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Gegenstand
der Erfindung sind Polysaccharide und bakterielle Nukleinsäuren, die
zur Stimulation einer Immunantwort fähig sind, und insbesondere
Substrat-Materialien, die diese Immunantwort potenzieren. In spezifischen
und bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsformen
werden Fragmente mit niedrigem Molekulargewicht von längerkettigen
immunstimulierenden Polysacchariden und bakteriellen Nukleinsäuren, die nur
eine geringe Bioaktivität
aufweisen, im Vergleich zur Ausgangssubstanz, von der sie sich herleiten,
ausreichend potenziert, um auf diese Weise ihre Verwendung bei der
Substitution für
die Ausgangsverbindung zu erlauben.
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Es
ist bekannt, dass unterschiedliche Uronsäure-Polymere mit einer β1-4-glykosidischen
Verknüpfung dazu
in der Lage sind, Monozyten zur Bildung des Tumornekrosefaktors
(TNF) über
eine CD14-abhängige Weise
in der Membran zu stimulieren (Espevik et al., Eur. J. Immunol.
23: 255). Mannuronan (Poly-M) stellt das potenteste der β1-4-verknüpften Uronsäure-Polymere
bei der Induktion der Cytokin-Produktion dar. Die Cytokin-stimulatorische
Aktivität
von Mannuronan hängt
jedoch vom Molekulargewicht des Polymers ab, und eine optimale Cytokin-Induktion
wird erhalten, wenn das MG bei 50 000 oder höher liegt (Otterlie et al.,
Infect. Immun. 61: 1993, Seiten 1917–1925. Es besteht jedoch ein
scharfer Abfall der Aktivität
bei niedrigeren Molekulargewichten und bei einem Molekulargewicht
unter 10 000 g/mol geht alle nützliche
Aktivität
verloren. Obwohl bei der Injektion von Mannuronan mit hohem Molekulargewicht
in die Mäuse
keine offensichtlichen toxischen Wirkungen auftreten, ist die Verwendung
einer so kleinen wie möglichen
Polymergröße für therapeutische
Zecke dennoch wichtig, um eine vollständigere und rasche Exkretion
des injizierten Materials aus dem Körper zu fördern. Diese Anforderung steht
deshalb mit dem Wunsch, die TNF-stimulierende Aktivität zu optimieren,
in Widerspruch.
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Es
ist auch bekannt, dass Lipopolysaccharid (LPS) eine TNF-induzierende
Fähigkeit
besitzt, die von der dreidimensionalen supramolekularen Struktur
abhängt
(Rietschel et al., „Bacterial
endotoxins properties and structure of biologically active domains", Verlag Chemie,
1988, S. 1). Diese supramolekularen Strukturen hängen von der Menge und der
Verteilung der Acylketten in der Lipid A-Region von LPS ab, und
wenn Lipid A in einer kubischen oder invertierten hexagonalen Struktur
auftritt, wird eine erhöhte Cytokin-Induktion
beobachtet, wohingegen eine Lamellenstruktur keine Cytokin-Induktion
ergibt.
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LPS
als solches ist hoch toxisch, es kann aber durch alkalische Hydrolyse
zur Bildung eines detoxifizierten LPS (D-LPS), aus dem die Lipid
A-Region, bei der es sich um die Hauptursache der Toxizität handelt, entfernt
wurde, delipidiert werden. D-LPS weist jedoch nur eine geringe Fähigkeit
zur Stimulation von Monozyten zur Bildung von TNF auf, obwohl es
einen intakten Polysaccharidanteil beibehält.
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Von
anderen Gliedern der Familie der Uronsäure-Polymere ist auch bekannt,
dass sie Monozyten zur Bildung von TNF oder anderen Cytokinen stimulieren.
So besitzt zum Beispiel D-Glucuronsäure (D-Glc-A) diese Eigenschaft,
obwohl mit einer geringeren Potenz im Vergleich zu Mannuronan.
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Polysaccharide
aus Gram-negativen und Gram-positiven Bakterien, wie zum Beispiel
Lipoarabinomannan, Lipoteichonsäure
und Peptidoglykane sind auch dafür
bekannt, dass sie Cytokine induzieren.
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Ein
anderes weithin bekanntes immunstimulierendes Polysaccharid stellt
Chitosan dar.
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Es
ist jedoch zur Kenntnis zu nehmen, dass nicht alle Polysaccharide
die Fähigkeit
zur Stimulation von Monozyten besitzen.
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Bestimmte
bakterielle Nukleinsäuren
bilden eine andere Substanzkategorie mit der Fähigkeit zur Stimulation einer
Immunantwort.
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Wir
haben nunmehr erfindungsgemäß gefunden,
dass die Cytokin-induzierende Aktivität vieler immunstimulierender
Polysaccharide und bakterieller Nukleinsäuren ebenso wie die Fragmente
mit dem niedrigeren Molekulargewicht davon, durch Bindung der Polysaccharide
an die Oberflächen
eines Substrats verbessert werden kann. Diese überraschende Entdeckung hilft
nicht nur, den vorstehend besprochenen Problemen unter Verwendung
von Mannuronan und D-LPS, zum Beispiel, bei der Therapie, zu begegnen, sondern
erschließt allgemeiner
neue Therapiemöglichkeiten,
die bisher nicht zur Verfügung
standen.
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Seljelid
et al. vom Institut der Medizinischen Biologie, Universität Tromsø, Norwegen,
in Scand. J. Immunol. 25, 55–60,
(1987) offenbaren, dass Mäuse
mit β-1,3-D-Glucan
derivatisierten Mikroperlen aus Kunststoff gegen Infektionen durch
Pneumokokken und E. coli geschützt
werden. Diese und andere Wissenschaftler am Institut für Medizinische
Biologie haben in der Folge gezeigt, dass diese Schutzwirkung zumindest
teilweise durch die Stimulation der Cytokin-Freisetzung veranlasst
wird (siehe zum Beispiel Rasmussen et al., Journal of Cellular Biochemistry
(1991) 46: 60–68).
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Nippon
Geka Gakkai Zasshi, 92 (1991) 627, offenbart an Polystyren-Perlen
immobilisiertes Lipopolysaccharid (LPS) und seine Anwendung für Antitumorzwecke.
Es wurde in Erwägung
gezogen, dass an Perlen immobilisiertes LPS Killerzellen über Cytokine
induzierte.
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US-A
5171 738 offenbart LPS aus den Zellwänden Gram-negativer Bakterien,
die auf einen festen, unlöslichen
Träger
immobilisiert sind und ihre Anwendung bei der Behandlung von Tumoren.
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WO-A-97/01330
offenbart Polysaccharid-Phospholipid-Konjugate und ihre Verwendung
als mit Antigen geeignet formulierte Adjuvanzien zur Bereitstellung
von Vakzinen.
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EP-A-0
175667 offenbart eine Makrophagen-stimulatorische Zusammensetzung,
enthaltend ein wasserunlösliches β-1,3-gebundenes
Glucan und einen wasserlöslichen
Träger,
an den das Glucan immobilisiert wurde.
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EP-A-0
506 326 offenbart die Verwendung von β-1,4-Polyuronaten und ihre Verwendung
zur Cytokin-Stimulation.
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US-A-4460575
offenbart einen Vakzin-Komplex, umfassend bakterielle ribosomale
RNA oder Fragmente von bakterieller ribosomaler RNA, an die von
1 bis 5 Gew.-% eines spezifischen Antigens des Bakterientyps gekoppelt
sind.
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Gemäß der vorliegenden
Erfindung wird ein pharmazeutisch verträgliches Substratmaterial an
dessen Oberfläche,
eine Cytokin-stimulierende bioaktive Substanz, die aus der Gruppe
ausgewählt
ist, bestehend aus Polysacchariden, enthaltend von 2 bis 100 Zuckereinheiten
mit Ausnahme von β-1,3-D-Glucan,
und bakterielle Nukleinsäuren,
enthaltend von 2 bis 100 Zuckereinheiten, chemisch gebunden ist,
bereitgestellt. Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch die
Bereitstellung eines Verfahrens zur Potenzierung der Cytokin-stimulierenden
Wirkung eines immunstimulierenden Polysacharids mit Ausnahme von β-1,3-D-Glucan,
oder einer immunstimulierenden bakteriellen Nukleinsäure, worin
die genannte bioaktive Substanz mit einem Substrat dergestalt kontaktiert
wird, dass sie an eine Oberfläche
davon gebunden wird.
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Die
vorliegende Erfindung stellt einen neuen Ansatz zum Potenzieren
der Cytokin-stimulierenden
Aktivität
von Polysacchariden und bakteriellen Nukleinsäuren bereit. Insbesondere ist
unseres Wissens bisher noch nicht offenbart worden, dass Fragmente
mit niedrigerem Molekulargewicht von immunstimulierenden Polysacchariden
und bakteriellen Nukleinsäuren,
die im Vergleich zu ihrer Ausgangsverbindung nur relativ schlechte
Cytokin-stimulierende Eigenschaften aufweisen, mittels ihrer Bindung
an die Oberfläche
eines wie hierin offenbarten Substrats, ihre Aktivität auf einen
Grad erhöht
haben können,
der die Verwendung der Fragmente anstelle der Ausgangsverbindungen
erlaubt. Die Größenordnung
der Potenzierung der Cytokin-stimulierenden Aktivität, die erfindungsgemäß erreichbar
ist, wird in den nachstehenden Beispielen erläutert.
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Die
Polysaccharide und Nukleinsäuren
enthalten bevorzugt von 10–30
Zuckereinheiten. Polysaccharide, die von 2 bis zu ca. 7 Zuckereinheiten
enthalten, werden häufig
für Oligomere
(Oligosaccharide) gehalten und werden so bezeichnet.
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Obwohl
die Erfindung, wie bereits angegeben, eine besondere Anwendbarkeit
zur Potenzierung von Polysaccharid- und Nukleinsäurefragmenten aufweist, kann
sie auch zum Potenzieren der Cytokin-stimulierenden Aktivität der immunstimulierenden
Polysaccharide und bakteriellen Nukleinsäuren selbst verwendet werden.
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Nach
unseren Studien hat es den Anschein, dass die Form und Beschaffenheit
des Substrats, das als Träger
für das
aktive Polysaccharid- oder Nukleinsäurematerial verwendet wird,
nicht besonders kritisch ist. Für
einige Zwecke ist es wünschenswert,
dass das Substrat in partikulärer
Form vorliegen sollte, zum Beispiel für die intravenöse oder
subkutane Injektion, in anderen Fällen könnte das Substrat aber die
Form eines Körpers
zur Implantation in vivo annehmen. In noch anderen Fällen könnte es
sich bei dem Substrat um ein Material handeln, über das zum Beispiel eine Flüssigkeit
zur Erlangung einer Reaktion mit dem gebundenen bioaktiven Material
in Kontakt gebracht werden könnte.
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Auf ähnliche
Weise können
viele verschiedene natürliche
oder synthetische Materialien als das Substrat verwendet werden.
Es versteht sich natürlich
von selbst, dass das Substratmaterial keine unerwünschten Reaktionen
in der Umgebung, in der es verwendet werden soll, auslösen darf.
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In
den Experimenten, die in den nachstehenden Beispielen beschrieben
sind, verwendeten wir magnetisch monodisperse Polystyren-Partikel,
die durch das von Ugelstad et al. in Progress in Polymer Science, 17,
Nr. 1, 87–161
(1992), beschriebene aktive Quellungsverfahren hergestellt werden.
Epoxygruppen wurden auf die Oberfläche der Partikel eingeführt und
unterschiedliche Mengen von Aminolinkern wurden dann nach dem Verfahren
von Hermanson et al. in Immobilized Affinity Ligand Techniques,
Academic Press, New York 1992, an die Epoxy-Oberfläche gekoppelt.
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Für einige
Zwecke wird bevorzugt, dass das Substrat durch Materialien, die
in vivo absorbiert werden können,
konstituiert werden sollte. Ein weiter Bereich von bioerodierbaren
und resorbierbaren Polymeren und anderen festen Materialien sind
im Stand der Technik bekannt.
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Andere
natürliche
oder synthetische Materialien, die als das erfindungsgemäße Substrat
verwendet werden könnten,
werden sich dem Fachmann ohne weiteres selbst anbieten.
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Die
Größe der Substratpartikel
kann, abhängig
vom beabsichtigten Endgebrauch, sehr weitgehend variieren. Partikel
für die
subkutane Injektion weisen zum Beispiel eine Größe von bis zu 50 μm, bevorzugt
aber weniger als 20 μm
auf, obwohl für
die intravenöse
Injektion die Partikelgröße weniger
als 5 μm
betragen sollte. Die Gestalt der als Substratmaterial verwendeten
Partikel ist nicht kritisch.
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Die
bioaktive Polysaccharid- oder Nukleinsäurekomponente kann mit dem
Substrat auf viele verschiedene Weisen verknüpft werden. So kann ein Polysaccharid
zum Beispiel durch Kopplung über
Hydroxylgruppen (liegen in Kohlenhydraten immer vor), Carbonylgruppen,
Amingruppen (Aminozucker) und Carboxylgruppen (Uronsäuren) oder über Substituenten,
wie zum Beispiel gegebenenfalls Sulfat- oder Phosphatgruppen, kovalent
verknüpft
sein. Linker für
die kovalente Kopplung können
gegebenenfalls an eine Substratoberfläche, der es an Gruppen zum
Eingehen einer kovalenten Bindung mit der bioaktiven Komponente
an Gruppen mangelt, aufgebracht werden.
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Einige
Beispiele der hierin nützlichen
kovalenten Kopplungschemie sind wie folgt:
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Carbonyl-reaktive Chemie
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Carbonylgruppen,
entweder Aldehyde oder Keton an reduzierenden Zuckern.
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Aldehydgruppen
können
anhand der Periodat-Oxidation auch leicht eingeführt werden.
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Beispiel:
Hydrazid-Aktivierung
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Beispiel:
Reduktive Aminierung unter Verwendung von Cyanoborhydrid
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Hydroxyl-reaktive Chemie
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Beispiel:
Polysaccharide können
mit CNBr aktiviert werden, die dann leicht an jedweden Liganden,
der primäre
Amine enthält,
gekoppelt werden können.
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Beispiel:
Epoxy-aktivierte Oberflächen
reagieren mit Hydroxyl- oder Amingruppen bei hohem pH und sind für die Kohlenhydrat-Kopplung
gut geeignet.
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Carboxyl-reaktive
Chemie
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In
den nachstehenden Beispielen wird ein auf Carbodiimid basierendes
Beispiel beschrieben.
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Obwohl
die kovalente Kopplung des Polysaccharids oder der Nukleinsäure häufig bevorzugt
ist, ist es auch möglich,
die bioaktive Komponente nicht kovalent an das Substrat zu binden.
So kann die Kopplung zum Beispiel durch ionische oder hydrophobe
Interaktionen, oder mittels Biospezifität (z. B. Enzym-Substrat, Antigen-Antikörper) erreicht
werden.
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Die
Dichte des bioaktiven Polysaccharid- oder Nukleinsäurematerials,
das auf der Oberfläche
der Partikel oder von anderem Substratmaterial gebunden ist, wird
in Bezug auf die beabsichtigte Verwendung der sich ergebenden Zusammensetzung
ausgewählt.
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Im
Allgemeinen wird die Dichte im Bereich von 0,1 bis 100 ng/μm2, bevorzugt im Bereich von 0,1 bis 50 ng/μm2 liegen.
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Es
liegen einige Hinweise vor, dass für jedwedes) gegebene Polysaccharid
oder Nukleinsäure,
eine optimale Dichte vorliegen könnte,
um die maximale Cytokin-Bildung zu erreichen; weitere Arbeiten werden
jedoch zur Bestätigung
benötigt,
ob dies der Fall ist oder nicht.
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Obwohl
wir nicht wünschen,
durch Theorie gebunden sein zu wollen, deutet unsere Arbeit darauf
hin, dass wenn M-Blöcke
oder detoxifiziertes LPS, zum Beispiel an eine Substratoberfläche gebunden
sind, zahlreiche Membranrezeptoren aggregiert werden könnten, die
bei der Induktion von TFN synergistisch wirken können.
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Es
wird erwartet, dass die erfindungsgemäßen Substratmaterialien in
der Medizin viele Verwendungszwecke finden werden. So können zum
Beispiel kurze Blöcke
aus Mannuronan, die mit biologisch abbaubaren Partikeln kovalent
verknüpft
sind, als ein Immunstimulator zur Behandlung verschiedener Krankheitstypen,
wie zum Beispiel denen, bei denen Patienten von einer verbesserten
Zellimmunität
profitieren werden, durch eine erhöhte Cytokinbildung erreicht
werden.
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Die
erfindungsgemäßen Substratmaterialien
können
weiter als ein Immunstimulator zum Schutz eines sich kurz vor einem
großen
chirurgischen Eingriff befindenden Patienten vor einer Infektion
mit Gram-positiven oder Gram-negativen Bakterien verwendet werden.
Eine andere potenzielle Verwendung der vorliegenden Materialien
ist die als ein Immunstimulator zum Schutz eines Patienten, der
sich in Kürze
einer die Knochenmarkszellen schädigenden
Strahlentherapie unterziehen wird. Die Verabreichung von zum Beispiel
erfindungsgemäßen Poly-M-gebundenen
Partikeln führt
zu einer verbesserten Hämatopoese.
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Die
erfindungsgemäßen Substratmaterialien
können
auch als Targeting von Antikrebsmitteln verwendet werden. Es ist
bekannt, dass Tumorzellen Inhibitionsfaktoren für Makrophagen bilden, dies
kann aber durch die Verabreichung von zum Beispiel Poly-M-gebundenen
Partikeln, die eine stimulierende Wirkung auf Makrophagen ausüben, umgekehrt
oder gedämpft
werden.
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Partikel,
an die erfindungsgemäß Polysacharide
und bakterielle Nukleinsäuren
gebunden sind, können
zum Beispiel durch intravenöse
oder subkutane Injektion verabreicht werden. Für diesen Zweck können die
Partikel mit einem pharmazeutisch verträglichen injizierbaren Träger, zum
Beispiel einem physiologischen Puffer, formuliert werden.
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Die
Erfindung wird anhand der folgenden Beispiele erläutert.
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Materialien und Verfahren
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Poly-M
wurde aus Kolonien von Pseudomonas aeruginosa 8830 auf Agar isoliert,
die bei 18°C,
wie von Gross et al., J. Phytophatol., 1983, 118: 276, beschrieben,
gezüchtet
wurden. Mit 14C-markierte Fruktose (Amersham,
Buckinghamshire, England) wurde dem Medium als Supplement zugefügt, um das
Alginat radioaktiv zu machen. Das Material wurde durch eine wiederholte
Kombination aus einer Alkalibehandlung mit 0,2 M NaOH bei 45°C, Präzipitation
mit Ethanol und Extraktion des Präzipitats durch Ethanol und
Chloroform gereinigt. Das Polymer wurde in pyrogenfreiem Wasser
aufgelöst,
durch Membranfilter (0,22 μm;
Millipore) filtriert und lyophilisiert. Die LPS-Kontamination in
Poly-M wurde mittels dem LAL-Assay (Chromogenix AB, Mölndal, Schweden)
gemessen. Der Endotoxin-Spiegel im Polymer betrug < 0,25 ng/mg. Anhand
der 1H-NMR-Spektroskopie (Grasdalen et al.,
Carbohydr. Res. 1979, 68: 23 und Grasdalen, Carbohydr. Res. 1979,
68: 23) wurde bestimmt, dass der Gehalt der Mannuronsäure 92%
betrug, und es wurde anhand der Viskosimetrie (Scott-Geräte) bestimmt,
dass das durchschnittliche Molekulargewicht 350 000 g/mol betrug.
M-Blöcke
(94% D-ManA) wurden mittels Hydrolyse von Poly-M 1 h bei 100°C bei pH
5,6 und 1 h bei 100°C
bei pH 3,8 hergestellt. Dieses Verfahren ergab M-Blöcke mit
einem durchschnittlichen MG von 5500 und 94% D-ManA. Für einige
Experimente wurden M-Blöcke
mit einem durchschnittlichen MG von 3000 durch zusätzliche
Hydrolyse hergestellt.
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G-Blöcke (94%
L-GulA und Polymerisationsgrad, 27) wurden aus Kolonien von Azotobacter
vinelandii, der bei 37°C
mit 14C-markierter Fruktose (Skjak-Bræk et al., Carbohydr.
Res. 1982, 103: 133) gezüchtet
wurde, isoliert. Solche G-Blöcke
besitzen keine immunstimulierenden Eigenschaften.
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C60XY
(β1-4-verknüpfte Glucuronsäure [D-GlcA]
wurde durch Oxidation von Cellulose an Position C-6 (Painter, Corb.
Res. 55, 95–103,
1977) hergestellt. Es wurde anhand von intrinsischen Viskositätsmessungen bestimmt,
dass das durchschnittliche MG 30 000 betrug und der Oxidationsgrad
(88% D-Glc-A und 12% D-Glc wurde mittels Titration bestimmt (Nevell,
Methods Carbohydr. Chem. 1963, 3: 161 und Yackel et al., JACS 1942,
64: 121).
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Die
Endotoxin-Kontamination in den verschiedenen Polysacchariden wurde
anhand des Limulus-Amöbocyt-Lysat-Assays
(LAL-Assays) (Chromogenix AB, Mölndal,
Schweden) gemessen. Die bestimmten Endotoxin-Spiegel waren wie folgt:
M-Blöcke:
0,24 ng/mg; Poly-M: 0,25 ng/mg; G-Blöcke: 12,4 ng/mg; C60XY: 1,2
ng/mg.
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Lipopolysaccharid
und detoxifiziertes LPS (D-LPS) aus glatten Salmonella minnesota
wurden von Sigma erworben. D-LPS wurde durch alkalische Deacylierung
von LPS durch die Entfernung der Ester-verknüpften Fettsäuren hergestellt (Ding et al.,
J. Med. Microbiol. 1990, 31: 95).
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Die
Merkmale der Polysaccharide sind in Tabelle 1 nachstehend zusammengefasst. Tabelle
1. Merkmale der in dieser Studie verwendeten Polyuronsäuren
- *) P. a. = Pseudomonas aeruginosa
- **) A. v. = Azotobacter vinelandii
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Kovalente Kopplung von
Uronsäuren
und D-LPS an Partikel
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Magnetische
monodisperse Polystyren-Partikel (PS-Partikel) mit Epoxygruppen
(Ugelstad et al., Progress in Polymer Science, 1992, 17: 87) wurden
wie von Hermanson et al. (Immunobilized Affinity Ligand Techniques,
Academic Press 1992) beschrieben, aminiert. In einigen Experimenten
wurden hydrophile bovine Serumalbumin-Partikel (BSA, Sigma) gemäß dem von
Longo et al. (J. Pharm. Sci. 1992, 71: 1323) beschriebenen Verfahren
hergestellt. Uronsäuren
und D-LPS wurden an magnetische monodisperse oder BSA-Partikel durch Bildung
von Amidbindungen zwischen den Carbonsäure-Gruppen an den Uronsäuren und
den Gruppen primärer
Amine auf den Partikeln gekoppelt. Die Kopplung wurde in 0,1 M Phosphatpuffer,
pH 7,3, durch Zufügen von
Carbodiimid-EDC (1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid) und
Sulfo-NHS (N-Hydroxysulfosuccinimid) wie von Staros et al. (Anal.
Biochem. 1986, 156: 200) beschrieben, durchgeführt. Nach der Verknüpfung des
Polysaccharids mit den Partikeln, wurden sie gründlich in 0,1 M Phosphatpuffer,
pH 10, zur Entfernung von nicht kovalent gebundenem Polysaccharid
gewaschen. Für
einige Experimente wurden aus vernetztem bovinen Serumalbumin hergestellte
Partikel hergestellt. Die Mengen von M- und G-Blöcken, die kovalent mit den Partikeln
verknüpft
wurden, wurden durch Messen der Radioaktivität in einem β-Zähler (Packard) bestimmt. Die
Merkmale der verwendeten Partikel und die Menge von an sie gekoppelten
M-Blöcken
und G-Blöcken
sind in der nachstehenden Tabelle 2 ersichtlich. Tabelle
2. Merkmale der in dieser Studie verwendeten Perlen und die Menge
der kovalent verknüpften
M-Blöcke
und G-Blöcke
- N.B.
- = Nicht bestimmt
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Monozyten-Kultivierung
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Monozyten
wurden aus dem Buffy-coat von A+-Blut (Blutbank,
Universitätsklinik
Trondheim, Norwegen), wie von Bøyum (Scand. J. Immunol. 1976,
5: 9) beschrieben, isoliert. Die Monolayers von Monozyten in 24-Well-Kulturplatten
(Costar, Cambridge, MA) wurden in serumfreiem AIM-Medium (Gibco)
mit 1% Glutamin und 40 μm/ml
Garamycin kultiviert. Den Monozyten wurden verschiedene Partikel-
und Polysaccharid-Konzentrationen in Lösung zugefügt und die Überstände wurden 8 Stunden später geerntet
und aus der TNF-Aktivität im
WHI-Klon-13-Bioassay untersucht (Espevik et al., J. Immunol. Methods,
1986, 95: 99).
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SW480/β-gal-Kultivierung
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Zellen
von einem humanen Kolonadenokarzinom, SW480/β-gal (zur Verfügung gestellt
von Dr. Gerald Ranges, Miles Inc. West Haven, CT, USA), enthalten
ein β-Galactosidase-Gen
(β-gal-Gen))
unter Kontrolle der unmittelbar frühen Promotor/Enhancer-Region
des Cytomegalovirus (CMV) (Galloway et al., Eur. J. Immunol 1992,
22: 305). SW480/β-gal
wurden in RPMI 1640 (Gibco Laboratories, Paisley, Schottland), supplementiert mit
2 mM L-Glutamin, 10% hitzeinaktiviertem FCS (HyClone, Logon, UT,
USA) und 40 μg/ml
Garamycin (FCS-Medium), gezüchtet.
Die Stimulation mit partikulären
und löslichen
Formen von M-Blöcken
und verschiedenen Formen von LPS wurde in RPMI 1640-Medium, supplementiert
mit Glutamin, 20% humanem A+-Serum (Blutbank,
Universitätsklinik
von Trondheim, Trondheim, Norwegen) und Garamycin (A+-Medium),
durchgeführt.
Der β-Galactosidase-Assay
wurde im Wesentlichen wie zuvor beschrieben durchgeführt (Loegreid
et al., J. Biol. Chem. 1995. 270: 25418). Die Substrat-Umwandlung
wurde als optische Dichte (OD) bei 570 nm gemessen.
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TNF-Assay
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Die
TNF-Aktivität
wurde durch Messen ihrer cytotoxischen Wirkung auf die Fibrosarcoma-Zelllinie WEHI
164 Klon 13, wie von Espevik et al. (J. Immunol. Methods 1986, 95:
99) beschrieben, bestimmt. Verdünnungen
von rekombinantem humanem TNF (zur Verfügung gestellt von Dr. Refaat
Shalaby, Genentech, South San Francisco, CA) wurden als ein Standard
eingeschlossen. Die TNF-Spezifität
des Assays wurde unter Verwendung eines neutralisierenden MAk gegen
rekombinanten humanen TNF verifiziert (Liabakk et al., J. Immunol.
Methods, 1990, 134: 253). Die Ergebnisse werden als pg/ml ± SD für Dreifachbestimmungen
vorgelegt.
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Beispiel 1
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Der
Zweck dieses Experiments war das Testen, ob die TNF-induzierende
Potenz von Poly-M durch seine Form beeinflusst wurde.
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Radiomarkiertes
Poly-M mit einem MG von 350 000 wurde mittels Säurehydrolyse durch das vorstehend
beschriebene Verfahren abgebaut, um Polysaccharid-Fragmente (M-Blöcke) mit
einem MG von 5,5 kD zu erhalten. Die sich ergebenden M-Blöcke wurden
durch das vorstehend beschriebene Verfahren mit den beiden Typen
von Polystyren-Partikeln, nämlich
PS 2 und PS 3 kovalent verknüpft
(siehe Tabelle 2 vorstehend).
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Die
TNF-induzierende Potenz der beiden Partikel-gebundenen M-Blöcke wurde
dann durch den vorstehend beschriebenen TNF-Assay bestimmt und mit
dem der nicht verknüpften
M-Blöcke
und auch mit nicht hydrolysiertem Poly-M in phosphatgepufferter
Kochsalzlösung
verglichen. Die Ergebnisse sind in 1A ersichtlich.
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Wie
aus 1A hervorgeht, reduzierte die Reduktion der Polymergröße auf 5,5
kD die TNF-induzierende Potenz um einen Faktor von 10–100. Die
kovalente Verknüpfung
der M-Blöcke
von 5,5 kD mit PS 2- oder PS 3-Partikeln führte jedoch im Vergleich zu
den löslichen
M-Blöcken
zu einer 2500- bzw. 60 000fachen Erhöhung der TNF-induzierenden
Potenz. Im Vergleich zu Poly-M in Lösung potenzierte auch die Verknüpfung von M-Blöcken mit
Partikeln die TNF-Response.
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Das
Experiment wurde wiederholt, wobei aber die Aminogruppen an den
Partikeln durch Carboxylgruppen substituiert wurden. Es wurde festgestellt,
dass diese Substitution die TNF-Freisetzung aus Monozyten nicht änderte.
Dies deutet folglich darauf hin, dass die stimulatorische Wirkung
von mit Partikeln verknüpften
M-Blöcken
nicht durch eine negative Nettoladung an den Partikeln oder eine
nicht spezifische Reaktion aufgrund des Kopplungsverfahrens verursacht
wurde.
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Vergleichsbeispiel 1
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Beispiel
1 wurde wiederholt, wobei aber die G-Blöcke von 5,5 kD, wie vorstehend
beschrieben, hergestellt wurden. Die Ergebnisse sind in 1B ersichtlich.
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In 1B ist
ersichtlich, dass G-Blöcke
in Lösung
oder mit PS 2-Partikeln verknüpft,
nicht die Monozyten zur Bildung von TNF induzieren.
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Dieses
Experiment weist darauf hin, dass die Bindung eines inhärent keine
Fähigkeit
zum Stimulieren einer Immunantwort aufweisenden Polysaccharids an
ein Substrat, keine Wirkung auf dieses Merkmal der Substanz besitzt.
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Beispiel 2
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Der
TNF-Assay wurde an LPS und detoxifiziertem LPS (die beide von Sigma
bezogen wurden) wiederholt. Die Reagenzien wurden als Lösungen zugefügt. Wie
in Beispiel 1 wurden M-Blöcke
als Kontrolle verwendet.
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Wie
in 2A ersichtlich ist, wurde festgestellt, dass das
detoxifizierte LPS (D-LPS) bis zu 1 μg/ml die Monozyten zur Bildung
von TNF nicht induzierte, wohingegen das unbehandelte LPS eine starke
TNF-Response ergab, wenn auf Monozyten in Lösung unter serumfreier Bedingung
getestet wurde.
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Wenn
das D-LPS erfindungsgemäß jedoch
kovalent mit PS 1-Partikeln verknüpft wurde (siehe Tabelle 2
vorstehend) und der TNF-Assay wiederholt wurde, wurde festgestellt,
dass im Vergleich mit den Partikeln des M-Blocks von Beispiel 1
(2B) eine starke Bildung von TNF stattfand.
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Da
die Molekulargewichte von M-Blöcken
und dem D-LPS vergleichbar sind, und da das D-LPS auch mit den Partikeln
durch Aminbindungen verknüpft
war, deutet dies darauf hin, dass die Menge von gebundenem D-LPS
gleich oder weniger als die Menge der an die Partikel gebundenen
M-Blöcke
ist. Die Daten zeigen folglich, dass Fragmente mit niedrigerem MG
aus Polysacchariden sehr potente TNF-Induktoren darstellen, wenn
sie auf Monozyten auf der Oberfläche
von Partikeln gerichtet werden.
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Vergleichsbeispiel 2
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Die
SW480-βgal-Zellen
exprimieren nicht CD14 in der funktionellen Membran, sondern reagieren
auf LPS in Gegenwart von Serum. Es war deshalb von Interesse zu
untersuchen, ob D-LPS oder M-Blöcke,
erfindungsgemäß entweder
in Lösung
oder mit Partikeln verknüpft,
zur Aktivierung dieser Zellen fähig
waren. Wie von 3A ersichtlich ist, ergab das
komplette LPS eine starke und dosisabhängige Aktivierung des humanen CMV-Promotors
in den SW480-βgal-Zellen,
wohingegen D-LPS oder M-Blöcke
in Lösung
keinen stimulatorischen Effekt aufwiesen. Der M-Block und das D-LPS,
die an PS 1-Polystyren-Partikel gebunden waren, wiesen außerdem keine
stimulatorische Wirkung auf diesen Zelltyp auf (3B).
Diese Daten deuten darauf hin, dass M-Block- und D-LPS-Partikel
eine Präferenz
bei der Stimulation CD14-positiver Monozyten in der Membran und
keine LPS-responsiven Zellen aufweisen, denen CD14 in der Membran
mangelt.
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Beispiel 3
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Der
TNF-Assay wurde mit einem anderen Glied der Uronsäure-Familie,
D-Glucuronsäure-Polymer (D-GlcA-Polymer)
wiederholt. Von solchen Polymeren ist bekannt, dass sie Monozyten
zur Bildung von TNF in einer CD14-abhängigen Weise, obwohl mit weniger
Potenz im Vergleich zu Poly-M, stimulieren.
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Ein
aus 88% D-GlcA und 12% D-Glc und mit einem MG von 30 000 bestehendes
Polymer wurde durch Oxidation der Cellulose mittels des vorstehend
beschriebenen Verfahrens hergestellt.
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Der
TNF-Assay wurde erfindungsgemäß sowohl
am D-GlcA-Polymer in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (1–2 ml/mg)
als auch am kovalent an PS 2-Partikel gebundenen Polymer durchgeführt. Die
Ergebnisse sind grafisch in 4 dargestellt.
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Es
wird zur Kenntnis genommen werden, dass das D-GlcA-Polymer in Lösung zu
einer geringen TNF-Bildung führte.
Das an die PS 2-Polystyren-Partikel gebundene D-GlcA zeigte jedoch
eine deutliche Zunahme der TNF-Bildung.
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In 4 sind
die Ergebnisse für
die M-Blöcke
für Vergleichszwecke
gezeigt.
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Beispiel 4
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Der
Zweck dieses Experiments bestand im Testen, ob die TNF-stimulierende
Aktivität
durch Mannuronan-Fragmente von sehr niedrigem Molekulargewicht gezeigt
würde,
wenn sie erfindungsgemäß kovalent an
bioabsorbierbare Partikel gebunden wären.
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Der
TNF-Assay wurde deshalb an M-Blöcken
mit einem MG von ca. 3 000, die wie hierin vorstehend hergestellt
wurden, wiederholt. Das sich ergebende Oligomer mit niedrigem Molekulargewicht
wurde mittels des vorstehend beschriebenen Verfahrens an BSA-Partikel
(siehe Tabelle 2 vorstehend) kovalent gebunden. Die Ergebnisse des
TNF-Assays auf das Partikel-gebundene Oligomer sind in 5 ersichtlich.
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Aus 5 wird
ersichtlich sein, dass das Zufügen
löslicher
M-Blöcke
zu Monozyten selbst bei einer Konzentration von 100 μg/ml nicht
zur Bildung von TNF führte.
Das Zufügen
von erfindungsgemäßen M-Block-BSA-Partikeln
führte
jedoch zu mehr als 1 ng/ml TNF bei einer 0,02 μg/ml entsprechenden Polymer-Konzentration.
Selbst bei einer 0,004 μg/ml
entsprechenden Polymer-Konzentration trat eine signifikante TNF-Bildung
auf.
