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Alle
lebenden Organismen erfordern Wasser. In der Tat sind die meisten
Lebewesen zu einem großen Ausmaß Wasser.
Eines der wenigen vereinheitlichenden Themen in der Biologie ist,
dass Wasser etwa 75 % des Gewichts eines Organismus ausmacht. Jedoch
gibt es bemerkenswerterweise eine Anzahl von Lebewesen, die in trockenem
Zustand nach Verlust nahezu ihres ganzen Wassers überleben
können.
Diese Fähigkeit, als
Anhydrobiose ("Leben
ohne Wasser") bezeichnet,
wird in allen biologischen Reichen gefunden, einschließlich Bakterien,
Pilzen, Tieren und Pflanzen, und entwickelte sich wahrscheinlich
mindestens vor zwei Milliarden Jahren. Derartige anhydrobiotische
Organismen sind in der Lage, vollkommen auszutrocknen und offensichtlich
zu sterben, jedoch sind sie nicht tot; sie überleben inaktiv und leblos über unbestimmte
Zeiträume
in einem Zustand des unterbrochenen Belebtseins, bis sie durch die
Anwesenheit von Wasser ins Leben zurückgebracht werden. Alle diese
lebendigen Dinge haben das Problem gelöst, biologische Moleküle ohne
Kühlung oder
Einfrieren zu konservieren.
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Ein
klar definiertes Merkmal, das anhydrobiotischen Organismen gemeinsam
ist und das wahrscheinlich für
ihre Austrocknungstoleranz kritisch ist, ist ihre Fähigkeit,
große
Mengen eines einfachen Zuckers herzustellen. Der wirksamste ist
Trehalose (α-D-Glucopyranosyl-α-D-glucopyranosid),
aber die anhydrobiotische Pflanze Craterostigma plantagineum akkumuliert
zum Beispiel Saccharose anstelle von Trehalose. Es ist klar, dass
intrazelluläre
und extrazelluläre
Zucker für
die Lebensfähigkeit
von getrockneten Zellen oder Organismen erforderlich sind. Dass
Trehalose allein ausreichend für
eine Anhydrobiose sein kann, wird durch Arbeiten bestätigt, in
denen das Disaccharid künstlich
in lebende Zellen eingeführt
worden ist, was ermöglichte,
dass sie erfolgreich getrocknet und rehydratisiert wurden.
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Trehalose
leitet seine Stabilisierungsfähigkeit
aus einer Kombination von mehreren Eigenschaften ab. Wie viele andere
Zucker kann es Strukturwasser durch Wasserstoffbrückenbindung
mit Moleküloberflächen ersetzen.
Trehalose ist inert und kann in trockenem Zustand nicht mit anderen
Molekülen
reagieren. Gewisse andere Analoga sind ebenfalls stabil und inert,
aber die meisten Zucker reagieren mit Aminogruppen (die sogenannte
Maillard-Reaktion) bei Temperaturen über dem Gefrierpunkt und zerstören das
Produkt. Wenn Moleküle
unter Verwendung des korrekten Verfahrens aus einer Zuckerlösung getrocknet
werden, wird ein Glas gebildet, in das die Moleküle eingebettet werden, was
die molekulare Diffusion und jeden damit verbundenen Abbau minimiert.
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Viele
Zuckerlösungen
können
sich beim Trocknen auf zwei sehr verschiedene Weisen verhalten.
Das üblichste
Verhalten ist, dass der Zucker kristallisiert. Moleküle in Lösung mit
dem Zucker werden nicht geschützt,
wenn dies stattfindet, da sie aus dem Kristall ausgeschlossen werden.
Das alternative Verhalten ist, dass die Lösung fortschreitend konzentrierter
wird, bis sie so viskos ist, dass sie bei Raumtemperatur ein festes
Glas bildet. Wenn dies passiert, ist das biomolekulare Produkt eine
glatte Änderung
vom Vorliegen in flüssiger
Lösung
zu Beginn zum Vorliegen in fester Lösung im Glas am Ende eingegangen.
In diesem Zustand kann man sich die Moleküle des Produkts als in der
Glasmatrix eingebettet und fest immobilisiert vorstellen. Dies ist
analog zu den alten Insekten, die in einem perfekten Konservierungszustand
in fossilem Bernstein eingebettet gefunden werden.
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Da
Zuckerglas wasserlöslich
ist, wird der Prozess leicht in Wasser umgekehrt, so dass das Produkt glatt
in seinen nativen Zustand in flüssiger
Lösung
zurückkehrt.
Diese glatten Übergänge stellen
sicher, dass während
des Trocknens kein Produktschaden auftritt. Was das Produkt betrifft,
ist der Übergang
von flüssiger Lösung zu
fester Lösung
nicht wahrnehmbar. Da Gläser
der besten Zucker inert sind und einen hohen Schmelzpunkt aufweisen,
wenn sie trocken sind, wird das Produkt auch bei der Lagerung geschützt, selbst unter
feindlichen Bedingungen.
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Parenteral
verabreichte Arzneistoffe werden herkömmlich durch eine hohle Metallnadel
als Lösung
in Puffer-Salze enthaltendem Wasser injiziert. Die Injektionen können intradermal,
subkutan, intramuskulär
oder intravenös
sein. Seltener kann ein anderer Weg, wie intrathekal oder intraokulär, geeignet
sein. Arzneistoffe werden seit über
hundert Jahren auf diese traditionelle Weise verabreicht, und trotz
der Angst, der Schmerzen und des Infektionsrisikos, die mit Injektionen
verbunden sind, gab es keine größere, allgemein
akzeptierte Verbesserung des Prozesses in dieser Zeit.
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Der
Flüssigstrahl-Injektor,
der durch Ausstoßen
eines sehr dünnen
Flüssigkeitsstroms
unter sehr hohem Druck direkt durch die Haut arbeitet, erzielte
etwas Erfolg in Impfprogrammen, aber frühe Modelle waren unzuverlässig. Jüngere Entwicklungen,
wie die Mediject- und Bioject-Vorrichtung, haben bei Diabetes signifikante
Nischen-Anwendungen gefunden und werden auf andere Bereiche erstreckt.
Jedoch ist der Spritzen- und Nadel- und der Strahl-Injektor-Technik
einen Hauptnachteil der derzeitigen Technologie gemeinsam. Viele parenterale
Arzneistoffe sind in wässriger
Lösung
instabil und werden als stabilerer gefriergetrockneter Kuchen oder
als Pulver hergestellt und gelagert, der bzw. das unmittelbar vor
der Injektion eine Rekonstitution mit Wasser oder Puffer erfordert.
Dieser Zusatzschritt erfordert ein Training in der Technik und fügt Risiken
in Form einer ungenauen Abfüllung
von Lösungsmittel
und deshalb der Dosierung oder der Einführung einer Infektion durch
eine nicht-sterile Technik hinzu. Arzneistoffe, die als Lösung oder
als Suspension (wie Insulin) gelagert werden, erfordern eine Kühlung, um
einen Abbau zu verhindern, und weisen eine begrenzte Haltbarkeit
auf.
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Die
Rekonstitution von trockenen Arzneistoffen muss korrekt und präzise vorgenommen
werden, um die korrekte Dosierung sicherzustellen, und alle Fehler
in diesem Schritt können
gefährlich,
bei hochpotenten Arzneistoffen sogar tödlich sein. Häufig ist
es erforderlich, mehr als einen Arzneistoff zu einem Zeitpunkt zu verabreichen.
Dies kann mehrere schmerzhafte Injektionen erfordern, weit gewisse
Arzneistoffe nicht in einer Spritze gemischt werden können, da
es chemische Inkompatibilitäten
zwischen den Molekülen
in Lösung
gibt, was zu einem Verlust oder selbst der Erzeugung von toxischen
Reaktionsprodukten führt.
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Die
optimale Lösung
für diese
Probleme, die seit langem ein Ziel der Arzneistoffformulierungs-Wissenschaftler
ist, ist eine stabile flüssige
Formulierung, die vor der Injektion keine Rekonstitution mit Lösungsmittel erfordert.
Obwohl einige kleinere Verbesserungen bei der Stabilität wässriger
Lösungen
erzielt wurden, sorgen sie nicht für die sehr hohen Grade an Arzneistoffstabilität, die mit
modernen trockenen Formulierungen unter Verwendung von Trehalose
und ähnlichen
stabilisierenden Hilfsstoffen erhalten werden können. Jedoch erfordern diese
letztgenannten Präparate,
obwohl sie selbst unter sehr feindlichen Umgebungsbedingungen äußerst stabil
sind, immer noch eine Rekonstitution vor der Injektion. Sie sind
auch nur stabil, solange sie sehr trocken sind. Die Aufnahme von
Feuchtigkeit selbst in geringen Mengen kann diese trockenen Präparate bei der
Lagerung instabil machen. Sie werden gewöhnlich als Zweiphasen-Systeme
gelagert, in denen der Arzneistoff in der diskontinuierlichen festen
Phase vorliegt und die kontinuierliche fluide Phase trockene Luft,
häufig
unter verringertem Druck, oder trockener Stickstoff in einem verschlossenen
Glasgefäß ist.
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Von
den zwei Hauptproblemen bei existierenden Impfstoffen für die Strahl-Injektion, die Instabilität bei der
Lagerung und das Erfordernis, getrocknete Impfstoffe zu rekonstituieren,
wird das erstgenannte durch ein Trocknungsverfahren, das nun von
Quadrant Holdings Cambridge Ltd. patentiert ist, unter Verwendung
des einfachen Zuckers Trehalose gelöst. Trehalose-getrocknete Impfstoffe
können
bei Umgebungstemperaturen von mindestens 45°C ohne nachweisbare Verschlechterung
gelagert werden. Am bemerkenswertesten werden selbst Aluminiumhydroxid-Adjuvansgele
durch Trehalose während
der Trocknung und Lagerung stabilisiert und gewinnen ihr voll hydratisiertes
Volumen und ihre Funktion ohne Verklumpen oder Fällung zurück.
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Obwohl
das Instabilitätsproblem
durch dieses Trocknungsverfahren angesprochen wird, lagen die vorstehend
beschriebenen Trehalose-getrockneten Impfstoffe in Form eines festen
Glasschaums vor und erforderten vor der Injektion mittels der herkömmlichen
Nadel- und Spritzen-Technik eine Rekonstitution (zum Beispiel mit
sterilem Wasser oder Puffer-Lösung).
Trockene Impfstoffe können
in Pulverform formuliert werden und können unter Verwendung von Überschall-Schockwellen
aus Gas durch die Haut zugeführt
werden. Wegen der Beschränkungen
der Gasgeschwindigkeit und dementsprechend des Penetrationsvermögens gibt
es gewisse Zweifel, ob tiefe intramuskuläre Injektionen durch diese
Mittel erzielt werden können.
Eine nützlichere Formulierung
wäre eine
gebrauchsfertige stabile Flüssigkeit,
welche nicht den Transport von getrennten Puffer-Lösungen oder
eine Rekonstitution vor Ort erfordert, welche jedoch immer noch
die außerordentliche
Stabilität
von Trehalose-getrocknetem Material aufweisen würde. Ein derartiger Impfstoff
könnte
in Mehrfachdosen-Behältern
formuliert und bequem in Massenimmunisierungskampagnen durch Standard-Strahl-Injektoren zugeführt werden.
Wir beschreiben nun eine Entwicklung unter Verwendung von feinen
Pulvern und nicht-wässrigen
Vehikeln, in denen die Pulver glatt als stabile monodisperse Suspension
verteilt werden können.
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Auf
der Grundlage des Phänomens
der Anhydrobiose haben wir Verarbeitungsbedingungen ersonnen und
validiert, welche die Bildung von stabilen Gläsern sicherstellen, die vollständig das
anhydrobiotische Phänomen
nachahmen. Sie können
für die
Stabilisierung und Konservierung der meisten Arten von Molekülen und biologischen
Systemen verwendet werden, einschließlich vieler Impfstoffe, ohne
eine Gefriertrocknung oder Kühlung
zu erfordern.
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Wir
beschreiben nun ein Verfahren, das für die Formulierung von selbst
den instabilsten Arzneistoffen in einer Flüssigkeitsformulierung verwendet
werden kann, die so stabil ist wie die besten Trehalose-getrockneten
Formulierungen, aber alle Sicherheit und Bequemlichtkeit von gebrauchsfertigen
flüssigen
Präparaten
aufweist.
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Ein
Arzneistoff kann als feines Pulver unter Bedingungen, die seine
optimale Stabilisierung sicherstellen, in Trehalose oder einem anderen
stabilisierenden Hilfsstoff im Glaszustand getrocknet werden. Andere Zucker,
die spontan gute stabilisierende Gläser bilden, sind Palatinit
(eine Mischung von Glucopyranosylsorbit und Glycopyranosilmannit,
hergestellt durch Reduktion von Palatinose (Isomaltulose) mit Wasserstoff
und Raney-Nickel-Katalysator: produziert von Südzucker AG in Deutschland).
Die reinen Isomere Glucopyranosylsorbit und Glucopyranosylmannit
sind auch gut, ebenso wie Lactit (das reduzierte Produkt von Lactose
oder Milchzucker). (Literatur: (i) Colaco C.A.L.S., Smith C.J.S.,
Sen S., Roser D.H., Newman Y., Ring S. und Roser B.J., Chemistry
of protein stabilisation by trehalose, in "Formulation and delivery of proteins
and peptides", Cleland und
Langer, Hg., American Chemical Society, Washington, 222–240 (1994);
(ii) PCT-Anmeldung Nr. WO 91/18091 "Stabilisation of biological macromolecular
substances and other organic compounds". Roser B.J. und Colaco C.; (iii) US-Patent
Nr. 5,621,094 "Method
of Preserving Agarose Gel Structure During Dehydration by Adding
a Non-reducing Glycoside of a Straight Chain Sugar Alcohol" Roser B. und Colaco
C.; (iv) PCT-Anmeldung Nr. WO 96/05809 "Improved method for stabilisation of
biological substances during drying and subsequent storage and compositions
thereof" Colaco
C., Roser B.J. und Sen S.).
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Wir
haben auch gefunden, dass eine ganze Klasse von Monosaccharidalkoholen,
von denen im Stand der Technik angegeben wurde, dass sie als glasbildende
Hilfsstoffe unbrauchbar sind, in der Tat ausgezeichnete stabile
Formulierungen bilden können,
wenn sie korrekt formuliert sind. Diese umfassen Mannit und Inosit.
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Die
Bildung von trockenen Glaspulvern, die stabilisierte Wirkstoffe
enthalten, kann unter Verwendung jedes geeigneten Zuckers oder Zucker-Derivats
aus diesen Gruppen bewerkstelligt werden. Dies kann durch direktes
Sprühtrocknen
oder durch irgendeinen anderen Trocknungsprozess erzielt werden,
einschließlich Standardprozessen
wie Vakuum- oder Gefriertrocknung, gefolgt von einem Mahlschritt,
wie Strahlmahlen, um die getrocknete Formulierung zu einem feinen
Pulver zu zerkleinern. Dieses feine Pulver aus Zuckerglas (diskontinuierliche
Phase), welches den Arzneistoff in einer stabilen festen Lösung in
dem Glas enthält,
wird dann als Suspension in einem Zweiphasen-System formuliert,
das als kontinuierliche Phase eine biokompatible nicht-wässrige Flüssigkeit
enthält,
in der der Zucker unlöslich
ist. Der Ausschluss von Wasser aus diesem System konserviert die
stabilisierende Wirkung der Trehalose oder des anderen verwendeten
stabilisierenden Hilfsstoffs. Wir haben früher mitgeteilt, dass Trehalose-getrocknete
Wirkstoffe mehrere Tage in nicht-wässrigen Flüssigkeiten stabil bleiben,
in denen die Trehalose selbst unlöslich ist. Gribbon E.M., Sen
S., Roser B.J. und Kampinga J. Stabilisation of Vaccines Using Trehalose
(Q-T4) Technology. In F. Brown (Hg.) New Approaches to Stabilisation
of Vaccine Potency Dev Biol Stand, Karger, Basel 87, 193–199 (1996).
Vorausgesetzt, dass das nicht-wässrige
Vehikel stabil ist, und vorausgesetzt, dass das Präparat nicht
signifikante Wassermengen absorbiert, scheint es wahrscheinlich,
dass derartige Formulierungen so unbegrenzt stabil wie das Trehalose-getrocknete
Material selbst wären.
Während
Experimente unter Verwendung nicht-wässriger Labor-Lösungsmittel wie Aceton oder
Dichlormethan das Prinzip der Stabilität von aktiven Molekülen in suspendierten
Zuckerglas-Mikrokügelchen
aufstellen, sind derartige Präparate
natürlich
nicht injizierbar, weil das Vehikel toxisch ist. Es gibt jedoch
verschiedene nicht-wässrige
Vehikel, die von den Zulassungsbehörden für eine parenterale Injektion
zugelassen sind und die eine Sicherheit und Zweckmäßigkeit
demonstriert haben. Die flüssige
Phase kann irgendein injizierbares hydrophobes Lösungsmittel sein, wie ein injizierbares
Sesam-, Erdnuss- oder Sojaöl,
Ethyloleat oder ein mit Wasser mischbares nicht-wässriges
Lösungsmittel,
wie Polyethylenglycol. Da die meisten der geeigneten nichtwässrigen
Flüssigkeiten
selbst bei Raum- oder erhöhten
Temperaturen sehr stabil sind und keine Kühlung erfordern, ist das resultierende
Zweiphasen-Präparat
inhärent
stabil.
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Jedoch
weisen die feinen Teilchen aus Zuckerglas eine innewohnende Tendenz
auf, in vielen nicht-wässrigen
Flüssigkeiten
wegen einer Phasentrennung Klumpen zu bilden. Da das Zuckerglas
intensiv hydrophil ist, weisen die Teilchen eine starke Tendenz
auf, aus einer kontinuierlichen hydrophoben Phase ausgeschlossen
zu werden. und werden in Klumpen zusammengedrängt. Diese Aggregate setzen
sich aus der Suspension ab und können
nicht leicht als monodisperse Suspension durch Schütteln oder
Beschallung rekonstituiert werden. Dies führt zu einer Ungleichförmigkeit
der Arzneistoffdosis in der Suspension, und in den schlimmsten Fällen ist
die Formulierung aufgrund von großen Klumpen, die die Nadel
blockieren können,
nicht injizierbar. Obwohl die ideale Suspension wasserfrei oder
nahezu wasserfrei ist, haben wir gefunden, dass überraschend einfache Verfahren,
die aus dem Gebiet der Stabilisierung von Wasser-in-Öl (WIÖ)-Emulsionen abstammen,
eine glatte, monodisperse Einteilchen-Suspension von Mikrokügelchen
in einer nicht-wässrigen Flüssigkeit
erzeugen können.
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Obwohl
der Wassergehalt dieser Systeme sehr gering ist (<1 %), weisen Tenside,
die gewöhnlich
verwendet werden, um Wasser-in-Öl
(WIÖ)-Emulsionen
zu stabilisieren, bei etwa 0,01 % bis 10 %, bevorzugt etwa 1 %,
eine dramatische Wirkung auf. Sie zerkleinern die Aggregate von
Glasteilchen zurück
zu einer glatten monodispersen Suspension, die im Wesentlichen keine
Tendenz zeigt, wieder zu verklumpen. Diese Tenside, die entweder
ein niedriges oder sehr niedriges hydrophil-lipophiles Gleichgewicht
(HLB) aufweisen, sind selbst in Wasser unlöslich, sind aber lipidlöslich. Tenside
mit niedrigem HLB, wie Sorbitansesquioleat (Arlacel C, HLB=3,7),
Mannidmonooleat (Arlacel A, HLB=4,3), Sorbitantristearat (Span 65,
HLB=2,1) und Glycerolmonostearat (Arlacel 129, HLB=3,2) weisen eine
sehr geringe Toxizität
(orale LD50 in Ratten > 15 g/kg) auf, werden bereits klinisch
in WIÖ-Emulsionen,
wie in Freund-Adjuvans, zur Injektion verwendet und sind für diesen Zweck
von den Zulassungsbehörden
zugelassen.
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Bevorzugt
wird das Tensid der kontinuierlichen nicht-wässrigen flüssigen Phase vor Zugabe der
Pulver-Teilchen zugesetzt.
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Arlacel
A ist eine wesentliche Komponente des sogenannten "Freund-Adjuvans", das in großem Umfang
bei der Immunisierung von Tieren verwendet wird, um maximale Titer
von Serum-Antikörpern
zu erzeugen. (Literatur: Handbook of Experimental Immunology, 4.
Auflage, Hg. D.M. Weir, Mitherausgeber L. Herzenberg und L. Herzenberg,
Band 1, S. 8.10 (1986)). Das Freund-Adjuvans ist im Grunde eine
feine Wasser-in-Öl-Emulsion,
in der das Antigen in der diskontinuierlichen Wasserphase gelöst ist,
während
die kontinuierliche Phase aus leichtem Paraffinöl als Reservoir wirkt, aus
dem das Antigen langsam freigesetzt wird. Komplettes Freund-Adjuvans
enthält
auch durch Wärme
abgetötetes Mycobakterium
tuberculosis, das eine heftige Entzündung hervorruft, was die Reaktivität des Immunsystems
erhöht.
Dies schließt
seine Verwendung beim Menschen aus.
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Ein
Hauptunterschied zwischen einer feinen Wasser-in-Öl-Emulsion
wie dem Freund-Adjuvans und den hierin beschriebenen monodispersen
Glas-in-Öl-Suspensionen ist
die relativ geringe Dispergierungsenergie, die erforderlich ist,
um die letztgenannten zu erzeugen. Während die Dispergierung der
wässrigen
Phase als feine Tröpfchen
in einer WIÖ-Emulsion
ein längeres
und heftiges Mischen erfordert (ein Hochgeschwindigkeits-Homogenisator
wird verwendet, um Freund-Adjuvans
zu erzeugen, und wird gewöhnlich über 15 bis
30 Minuten bei einer Spitzengeschwindigkeit von > 18.000 U/min betrieben, bevor eine stabile
Emulsion erzielt wird), erfordern die hierin beschriebenen stabilen
Suspensionen nur die Zugabe des fein gepulverten Arzneistoffs zu
dem Öl/Tensid-Grundmaterial
und ein heftiges Schütteln,
um die Phasen zu mischen. Eine kurze, < 5-minütige Einwirkung eines Ultraschallbads
kann verwendet werden, um das Aufbrechen jeglicher kleiner Klumpen
sicherzustellen, die sich vor oder während der Zugabe zu der hydrophoben
Phase gebildet haben könnten.
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Die
feinen Mikrokügelchen
aus Zuckerglas sind in dem hydrophoben Lösungsmittel vollständig unlöslich, sie
sind ohne Tendenz umzukristallisieren in der Glasphase stabil, und
die stabilisierten Moleküle
in fester Lösung
in den Glaskugeln sind ebenfalls stabil.
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Ein
signifikanter Nachteil von Pulvern, die durch herkömmliche
Sprühtrocknungs-Technik erzeugt werden,
ist die große
Schwankung der üblicherweise
erzeugten Teilchengröße. Weiter
haben herkömmliche Sprühtrockner
große
Schwierigkeiten bei der Erzeugung von Teilchen mit einem mittleren
Durchmesser, der signifikant kleiner als 5–10 μm ist. Teilchen dieser Größe setzen
sich schnell in Flüssigkeiten
niedriger Viskosität
ab. Dies kann zu einer großen
Schwankung in der Dosisverteilung innerhalb des Fläschchens
und zu einem Erfordernis für
ein häufiges
und heftiges Schütteln
zur Resuspendierung der Teilchen führen. Teilchen aus Zuckerglas
mit einem Durchmesser von etwa 0,1 bis 1 μm wären besser, da sie durch normale
thermodynamische Kräfte,
wie die Brownsche Bewegung, in gleichmäßiger Suspension gehalten werden.
Obwohl pharmazeutische Standard-Verarbeitungstechniken, wie ein
Strahlmahlen, die Größe von Pulvern
auf einen mittleren Durchmesser von etwa 1 bis 2 μm verringern
können,
ist es gewöhnlich
nicht praktikabel, weit darunter zu gehen. Ein zusätzlicher
Schritt, wie ein Strahlmahlen, würde
natürlich
die Verarbeitungskosten erhöhen.
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Wenn
Ultraschall-Vernebler anstelle von herkömmlichen Sprühdüsen verwendet
werden, ist es möglich,
eine Sprühtrocknungsvorrichtung
zu modifizieren, so dass sie kleine und sehr gleichförmige Mikrokügelchen
liefert. Es scheint kein Grund vorzuliegen, warum dieses Verfahren
nicht an die sterile Verarbeitung von stabilisierten Impfstoffen
in großen
Mengen angepasst werden sollte. Ein Nachteil der Verringerung der
Teilchengröße auf Submikrometer-Abmessungen
in Luft oder einer kontinuierlichen Phase irgendeines anderen Gases
sind die Materialverluste, denen man häufig wegen der Schwierigkeit
der Abtrennung der feinen Teilchen aus dem Gasstrom begegnet. Alternativ
ist eine pharmazeutische Standard-Hochdruck-Mikrohomogenisierungsausrüstung, wie
der Microfluidizer (Constant Systems Inc.), der in großem Umfang
verwendet wird, um sterile, stabile Mikroemulsionen zu erzeugen,
auch bei der Erzeugung von stabilen Mikrosuspensionen durch Verringerung
der mittleren Teilchengröße, die
in der kontinuierlichen flüssigen
Phase suspendiert sind, wirksam. Dieses Verfahren ergibt eine praktisch
vollständige
Material-Zurückgewinnung
und ist wahrscheinlich das Verfahren der Wahl, insbesondere bei
seltenen oder teuren Wirkstoffen. Eine einzige Stufe wie diese könnte preiswert
in das Produktionsverfahren integriert werden, da die Produktionskosten
bei etwa $ 1.000 pro Kilogramm Pulver liegen. Dieses würde etwa
20.000 Dosen eines Standard-Kinderimpfstoffes, wie DTP, enthalten,
was 5 Cent zu den Kosten jeder Dosis hinzufügen würde. Da die Verluste der derzeitigen
instabilen Impfstoffe vor Ort 50 % bis 90 betragen können, selbst
bei einer teuren Kühlkette
(Kühlung)
vor Ort, würden
die zusätzlichen
Kosten von stabilen flüssigen
Impfstoffen, die ohne Kühlkette
auskommen könnten,
schnell wieder eingebracht werden.
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Zusammenfassung
der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Erzeugung von stabilen
Teilchen-in-Flüssigkeit (PIL)-Formulierungen
zusammen mit den Produkten der Verfahren bereit. Die Teilchen liegen
in feiner pulverförmiger
Form vor, wobei sie bevorzugt Mikroteilchen mit einem Durchmesser
von 10 Mikrometer oder weniger, am bevorzugtesten 1 Mikrometer oder
weniger sind. Vorzugsweise zeigen die Teilchen keine große Schwankung
der Teilchengröße. Die
Teilchen sind im Wesentlichen trocken mit einem sehr niedrigen Wassergehalt
von weniger als etwa 1 %. Die Teilchen können ein oder mehrere biomolekulare
Produkte enthalten und können andere
Additive, Hilfsstoffe und dergleichen enthalten. Das biomolekulare
Produkt ist bevorzugt ein Arzneistoff oder ein anderer biologisch
aktiver Bestandteil, wie ein Protein, Antikörper, Enzym (z.B. Restriktionsendonuklease)
und dergleichen, schließt
aber nicht andere biologische Materialien (z.B. Nahrungsmittel,
Färbemittel, Getränke und
dergleichen) aus. Die Teilchen sind in einer nicht-wässrigen
Flüssigkeit
suspendiert, in der sie unlöslich
sind.
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Gemäß der Erfindung
wird eine Formulierung aus feinen trockenen Pulver-Teilchen bereitgestellt,
die ein biomolekulares Produkt umfassen, wobei die Teilchen eine
monodisperse Suspension in einer kontinuierlichen Phase aus einer
biokompatiblen nicht-wässrigen
Flüssigkeit
darstellen, in der die Teilchen nicht löslich sind, wobei die kontinuierliche
Phase ein lipidlösliches
Tensid mit niedrigem HLB einschließen kann.
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Die
Suspensionsformulierung kann zum Beispiel etwa 1 % bis mehr als
50 %, z.B. 10 %, teilchenförmiges
Produkt enthalten, obwohl eine Beladung mit mehr oder weniger bevorzugt
sein kann, abhängig
von der gewählten
Anwendung und den gewählten
Bestandteilen der Mischung.
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Die
Teilchen umfassen Moleküle
des Produkts in einem Zuckerglas oder bestehen aus solchen. Das Produkt
in dem Zuckerglas liegt entweder in stabiler fester Lösung vor
oder liegt selbst in Suspension in dem Zuckergas vor. Bevorzugt
ist das Zuckerglas aus Trehalose gebildet.
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In
dieser Anmeldung ist der Ausdruck "Zucker" so zu verstehen, dass er nicht nur
Disaccharid-Zucker, wie Trehalose, sondern auch Monosaccharid-Zucker
und deren nicht-reduzierenden Derivate, wie Zuckeralkohole, einschließlich Mannit,
Inosit, Xylit, Ribit und dergleichen, abdeckt, welche eine allgemeine
Klasse von stabilisierenden glasbildenden Zuckern und Zucker-Derivaten
bilden. Der Ausdruck "Zuckerglas" ist so zu verstehen,
dass er nicht nur Gläser
abdeckt, die leicht und rasch in einer wässrigen Umgebung gelöst werden,
wie Trehalose-Glas, sondern auch Zuckergläser, in denen das Zucker-Molekül durch
das Anbringen einer oder mehrerer hydrophober Seitenketten modifiziert
worden ist, um das Glas in Körperflüssigkeiten
langsamer löslich
zu machen als der native Zucker, um eine gesteuerte Freisetzung
eines biomolekularen Produkts zu ergeben.
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Wenn
die Formulierung für
eine medizinische Verwendung, zum Beispiel als Injektions-Formulierung, bestimmt
ist, muss die nicht-wässrige
Flüssigkeit
der kontinuierlichen Phase biokompatibel sein. Diese flüssige Phase
kann ein injizierbares hydrophobes Lösungsmittel oder ein mit Wasser
mischbares nichtwässriges
Lösungsmittel
sein. Da eine Zuckerglas-Stabilisierung des biomolekularen Produkts
verwendet wird, ist es klar, dass die nicht-wässrige Flüssigkeit ein Nicht-Lösungsmittel
für Zucker
sein muss. Zum Beispiel könnte
jedes nicht-wässrige
nicht-toxische Öl,
das für
die parenterale Verwendung zugelassen ist, in der Erfindung verwendet
werden. Ein niedrigviskoses Öl,
wie Ethyloleat, ist geeignet und weist den Vorteil auf, dass es
leicht zu injizieren ist. Mit Wasser mischbare nicht-wässrige Lösungsmittel
umfassen Glycerol, Ethylenglycol, Propylenglycol, Propylenoxid,
Polypropylenglycol.
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Das
lipidlösliche
Tensid weist ein niedriges oder sehr niedriges HLB auf. Der Fachmann
erkennt leicht, dass die Bedeutung dieser allgemeinen Ausdrücke, insbesondere
im Zusammenhang mit den HLB-Werten, die in der beigefügten Beschreibung
angegeben werden, bevorzugte Beispiele von Tensiden mit niedrigem HLB
betrifft. Es ist ein besonders überraschender
Aspekt der vorliegenden Erfindung, dass ein Tensid, das vom kommerziellen
Hersteller speziell für
die Stabilisierung von Wasser-in-Öl-Emulsionen entwickelt wurde, überhaupt
irgendeine Aktivität
oder Nützlichkeit
bei der Formulierung eines im Wesentlichen wasserfreien Präparats aufweisen
würde.
Die Tenside umfassen Sorbitansesquioleat, Mannidmonooleat, Sorbitantristearat
und Glycerolmonostearat und Lecithin (Phosphatidylcholin) und auch
Dipalmitoylphosphatidylcholin, Distearoylphosphatidylcholin und
Dimyristoylphosphatidylcholin als Beispiele von normalen Körper-Komponenten
mit Tensid-Wirkung, die vorteilhaft in dieser Technologie verwendet
werden; auch die synthetischen und bereits zugelassenen Tenside,
wie Sorbitanlaurat, -palmitat, -stearat und -oleat.
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Dank
der Erfindung ist es möglich,
ein stabiles Teilchen in flüssigen
Formulierungen zu erzeugen, in denen feines trockenes Pulver glatt
als stabile monodisperse Suspension verteilt ist. Der Fachmann erkennt leicht,
dass derartige monodisperse Suspensionen direkt entweder mittels
Spritze und Nadel oder mittels Flüssigkeitsstrahl-Injektor injiziert
werden könnten.
Die Formulierungen können
als solche injiziert werden, ohne eine Rekonstitution mit Lösungsmittel
vor der Injektion zu erfordern. Dies ist ein klarer Vorteil, wenn
die Bereitstellung von sterilen Bedingungen und sterilen Rekonstitionslösungsmitteln
und/oder -puffern problematisch ist. Die Teilchen in den flüssigen Formulierungen
sind stabil, und dementsprechend ist es möglich, ohne das Erfordernis
für eine
Kühlung
auszukommen.
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Feste
Lösungen
von wasserfreiem Arzneistoff, der in Zuckerglas in feiner teilchenförmiger Form
stabilisiert ist, sind leicht hydratisierbar. Es ist ein besonderer
weiterer Vorteil der vorliegenden Erfindung, dass biokompatible
Formulierungen direkt in einen Empfänger injiziert werden können, mit
dem Effekt, dass die normale physiologische wässrige Umgebung den Arzneistoff
in situ hydratisieren wird. Man kann leicht erkennen, dass eine
stabile, Temperaturunempfindliche, direkt injizierbare Arzneistoff-Formulierung
ein sehr großes
Potential in Impfprogrammen und für eine umfangreiche prophylaktische
oder therapeutische Arzneistoff-Verabreichung aufweist.
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Die
Formulierungen der Erfindung können
auch für
Diagnostika und Reagenzien verwendet werden, wenn die nicht-wässrige Flüssigkeit
wasserlöslich
oder mit Wasser mischbar ist. Eine Flüssigkeitsabgabevorrichtung
kann dann instabile diagnostische Reagenzien ohne Kühlung lagern
und sie in Testsysteme abgeben, die auf Wasser basieren, wie Immunoassays,
Diagnostika auf der Basis von DNA-Sonden, PCR-Reaktionen und dergleichen.
Beim Kontakt mit Wasser in dem diagnostischen System löst sich
das fein gepulverte diagnostische Reagens in dem nicht-wässrigen
Vehikel sofort, und das Reagens wird voll aktiv. Als Beispiel kann dieses
Verfahren für
Restriktionsenzyme verwendet werden, welche zum Verdau von DNA an
spezifischen Sequenzstellen verwendet werden.
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Die
Teilchen in einem speziellen Präparat
mit kontinuierlicher Phase können
von mehr als einer Art sein, die rasch miteinander reagieren, wenn
sie in Wasser freigesetzt werden. Das Beispiel, das wir angeben, ist
alkalische Phosphatase in einem Teilchen und p-Nitrophenylphosphat
(deren Substrat) in dem anderen. Diese könnten ebenso leicht zwei Prodrug-Komponenten
sein, die wechselwirken müssen,
um einen aktiven Arzneistoff aus zwei Prodrugs zu erzeugen. Es könnten auch
mehrere verschiedene Teilchen vorliegen, wie die einzelnen Komponenten
eines polyvalenten Impfstoffs. Diese gehen keine zerstörerischen
Wechselwirkungen in dem Öl
ein, und sie haben keine Zeit wechselzuwirken, wenn sie im Körper rehydratisiert
werden, da sie vom Injektionspunkt absorbiert und zu ihrer Wirkungsstelle
transportiert werden.
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In
dem Restriktionsenzym-Beispiel können
wir mehrere Reagenzien in getrennten Teilchen für komplexe Molekularbiologie-Techniken
verwenden, wie die Komponenten der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) oder
von Sequenzierungsreaktionen. In der erstgenannten würde ein
Teilchen die DNA-Polymerase enthalten, eines würde einen Primer enthalten,
und das dritte würde
den anderen Primer enthalten, und ein viertes könnte die Nukleotide enthalten.
In einer Sequenzierungsreaktion könnte die DNA-Polymerase in
einem Teilchen und die Nukleotide und die Ketten-terminierenden
Desoxynukleotide könnten
in einem anderen vorliegen. Es ist klar, dass die Fähigkeit,
verschiedene Reagenzien in nicht wechselwirkenden Teilchen in dem Öl zu mischen, viele
Möglichkeiten
für den
Bau von leistungsfähigen
und zweckmäßigen Kits
ermöglicht.
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Kurze Beschreibung
der Figuren
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1 zeigt
die zeitabhängige
Aktivität
von gefriergetrockneter alkalischer Phosphatase bei 37°C, 4°C und –20°C;
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die 2 und 3 zeigen
die Aktivität
von trockenem Pulver oder Öl-Suspensions-Formulierungen von
Trehalose-stabilisierter alkalischer Phosphatase bei 37°C und 55°C;
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die 4 und 5 zeigen
die Aktivität
von gefriergetrocknetem und Trehalose-stabilisiertem trockenem Pulver oder Öl-Suspensionsformulierungen
von rekombinantem EPO bei 37°C
und 55°C;
und
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die 6, 7 und 8 zeigen
die Aktivität
von gefriergetrocknetem und Trehalose-stabilisiertem trockenem Pulver oder Öl-Suspensionsformulierungen
von EcoRI bei 4°C,
37°C und
55°C.
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Beispiele
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Beispiel 1 Alkalische
Phosphatase
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Das
Enzym alkalische Phosphatase aus Rinder-Eingeweideschleimhaut EC
Nummer 3.1.3.1 (Sigma-Aldrich Co. Ltd. p8647) wird gewöhnlich als
gefriergetrocknetes Pulver erhalten. Dies erfordert eine wasserfreie
Lagerung in einem Gefrierschrank bei <0°C,
um die Aktivität
des Enzyms zu konservieren. Selbst bei dieser Temperatur verliert
das gefriergetrocknete Enzym allmählich die Aktivität. Wenn
es bei höheren
Temperaturen gelagert wird, tritt ein rascherer, temperaturabhängiger Aktivitätsverlust
ein (1).
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Formulierung
und Trocknung
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Das
Enzym wurde in einem Puffer gelöst,
der zusammengesetzt war aus:
| Substanz | Konzentration |
| Trehalose | 0,6
M |
| Natriumsulfat | 0,35
M |
| Rinderserum-Albumin | 0,75
mM |
| Alkalische
Phosphatase | 40
Einheiten/ml |
| Zinkchlorid | 1
mM |
| Magnesiumchlorid | 1
mM |
und in einem Labplant SD1-Sprühtrockner getrocknet. Die Trocknungsbedingungen
waren: Einlasstemperatur 135°C,
Auslasstemperatur 80°C,
mit maximalem Luftstrom. Der Restwassergehalt des Glaspulvers am
Ende dieses Verfahrens wurde mittels Thermogravimetrieanalyse (TGA)
in einer Seiko SSC/5200-Maschine (Seiko Instruments Inc.) als 2
% gemessen.
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Lagerung
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Aliquoten
von 100 mg des Pulvers wurden in 5 ml-Impfstofffläschchen
abgewogen und unter Vakuum verschlossen. Andere Aliquoten wurden
in Fläschchen
abgewogen und in Ethyloleat pharmazeutischer Güte (Croda Chemical Company
Ltd.) bei einer Konzentration von 200 mg/ml Öl resuspendiert. Diese Fläschchen wurden
ebenfalls unter Vakuum verschlossen. Proben von sowohl dem trockenen
Pulver als auch der Ölsuspension
wurden dann über
verschiedene Zeitspannen bei entweder 37°C oder 55°C gelagert.
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Assay
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Am
Ende der Lagerzeitspanne wurden 5 ml-Volumina Puffer der folgenden
Zusammensetzung, eingestellt auf pH 10,0 mit Natriumhydroxid-Lösung,
| Substanz | Konzentration |
| Glycin | 100
mM |
| Zinkchlorid | 1
mM |
| Magnesiumchlorid | 1
mM |
dazugegeben, und die Fläschchen wurden 10 min bei 3.500
U/min in einer IEC Centra 413-Zentrifuge zentrifugiert. Dies hatte
die Wirkung, dass die das Enzym enthaltenden Glasteilchen durch
die Öl-Wasser-Grenzfläche überführt wurden
und in dem Puffer gelöst
wurden, um das verbleibende Enzym zurückzugewinnen. Die Menge an
zurückgewonnenem
Enzym war identisch, unabhängig
davon, ob die Fläschchen
heftig nach der Zugabe des wässrigen
Puffers geschüttelt
wurden oder nicht. Die Aktivität
wurde unter Verwendung eines kinetischen Verfahrens zur Bestimmung
von "Glycin-Einheiten" (Sigma-Aldrich Co.
Ltd.) mit einem Shimadzu UV-160A-Spektrophotometer bei 37°C unter Verwendung
von p-Nitrophenylphosphat-Substrat und Messen der Farbentwicklung
bei einer Wellenlänge
von 405 nm gemessen.
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Ergebnisse
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Bei
einer Lagerung bei 37°C
gab es keinen Verlust an Enzymaktivität über 84 Tage Lagerung, weder bei
dem trockenen Pulver noch bei der Ölsuspension (2).
Bei einer Lagerung bei 55°C
gab es innerhalb der ersten 7 Tage einen leichten Verlust, aber über 90 %
der Aktivität
waren bis zu 84 Tage stabil (3). Wann immer
ein Unterschied zwischen der Öl-
und Pulver-Probe auftrat, war die Erstgenannte besser, aber der
Unterschied war nicht signifikant. Es wurden im Wesentlichen identische
Ergebnisse erhalten, unabhängig
davon, ob Mineralöl
oder Ethyloleat als kontinuierliche Phase verwendet wurde.
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In
anderen Experimenten wurde die Sprühtrocknung unter Verwendung
anderer Puffer-Zusammensetzungen vorgenommen, die Calciumlactat
anstelle von Natriumsulfat oder Mannit anstelle von Trehalose enthielten.
Diese ergaben im Wesentlichen ähnliche
Ergebnisse. Die guten Ergebnisse mit glasbildenden Puffern auf Mannit-Basis
waren besonders überraschend,
da früher
offenbarte Arbeiten angeführt
hatten, dass es nicht möglich
war, Monosaccharid-Zuckeralkohole
als Stabilisierungsmittel zu verwenden (PCT-Anmeldung Nr. WO 91/18091 "Stabilisation of
biological macro-molecular substances and other organic compounds", Roser B.J. und
Colaco C.; US-Patent Nr. 5,621,094 "Method of Preserving Agarose Gel Structure
During Dehydration by Adding a Non reducing Glycoside of a Straight
Chain Sugar Alcohol" Roser
B. und Colaco C.; PCT-Anmeldung Nr. WO 96/05809 "Improved method for stabilisation of
biological substances during drying and subsequent storage and compositions
thereof" Colaco
C., Roser B.J. und Sen S.). Dies ist klar nicht der Fall, vorausgesetzt, dass
die Formulierung und Trocknungstechnik derart ist, dass sichergestellt
ist, dass ein gutes Glas gebildet wird.
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Als
Anzeige für
die Inertheit und Stabilität
der in den Glaspulver in Suspension getrockneten Wirkstoffe wurden
Mischungen von Pulvern, die alkalische Phosphatase enthielten – und Pulver,
die p-Nitrophenylphosphat enthielten – in Mineralöl hergestellt
und 7 Tage bei 55°C
gelagert. Diese Suspensionen erschienen am Ende dieser Zeit unverändert. Nach
Zugabe von 1 ml Wasser und Schütteln
entwickelte sich sofort eine intensive gelbe Farbe in der getrennten
wässrigen
Phase, was anzeigte, dass das Wasser sowohl das Enzym als auch das
Substrat reaktiviert hatte. Dieses Ergebnis zeigt, dass diese Präparate in
demselben Vehikel Komponenten unterbringen können, die in herkömmlichen
wässrigen
Mischungen miteinander reagieren würden. Diese Eigenschaft sollte
zum Beispiel in polyvalenten Impfstoffen von großem Wert sein. Es ist unserer
Aufmerksamkeit nicht entgangen, dass sie auch ein gutes Modellsystem
für die
Entwicklung von sogenannten "binären" Arzneistoffen ist,
bei denen die aktive End-Komponente durch eine chemische Reaktion
synthetisiert oder freigesetzt wird, die nur beginnt, wenn die Vorstufen-Moleküle durch
Körperflüssigkeiten
benetzt werden.
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Beispiel 2 Rekombinantes
humanes Erythropoietin (EPO)
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EPO
wurde als Beispiel für
ein modernes Pharmazeutikum gewählt,
das durch gentechnische Herstellung eines rekombinanten Proteins
in E. coli produziert wird.
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Gefriergetrocknetes
EPO wurde rehydratisiert und 100-fach mit einem Puffer der folgenden
Zusammensetzung:
| Substanz | Konzentration |
| Trehalose | 0,6
M |
| Natriumsulfat | 0,7
M |
| Rinderserum-Albumin | 0,75
mM |
verdünnt
und wie oben in einem Sprühtrockner
getrocknet. Das Pulver wurde zu 125 mg-Aliquoten abgewogen und bei
einer Temperatur, die mit einer Geschwindigkeit von 15 Grad pro
Stunde von 40°C
auf 80°C
anstieg, einer zweiten Trocknung unter Vakuum unterzogen und dann
entweder in einem Serumfläschchen
eingeschlossen oder in 0,5 ml Mineralöl BP resuspendiert und eingeschlossen.
Sie wurden bis zu 15 Tagen bei 37°C
oder 55°C
gelagert. Am Ende der Lagerzeitspanne wurde verbleibendes EPO mit
0,01 % BSA enthaltender Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung wie
oben extrahiert, und die verbleibende Menge im Extrakt wurde unter
Verwendung eines EPO-spezifischen Quantikine IVD-Immunoassays (R&D Systems Inc.)
gemessen.
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Innerhalb
eines Tages bei 37°C
hat frisches EPO 88 % seiner Aktivität verloren, während das
getrocknete Material, ob in Öl
suspendiert oder nicht, voll aktiv ist (4). Nach
15 Tagen gibt es einen kleinen Aktivitätsverlust, aber mehr als 90
% der Aktivität
verbleibt. Bei Lagerung bei 55°C
verliert frisches EPO >95
Aktivität
innerhalb eines Tages (5). Im Gegensatz dazu verliert
das getrocknete Material am ersten Tag keine Aktivität und 15
Tage später
können
immer noch >80 % Aktivität zurückgewonnen
werden.
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Beispiel 3 Restriktionsendonuklease
EcoRI
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Restriktionsenzyme
werden gewöhnlich
in Gefrierschränken
bei –20°C in Puffern
aufbewahrt, die 50 % Glycerol enthalten, um eine Eisbildung zu verhindern.
Selbst unter diesen Bedingungen weisen einige von ihnen eine begrenzte
Lagerzeit auf und müssen
in Intervallen ersetzt werden. Mehrere Enzyme wurden unter Verwendung
der Technik der vorliegenden Erfindung mit ähnlichen Ergebnissen getrocknet.
Die Daten bei einem Enzym, EcoRI, werden erläutert. Die Enzym-Lösung wurde 100-fach in SC-Puffer
(Colaco C.A.L.S., Sen S., Thangavelu M., Pinder S. und Roser B. "Extraordinary stability
of enzymes dried in trehalose: Simplified molecular biology." Biotechnol. 10,
1007–1011
(1992)) verdünnt.
Das getrocknete Enzym wurde wie oben in dem Sprühtrockner erzeugt, in Fläschchen
mit oder ohne Öl
eingeschlossen, und seine Stabilität wurde bei den drei Lagerungstemperaturen
4°C, 37°C und 55°C mit frischem
flüssigem
Enzym verglichen, das in Schneid-Puffer verdünnt war. Um die verbleibende
Aktivität
nach Lagerung zu bestimmen, wurde das System in der wässrigen
Phase zurückgewonnen,
wie zuvor beschrieben, mit SC-Puffer in einer 2-fachen Verdünnungreihe
verdünnt
und verwendet, um 0,5 μg
Phage lambda-DNA (Life Technologies Inc.) zu schneiden. Die Vollständigkeit
des Schneidens bei verschiedenen Verdünnungen wurde durch Auftrennung
der DNA-Fragmente mittels Agarosegel-Elektrophorese beurteilt, in
der die Banden mittels Ethidiumbromid-Färbung unter UV-Licht sichtbar
gemacht wurden. Der Titer des Enzyms wurde als die maximale Verdünnung ausgedrückt, die
ein vollständiges
Schneiden zeigte, ohne dass Teilbanden erschienen.
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Wenn
sie bei 4°C
gelagert wurden, zeigte keines der Präparate einen fortschreitenden
Aktivitätsverlust über 28 Tage.
Selbst das frische flüssige
Präparat
war bei dieser Temperatur stabil (6). Bei
37°C verlor das
frische Enzym im Wesentlichen alle Aktivität im Verlauf von 28 Tagen,
während
das getrocknete Enzym mit oder ohne zugesetztes Öl hoch aktiv war (7).
Die getrockneten Präparate
zeigten die gleiche Aktivitätszurückgewinnung
nach Lagerung bei 55°C,
während
bei dieser Temperatur das frische Enzym innerhalb von 7 Tagen vollständig inaktiv
war (8).
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Diese
Formulierungen von Restriktionsenzymen stellen einen bequemen neuen
Weg zum Schneiden von DNA bereit. Das Öl, das suspendiertes Enzym-Pulver
enthält,
wird über
eine DNA-Lösung
geschichtet, gevortext und in einer Eppendorf-Zentrifuge zentrifugiert. Die Enzym-Suspension
löst sich
in der wässrigen
Phase, welche die DNA enthält,
und beginnt bei 37°C
zu schneiden. Die Ölphase
bildet eine bequeme Dampfbarriere, welche über dem Verdau liegt, um ein
Verdampfen zu verhindern. Dieses Verfahren ist Molekularbiologen als üblicher
Teil der Polymerase-Kettenreaktionstechnik bereits geläufig. Bei
Raumtemperatur aufbewahrbare Restriktionsenzyme in einem nicht hygroskopischen
Mineralöl-Vehikel stellen ein
wertvolles und bequemes neues Produkt für die Molekularbiologie dar.