmaterials (TCA lösliche UF Molke) wird in Tabelle 2 gezeigt. Tabelle 2. Wachstumsinhibierung von Gram-positiven und Gram-negativen Bakterien durch TCA-lösliche UF-Molke. Mikrobielles Wachstum wurde durch die optische Dichte bei einer Wellenlänge von 650 nm nach 30 h Inkubation bei 37°C bestimmt.

Spezies	Wachstumsinhibierung durch TCA-lösliche UF-Molke %
	3.7 mg/ml	1.9 mg/ml
Gram-positive Bakterien
S. mutans	89 ± 6^a	42 ± 11
S. aureus	47 ± 18	18 ± 18
S. sanguinis	KI^b	KI
Gram-negative Bakterien
E.coli	14 ± 8	12±15
S. typhimurium	8 ± 7	KI
P. aeruginosa	9 ± 6	KI
a – % Durchschnittsinhibierung des Wachstums ± Standartabweichung (n = 3-6) b – keine Inhibierung

4 zeigt die RP-HPLC der TCA-löslichen UF Molke. Fünf Peaks wurden gesammelt und auf antibakterielle Aktivität hin analysiert. Peak 4 wies die höchste spezifische antimikrobielle Aktivität auf, wie in Tabelle 3 gezeigt. Peak 4 (RP4) wurde ferner einer Gelfiltrationschromatographie mit einer Gelfiltrationssäule (Supelco 30 × 7.8 cm) unterzogen und mit 30% Acetonitril v/v 0.1% TFA in Wasser bei einer Flussrate von 1 ml/min eluiert. Tabelle 3. Wachstumsinhibierung von Steptokokken-Spezies durch RP-HPLC Peaks von UF-Molke. Die erzeugten Peaks wurden in dem antibakteriellen Assay getestet. Mikrobielles Wachstum wurde durch die optische Dichte bei einer Wellenlänge von 650 nm nach 30 h Inkubation bei 37°C bestimmt.

Probe	Menge^✝ (mg)	Assaykonzentration^∞ (mg/ml)	% Wachstumsinhibierung
			S. mutans	S. sobrinus	S. sanguinis
RP1 +	1.7	1.4	23 ± 16^a	–^b	KI^c
RP2
RP3	1.0	0.90	17 ± 16	23 ± 20	17 ± 7
RP4	0.64	0.53	91 ± 3	81 ± 5	26 ± 7
RP5	0.60	0.50	79 ± 7	79 ± 14	23 ± 5
a – % Durchschnittsinhibierung des Wachstums ± Standartabweichung (n = 3-6) b – nicht bestimmt c – keine Inhibierung ✝ – Menge jedes Peaks bestimmt bei 215nm Absorption ∞ – Konzentration des Peaks in antibakteriellem Assay

5 zeigt die Gelfiltrationschromatographie von Peak 4 (RP4) von der RP-HPLC der TCA-löslichen UF-Molke. Vier Peaks aus der Chromatographie wurden gesammelt und auf antimikrobielle Aktivität gegen S. mutans hin getestet, wie in Tabelle 4 gezeigt. Tabelle 4. Die Inhibierung des Wachstums von S. mutans durch Gelfiltrationspeaks von Peak 4 der RP-HPLC von TCA-löslicher Molke.

Probe	Menge^✝ (mg)	Assaykonzentration^∞ (mg/ml)	% Wachstumsinhibierung
RP4GF1	3.12	2.6	46 ± 9^a.
RP4GF2	–^b	–	KI^c
RP4GF3	19.2	16	26 ± 12
RP4GF4	2.88	2.4	41 ± 11
a – % Durchschnittsinhibierung des Wachstums ± Standartabweichung (n = 3-6) b – nicht bestimmt c – keine Inhibierung ✝ – Menge jedes Peaks bestimmt bei 215nm Absorption ∞ – Konzentration des Peaks in antibakteriellem Assay

Die vier Peaks wurden auch durch Aminosäuresequenzanalyse und durch Massenspektroskopie analysiert. Massenspektrometrische Analyse (MS) Der Peptide wurde mit einer Perspective Biosystems (Framingham, MA, USA) Voyager linear Matrix unterstütztem Laser Desorptions/Ionisierungs Flugzeit (MALDI-TOF) Massenspektrometer durchgeführt, der mit einer verzögerten Extraktion ausgestattet war. Proben wurden auf der Probenanalyseplatte mit einer 5 mg/ml Lösung von 2-5, Dihydroxybenzosäure in 50% wässrigem Acetonitril, enthaltend 0.25% v/v TFA in Wasser gemischt (1:1 v/v). Alle Spektren wurden in linearem positiven Modus bei einer Beschleunigungsspannung von 20 kV, Gitterspannung von 92% und einer Pulsverzögerungszeit von 125 ns erhalten. Die Calibrierung wurde mit bovinem Insulin (MW 5733.54 Da) durchgeführt. Für die Sequenzanalyse wurden Peptide auf eine voreingestellte Hewlett-Packard (HP; Blackburn, Vic, Australien) Sequenzierungssäule in 1 ml Probenladungslösung (2% v/v TFA in Wasser) geladen und dann mit einem HP G1005A Proteinsequenzierer analysiert. Tabelle 5. Vergleich der Peaks der Gelfiltrationchromatographie von Peak 4 (RP₄) von TCA-löslicher UF Molke, wie sie durch Sequenz- und Massenspektrometeranalyse bestimmt wurden.

Peak	Gemessene Masse (Da)	Berechnete Masse (Da)	Zuordnung^✝
RP4GF1	6756	6755	Ser(P)¹⁴⁹ κ-Casein-B-(106-169)
	6788	6787	Ser(P)¹⁴⁹ κ-Casein-A-(106-169)
	6736	6835	Ser(P)¹²⁷, Ser(P)¹⁴⁹ κ-Casein-B-(106-169)

Peak	Gemessene Masse (Da)	Berechnete Masse (Da)	Zuordnung^✝
	6869	6867	Ser(P)¹²⁷, Ser(P)¹⁴⁹ κ-Casein-A-(106-1169)
RP4GF2	–	–	β–Lactoglobulin, geringe Spuren von α-Lactalbumin und κ-Casein (106-169)
RP4GF3	–	–	α-Lactalbumin
RP4GF4	6758	6755	Ser(P)¹⁴⁹ κ-Casein-B-(106-169)
	6788	6787	Ser(P)¹⁴⁹ κ-Casein-A-(106-169)
	6738	6835	Ser(P)¹²⁷, Ser(P)¹⁴⁹ κ-Casein-B-106-169
	6869	6867	Ser(P)¹²⁷, Ser(P) ¹⁴⁹ κ-Casein-A-(106-169)
✝ – durch N-terminale Aminosäuresequenzierung zugeordnet

Die Gelfiltrationspeaks mit der gleichen spezifischen antimikrobiellen Aktivität RP4 GF1 und RP4 GF4 (Tabelle 4) enthielten die gleichen Peptide, vermutlich die höher molekulargewichtige Fraktion RP4 GF1, die eine aggregierten Zustand der Phosphopeptide darstellten. Die aktiven Peptide wurden identifiziert als:
Ser(P)¹⁴⁹ ϰ-Casein-B-(106-169)
Ser(P)¹⁴⁹ ϰ-Casein-A-(106-169)
Ser(P)¹²⁷ Ser(P)¹⁴⁹ ϰ-Casein-B-(106-169)
Ser(P)¹²⁷, Ser(P)¹⁴⁹ ϰ-Casein-A-(106-169)
Die Identifikation von antimikrobieller Aktivität mit der phosphorylierten nicht glykolysierten Form von ϰ-Casein (106-169) ist konsistent mit der Identifizierung des tryptischen Caseinpeptids Ser(P)¹⁴⁹ ϰ-Casein-(117-169) als ein antimikrobielles Peptid in Beispiel 1.
B. Präparation von antimikrobiellen Peptiden aus TCA-löslicher UF Molke, die mit Endopeptidase Glu-C behandelt wurde
Endopeptidase Glu-C (Sigma Chemical Co, St. Louis, MO, USA) wurde zu einer Lösung von TCA-löslicher UF-Molke (1.0 mg/ml) in Ammonium-acetat (0.05 M, pH 4.0) hinzugefügt (5.0 μg/ml) und bei 37°C für 24 h inkubiert. Die Reaktion wurde gestoppt durch Erniedrigen des pHs auf 3.0 durch Zugabe von Eisessig. Produkte des enzymatischen Verdaus wurden durch RP-HPLC getrennt.

6 zeigt die RP-HPLC des Endo Glu-C-Verdaus von TCA-löslicher UF Molke. Zwölf Peaks wurden gesammelt und nur Peak 12 wies antimikrobielle Aktivität gegen S. mutans auf, wie in Tabelle 6 gezeigt. Peak 12 enthielt drei Peptide, wie durch Sequenz und Massenspektrometeranalysen gezeigt (Tabelle 7). Diese Peaks wurden weiter gereinigt durch analytische RP-HPLC und nur Peptid Ser(P)¹⁴⁹ ϰ-Casein A (138-158) wies antimikrobielle Aktivität auf, wobei eine 100 μM Konzentration eine fast 100% Wachstumsinhibierung von S. mutans ergab. Tabelle 6. Antimikrobielle Aktivität gegen S. mutans von lyophilisierten Peaks 9-12 aus einer RP-HPLC eines Endo Glu-C Hydrolysats von TCA-löslicher Molke

Probe	Menge^✝ (mg)	Assaykonzentration^∞ (mg/ml)	% Wachstumsinhibierung
9	0.64	0.53	KI^a
10	0.30	0.25	KI
11	0.32	0.27	KI
12	0.40	0.34	84 ± 9^b
a – keine Inhibierung b – % Durchschnittsinhibierung des Wachstums ± Standartabweichung (n = 3) ✝ – Menge jedes Peaks bestimmt bei 215nm Absorption ∞ – Konzentration des Peaks in antibakteriellem Assay

Tabelle 7. Zusammensetzung von Peaks 9-12 aus einer RP-HPLC eines Endo Glu-C Hydrolysats von TCA-löslicher UF-Molke

Peak	Gemessene Molekularmasse (Da)^a	Berechnete Molekularmasse (Da)	Zuordnung
9	3056.5	3050.2	Ser(P)¹⁴⁰ ϰ-Casein-B-(141-151)
	4080.9	4076.2	ϰ-Casein-A-1 GalNAC, 1 Gal-(106-140)
	4373.7	4367.2	ϰ-Casein-A-1 GalNAc, 1Gal, 1NeuAc-(106-140) + Methionin-sulfoxid
	4750.9	4748.0	ϰ-Casein-A-2 GalNAc, 2Gal, 1NeuAc-(106-140)
	5040.8	5039.0	ϰ-Casein-A-2 GalNAC, 2Gal, 2NeuAc-(106-140) + Methionin-sulfoxid
10	2438.2	2432.4	ϰ-Casein-A-1 GalNAC-(119-140)
	2481.9	2474.0	Ser(P)¹⁴⁹ ϰ-Casein-A-1 GalNAc, 1 NeuAc-(141-158)
	3423.8	3423.0	ϰ-Casein-B-(106-137)
	4092.5	4092.2	ϰ-Casein-A-1 GalNAc, 1 Gal-(106-140) + Methionin-sulfoxid

Peak	Gemessene Molekularmasse (Da)^a	Berechnete Molekularmasse (Da)	Zuordnung
	4383.7	4383.2	ϰ-Casein-A-1 GalNAc, 1 Gal, 1 NeuAc-(106-140) + Methionin-sulfoxid
11	1890.1	1884.1	ϰ-Casein-A-(152-169) and ϰ-Casein-B-(152-169)
	2938.4	2931.2	ϰ-Casein-A-(119-147)
	3427.4	3423.8	ϰ-Casein-B-(106-137)
	4094.2	4088.0	ϰ-Casein-B-1 GaINAc, 1 Gal-(106-140)
	4385.3	4379.0	ϰ-Casein-B-1 GalNAc, 1 Gal, 1 NeuAc-(106-140)
12	2285.6	2279.3	Ser(P)¹⁴⁹ ϰ-Casein-A-(138-158)
	2356.8	2348.4	Ser(P)¹⁴⁹ κ-Casein-B-(148-169)
	2398.3	2392.5	Ser(P)¹⁴⁹ ϰ-Casein-A-(148-169)
a – Molekularmasse durch MS bestimmt

Diese Ergebnisse zeigten, dass ein nur 20 Reste langes Fragment von Ser(P)¹⁴⁹ ϰ-Casein A (106-169), Ser(P)¹⁴⁹ ϰ-Casein A (138-158) antimikrobielle Aktivität aufwies, obgleich sie weniger stark (100 μM MIC) verglichen mit dem längeren Peptid (2.5 μM MIC) war. Das zwanzig Reste Fragment der zwei genetischen Hauptvarianten A und B wird gezeigt:
Ser(P)¹⁴⁹ ϰ-Casein A (138-158)
Ser(P)¹⁴⁹ ϰ-Casein B (138-158)
Das zwanzig Reste-Fragment ist amphipatisch und ist in der Lage eine amphipatische Helix und daher einen Kanal in der bakteriellen Membran zu bilden. Ein Molekularmodell von ϰ-Casein (130-158) als eine Hexamer, das einen polaren Kanal mit einem nicht polaren Äußeren bildet, das den Durchtritt von Kationen (Na⁺, K⁺, H⁺, usw.) durch eine bakterielle Zellmembran ermöglichen könnte, wodurch die elektrochemischen Transmembrangradienten zerstört würden, wurde konstruiert. Es war interessant zu bemerken, dass das Molekularmodell der glyskosylierten Form von ϰ-Casein (130-158), das keine antimikrobielle Wirkung besitzt, den Kanal durch Zuckerreste blockiert hat, was möglicherweise den Mangel an Aktivität mit den glykosylierten Peptiden erklärt.
C. Synthese von Ser(P)¹⁴⁹ ϰ-Casein (138-160)
Um die antimikrobielle Aktivität von Ser(P)¹⁴⁹ ϰ-Casein (138-158) zu bestätigen, wurden verwandte Peptide mit und ohne Phosphorylierung synthetisiert und auf ihre antimikrobielle Aktivität hin getestet.
Ein Peptid, das Ser(P)¹⁴⁹ ϰ-Casein A (138-160) entsprach, das eine Phosphoryl-Gruppe am Ser149 enthielt, und ϰ-Casein A (130-158) wurden manuell mittels Standart-Festphasen-Peptidsyntheseprotokollen für die Fmoc Chemie synthetisiert. Die Peptide wurden in der Carboxyl-Form mit Pac-Peg-PS Träger (PerSeptive Biosystems) zusammengebaut. Nachfolgende Zugaben der verbleibenden Fmoc Aminosäuren enthaltend Fmoc-Ser(PO(OBzl)OH)-OH wurden mit HBTU/HOBt Aktivierung mit 4 Äquivalenten Fmoc-Aminosäure und 6 Äquivalenten DIPEA erreicht. Die Fmoc Gruppe wurden mit einem kontinuierlichen Fluss von 2% v/v DBU in DMF enthaltend 2% v/v Piperidin für 5 Min entfernt. Spaltung des Peptids vom Träger wurde mit TFA:TIPS:Wasser (95:2.5:2.5) Spaltungscocktail für 2.5 h unter N₂ im Dunklen durchgeführt. Nach Spaltung wurde der Träger durch Filtration entfernt und das Filtrat wurde unter einem Strom von Stickstoff konzentriert. Nachdem die Peptidprodukte in kaltem Ether gefällt waren, wurden sie zentrifugiert und drei Mal gewaschen. Das Peptidpräzipitat wurde dann in Wasser enthaltend 0.1% v/v TFA gelöst und der unlösliche Rest wurde durch Zentrifugation entfernt.

Aufreinigung der synthetisierten Peptide wurde mit einer präparativen Brownlee C-18 Säule durchgeführt. Chromatogramme wurden bei einer Flussrate von 4.0 ml/min entwickelt und die Peptide wurden mit einem Gradienten mit 0-100 % Lösungsmittel B in 43 Min eluiert. Die Peptidfraktionen, die von der Säule gesammelt wurden, wurden auf die analytische Brownlee C-18 Säule aufgetragen und mit einem Gradienten von 0-100 % Lösungsmittel B in 40 Min eluiert. Alle gesammelten Peptidfraktionen wurden lyophilisiert und der Analyse durch MS unterzogen. Tabelle 8 zeigt die antimikrobielle Aktivität der zwei synthetischen Peptide. Diese Ergebnisse zeigen, dass die Phosphorylierung von Ser¹⁴⁹ essentiell für die volle antimikrobielle Aktivität ist. Der Phosphoseryl-Rest Ser(P)¹⁴⁹ kann für die Bildung eines Ionenkanals in der Bakterienmembran notwendig sein oder kann für die Löslichkeit notwendig sein. Weiterhin legen die höhere MIC (100-150 μM) für das Ser(P)¹⁴⁹ ϰ-Casein A (138-160) verglichen mit dem größeren Peptid Ser(P)¹⁴⁹ ϰ-Casein A (117-169) (2.5 μM MIC) nahe, dass die flankierenden Reste von Ser(P)¹⁴⁹ ϰ-Casein (138-158) für die Löslichkeit und/oder Interaktion mit der Bakterienzelle und Bildung des Ionenkanals notwendig sein können. Tabelle 8. Inhibierung von S. mutans Wachstum durch synthetische Peptide ϰ-Casein-A-(130-158) (nicht phosphoryliert) und Ser(P)¹⁴⁹ ϰ-Casein-A-(138-160).

Peptid	MIC	% Wachstumsinhibierung Konzentration der synthetischen Peptide (mM)
		100	75	50	25	10
ϰ-Casein-A(130-158)	1.2 mM	17 ± 13^a	–^b	14 ± 13	11 ± 7	KI^c
Ser(P)¹⁴⁹ ϰ-Casein-A(138-160)	150 μM	–	69 ± 6	52 ± 5	17 ± 9	6 ± 10
a – % Durchschnittsinhibierung des Wachstums ± Standartabweichung (n = 3-6) b – nicht bestimmt c – keine Inhibierung

Beispiel 3
A. Trypsin-Hydrolyse
Natrium-caseinat wurde in 150 mM NH₄HCO₃ pH 8.0 mit 10% (w/v) gelöst und mit Novo Trypsin (2 g/L) bei 50 °C für 2 h hydrolysiert. Die Hydrolyse wurde durch die Zugabe von 1N HCl auf pH 4.6 beendet und das unverdaute Protein wurde durch Zentrifugation entfernt. Eine Probe des Hydrolysats wurde auf eine 7 μm Applied Biosystems C8 Säule (4.6 × 220 mm) aufgetragen und wie in Beispiel 1 beschrieben eluiert. Die Peaks wurden gesammelt und auf antimikrobielle Aktivität gegen Streptococcus sanguinis getestet. Zwei Peptide zeigten Aktivität, Ser(P)¹⁴⁹ ϰ-casein (117-169) und β-casein (184-702).
B. Lab-Hydrolyse
Casein HCl (5 g) wurde in 100 ml 100 mM Ammonium-bicarbonat pH 8.0 gelöst. Sobald das Casein gelöst war, wurde der pH auf 6.3 mit 1 M HCl gesenkt und 1 mg Lab (Chymosin, Sigma) wurde hinzugefügt und die Mischung wurde für 1 h bei 37°C inkubiert.
TCA (11% w/v) wurde zu der Lösung hinzugegeben oder der pH wurde auf 4.5 durch die Zugabe von 1 M HCl verringert und die gefällten Proteine wurden durch Zentrifugation entfernt. Der Überstand wurde gesammelt, neutralisiert und lyophilisiert. Die getrocknete Probe wurde in Lösungsmittel A (0.1% TFA in Wasser) gelöst und auf eine präparative Brownlee C18 RP-HPLC Säule geladen. Die Säule wurde mit einem Gradienten aus 15% Lösungsmittel B für 5 Min. 15-60% Lösungsmittel B für 225 Min. gefolgt von 60-100% Lösungsmittel B für 1 Min, bei einer Flussrate von 4.0 ml/min eluiert. Das Eluant wurde bei 215 nm beobachtet. Vier Peaks wurden erhalten, von denen zwei antimikrobielle Aktivität hatten und dem nicht glykolysierten, phosphorylierten ϰ-Casein (106-169) entsprachen.

Die aktiven Peptide wurden identifiziert als:
Ser(P)¹⁴⁹ ϰ-Casein A (106-169).
Ser(P)¹²⁷, Ser(P)¹⁴⁹ ϰ-Casein A (106-169) und
Ser(P)¹⁴⁹ ϰ-Casein B (106-169).
Ser(P)¹²⁷, Ser(P)¹⁴⁹ ϰ-Casein B (106-169). Beispiel 4 – Vorgeschlagene Zahnpastaformulierungen

Formulierung 1

Inhaltsstoff	% w/w
Dikalzium-phosphat-dihydrat	50.0
Glyzerin	20.0
Natrium-carboxymethyl-zellulose	1.0
Natrium-lauryl-sulphat	1.5
Natrium-lauroyl-sarconisat	0.5
Aromastoff	1.0
Natrium-saccharin	0.1
Chlorhexidin-gluconat	0.01
Dextranase	0.01
Ser(P)¹⁴⁹ ϰ-Casein(106-169)	1.0
Wasser	zum Auffüllen

Formulierung 2

Inhaltsstoff	% w/w
Dikalzium-phosphat-dihydrat	50.0
Sorbitol	10.0
Glyzerin	10.0
Natrium-carboxymethyl-zellulose	1.0
Natrium-lauryl-sulphat	1.5
Natrium-lauroyl-sarconisat	0.5
Aromastoff	1.0
Natrium-saccharin	0.1
Natrium-monofluorophosphat	0.3
Chlorhexidin-gluconat	0.01

Formulierung 2
Dextranase	0.01
Ser(P)¹⁴⁹ ϰ-Casein(106-169)	2.0
Wasser	zum Auffüllen

Formulierung 3

Inhaltsstoff	% w/w
Dikalzium-phosphat-dihydrat	50.0
Sorbitol	10.0
Glyzerin	10.0
Natrium-carboxymethyl-zellulose	1.0
Lauroyl-diethanolamid	1.0
Saccharose-monolaurat	2.0
Aromastoff	1.0
Natrium-saccharin	0.1
Natrium-monofluorophosphat	0.3
Chlorhexidin-gluconat	0.01
Dextranase	0.01
Ser(P)¹⁴⁹ K-Casein(106-169)	5.0
Wasser	zum Auffüllen

Formulierung 4

Inhaltsstoff	% w/w
Sorbitol	10.0
Irisches Moos	1.0
Natrium-hydroxid (50%)	1.0
Gantrez	19.0
Wasser (entionisiert)	2.69
Natrium-monofluorophosphat	0.76
Natrium-saccharin	0.3
Pyrophosphat	2.0
Hydratisiertes Aluminium	48.0
Aromaöl	0.95
Ser(P)¹⁴⁹ ϰ-Casein(106-169)	1.0

Formulierung 4
Wasser	zum Auffüllen

Formulierung 5

Inhaltsstoff	% w/w
Natrium-polyacrylat	50.0
Sorbitol	10.0
Glyzerin	20.0
Natrium-saccharin	0.1
Natrium-monofluorophosphat	0.3
Chlorhexidin-gluconat	0.01
Ethanol	3.0
Ser(P)¹⁴⁹ ϰ-Casein(106-169)	2.0
Linolsäure	0.05
Wasser	zum Auffüllen

Beispiel 5 – Vorgeschlagene Mundreinigungslösungsformulierungen

Formulierung 1

Inhaltsstoff	% w/w
Ethanol	20.0
Aromastoff	1.0
Natrium-saccharin	0.1
Natrium-monofluorophosphat	0.3
Chlorhexidin-gluconat	0.01
Lauroyl-diethanolamid	0.3
Ser(P)¹⁴⁹ ϰ-Casein(106-169)	2.0
Wasser	zum Auffüllen

Formulierung 2

Inhaltsstoff	% w/w
Gantrez S-97	2.5
Glyzerin	10.0
Aromaöl	0.4
Natrium-monofluorophosphat	0.05

Formulierung 2
Chlorhexidin-gluconat	0.01
Lauroyl-diethanolamid	0.2
Ser(P)¹⁴⁹ ϰ-Casein(106-169)	2.0
Wasser	zum Auffüllen

Beispiel 6. Vorgeschlagene Pastillenformulierung

Inhaltsstoff	% w/w
Zucker	75-80
Maissirup	1-20
Aromaöl	1-2
NaF	0.01-0.05
Ser(P)¹⁴⁹ ϰ-Casein(106-169)	3.0
Mg-stearat	1-5
Wasser	zum Auffüllen

Beispiel 7 – Vorgeschlagene gingivale Massagecremeformulierungen

Inhaltsstoff	% w/w
Weißes Petrolatum	8.0
Propylen-glycol	4.0
Stearyl-alkohol	8.0
Polyethylenglycol 4000	25.0
Polyethylenglycol 400	37.0
Saccharose-monostearat	0.5
Chlorohexidin-gluconat	0.1
Ser(P)¹⁴⁹ ϰ-Casein(106-169)	3.0
Wasser	zum Auffüllen

Beispiel 8 – Vorgeschlagene Kaugummiformulierungen

Inhaltsstoff	% w/w
Gummibasis	30.0
Kalziumcarbonat	2.0
Kristallines Sorbitol	53.0

Inhaltsstoff	% w/w
Glyzerin	0.5
Aromaöl	0.1
Ser(P)¹⁴⁹ ϰ-Casein(106-169)	2.0
Wasser	zum Auffüllen

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In jeder der obigen Sequenzen stellt Σ Phosphoseryl dar.
Sequenzprotokoll Annex

Claims

Antimikrobielles, nicht-glykosyliertes Peptid mit weniger als 100 Aminosäuren, das eine Aminosäuresequenz enthält, die aus der Gruppe bestehend aus AVESTVATLEAΣPEVIESPPE, (SEQ. ID. NO. 1) AVESTVATLEDΣPEVIESPPE, (SEQ. ID. NO. 2) ausgewählt ist, wobei Σ einen Phosphoserylrest darstellt.
Antimikrobielles Peptid nach Anspruch 1, wobei das Peptid weniger als 70 Aminosäuren enthält.
Antimikrobielles Peptid nach einem der Ansprüche 1 bis 2, wobei das Peptid eine Aminosäuresequenz enthält, die aus der Gruppe, bestehend aus
ausgewählt ist.
Antimikrobielles Peptid nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das Peptid aus der Gruppe, bestehend aus
ausgewählt ist.
Chimäre Verbindung, die ein Peptid nach einem der Ansprüche 1 bis 4 enthält, das mit einem Nicht-Peptidmolekül konjugiert ist.
Chimäre Verbindung nach Anspruch 5, wobei der Nicht-Peptidanteil des Moleküls Acylgruppen einschließt.
Antimikrobielle Zusammensetzung, wobei die Zusammensetzung das Peptid nach einem der Ansprüche 1 bis 4 und einen verträglichen Träger einschließt.
Verwendung eines Peptids, das wie in einem der Ansprüche 1 bis 4 definiert ist, zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung oder Prävention von Zahnkaries oder einer periodontalen Erkrankung in einem Subjekt.