DE69830900T2

DE69830900T2 - Immunologische toleranz-induzierende zusammensetzungen enthaltend antigen und mucosabindungskomponente

Info

Publication number: DE69830900T2
Application number: DE69830900T
Authority: DE
Inventors: Sten Jacob PETERSEN
Original assignee: Triotol AB; TRIOTOL VAESTRA FROELUNDA AB
Current assignee: TRIOTOL AB, VäSTRA FRöLUNDA, SE
Priority date: 1997-04-23
Filing date: 1998-04-23
Publication date: 2006-05-24
Anticipated expiration: 2018-04-24
Also published as: US7097845B2; US20020119159A1; EP0977586B1; AU7161098A; JP2001523249A; ATE299711T1; WO1998047529A1; DE69830900D1; EP0977586A1; DK0977586T3

Description

TECHNISCHES GEBIET
Diese Erfindung bezieht sich allgemein auf das Gebiet der oralen Tolerisierung ("tolerization"). Spezieller stellt sie Produkte und Verfahren zum Behandeln von Diabetes und anderen Zuständen bereit, die eine ungewünschte Immunantwort durch spezifisches Inhibieren der immunologischen Reaktivität einschließen, die zu den pathologischen Wirkungen des Zustands beiträgt.
HINTERGRUND
Es besteht ein zunehmendes Bewusstsein, dass viele menschliche Krankheiten in Bezug zu einer Fehlausrichtung des Immunsystems gegenüber den Bedürfnissen des Wirts stehen. Das Versagen, pathogene Mikroorganismen zu eliminieren, rührt oft von einer Immunhyporeaktivität oder inadäquaten Effektorwirkung her. Andererseits rührt Gewebezerstörung in der Abwesenheit eines eindringenden Organismus oft von einer Immun-Überempfindlichkeit auf ein Antigen her. Arzneimittel auf der Basis kleiner Moleküle, die starke nicht-spezifische Immunverstärker oder -suppressiva sind, sind entwickelt worden. Aber sie sind stumpfe Instrumente, für das was wirklich erforderlich ist – eine fokussierte Modulation der Immunreaktivität gegen wenige ausgewählte Zielmoleküle.
Eine der Herausforderungen bei der Hinwendung auf diese Frage ist es, die Unterschiede in den zugrunde liegenden Mechanismen der Immunogenität und Immunotoleranz zu verstehen: der Aufwärts- bzw. Abwärtsmodulation der immunologischen Reaktivität. In bestimmten Kontexten schließen beide Typen der Modulation ein induzierendes Antigen in einer komplexen Wechselwirkung mit Antigen-präsentierenden Zellen und T-Zellen ein.
Das Mucosa-Immunsystem ist mehr auf eine Nicht-Reagibilität und ein Tolerant-Machen eines fremden Antigens gerichtet als das systemische Immunsystem. Die Reaktion gegen alle Fremdsubstanzen in der Nahrung würde die Ressourcen des Systems eindeutig erschöpfen. Die Mechanismen, die die Reagibilität dämpfen, schließen die Clearance von Nahrungsmittelantigenen aus dem Pfortaderkreislauf durch Kupfer-Zellen und die Probenahme von Antigenen durch M-Zellen der Peyer'schen Plaques und reifen Enterozyten zur Präsentation gegenüber dem Immunsystem in einem tolerogenen Kontext ein. Lymphozyten und andere Zellen, die am Mucosa-Immunsystem beteiligt sind, scheiden ein unterschiedliches Spektrum von Zytokinen ab und tragen ein unterschiedliches Spektrum von Oberflächenmarkern ihrer Gegenstücke in dem systemischen Immunsystem.
Das Muscosa-Immunsystem ist den verschiedenen Mucosaflächen gemein, einschließen dem Bronchus, der Brust und dem Darm (Bienenstock et al., Adv. Exp. Med. Biol. 107:53, 1978). Im Gegensatz dazu sind das Mucosa- und das systemische Immunsystem voneinander getrennt. Die tolerogene Antwort im Darm schließt die regulatorischen TGF-β-, IL-4- und IFN-γ-abscheidenden T-Zellen ein (Leonilda et al., Cell. Immunol. 157:439, 1994; Zeng-Yu et al., Cellular Immunol. 157:353, 1994). Die Zellen in dem efferenten Gefäß der mesenteralen Lymphknoten kehren bevorzugt zurück ("home back") zur Mucosa, wohingegen die Zellen in dem efferenten Gefäß der peripheren Knoten bevorzugt zur Peripherie zurückkehren ("home back"). Nichtsdestoweniger gibt es genügend Überschneidung bzw. Austausch zwischen den Systemen, so dass eine Antwort, die im Darm ausgelöst wird, mit dem systemischen Kompartement geteilt wird. Daher induziert die Sabin-Polio-Impfung Schutz gegen Polio sowohl an der Mucosa-Oberfläche als auch im Blutkreislauf. Toleranz, die gegenüber verschiedenen Antigenen, die im Darm präsentiert werden, induziert wird, kann zu einer systemischen Nicht-Reagibilität gegenüber jenen Antigenen führen.
Anstrengungen wurden unternommen, um einen Vorteil aus der Mucosaausrichtung auf Toleranz hin als eine Art Therapie für spezifische immunologische Herunterregulation zu ziehen. Für einen Überblick über das Gebiet siehe Thompson et al. (Immunol. Today 11:197,1990); Weiner (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:10762, 1994); MacDonald (Curr. Biol. 4:178, 1994); und Weiner et al. (Annu. Rev. Immunol. 12:809, 1994). Allgemein bestand die Vorgehensweise darin, ein Antigen in den Dünndarm von Tieren mit abweichender Immunantwort zu intubieren, in einem Bemühen, die Reagibilität zu verringern und dadurch den Zustand zu verbessern.
Die Internationale Patentveröffentlichung WO 91/12816 und die EP-Patentanmeldung EP 0 666 080 A1 beschreiben die Behandlung von Autoimmunkrankheiten durch orale Verabreichung von Autoantigenen. Das Autoantigen ist spezifisch für eine Autoimmunkrankheit, und es wird oral oder enteral verabreicht, um die Suppressor-T-Zellen auszulösen, die das Autoantigen erkennen. Die Internationale Patentveröffentlichung WO 91/08760 beschreibt die Behandlung von Autoimmunkrankheiten durch Aerosol-Verabreichung von Autoantigen.
Die Internationale Patentveröffentlichung WO 96/39176 beschreibt die Anwendung einer oralen Verabreichung eines Antigens, um sowohl T_H1- und T_H2-Immunantworten zu unterdrücken und die Antikörperproduktion zu unterdrücken. In Ausführungsbeispielen wurde das Antigen ad libitum dem Trinkwasser zugefügt, und die abhängigen Patentansprüche beschreiben zumindest sechs Dosen pro Tag oder anhaltende Freisetzung.
Die Internationale Patentveröffentlichung WO 93/16724 beschreibt die Behandlung von Autoimmunkrankheiten durch Verabreichung eines "Bystander"-Antigens an Stelle eines Autoantigens, das direkt mit der Krankheit assoziiert ist. Das "Bystander"-Antigen löst die Freisetzung von TGF-β an einem Ort innerhalb des Körpers von Säugetieren aus, wobei gefunden wurde, dass T-Zellen, die zur Autoimmunantwort beitragen, die T-Zellen unterdrücken, die zu der Krankheit beitragen. Die Internationale Patentveröffentlichung WO 94/27634 beschreibt die Verwendung kryptischer Peptide beim Induzieren immunologischer Toleranz. Kryptische Epitope sind jene Determinanten in einem Proteinantigen, die aufgrund der Reifung bzw. Prozessierung und Präsentation des Antigens des nativen Proteins dem Immunsystem normalerweise nicht enthüllt werden.
Eine Zahl von Patentoffenbarungen und akademischen Artikeln beschreibt die Behandlung von besonderen Zuständen durch Tolerant-Machen über einen mucosalen Weg. Das US-Patent Nr. 5,399,347 und Thompson et al. (Autoimmunity 16:189, 1993) beschreiben Verfahren zum Behandeln rheumatoider Arthritis, wobei vollständiges Typ-II-Kollagen oral verabreicht wird. Die Internationale Patentveröffentlichung WO 94/27634 und Vrabec et al. (Autoimmunity 12:175, 1992) beschreiben das Behandeln von Autoimmunuveoretinitis durch orales Verabreichen des S-Antigens. Chen et al. (Science 265:1237, 1994) und Whitachre et al. (J. Immunol. 147:2155, 1991) beschreiben. die Unterdrückung von autoimmuner Encephalomyelitis durch orale Verabreichung von Myelin Basic Protein ("myelin basic protein" = MBP). Wang et al. (Cell. Immunol. 152:394, 1993) beschreiben die orale Verabreichung von Acetylcholinrezeptor zum oralen Tolerant-Machen gegen experimentelle autoimmune Myasthenia gravis.
Die Internationale Patentveröffentlichung WO 94/27634 beschreibt das Behandeln von Typ-I-Diabetes durch orale Verabreichung von Insulin. Für weitere Experimente an nicht-adipösen diabetischen (NOD)-Mäusen, siehe Ramiya et al. (Diabetes 44:164A, 1995) und Zhang et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:10252, 1991). In einem Virus-induzierten Antigen-spezifischen diabetischen Modell verhindert die orale Behandlung mit Insulin, die eine Woche oder 10 Tage nach der auslösenden viralen Provokation begonnen wurde, das Auftreten von Hyperglykämie bei >50 % der Mäuse. Von oraler Verabreichung wurde angenommen, dass sie weder die Erzeugung von anti-β-zellzytotoxischen T-Lymphozyten noch die Infiltration in das Pankreas beeinflusst, aber weniger β-Zellen wurden zerstört. Die Mehrheit der Lymphozyten in den Inseln von erfolgreich behandelten Insulin-behandelten Mäusen produzierte IL-4, IL-10 und TGF-β, wobei die Lymphozyten von symptomatischen Mäusen hauptsächlich γ-IFN produzierten.
Die Internationale Patentveröffentlichung WO 92/07581 beschreibt Verfahren und Zusammensetzungen zur Unterdrückung der Abstoßung eines allogenen Transplantats bei Säugetieren. Dem Transplantatempfänger wird durch orale oder Aerosol-Verabreichung ein Mittel verabreicht, das aus der Gruppe, bestehend aus Milzzellen, kultivierten Zellen oder von Donor-stammenden Extrakten oder MHC-Antigenen, ausgewählt ist.
Die zuvor genannten Offenbarungen zeigen typischerweise, dass das tolerant-machende Antigen häufig verabreicht werden muss, bis mehrmals pro Tag, oder in einer Dosis von über 1 mg/Maus. Um die Toleranz aufrecht zu erhalten, ist es allgemein erforderlich, das Antigen auf einer fortlaufenden Basis zu verabreichen.
Choleratoxin ist ein Prototyp eines bakteriellen Enterotoxins, welches durch Vibrio cholerae freigesetzt wird, und es induziert aktiv Elektrolyt- und Wasserabscheidung aus dem intestinalen Epithel. Es ist ein Protein, das aus einer einzelnen A-Untereinheit mit einem Molekulargewicht von 28.000 und fünf B-Untereinheiten mit einem Molekulargewicht von 11.600 aufgebaut ist. Die B-Untereinheiten sind in einem Ring durch enge nicht-kovalente Bindungen aggregiert; die A-Untereinheit ist daran angefügt und durch schwächere nicht-kovalente Wechselwirkungen wahrscheinlich teilweise in den B-Pentamer-Ring eingefügt. Die B-Untereinheiten sind für die Zellbindung verantwortlich, und die A-Untereinheit hat eine toxische Aktivität bzw. Wirkung, die das Modifizieren der G-Proteine des cyclischen AMP-Wegs einschließt. Die Bindungsaktivität bzw. Wirksamkeit der B-Untereinheit richtet sich auf das Gangliosid GM1, das auf der Mucosa-Oberfläche vorhanden ist.
Es gibt eine umfangreiche Literatur hinsichtlich der Fähigkeit von Choleratoxin als ein Adjuvans in Mucosa-Vakzinen zu wirken, wobei es das Niveau der Immunantwort gegen das Antigen, mit dem es gemischt ist, erhöht. Siehe z.B. Elson, Curr. Top. Microbiol. Immunol. 146, 1989; Nedrud et al., J. Immunol. 139:3484, 3492, 1987; und McKenzie et al., J. Immunol. 133:1818, 1984.
Vor kürzerer Zeit wurde gezeigt, dass die an bestimmte Antigene gekoppelte CTB-Untereinheit eine Toleranz-induzierende Wirkung hatte, wenn sie auf eine Mucosa-Oberfläche verabreicht wurde.
Die Internationale Patentveröffentlichung WO 95/10301 beschreibt ein immunologisches Toleranz-induzierendes Mittel, das ein Mucosabindungsmolekül umfasst, welches an ein spezifisches Tolerogen ("tolerogen") gekoppelt ist. Beispielhafte Mucosabindungsstrukturen waren CTB und die Untereinheit des Hitze-labilen Enterotoxins von E. coli.
Sun et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 7196, 1996) beschreibt CTB als ein wirksames transmucosales Träger-Abgabesystem ("transmucosal carrier-delivery system"). Rote Blutkörperchen wurden modifiziert durch kovalentes Koppeln mit GM1, an welches dann das CTB angefügt wurde. HGG wurde durch kovalentes Koppeln direkt an CTB modifiziert. Eine einzelne orale Verabreichung eines löslichen oder partikulierten Antigens, das an CTB gekoppelt war, verstärkte die Toleranz. Sun et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 7196, 1996) beschreibt die Behandlung von experimenteller autoimmuner Encephalomyelitis durch Füttern von Myelin Basic Protein, das kovalent an CTB konjugiert war.
Die Internationale Patentveröffentlichung WO 96/21458 beschreibt auf Kollagenbasierende Verfahren und Formulierungen zur Behandlung von Immunsystem-vermittelten Krankheiten, wie Autoimmuno-Leberkrankheit, Morbus Crohn, Goodpasture-Syndrom, Psoriasis, lokalisierte Sklerose, die verschiedenen Erscheinungsformen von Arthritis und verschiedene lokalisierte zersetzende entzündliche oder fibrotische Zustände. Die Verbindung wird an ein Mucosabindungsmolekül, wie CTB, gebunden verabreicht.
In den Versuchen dieser Veröffentlichungen wurde der wirksame Inhaltsstoff durch Konjugieren mit dem Antigen entweder mit CTB direkt oder mit einer Linkergruppe aufgebaut.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die in der vorliegenden Erfindung verwendeten Kombinationen enthalten ein induzie rendes Antigen und eine Mucosabindungskomponente, die, ausgewählt aus Choleratoxin-Untereinheit B und Hitze-labilem Enterotoxin B, nicht-kovalent aneinander gefügt sind und wirksam sind beim Induzieren spezifischer immunologischer Toleranz, wenn sie auf eine Mucosaoberfläche verabreicht werden. Diese Zusammensetzungen sind eine Verbesserung gegenüber den Zusammensetzungen aus Antigen allein aus dem Stand der Technik, weil sie Toleranz bei einer 10-fach geringeren Dosis induzieren können und zu einer länger andauernden Antwort führen. Im Vergleich zu kovalent verknüpften Komplexen sind sie bequemer in der Leichtigkeit und Wirtschaftlichkeit ihrer Herstellung.
Eine Ausführungsform der Erfindung ist die Verwendung eines induzierenden Anti gens und einer Mucosaverbindungskomponente, wie oben definiert, bei der Herstellung eines Medikaments zum Induzieren anhaltender immunologischer Toleranz in einem Individuum gegenüber einem Zielantigen, wobei das induzierende Antigen Toleranz gegenüber dem Zielantigen induziert, und das induzierende Antigen und die Mucosaverbindungskomponente in dem Medikament in einer unkonjugierten Form vorliegen. Das induzierende Antigen kann das Zielantigen, gegen welches die Tolerant-Machung gewünscht ist, oder ein "Bystander" für das Zielantigen sein. Induzierende Antigene können Autoantigene (einschließlich, aber nicht beschränkt auf, Insulin-Peptide, Kollagen-Peptide und MBP-Peptide), Alloantigene (einschließlich, aber nicht beschränkt auf, HLA Klasse I und II), Xenoantigene oder Allergene sein.
Eine andere Ausführungsform der Erfindung ist die Verwendung eines induzierenden Antigens und einer Mucosabindungskomponente, wie oben beschrieben, bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Hypersensitivität gegen ein Zielantigen in einem Individuum, wobei das induzierende Antigen Toleranz gegenüber dem Zielantigen induziert, und das induzierende Antigen und die Mucosabindungskomponente in dem Medikament in einer unkonjugierten Form vorliegen. Eine andere Ausführungsform ist die Verwendung eines induzierenden Antigens und einer Mucosabindungskomponente, wie oben beschrieben, bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung eines Autoimmunzustands in einem Individuum, wobei der Autoimmunzustand mit immunologischer Reaktivität gegen ein Zielantigen assoziiert ist, wobei das induzierende Antigen Toleranz gegenüber dem Zielantigen induziert, und das induzierende Antigen und die Mucosabindungskomponente in dem Medikament in einer unkonjugierten Form vorliegen.
Eine andere Ausführungsform der Erfindung ist eine pharmazeutische Zusammensetzung zum Induzieren anhaltender immunologischer Toleranz gegenüber Insulin, umfassend eine wirksame Kombination von Insulinpeptid zusammen mit Choleratoxin-Untereinheit B (CTB) oder hitze-labilem Enterotoxin B (LTB), wobei das Insulinpeptid und CTB/LTB in einer unkonjugierten Form sind, und ein Metallkation. Bevorzugte Zusammensetzungen zum Behandeln von Diabetes enthalten Zink als das Metallkation. Auch enthalten ist ein Verfahren zur Herstellung von solchen pharmazeutischen Zusammensetzungen, die das Kombinieren der Komponenten bei dem Gewichtsverhältnis der wirksamen Kombination umfassen.
Weitere Ausführungsformen beziehen sich auf Induzieren der Toleranz in dem Kontext der Gewebetransplantation. Eine solche Ausführungsform ist die Verwendung eines induzierenden Antigens und einer Mucosabindungskomponente, wie oben definiert, bei der Herstellung eines Medikaments zum Verringern des Risikos einer Abstoßung eines Gewebetransplantats, transplantiert von einem Donor in einen Empfänger, wobei das induzierende Antigen allotypische Determinanten des Donors umfasst, und das induzierende Antigen und die Mucosabindungskomponente in dem Medikament in einer unkonjugierten Form vorliegen. Sowohl xenogene als auch allogene Transplantate sind eingeschlossen. Eine andere solche Ausführungsform ist die Verwendung eines induzierenden Antigens und einer Mucosabindungskomponente, wie definiert, bei der Herstellung eines Medikaments zum Verringern des Risikos von Transplantat gegen Empfänger-Reaktion in einem Empfänger von einem Gewebetransplantat, transplantiert von einem Donor, wobei das induzierende Antigen allotypische Determinanten des Empfängers umfasst, und das induzierende Antigen und die Mucosabindungskomponente in dem Medikament in einer unkonjugierten Form vorliegen. Das induzierende Antigen kann z.B. ein einzelnes HLA-Antigen oder eine HLA-Antigenmischung oder eine Zelle oder ein Zellderivat von einem oder mehreren Individuen sein.
WO 94/07516 lehrt die Verwendung von Proteinen in der Immunmodulation, die in der Lage sind, α-2,6-Sialinsäure- oder α-2,3-Sialinsäurestrukturen zu bilden. Es gibt keine Vorschläge, CTB oder LTB zu verwenden. Die Offenbarung bezieht sich auf parenterale Verabreichung als bevorzugte Art. Vorschläge, eine mucosale Verabreichung zu verwenden, sind auf jene Beispiele beschränkt, bei denen die Entzündung lokal behandelt werden sollte. Darüber hinaus gibt es keine Vorschläge, dass eine mocosale Verabreichung, wie sie in der vorliegenden Erfindung gelehrt wird, in der Lage sein sollte, eine anhaltende Wirkung zu verursachen.
EP-A-0 474 453 bezieht sich auf die Verwendung von LTB als ein Mittel, das die Absorption von Peptiden und Proteinen über die Wand des Gastrointestinaltrakts fördert. Es gibt keine Lehre, dass diese Wirkung irgendwelche immunmodulierenden Wirkungen hat.
Patent Abstracts of Japan, Band 14, Nr. 548, und JP-A-02 235 823 beziehen sich auf die Verwendung des B-Oligomers des Pertussis-Toxins oder einer Untereinheit davon in der Behandlung von Autoimmunität. Die Literaturverweise schlagen nicht die Kombination mit einem induzierenden Mittel vor und sehen im Allgemeinen die nicht-spezifische Behandlung von Autoimmun-Störungen bzw. -Krankheiten vor. Es gibt keine Lehre, die CTB oder LTB betrifft.
WO 96/17620 bezieht sich auf antiallergisches Mittel, das eine Mischung eines Allergens und eines Adjuvans umfasst, welches in der Lage ist, die Produktion von IgA zu fördern. Ein solches Adjuvans ist das Choleratoxin, welches zusammen mit einer Anzahl von anderen gut bekannten immunogenen Adjuvanzien genannt wird. Der Literaturverweis lehrt die Induktion einer gewünschten Immunantwort, die mit bestimmten Antigenen (Allergenen) an ihrer Eintrittsstelle in den Körper Wechsel wirken kann, und in immunologischen Begriffen ist dies das Gegenteil der Induktion von Toleranz.
J. Immunol. 154, 1995, S. 3611-3617 bezieht sich auf die Verwendung von CTB als einen nicht-spezifischen Suppressor von GVH-Reaktionen via eine ex vivo-Behandlung der Zellen, die für eine Transplantation verwendet werden. Es gibt keine Hinweise, dass CTB in vivo zur Behandlung von Autoimmunität oder zum Verhindern einer Transplantatabstoßung verwendet werden könnte.
JP-A-03 109 328 bezieht sich auf die Verwendung von CTB oder LTB zum Verringern der Transplantatabstoßung bei Transplantation. Es gibt keinen Hinweis, dass CTB oder LTB zusammen mit einem induzierenden Antigen verwendet werden sollten.
PNAS USA 91, 1994, S.: 107795-99 bezieht sich auf die Verwendung von Konjugaten zwischen CTB und Antigen, um bei dem verzögerten Typ von Hypersensitivität einzugreifen. Es gibt keine Lehre in diesem Literaturverweis, die den Fachmann dazu veranlassen würde, CTB und ein Immunogen in einer unkonjugierten Form zu verwenden.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG
Es ist eine Aufgabe dieser Erfindung, ein System zum Induzieren spezifischer immunologischer Toleranz bereitzustellen, unter Verwendung von Zusammensetzungen, die leicht aufgebaut und verabreicht werden können.
Die Zusammensetzungen umfassen minimal die folgenden zwei Komponenten in einer wirksamen Kombination:

• eine Mucosabindungskomponente, ausgewählt aus der Choleratoxin-Untereinheit B (CTB) und dem Hitze-labilen Enterotoxin B,
• ein induzierendes Antigen, wie Insulin, welches entweder das Ziel, für das die Toleranz gewünscht wird, oder ein "Bystander" für das Ziel ist.

Das induzierende Antigen kann mit der Mucosabindungskomponente vor der Verabreichung gemischt werden, sie können getrennt verabreicht werden oder das Antigen kann bereits auf der Mucosaoberfläche vorhanden sein. Wenn sie zusammengegeben werden, sind die Mucosabindungskomponente und das induzierende Antigen unkonjugiert, was bedeutet, dass sie nicht kovalent aneinander gebunden sind, weder direkt noch durch einen dazwischen liegenden Linker.
Die Anwendung bzw. Auftragung der Zusammensetzungen auf einer Mucosaoberfläche resultiert in spezifischer immunologischer Toleranz gegen das Zielantigen. Typischerweise wird die Toleranz durch Behandlung mit einer Vielzahl von Verabreichungen induziert, die etwa alle zwei Wochen gegeben werden können. Die daraus resultierende immunologische Toleranz ist typischerweise anhaltend, was bedeutet, dass immunologischer oder klinische Toleranzindikatoren bei einem Teil von Personen beobachtbar sind, die die Behandlung erhielten, über eine anhaltende Dauer von mehreren Wochen, zumindest 3 Wochen, typischerweise zumindest etwa 5 Wochen, und bevorzugt zumindest etwa 10 oder sogar 15 Wochen nach der letzten der auslösenden Verabreichungen. Zusätzliche Auffrischungsverabreichungen können während oder auf diesen Zeitabschnitt folgend gegeben werden, um das Niveau der Toleranz zu fördern. Obwohl nicht beabsichtigt wird, an eine Theorie gebunden zu sein, scheint es, dass anhaltende Toleranz, zumindest teilweise eine aktive Immunosuppression der Immun-B- oder -T-Zellen, die spezifisch für das Zielantigen sind, beinhaltet.
Die Ergebnisse, die der Erfindung zugrunde liegen, wurden während der Entwicklung von kovalenten Konjugaten zwischen Insulin und CTB und ihrem nachfolgenden Testen als orale Tolerogene ("tolergogens") in dem NOD-Mausmodell für Diabetes entdeckt. Kontrollgruppen von Mäusen schlossen jene ein, die mit Insulin oder CTB allein oder einer nicht-kovalenten Mischung der zwei behandelt wurden. Eine kleine Toleranzmenge bei hohem Level von Insulin allein wurde im Hinblick auf frühere Beschreibungen der Wirkung einer mucosalen Verabreichung von Insulin erwartet. Einige der kovalenten Insulin-CTB-Konjugate waren erheblich leistungsfähiger beim Induzieren der Toleranz. Es stellte sich heraus, dass die nicht-kovalente Mischung von Insulin und CTB sehr leistungsfähig beim Induzieren der Toleranz war, erheblich mehr als Insulin allein. Beispiel 1 beschreibt ein Folgeexperiment, in dem die Beschaffenheit der Antwort auf nicht-kovalente Kombinationen weiter charakterisiert wurde.
Die Ergebnisse dieser Versuche zeigen, dass nicht-kovalente Konzentrationen die folgenden unerwarteten Eigenschaften haben:

• Die Kombinationen induzierten Toleranz, wenn sie oral in Konzentrationen verabreicht wurden, die etwa 10-fach niedriger waren als die zum Induzieren von Toleranz erforderliche Menge bei alleiniger Verwendung von Insulin.
• Anders als bei der Wirkung von Insulin allein war die Toleranz, die durch die nicht-kovalente Kombination induziert wurde, über eine längere Zeitdauer anhaltend. Die Behandlung war in der Lage, den Ausbruch der diabetischen Symptome bei einem wesentlichen Anteil von NOD-Mäusen für mindestens 17 Wochen nach dem Beginn der Behandlung abzuwenden.

Der Mechanismus, durch den die Mucosabindungskomponente das tolerogene Potential des Antigens verstärkt, ist nicht völlig aufgeklärt. Weder ist ein Verstehen des Mechanismus erforderlich, um die Erfindung anzuwenden, noch ist irgendeine Einschränkung durch die folgenden Erklärungen beabsichtigt. In einem möglichen Mechanismus kann die Mucosabindungskomponente die Fähigkeit des Antigens, die Mucosaoberfläche zu durchdringen, unterstützen und sich nahe Antigen-präsentierender oder regulatorischer Zellen, die an der spezifischen Toleranz beteiligt sind, akkumulieren. Wenn die Kombination in einer Zahl wiederholter Dosen gegeben wird, kann die Mucosabindungskomponente alternativ oder zusätzlich Mucosaimmunität bewirken, was in einer raschen Effektorantwort auf nachfolgende Dosen der Mischung resultiert. Dies wiederum kann Zytokine oder andere lösliche Faktoren beitragen, die die Aufnahmefähigkeit regulatorischer T-Zellen gegenüber einer geringeren Menge des Antigens in der Mischung erhöhen. In einer dritten Erklärung kann die verstärkende Wirkung von CTB durch Vernetzen von GM1 auf Lymphozyten oder Antigen-präsentierenden Zellen vermittelt sein. Beispiel 2 zeigt, dass CTB, welches vor dem Antigen zu Zellkulturen gegeben wurde, offenbar die Präsentation verstärkt und T_H1-Zellen (IL-2- und IFN-γ- sezernierend) und T_H2 (IL-4-sezernierend) vermehrt. CTB-Vernetzen von GM1 auf Zellen des Mucosaimmunsystems kann eine spezifische Aktivierung von Suppressorzellen erhöhen.
Während das Antigen und die Mucosabindungskomponente optional in einer nichtkovalenten Weise assoziiert sein können, wird nicht angenommen, dass dies notwendig ist, um die gewünschte Wirkung zu erhalten. Die Erfindung schließt Zusammensetzungen ein, in denen einige oder alle der Komponenten nicht-kovalent miteinander assoziiert sind, wenn sie in wässriger Lösung sind, und Zusammensetzungen, in denen die Komponenten nicht assoziiert sind.
Diese Erfindung stellt bestimmte Vorteile beim Induzieren immunologischer Toleranz bereit, die beim Behandlung unerwünschter immunologischer Antworten von Interesse sein werden. Da die Mucosabindungskomponente die Fähigkeit des induzierenden Antigens, Toleranz zu induzieren, verstärkt, kann eine beträchtlich kleinere Dosis des Antigens gegeben werden. Die anhaltende Natur der Antwort bedeutet auch, dass weniger oft Auffrischungsdosen gegeben werden können. Da die Zusammensetzung nur durch Mischen der Komponenten aufgebaut ist, ist die Herstellung schnell. Die Leichtigkeit des Aufbauens der Zusammensetzung bedeutet, dass das Testen von neuen Komponenten, Kombinationen und Anteilen erleichtert ist und die kommerzielle Herstellung von erprobten Zusammensetzungen bei geringen Kosten durchgeführt werden kann. Sehr komplexe Mischungen können ebenfalls erhalten werden, in denen die Mucosabindungskomponente das Tolerant-Machen gegenüber Antigenen, die in einer Antigenmischung, einem Zellextrakt oder einem Zelllysat vorhanden sein können, verstärkt.
Zusätzlich stellt die vorliegende Erfindung den Vorteil bereit, dass das Immunsystem manipuliert werden kann, um neue therapeutische Strategien zu entwickeln. Es wird in Erwägung gezogen, dass immunologische Toleranz gegenüber Zielantigenen einer unerwünschten Hypersensitivitätsantwort auf ein fremdes Antigen stimuliert werden kann. Zielantigene schließen Nahrungsmittel, Nahrungsmittelzusatzstoffe, Pollen, Pilzsporen, Stäube oder tierische Hautschuppen ein. Die Exposition kann durch den Gastrointestinaltrakt, durch Inhalation oder durch Hautkontakt auftreten. Eine Mucosabindungskomponente, wie CTB, wird vor, gleichzeitig mit oder kurz auf die Quelle des angreifenden Antigens folgend verabreicht oder direkt vor der Verabreichung mit einer Probe des Antigens gemischt. Wenn sie getrennt verabreicht werden, werden die Komponenten innerhalb einer Dauer gegeben, in der die Muco sabindungskomponente die Toleranz gegen das induzierende Antigen fördern kann, und bevorzugt so nahe zusammen wie möglich.
Die Erfindung stellt weiterhin Verfahren zum Induzieren immunologischer Toleranz gegenüber Zielantigenen bereit, die auf der Mucosaoberfläche vorhanden sind. Von besonderem Interesse sind Zielantigene, die bevorzugt mit Mucosastörungen bzw. -krankheiten, exemplarisch dargestellt durch entzündliche Darmerkrankung, Reizdarmkrankheit, Colitis ulcerosa, Zöliakie und Morbus Crohn, assoziiert sind. Eine Mucosabindungskomponente, wie CTB, wird einem Patienten, der an einer Mucosastörung bzw. -Krankheit leidet, verabreicht, um eine Umgebung zu schaffen, die der Induktion von Toleranz in jedem Fall des endogenen Zielantigens, das mit der Mucosastörung bzw. -Krankheit assoziiert ist, förderlich ist. Bestimmte Zielantigene werden bereits auf der Mucosaoberfläche vorhanden sein, und der Level oder die Beschaffenheit der Expression kann durch den Krankheitszustand verändert werden. Die verabreichte CTB schafft eine wirksame Kombination in situ, um spezifische Toleranz zu erzeugen.
Spezifische Toleranz ist zum Verbessern, Einschränken oder Verschieben des Ausbruchs einer unerwünschten Immunantwort bei einer Person wünschenswert. Demgemäß sind die Verfahren und Zusammensetzungen dieser Erfindung von beträchtlichem Interesse in der Behandlung einer Zahl von Humankrankheiten, mit einer Ätiologie, die eine unerwünschte Immunantwort einschließt.
Definitionen und allgemeine Techniken
Ein Verfahren oder eine Zusammensetzung wird hierin als "immunologische Toleranz"-hervorrufend bezeichnet, wenn es/sie mindestens eine dieser Wirkungen auf einen Teil der behandelten Personen im Vergleich zu unbehandelten Personen hat: a) Ein verringertes Niveau einer spezifischen immunlogischen Antwort (betrachtet als zumindest teilweise durch Antigen-spezifische Efektor-T-Lymphozyten, B-Lymphozyten, Antikörper oder ihre Äquivalente vermittelt); b) eine Verzögerung im Ausbruch oder Fortschreiten einer spezifischen immunologischen Antwort; oder c) ein verringertes Risiko des Ausbruchs oder Fortschreitens einer spezifischen immunologischen Antwort. "Spezifische" immunologische Toleranz tritt auf, wenn die immunologische Toleranz bevorzugt gegen bestimmte Antigene im Vergleich zu anderen hervorgerufen wird.
"Wirksame bzw. aktive" immunologische Toleranz bezieht sich auf einen Zustand, in dem die Toleranzwirkungen) das Ergebnis eines fortschreitenden biologischen Prozesses ist sind: zum Beispiel Herunterregulation spezifischer Effektorzellen durch Suppressorzellen. Wirksame bzw. aktive Toleranz kann durch Zell-Misch- oder Zell-Übertragungs-Versuche gezeigt werden. Die folgenden zwei Beispiele von Versuchsergebnissen (durchgeführt mit geeigneten Kontrollen) sind Beweis für aktive immunologische Toleranz: a) wenn Leukozyten von einem tolerant-gemachten Tier mit spezifischen Effektorzellen von einem zweiten Tier gemischt werden und die Wirksamkeit bzw. Aktivität der Effektorzellen verringert ist; wenn Leukozyten von einem tolerant-gemachten Tier auf ein zweites Tier übertragen werden, das eine Autoimmunkrankheit hat, und Merkmale dieser Krankheit verringert werden.
"Anhaltende Toleranz" ist Toleranz, die messbar für mindestens 3 Wochen besteht. Die Begriffe "Polypeptid", "Peptid" und "Protein" werden hierin austauschbar verwendet, um sich auf Aminosäurepolymere jeglicher Länge zu beziehen. Der Begriff "Polynukleotid" bezieht sich auf eine polymere Form von Nukleotiden jeglicher Länge, entweder Desoxyribonukleotide oder Ribonukleotide oder Analoga davon, und schließt Plasmide und Vektoren ein. Wenn Sequenzen zwischen Proteinen oder zwischen Polynukleotiden verglichen werden, sind gelegentliche Lücken erlaubt, die eindeutig benötigt werden, um die wesentlichen Homologiebereiche abzugleichen, außer dort, wo die Reste in einer linearen Sequenz als "aufeinanderfolgend" ("consecutive") definiert sind.
Wenn es in dieser Offenbarung verwendet wird, ist ein "Zielantigen" ein Antigen, für das Immuntoleranz gewünscht ist. Typischerweise wird das Zielantigen auch Ziel für eine unerwünschte immunologische Antwort sein (bereits laufend oder für eine, für die bei der Person ein Risiko besteht), und ein Ziel wird sein, das Risiko der Antwort zu verringern, zu verzögern oder herabzusetzen.
Ein "induzierendes Antigen" ist ein Antigen, das in den Kombinationen der Erfindung eingeschlossen ist, um Toleranz hervorzurufen. Es kann das Zielantigen oder ein Fragment oder Derivat davon sein. Alternativ kann es ein "Bystander"-Antigen sein.
Ein "Bystander-Antigen" ist ein Antigen, das als Antigen von dem Zielantigen verschieden ist, aber das Zielantigen beim Hervorrufen der spezifischen immunologischen Toleranz ersetzen kann. Gewöhnlich wird ein "Bystander"-Antigen in dem gleichen Gewebe in der Nachbarschaft des Zielantigens exprimiert. Die möglichen Mechanismen, durch welche "Bystander"-Antigene ihre Rolle spielen, werden anderweitig in dieser Offenbarung ausgearbeitet.
Ein "Nahrungsmittel-Antigen" ("dietary antigen") ist jedes Antigen, auf das beim Konsum von Nahrungsmitteln gestoßen werden kann, einschließlich Antigene, die in Nahrungsmittelkomponenten und Lebensmittelzusatzstoffen vorhanden sind. Ein "Mucosa-Antigen" ist ein Antigen, das entweder konstitutiv oder durch Induktion, z.B. in dem Verlauf einer Entzündung oder Krankheit, an der Mucosaoberfläche exprimiert wird. Ein "Allergen" ist ein Antigen, das eine Typ-I-Hypersensitivitätsreaktion in einem vorsensibilisierten Individuum erzeugen kann.
Moleküle werden hierin "konjugiert" oder "verknüpft" ("linked") bezeichnet, wenn sie entweder direkt oder durch eines oder mehrere Linkermoleküle kovalent aneinander gebunden sind. Die Begriffe übertragen keine andere Einschränkung als hinsichtlich der Natur der Bindung oder des gebildeten Produkts. Somit sind z.B. Disulfid-verbundene Aminosäureketten konjugiert; die erste Hälfte einer Polypeptidkette ist mit der zweiten Hälfte konjugiert. "Nicht-konjugierte" Moleküle sind nicht konjugiert oder miteinander verknüpft.
Zwei Moleküle in einer Zubereitung werden hierin als "assoziiert" bezeichnet, wenn mindestens 50 % des Moleküls, das nicht im Überschuss vorliegt, in einem nicht-kovalenten Heterodimer oder Heteropolymer beider Moleküle assoziiert ist, wenn die Zubereitung in 100 ml isotonischem Puffer bei pH ~ 7 gelöst oder verdünnt wird. In bestimmten Ausführungsformen hat jede Assoziation zwischen den Molekülen eine Assoziationskonstante <10¹⁰ M^–1, bevorzugt < 10⁸ M^–1. Zwei "unassoziierte" Moleküle sind weder konjugiert noch assoziiert.
"Behandlung" bezieht sich auf das klinische Eingreifen in einem Versuch, den natürlichen Verlauf bei dem behandelten Individuum zu verändern und kann entweder zur Prophylaxe oder während des Verlaufs der chemischen Pathologie durchgeführt werden. Die gewünschten Wirkungen schließen das Verhindern des Auftretens oder des erneuten Auftretens einer Krankheit, die Linderung der Symptome, die Verminderung von jeglichen direkten oder indirekten pathologischen Konsequenzen der Krankheit, die Verringerung der Geschwindigkeit des Fortschreitens der Krankheit usw. ein, wie anhand klinischer Merkmale und allgemein anerkannter biochemischer immunologischer oder histopathologischer Merkmale des Zustands gemessen werden kann. Die Pathologie, die mit einem Krankheitszustand assoziiert ist, ist alles, was das Wohlbefinden, die normale Physiologie oder die Lebensqualität des betroffenen Individuums umfasst.
Ein Individuum oder eine Person, die unter Verwendung der Zusammensetzungen und Verfahren dieser Erfindung behandelt wird, wird ein Vertebrat, insbesondere ein Säugetier (einschließlich Nutztiere, Sporttiere und Haustiere) und häufig ein Mensch sein.
Eine "wirksame Kombination" von Komponenten in einer Zubereitung, die zur Behandlung verwendet wird, umfasst eine Menge jeder der Komponenten, die in Kombination die gewünschte Wirkung erzielt. Die Wirkung kann in einer oder in einer Serie von Verabreichungen erreicht werden.
Ein "wirksamer Anteil" der Komponenten in einer Komponentenmischung hat den gleichen Anteil der Komponenten (auf einer G/G-Basis) in einer wirksamen Kombination. Die Mischung kann daher geteilt, gelöst oder verdünnt werden, um eine Zusammensetzung für eine wirksame Verabreichung herzustellen.
Die Verfahrensweise der vorliegenden Erfindung wird, falls nicht anders angegeben, konventionelle Techniken der Molekularbiologie, Mikrobiologie, DNA-Rekombination und Immunologie anwenden, die innerhalb des einschlägigen Stands der Techniks liegen. Siehe z.B. "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 2. Ausgabe (Sambrook, Fritsch & Maniatis, 1989), "Animal Cell Culture" (R.I. Freshney, Hrsg., 1987); die Serien "Methods in Enzymology" (Academic Press, Inc.); "Handbook of Experimental Immunology" (D.M. Weir & C.C. Blackwell, Hrsg.), "Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells" (J.M. Miller & M.P. Calos, Hrsg., 1987), "Current Protocols in Molecular Bilogy" (F.M. Ausubel et al., Hrsg., 1987); und "Current Protocols in Immunology" (J.E. Coligan et al., Hrsg., 1991).
Herstellung der Mucosabindungskomponente
Die Mucosabindungskomponenten können durch eine Zahl von Techniken, die im Stand der Technik bekannt sind, abhängig von der Beschaffenheit des Moleküls, hergestellt werden. Die Moleküle können gemäß der ursprünglichen Beschreibung aus ihren Quellen isoliert werden. Kurze Peptide werden bequem durch Synthese aus Aminosäuren hergestellt. Antikörper werden durch Immunisieren eines Tieres mit dem isolierten Mucosabindungsziel und anschließendem Aufreinigen des Antikörpers aus dem Serum erzeugt oder durch Erzeugen von Hybridom-Antikörpern unter Verwendung von Lymphozyten des Tieres. Längere Proteine bekannter Sequenz können durch Synthetisieren einer codierenden Sequenz oder PCR-Vermehrung einer codierenden Sequenz aus einer natürlichen Quelle oder einem Vektor und anschließenden Exprimieren der codierenden Sequenz in einem geeigneten bakteriellen oder eukaryotischen Wirt hergestellt werden.
Die Mucosabindungskomponenten sind die Choleratoxin-Untereinheit B (CTB) und die Hitze-labile Enterotoxin-Untereinheit B (LTB) von E. coli. Begriffe wie CTB-Peptid und LTB-Peptid, wie sie hierin verwendet werden, beziehen sich nicht nur auf die intakte Untereinheit, sondern auch auf Allele und synthetische Varianten, Fragmente, Fusionspeptide, Konjugate und andere Derivate, die eine Region enthalten, die homolog (vorzugsweise zu 70 % identisch, stärker bevorzugt zu 80 % identisch und noch stärker bevorzugt zu 90 % identisch auf dem Aminosäurelevel) zu mindestens 10 und bevorzugt 30 aufeinander folgenden Aminosäuren zu dem entsprechenden Molekül ist, zu dem sie analog ist, wobei der homologe Bereich des Derivats Mucosabindungsaktivität hat, wie sie in den früher beschriebenen Bindungsassays bestimmt werden kann.
Um das Risiko zu minimieren, eher eine Immunantwort zu verstärken als Toleranz induzieren, ist die als Mucosabindungskomponente verwendete CTB in den meisten Ausführungsformen im Wesentlichen frei von jeglichem intakten Choleratoxin oder der funktionellen Choleratoxin-Untereinheit A. Dies bedeutet, dass < 0,1 Gew.-% und bevorzugt < 0,01 Gew.-% der CTB-Zubereitung aktive Untereinheit A ist. Rekombinant erhaltene CTB ist ein bevorzugte Quelle, da es unwahrscheinlich ist, dass sie die Untereinheit A als eine Kontaminante enthält.
Das Choleratoxin und CTB sind von Sigma Chemical Co., St. Louis MO erhältlich. Die codierende DNA-Sequenz für die A- und B-Kette des Choleratoxins sind in dem US-Patent Nr. 4,666,837 offenbart. Für Materialien und Techniken, die zum Herstellen der rekombinanten CTB zweckmäßig sind, wird der Leser auf EP Patent Nr. 0 095 426, US-Patent Nr. 5,268,276 und Sanchez et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:481, 1989 verwiesen. Für Materialien und Techniken, die zum Herstellen des rekombinanten LTB zweckmäßig sind, wird der Leser auf die Internationale Patentveröffentlichung WO 95/10301 und Hirst et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:7752, 1984 verwiesen. Proteine, die von Bakterien-Expressionssystemen sezerniert werden, können aus dem Wachstumsmedium durch Einstellen des pH auf 4,5, Präzipitieren mit Hexametaphosphat (Endkonzentration 2,5 g/l), Zentrifugieren bei 8000 U/min, Auflösen und Dialysieren gegen Phosphat-gepufferte Salzlösung und anschließendes Klären durch Zentrifugation und Ultrafiltration gewonnen werden. Die Zubereitungen können weiter aufgereinigt werden, z.B. durch Gelfiltrationschromatographie.
Auswahl und Herstellung des Antigens
Der Fachmann hat eine Zahl von Wahlmöglichkeiten für Antigene, die in den Kombinationen dieser Erfindung verwendet werden. Das in der Kombination vorhandene induzierende Antigen trägt zu der Spezifität der tolerogenen ("tolerogenic") Antwort, die induziert wird, bei. Es kann, muss aber nicht, das gleiche sein, wie das Zielantigen, das das Antigen ist, das in der behandelten Person vorhanden ist oder in sie eingebracht werden soll, das ein Ziel der unerwünschten immunologischen Antwort ist und für das Toleranz angestrebt wird.
Ein induzierendes Antigen dieser Erfindung kann ein Polypeptid, Polynukleotid, Kohlenhydrat, Glycolipid oder ein anderes Molekül sein, isoliert aus einer biologischen Quelle, oder es kann ein chemisch synthetisiertes kleines Molekül, Polymer oder Derivat eines biologischen Materials sein, vorausgesetzt es hat die Fähigkeit, Toleranz gemäß dieser Beschreibung zu induzieren, wenn es mit der Mucosabindungskomponente kombiniert wird.
In bestimmten Ausführungsformen dieser Erfindung ist das induzierende Antigen ein einzelnes isoliertes oder rekombinant hergestelltes Molekül. Zum Behandeln von Zuständen, bei denen das Zielantigen über verschiedene Orte im Wirt verteilt ist, ist es allgemein notwendig, dass das induzierende Antigen identisch oder immunologisch verwandt mit dem Zielantigen ist. Beispiele solcher Antigene sind zumeist Polynukleotid-Antigene und einige Kohlenhydrat-Antigene (wie Blutgruppen-Antigene).
Wo das Zielantigen bevorzugt in einem bestimmten Organ, einer bestimmten Zelle oder einem bestimmten Gewebetyp exprimiert wird, hat der Fachmann wieder die Möglichkeit, ein induzierendes Antigen zu verwenden, das identisch oder immunologisch verwandt mit dem Zielantigen ist. Jedoch gibt es ebenfalls die zusätzliche Option, ein Antigen zu verwenden, das ein "Bystander" für das Ziel ist. Dies ist ein Antigen, das nicht immunologisch verwandt mit dem Zielantigen sein muss, aber das bevorzugt in einem Gewebe exprimiert wird, in dem das Zielantigen exprimiert wird. Eine Arbeitshypothese bezüglich der Wirksamkeit der "Bystander"-Suppression ist, dass die Suppression ein durch aktive Zellen vermittelter Prozess ist, der den Effektor-Zweig der Immunantwort bei den Zielzellen herunterreguliert. Die Suppressorzellen werden spezifisch durch das induzierende Antigen ("inducer antigen") an der Mucosaoberfläche stimuliert und kehren zu einer Gewebestelle zurück, an der das "Bystander"-Antigen bevorzugt exprimiert wird. Durch einen sich wechselseitig beeinflussenden oder Zytokin-vermittelten Mechanismus regulieren die lokalisierten Suppressorzellen dann die Effektor-Zellen (oder Inducer von Effektor-Zellen) in der Nachbarschaft her unter, unabhängig davon, wogegen diese reaktiv sind. Wenn die Effektor-Zellen spezifisch für ein Ziel sind, das von dem induzierenden Antigen verschieden ist, dann ist das Ergebnis eine "Bystander"-Wirkung. Für eine weitere Ausarbeitung der "Bystander"-Reaktion und eine Liste von tolerogenen ("tolerogenic") Peptiden, die diesen Effekt haben, wird der Leser auf die Internationale Patentveröffentlichung WO 93/16724 verwiesen. Eine Folge der "Bystander"-Theorie ist, dass ein Fachmann ein bestimmtes Zielantigen, gegen das Toleranz angestrebt wird, weder identifizieren noch isolieren muss, um die vorliegende Erfindung anzuwenden. Der Fachmann braucht nur in der Lage zu sein, mindestens ein Molekül, das bevorzugt an dem Zielort exprimiert wird, zur Verwendung als ein induzierendes Antigen zu erhalten.
Insulin-abhängiger Diabetes mellitus schließt einen Autoimmunangriff auf β-Zellen des Pankreas ein, das der Ort der Insulinproduktion ist. Es wird allgemein angenommen, dass das Ziel des Angriffs nicht das Insulin ist, sondern ein anderes Antigen, das von den β-Zellen exprimiert wird. Da jedoch Insulin, Glucagon und Amylin bevorzugt durch β-Zellen exprimiert werden, ist jedes von diesen als ein induzierendes Antigen für diese Erfindung geeignet. Gereinigtes Schweine- und Rinderinsulin und rekombinantes Humaninsulin sind kommerziell von vielen Quellen für das klinische und Veterinärmanagement des Glucosemetabolismus erhältlich: z.B. NovoNordisk, Connaught Laboratories, und Eli Lilly & Co.. Diese Zubereitungen können direkt in die Praxis dieser Erfindung implementiert werden oder das Insulin kann durch rekombinante Expression hergestellt werden. In bestimmten Ausführungsformen stammt das Insulin von der gleichen Spezies wie die Person bzw. das Subjekt, die bzw. das tolerant gemacht werden soll. In anderen Ausführungsformen stammt das Insulin von einer anderen Spezies als die Person bzw. das Subjekt, die bzw. das tolerant gemacht soll. Die Vorläuferform von Insulin (eine AAK-Sequenz umfassend, die die B-Kette mit der A-Kette verknüpft), andere Einzelketten-Formen und Formen, die ein Signalpeptid für die Sekretion enthalten, können ebenfalls verwendet werden.
In bestimmten Ausführungsformen dieser Erfindung hat das induzierende Antigen nicht die gleiche Form, wie sie in dem behandelten Individuum exprimiert wird, sondern es ist ein Fragment oder Derivat davon. Induzierende Antigene dieser Erfindung schließen Peptide ein, die auf einem Molekül geeigneter Spezifität basieren, das aber durch Fragmentierung, Restsubstitution, Markieren, Konjugation und/oder Fusion mit Peptiden, die andere funktionelle Eigenschaften haben, angepasst wurde. Die Anpassung kann für jegliche gewünschte Zwecke durchgeführt werden, einschließlich, aber nicht beschränkt auf, die Eliminierung jeglicher unerwünschten Eigenschaft, wie Toxizität oder Immunogenität, oder der Verstärkung jeglicher gewünschten Eigenschaft, z. B. die Mucosabindung, Mucosadurchdringung oder Stimulation des tolerogenen ("tolerogenic") Zweigs der Immunantwort. Begriffe wie Insulinpeptid, Kollagenpeptid und Myelin Basic Protein Peptid, wie sie hierin verwendet werden, beziehen sich nicht nur auf die intakte Untereinheit sondern auch auf allotypische und synthetische Varianten, Fragmente, Fusionspeptide, Konjugate und andere Derivate, die einen Bereich enthalten, der homolog (vorzugsweise zu 70 % identisch, stärker bevorzugt zu 80 % identisch und noch stärker bevorzugt zu 90 % identisch auf dem Aminosäurelevel) zu mindestens 10 und bevorzugt 30 aufeinander folgenden Aminosäuren des entsprechenden Moleküls ist, zu dem es analog ist, wobei der homologe Bereich des Derivats mit dem entsprechenden Stammmolekül eine Fähigkeit teilt, Toleranz gegenüber dem Zielantigen zu induzieren.
Es ist anerkannt, dass tolerogene ("tolerogenic") Bereiche eines induzierenden Antigens häufig verschieden von den immundominanten Epitopen für die Stimulation einer Antikörperantwort sind. Tolerogene ("tolerogenic") Bereiche sind allgemein Bereiche, die bei besonderen zellulären Wechselwirkungen, die T-Zellen einschließen, präsentiert werden können. Tolerogene ("tolerogenic") Bereiche können vorhanden sein und in der Lage sein, bei Präsentation des intakten Antigens Toleranz zu induzieren. Einige Antigene enthalten kryptische tolerogene ("tolerogenic") Bereiche, in denen die Reifung bzw. Prozessierung und Präsentationen des nativen Antigens normalerweise keine Toleranz auslöst. Eine ausführliche Darstellung von kryptischen Antigenen und ihrer Identifikation findet sich in der Internationalen Patentveröffentlichung WO 94/27634.
Eine Zerlegung des nativen Moleküls in immunstimulatorische und tolerogene ("tolerogenic") Bereiche ist gerechtfertigt, entweder wenn ein immunodominanter Bereich die tolerogene ("tolerogenic") Wirkung überschattet, oder wenn die einzigen tolerogenen ("tolerogenic") Bereiche kryptische sind, wie in vielen Allergenen. Die Zuordnung und die Auswahl des geeigneten tolerogenen ("tolerogenic") Fragments kann unter Verwendung eines der funktionellen Assays durchgeführt werden, die im nächsten Abschnitt beschrieben sind. Sowohl die A- als auch die B-Kette des Insulins induzieren Toleranz, wenn sie alleine verwendet werden, obwohl die B-Kette bei der Induktion etwas besser ist. Maßgebliche Fragmente der reifen B-Kette enthalten die Reste 1–12, 10–22 oder 11–30, aber die Reste 23–30 sind allein weniger wirksam.
Insulinanaloga können durch Verfahren, die im Stand der Technik bekannt sind, hergestellt werden, siehe z.B. Marki et al., Hoppe-Seyler's Z. Physiol. Chem. 360:1619–32, 1979; Kitagawa et al., Biochem. 23:4444–8, 1984; Schwartz et al., Biochem. 17:4550–6, 1978; Nakagawa et al., J. Biol. Chem. 266:11502–9, 1991; Schwartz et al., Int. J. Pept. Prot. Res. 17:243–55, 1981; Hu et al., Biochem. 32:2631–5. 1993; Nakagawa et al., J. Biol. Chem. 261:7332–410, 1986; und Riemen et al., Biochem. 22:1507–15, 1983.
Es ist oft unnötig und manchmal weniger wünschenswert, dass das induzierende Antigen funktionelle Wirksamkeit bzw. Aktivität hat, abgesehen von seiner Fähigkeit, als Toleranzinduzierendes Mittel zu wirken. Zum Beispiel dort, wo Toleranz gegenüber Insulin oder einem Insulin-"Bystander" gewünscht wird, schließt die Erfindung das Verwenden von metabolisch inaktiven Formen von Insulin, metabolisch inaktiven Insulinfragmenten und metabolisch inaktiven Insulinanaloga ein. Bevorzugte inaktive Formen haben nicht die Fähigkeit, die Blutzuckerspiegel innerhalb von 4 Stunden nach der Verabreichung signifikant zu senken, oder sind nicht ausreichend wirksam bzw. aktiv, um Typ-I-Diabetes zu behandeln, wenn sie in einer äquivalenten Dosis gegeben werden. Metabolisch inaktive Analoge und Fragmente schließen diejenigen ein, die eine Wirksamkeit bzw. Aktivität haben, die weniger als 7 %, bevorzugt weniger als 3 %, stärker bevorzugt weniger als 1 % und noch stärker bevorzugt weniger als 0,1 % der Wirksamkeit bzw. Aktivität ist, die von normalen Human-Insulin aufgewiesen wird. Verfahren zum Messen der Insulinwirksamkeit bzw. Aktivität schließen den euglykämischen Klemmenassay am Schwein ("euglycemic pig clamp assay"), den intravenösen Kaninchen-Blutglucose-Assay, den fettfreien, Zellassay an der Maus ("mouse fat free cell assay)"), den subkutanen Maus-Blutglucoseassay und Rezeptorbindungsassays unter Verwendung ganzer Zellen oder löslicher Rezeptoren ein (Anderson et al., J. Biol. Chem. 267:133681–6, 1992;Vølund et al., Diabetic Med. 8:839–47, 1991; Moody et al., Horm. Metab.Res. 6:12–6, 1974;Vølund, Biometrics 34:357–65, 1978; Brang et al., Diabet. Care 13:923–54, 1990; und Drejer, Diabet. Met. Rev. 8:259–86, 1992).
Beispielhaft genannte metabolisch inaktive Insulinanaloga schließen ein: X28; X38 (Asp^B25 Humaninsulin); M13; die A-Kette des Insulins; die B-Kette des Insulins; des(A1–A2)-Humaninsulin; des(A1–A3)-Humaninsulin; desA21-Humaninsulin; des(B1–B5)-Humaninsulin; des(B1–B6)-Humaninsulin; des(B23–B30)-Humaninsulin; des(B24B30)-Humaninsulin; des(B25–B30)-Humaninsulin; Gly^A2-Humaninsulin; A la^A2-Humaninsulin; Nle^A2-Humaninsulin;Thr^A2-Humaninsulin;Pro^A2-Humaninsulin; D-allo Ile^A2-Humaninsulin; Nva^A3-Humaninsulin; Leu^A3-Humaninsulin; Val^A2,Ile^A3-Humaninsulin;Abu^A2,Abu^A3-Humaninsulin; D-Cys^A6-Humaninsulin; D-Cys^A6, C-Cys^A11-Humaninsulin; Ser^A6, Ser^A11, des(A8–A10)-Humaninsulin; D-Cys^A7-Humaninsulin; D-Cys^A11-Humaninsulin;Leu^A19-Humaninsulin; Gly^B6-Humaninsulin; Glu^B12-Humaninsulin;Asn^B12-Humaninsulin;Phe^B12-Humaninsulin; und D-Ala^B12-Humaninsulin.
In bestimmten Ausführungsformen dieser Erfindung werden zwei, drei oder eine größere Vielzahl von induzierenden Antigenen verwendet. Es kann wünschenswert sein, diese Ausführungsformen zu implementieren, wenn es eine Vielzahl von Zielantigenen gibt oder um eine Vielzahl "Bystander" für das Ziel zur Verfügung zu stellen. Bei der Behandlung von Diabetes können z.B. sowohl Insulin als auch Glucagon mit einer Mucosabindungskomponente gemischt werden. Es kann ebenfalls wünschenswert sein, eine Mischung von Antigenen zur Verfügung zu stellen, um einige mögliche alternative Ziele abzudecken. Zum Beispiel könnte eine Mischung von Histokompatibilitätsantigenfragmenten verwendet werden, um eine Person in Erwartung einer zukünftigen Transplantation mit einem allogenen Transplanat unbekannten Phänotyps tolerant zu machen. Allovariante Bereiche der Humanleukozyten-Antigene sind im Stand der Technik bekannt: z.B. Immunogenetics 29:231, 1989. In einem anderen Beispiel kann eine Mischung von Allergenen als induzierendes Antigen für die Behandlung einer Atopie beginnen.
Induzierende Antigene können mittels einer Zahl von Techniken, die im Stand der Technik bekannt sind, abhängig von der Beschaffenheit des Moleküls, hergestellt werden. Polynukleotid-, Polypeptid- und Kohlenhydrat-Antigene können aus denjenigen Zellen der zu behandelnden Spezies isoliert werden, in denen sie angereichert sind. Kurze Peptide werden bequem durch Aminosäuresynthese hergestellt. Längere Proteine bekannter Sequenz können durch Synthetisieren einer codierenden Sequenz oder PCR-Vermehrung einer codierenden Sequenz aus einer natürlichen Quelle oder einem Vektor und anschließendem Exprimieren der codierenden Sequenz in einer geeigneten bakteriellen oder eukaryotischen Wirtszelle hergestellt werden.
In bestimmten Ausführungsformen dieser Erfindung umfasst die Kombination eine komplexe Mischung von Antigenen, erhalten aus einer Zelle oder einem Gewebe, von denen eines oder mehrere die Rolle des induzierenden Antigens spielen. Die Antigene können in der Form ganzer Zellen, entweder intakt oder mit einem Fixierungsmittel, wie Formaldehyd, Glutaraldehyd oder Alkohol, behandelt, vorliegen. Die Antigene können in der Form eines Zelllysats, hergestellt durch Tensidsolubilisierung oder mechanisches Aufbrechen von Zellen oder Gewebe, gefolgt von Klärung, vorliegen. Die Antigene können auch durch subzelluläre Fraktionierung erhalten werden, insbesondere durch eine Anreicherung der Plasmamembran mittels Techniken, wie Differentialzentrifugation, optional gefolgt von Tensidsolubilisierung und Dialyse. Andere Trenntechniken sind ebenfalls geeignet, wie Affinitäts- oder Ionenaustauschchromatographie von solubilisierten Membranproteinen.
Antigene können auch in der Form von Nahrungsmittelprodukten vorliegen, die gegessen werden, und die Antigene können während der Verdauung in die Mucosa freigesetzt werden. Solche Nahrungsmittelprodukte schließen diejenigen ein, die Getreidekörner, Samen oder Nüsse oder verwandte Produkte, wie Öle, Milch oder Feststoffe der Milch, Käse, Früchte, Gemüse, Meeresfrüchte, Gewürze und Eier, oder verwandte Produkte, wie Eiweiß und Albumin, enthalten. Ebenfalls eingeschlossen sind Nahrungsmittelprodukte, die auf kleinen Molekülen basierende Verbindungen enthalten, die ein Ziel für Hypersensitivität sind – z.B. Farbstoffe, wie die gelben Farbstoffe FD&C Yellows 5 & 6, und Konservierungsstoffe, Nebenprodukte und Geschmacksverstärker, wie Sulfate und Mononatriumglutamat. Antigene können auch exprimiert werden oder in dem Individuum vorhanden sein als Antwort auf oder in Verbindung mit einem pathologischen Zustand, wie diejenigen, die mit Mucosastörungen bzw. -krankheiten assoziiert sind. Beispielhaft genannte Mucosastörungen bzw. -krankheiten schließen entzündliche Darmerkrankung, Reizdarmkrankheit, Colitis ulcerosa, Zöliakie und Morbus Crohn ein.
Mischungen von Antigenen aus Zellen oder Geweben sind in einer Zahl von Anwendungen dieser Erfindung von besonderem Interesse. Zum Beispiel: (1) zur Behandlung von organospezifischen Autoimmunkrankheiten, bei denen die Identität des Zielantigens oder eines geeigneten "Bystander"-Antigens unbekannt ist, oder um eine Vielzahl von Antigenen zur Verfügung zu stellen, um die tolerogene ("tolerogenic") Antwort zu erhöhen. Geeignete Quellen von Zellen für diesen Zweck würde eine Biopsie-Probe des gleichen Gewebes der zu behandelnden Person sein, oder eine kultivierte Zelllinie des gleichen Gewebetyps; (2) um einen Empfänger einer geplanten Gewebetransplantation tolerant zu machen. Wo der Phänotyp des Donors zum Zeitpunkt der Tolerantmachung bekannt ist, wird die Zellquelle bevorzugt entweder von dem Donor oder einem Individuum, das mindestens einen Haupthistokompatibili tätskomplex-Allotyp mit dem Donor teilt, erhalten. Bei Menschen werden bevorzugt zwei oder mehr Allotypen an dem HLA-A/B- und HLA-DR-Locus geteilt (in der Reihenfolge zunehmender Präferenz bei der Behandlung einer Transplantatabstoßung; in der Reihenfolge abnehmender Präferenz bei der Behandlung einer Transplantat-gegen-Empfänger-Reaktion). Für das Tolerant-Machen gegen Antigene der Histokompatibilitätsklasse II (das übliche Ziel einer akuten Abstoßung eines allogenen Transplantats) sind mononukleäre Zellen des periphären Bluts, Milzzellen oder Lymphknotenzellen besonders geeignet. Für das Tolerantmachen gegen Kohlenhydrat-Antigene (das übliche Ziel einer hochakuten Abstoßung eines xenogenen Transplantats) ist es angemessen, irgendeinen Zelltyp zu verwenden, der am Ziel angereichert ist, wie Endothelzellen oder Leukozyten. Wo der Phänotyp des Donors zum Zeitpunkt des Tolerantmachens unbekannt ist, ist es passend, eine Mischung von Zellen (wie mononukleäre Leukozyten) zu verwenden, die von verschiedenen Mitgliedern einer durch Kreuzung nicht-verwandter Individuen entstandenen Population der gleichen Spezies genommen wurden.
Aufbau und Testen der Kombination
Die Kombinationen dieser Erfindung werden durch Kombinieren von einem oder mehreren induzierenden Antigenen mit einer oder mehreren Mucosabindungskomponenten aufgebaut. Dies wird am zweckmäßigsten in einen relativ neutralen wässrigen Lösungsmittel oder Puffer, wie Wasser, isotonische Salzlösung, Phosphatpuffer oder Hydrogencarbonat, oder irgendeinem pharmakologisch- und physiologisch-kompatiblen Exzipiens durchgeführt. Wo die Kombination gelagert werden soll oder in fester Form verabreicht werden soll, können die Komponenten als Feststoffe kombiniert werden, die es erlauben, dass sich die Mischung bei Resuspendierung oder Auflösung bildet.
Das induzierende Antigen/die induzierenden Antigene und die Mucosabindungskomponente(n) werden in dem Verhältnis einer wirksamen Kombination kombiniert. Allgemein wird eine wirksame Kombination zwischen etwa 100:1 und etwa 1:100, bezogen auf das Gewicht, sein; gewöhnlich wird sie zwischen etwa 20:1 und etwa 1:20, bezogen auf das Gewicht, sein, und typischerweise wird sie zwischen etwa 5:1 und etwa 1:5, bezogen auf das Gewicht, sein. Ein guter Ausgangspunkt für das Testen neuer Kombinationen ist ein Gewichtsverhältnis von etwa 1:1. Nach dem Kombinieren wird die Mischung geteilt, falls erforderlich, so dass jeder Teil die Antigenmenge enthält, die für eine einzelne Verabreichung gewünscht wird.
Kombinationen können auf ihre Fähigkeit hin getestet werden, Toleranz zu fördern, indem Versuche mit isolierten Zellen oder in Tiermodellen durchgeführt werden.
Stellvertretend für tolerogene ("tolerogenic") Wirksamkeit bzw. Aktivität ist die Fähigkeit eines intakten Antigens oder Fragments, die Produktion eines geeigneten Zytokins an dem Zielort zu stimulieren. Es wird angenommen, dass das immunoregulatorische Zytokin, das durch T-Suppressor-Zellen an dem Zielort freigesetzt wird, TGF-β ist (Miller et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:421, 1982). Andere Faktoren, die während der Toleranz produziert werden können, sind die Zytokine IL-4 und IL-10 und der Mediator PGE. Im Gegensatz dazu sezernieren Lymphozyten in Geweben, die einer aktiven Immun-Zerstörung unterliegen, Zytokine, wie IL-1, IL-2, IL-6 und γ-IFN. Daher kann die Wirksamkeit eines induzierenden Antigen-Kandidaten bewertet werden, indem seine Fähigkeit gemessen wird, den geeigneten Zytokin-Typ zu stimulieren.
Mit Blick darauf kann ein schneller Screening-Test für tolerogene ("tolerogenic") Epitope des induzierenden Antigens, wirksame Mucosabindungskomponenten, wirksame Kombinationen oder wirksame Arten und Zeitpläne der Mucosaverabreichung unter Verwendung syngenetischer Tiere als Donoren für in vitro-Zell-Assays durchgeführt werden. Tiere werden an der Mucosaoberfläche mit der Testzusammensetzung behandelt und zu irgendeiner Zeit mit einer parenteralen Verabreichung des Zielantigens in komplettem Freund'schem Adjuvans stimuliert. Milzzellen werden isoliert und in vitro in Gegenwart des Zielantigens bei einer Konzentration von etwa 50 μg/ml kultiviert. Das Zielantigen kann durch Kandidaten-Proteine oder Unterfragmente ersetzt werden, um den Ort der tolerogenen ("tolerogenic") Epitope zu kartieren. Die Zytokinabscheidung in das Medium kann durch einen Standardimmunoassay quantifiziert werden.
Die Fähigkeit der Zellen, die Aktivität anderer Zellen zu unterdrücken, kann unter Verwendung von Zellen, die aus einem mit dem Zielantigen immunisierten Tier isoliert wurden, bestimmt werden, oder durch Schaffen einer Zelllinie, die auf das Zielantigen anspricht (Ben-Nun et al., Eur. J. Immunol. 11:195, 1981). In einer Variation dieses Versuchs wird die Suppressor-Zellpopulation schwach bestrahlt (etwa 1000 bis 1200 Rad), um die Proliferation zu verhindern, die Suppressoren werden mit den Responder-Zellen co-kultiviert und dann wird der Einbau von Tritium-markiertem Thymidin (oder MTT) verwendet, um die Proliferationsaktivität der Responder zu quantifizieren. In einer anderen Variation werden die Suppressor-Zellpopulation und die Responder-Zellpopulation in den oberen und unteren Leveln eines Zweikammer-Transwell-Kultursystems ("dual chamber transwell culture system") (Costar, Cambridge MA) kultiviert, was es ermöglicht, die Populationen innerhalb 1 mm voneinander zu co-inkubieren, getrennt durch eine Polycarbonat-Membran (WO 93/16724). Bei dieser Vorgehensweise ist die Bestrahlung der Suppressor-Zellpopulation unnötig, da die Proliferationsaktivität der Responder getrennt gemessen werden kann.
In den Ausführungsformen der Erfindung, in denen das Zielantigen bereits in dem Individuum vorhanden ist, besteht keine Notwendigkeit, das Antigen zu isolieren oder es zuvor mit der Mucosabindungskomponente zu kombinieren. Zum Beispiel kann das Antigen in dem Individuum in einer bestimmten Weise als ein Ergebnis eines pathologischen Zustands (wie entzündliche Darmerkrankung oder Zöliakie) oder durch Verdauung eines Nahrungsmittelallergens exprimiert werden. Das Testen wird durchgeführt, indem die Mucosabindungskomponente in einer oder mehreren Dosen oder Formulierungen gegeben wird und ihre Fähigkeit, die Tolerantmachung gegen das Antigen in situ zu fördern, bestimmt wird.
Die Wirksamkeit der Zusammensetzungen und Verabreichungsweisen zur Behandlung einer spezifischen Krankheit kann auch in einem entsprechenden Tierkrankheitsmodell ausgearbeitet werden. Die Fähigkeit der Behandlung, die Symptomatologie der Krankheit zu vermindern oder zu verzögern, wird auf dem Niveau von zirkulierenden biochemischen und immunologischen Kennzeichen der Krankheit, der Immunhistologie des betroffenen Gewebes und groben klinischen Merkmalen überwacht, wie es für das verwendete Modell angemessen ist. Nicht-einschränkende Beispiele von Tiermodellen, die für das Testen verwendet werden können, sind in dem folgendem Abschnitt eingeschlossen.
Spezifische Tolerisierung für Behandlungszwecke
Die Zusammensetzungen und Verfahren dieser Erfindung können zur Anwendung gebracht werden, wann immer es wünschenswert ist, eine unerwünschte immunologische Antwort abzuwenden oder zu unterdrücken. Dies ist bei der Behandlung einer Zahl von Human- und Veterinärzuständen angebracht.
Die Behandlung wird durchgeführt, indem eine wirksame Kombination aus Mucosabindungskomponente und Antigen in einer wirksamen Menge verabreicht wird. Eine pharmazeutische Zusammensetzung oder ein Behandlungsprotokoll ist wirksam, wenn es nach einer oder mehreren Verabreichungen in einem günstigen oder gewünschten klinischen Ergebnis resultiert.
Bestimmte Ausführungsformen dieser Erfindung beziehen sich auf das Bewirken von Immuntoleranz bei einem Individuum, das nicht zuvor durch therapeutisches Eingreifen tolerant gemacht wurde. Diese Ausführungsformen schließen im Allgemeinen eine Vielzahl von Verabreichungen einer Kombination aus Antigen und Mucosabindungskomponente ein. Typischerweise mindestens drei Verabreichungen, oft mindestens vier Verabreichungen und manchmal mindestens sechs Verabreichungen, werden während des Primings durchgeführt, um ein lang anhaltendes Ergebnis zu erzielen, obwohl die Person früh im Verlauf der Behandlung Toleranzmanifestationen zeigen kann. Am häufigsten wird jede Dosis als eine Bolus-Verabreichung gegeben, aber anhaltende Formulierungen, die zu einer Mucosa-Freisetzung in der Lage sind, sind ebenfalls geeignet. Wo Mehrfachverabreichungen durchgeführt werden, liegt die Zeit zwischen den Verabreichungen allgemein zwischen 1 Tag und 3 Wochen und typischerweise zwischen etwa 3 Tagen und 2 Wochen. Allgemein sind das gleiche Antigen und die Mucosabindungskomponente in der gleichen Konzentration vorhanden, und die Verabreichung wird auf die gleiche Mucosaoberfläche gegeben, aber Variationen von jeder dieser Variablen können während eines Verlaufs der Behandlung untergebracht werden.
Andere Ausführungsformen dieser Erfindung beziehen sich auf das Auffrischen oder Ausweiten der Fortdauer einer zuvor etablierten Immuntoleranz. Diese Ausführungsformen beinhalten im Allgemeinen eine Verabreichung oder einen kurzen Verlauf der Behandlung zu einer Zeit, wenn die etablierte Toleranz abnimmt oder das Risiko besteht, dass sie abnimmt. Das Auffrischen wird allgemein einen Monat bis 1 Jahr und typischerweise 2 bis 6 Monate nach dem Priming oder einer vorhergehenden Auffrischung durchgeführt. Diese Erfindung schließt auch Ausführungsformen ein, die die regelmäßige Aufrechterhaltung der Toleranz in einem Zeitplan von Verabreichungen einschließt, die halb-wöchentlich, wöchentlich, zweiwöchig oder in jedem anderen regelmäßigen Zeitplan erfolgen.
Diese Erfindung zieht Behandlungskombinationen in Betracht, in denen hier beschriebene Ausführungsformen simultan oder sequenziell mit anderen Arten zum Induzieren von Toleranz oder anderem Behandeln des klinischen Zustands verwendet werden. Dies schließt die Mucosaverabreichung des Antigens allein, der Mucosabindungskomponente allein oder kovalenter Konjugate von Antigen und Mucosabindungskomponente oder intravenöse Verabreichung von tolerogenen ("tolerogenic") Substanzen jeglicher Art ein, ist aber nicht darauf beschränkt.
Die Behandlung ist allgemein wirksamer zum Verhindern der schwersten Konsequenzen einer immun-vermittelten Krankheit, wenn sie auf einer prophylaktischen Basis durchgeführt wird. Es gibt einige Gründe dafür. Erstens, kann die Tolerisierung wirksamer darin sein, den Ausbruch einer unerwünschten immunologischen Reaktion zu beschränken, als ihn rückgängig zu machen. Zweitens, kann eine unerwünschte immunologische Reaktion ein Zielorgan oder Gewebe irreversibel schädigen. Zum Beispiel werden die Insulin-sezernierenden β-Zellen des Pankreas beim Typ-I-Diabetes eliminiert. Demgemäß ist es häufig angemessen, eine prophylaktische Verabreichung bei einer Person zu beginnen, bei der festgestellt wurde, dass ein ausreichendes Risiko für die Krankheit aufgrund der Familiengeschichte, aufgrund von biochemischen, immunologischen oder genetischen Markern oder früheren klinischen Merkmalen besteht.
Nichtsdestoweniger wird der behandelnde Arzt auch die Möglichkeiten zur Anwendung dieser Erfindung in der Behandlung einer aktiven Krankheit erkennen. Die Linderung des Zustands ist sicherlich ein wertvolles Ergebnis, sogar wenn eine vollständige Aufhebung nicht möglich ist. Eine fortschreitende Pathologie, die einer immunologischen Reaktion zugeordnet werden kann, kann von der Tolerisierung profitieren – wie bei systemischem Lupus, rheumatoider Arthritis oder Mucosastörungen bzw. -kankheiten, wie entzündliche Darmerkrankung, Reizdarmerkrankung, Zöliakie oder Morbus Crohn. Es kann sich lohnen, Diabetes im aktiven Zustand zu behandeln, indem Toleranz hervorgerufen wird, wenn die β-Zell-Zerstörung nicht vollständig ist, wo es einen Antikörper gibt, der die Wirksamkeit des zur Regulation des Glucosemetabolismus verabreichten Insulins vermindert oder wo eine β-Zelltransplantation geplant ist. Andere Hypersensitivitätsantworten, wie Nahrungsmittelallergien, können durch eine Quelle des Zielantigens hervorgerufen werden, z.B. durch Essen von Nahrungsmitteln, von denen bekannt ist, dass sie eine solche Antwort in dem Individuum stimulieren. Die Behandlung gemäß dieser Erfindung würde die Verabreichung der Mucosabindungskomponente an die sensibilisierte Mucosaoberfläche etwa zu der Zeit, wenn eine Exposition wahrscheinlich ist, einschließen.
Veranschaulichung der Krankheiten, die durch spezifische Tolerisierung behandelbar sind
Die Zusammensetzungen und Verfahren zum Induzieren spezifischer immunologischer Toleranz, die hierin offenbart sind, können im Management einer Zahl verschiedener Zustände zur Anwendung gebracht werden. Was folgt, sind nicht-einschränkende Veranschaulichungen von bestimmten Zuständen von Interesse.
Bestimmte Ausführungsformen dieser Erfindung beziehen sich auf die Behandlung von pathologischen Zuständen, in denen Autoimmunität eine Rolle spielt. Autoimmunkrankheiten können als organspezifisch und systemisch charakterisiert werden. Die Pathologie kann Antikörper-vermittelte oder Zell-vermittelte Cytolyse des betroffenen Gewebes, entzündliche Zerstörung, vermittelt durch T-Helfer/Inducer-Zellen, Ablagerung von Immunkomplexen und Antikörper-vermitteltes Rezeptor-Auslösen oder -Blockieren einschließen. Nichteinschränkende Beispiele von Zuständen, die gemäß dieser Erfindung behandelt werden können, schließen Folgende ein.
Für Collagen-Typen, die als induzierende Antigene für andere klinische Zustände geeignet sind, wird der Leser auf die Internationale Patentveröffentlichung WO 96/21458 verwiesen.
Eine Zahl von Tiermodellen für Autoimmunzustände wurden im Stand der Technik entwickelt. Zum Beispiel Insulin-pflichtiger Diabetes (Martin et al., J. Autoimmunity 9:637, 1996; Yang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:10494, 1993; von Herrath et al., J. Clin. Invest. 98:1324, 1996; und Beispiele 1 and 3), Arthritis (Zeidler et al., Autoimmunity 21:245, 1995; WO 96/21458; Pearson et al., J. Chronic Dis. 16:863, 1963; und Beispiel 4), Multiple Sklerose (Alvord et al., "Experimental Allergic Encephalomyelitis..", Allan R. Liss NY, 1984; und Beispiel 4), und autoimmune Uveoretinitis (WO 91/01333).
Andere Ausführungsformen dieser Erfindung beziehen sich auf die Behandlung von pathologischen Zuständen, betreffend eine unerwünschte Hypersensitivität. Die Hypersensitivität kann irgendeine der Typen I, II, III und IV sein. Unmittelbare (Typ I) Hypersensitivität wird typischerweise unter Verwendung von einem oder mehreren angreifenden allergenen oder tolerogenen ("tolerogenic") Fragmenten davon als dem induzierenden Antigen behandelt. Die Häufigkeit der Verabreichung wird typischerweise mit der Zeitvorgabe der Allergenexposition übereinstimmen. Geeigneter Tiermodelle sind im Stand der Technik bekannt (z.B. Gundel et al., Am. Rev. Respir. Dis. 146:369, 1992; Wada et al., J. Med. Chem. 39, 2055, 1996; und WO 96/35418).
Andere Ausführungsformen dieser Erfindung beziehen sich auf die Transplantation. Dies bezieht sich auf die Übertragung einer Gewebeprobe oder eines Transplantats von einem Donorindividuum auf ein Empfängerindividuum und wird häufig bei menschlichen Empfängern durchgeführt, die das Gewebe brauchen, um eine physiologische Funktion wieder herzustellen, die durch das Gewebe bereitgestellt wird. Gewebe, die transplantiert werden, schließen (aber sind nicht darauf beschränkt) ganze Organe, wie Niere, Leber, Herz, Lunge, Organkomponenten, wie Hauttransplantate und die Cornea des Auges, und Zellsuspensionen, wie Knochenmarkzellen und Kulturen von Zellen, die ausgewählt und ausgebreitet sind von dem Knochenmark oder dem zirkulierenden Blut, und Vollblut-transfusionen ein.
Eine ernsthafte mögliche Komplikation jeder Transplantation folgt aus den Antigenunterschieden zwischen dem Wirtsempfänger und dem verpflanzten Gewebe. Abhängig von der Natur und dem Grad des Unterschiedes kann das Risiko eines immunologischen Angriffs auf das Transplantat durch den Wirt oder auf den Wirt durch das Transplantat oder beides auftre ten. Das Ausmaß des Risikos wird bestimmt, indem dem Antwortmuster in einer Population von ähnlich behandelten Personen mit einem ähnlichen Phänotyp gefolgt wird und die verschiedenen möglichen beitragenden Faktoren gemäß gut akzeptierten klinischen Vorgehensweisen korreliert werden. Der immunologische Angriff kann das Ergebnis einer zuvor bestehenden immunologischen Antwort (wie vorgebildete Antikörper) sein oder eines, das etwa zum Zeitpunkt der Transplantation ausgelöst wird (wie die Erzeugung von T_H-Zellen). Antikörper, T_H-Zellen oder T_C-Zellen können in jeglicher Kombination miteinander und mit verschiedenen Effektormolekülen und -zellen beteiligt sein.
Es ist eine Aufgabe dieser Erfindung, Materialien und Vargehensweisen bereitzustellen, die es erlauben, dass eine Transplantation gemäß den Standard-chirurgischen Vorgehensweisen durchgeführt wird, aber mit vermindertem Risiko einer schädlichen immunologischen Reaktion gegen den Empfänger des Transplantats. Die Vorgehensweisen beinhalten die Tolerisierung des Empfängers gegen die Gewebe des Donors oder umgekehrt oder beides. Die Tolerisierung wird durchgeführt, indem ein Zielantigen, das in dem transplantierten Gewebe exprimiert wird, oder ein "Bystander"-Antigen in einer nicht-konjugierten Kombination mit einem Mucosabindungsprotein verabreicht wird. Die Leichtigkeit der Herstellung einer wirksamen Kombination bedeutet, dass sie kurzfristig, maßgeschneidert gemäß dem Phänotyp des Donors und des Empfängers, hergestellt werden kann. Das Transplantat kann eine komplexe Struktur von vielen verschiedenen Zelltypen sein und einer oder mehrere der Zelltypen, die in das Individuum transplantiert wurden, kann/können ein Risiko, für das die Vorgehensweisen dieser Erfindung angebracht sind, aufwerfen. Zum Beispiel komplizieren Endothelzell-Antigene Nierentransplantate, und "Passenger-Lymphozyten" komplizieren Lebertransplantate.
Bestimmte Ausführungsformen der Erfindung beziehen sich auf das Verringern des Risikos einer Wirt-gegen-Transplantat-Reaktion, die zu einer Abstoßung des Gewebetransplantats durch den Empfänger führt. Die Behandlung kann durchgeführt werden, um die Wirkung einer hochakuten, akuten oder chronischen Abstoßungsantwort zu verhindern oder zu verringern. Die Behandlung wird bevorzugt ausreichend weit im voraus vor der Transplantation begonnen, so dass Toleranz bestehen wird, wenn das Transplantat eingesetzt wird; aber wo dies nicht möglich ist, kann die Behandlung simultan oder auf das Transplantat folgend begonnen werden. Ungeachtet der Zeit des Beginns wird die Behandlung allgemein in regelmäßigen Intervallen für mindestens den ersten auf die Transplantation folgenden Monat fort gesetzt werden. Folgedosen müssen nicht erforderlich sein, wenn eine ausreichende Anpassung des Transplantats auftritt, aber sie sollten wieder aufgenommen werden, wenn es irgendeinen Beweis einer Abstoßung oder Entzündung des Transplantats gibt. Natürlich können die Tolerisierungs-Vorgehensweisen dieser Erfindung mit anderen Formen der Immunsuppression kombiniert werden, um sogar ein noch niedrigeres Risikoniveau zu erreichen.
In einem Beispiel besteht bei einer xenogenen Transplantation von Schweinenieren in eine andere Spezies das Risiko einer hochakuten Abstoßung hauptsächlich, aber nicht ausschließlich aufgrund von vorgebildeten Antikörpern gegen das Trisaccharid Galα1-3Galβ1-4GlcNacβ1-, das auf den Nierenendothelzellen exprimiert wird. Demgemäß kann der Empfänger in Erwartung eines allogenen Transplantats vom Schwein im voraus unter Verwendung einer Zusammensetzung, in der das Trisaccharid das induzierende Antigen ist, tolerant gemacht werden. Alternativ kann ein Endothelzellextrakt vom Schwein verwendet werden, um die Tolerisierung zu fördern, nicht nur gegen das dominante Trisaccharid sondern auch gegen andere Trisaccharide, xenogenetische Derminanten auf Histokompatibilitätsantigenen und unvorhergesehene Antigenfehlanpassungen. In einem zweiten Beispiel besteht bei einem allogenen zwischen-menschlichen Nierentransplanat das Risiko einer akuten (hauptsächlich T_H-vermittelten) Abstoßungsantwort aufgrund von Diskordanz der Antigene der Histokompatibilitätsklasse II. Demgemäß könnte die Tolerisierung des Empfängers vor, während oder nach der Transplantation durchgeführt werden, unter Verwendung eines isolierten oder rekombinanten Humanleukozyten-Antigens (HLA) Klasse II des Donorphänotyps. Alternativ könnten Zellen oder ein Zellextrakt des Donors als das induzierende Antigen verwendet werden, um sowohl gegen Klasse II-Diskordanz und andere Fehlanpassungen tolerant zu machen. Ein bevorzugter Zelltyp für diese Anwendung würde vorzugsweise Klasse II-Antigene auf beträchtlichem Niveau, insbesondere B-Zellen, Monozyten und Makrophagen exprimieren. Diese Zellen können aus dem peripheren Blut (falls verfügbar), aus Lymphknoten oder aus der Milz erhalten werden. Eine mononukleäre Leukozytenpopulation (erhalten durch Zentrifugation auf einem Medium wie Hostopaque Ficoll^TM) wird allgemein gut mit Klasse II-Antigenen angereichert sein. Es ist auch möglich, eine Person auf einer Transplationswarteliste gegenüber einer Zahl von möglichen Donoren prä-tolerant zu machen ("pre-tolerize"), indem eine Mischung von rekombinanten HLA-Antigenen oder ein Extrakt einer gemischten Leukozytenpopulation von einer Zahl verschiedener Donoren gegeben wird.
Bestimmte Ausführungsformen dieser Erfindung beziehen sich auf das Verringern des Risikos einer Transplantat-gegen-Empfänger-Reaktion. In diesen Reihen von Ausführungsformen ist es notwendig, einen lebenden Donor gegen ein Zielantigen des zukünftigen Transplantat-Empfängers tolerant zu machen, bevor die Transplantation stattfindet. Wenn die Toleranz einmal erreicht ist, werden die Zellen oder Gewebe des Donors geerntet und die Transplantation wird durchgeführt.
In einem Beispiel wird ein nicht-autologer Knochenmarkdonor gegenüber den Geweben des Empfängers prä-tolerant gemacht ("pre-tolerized"), wobei die Lymphozyten in dem Transplantat daran gehindert werden, eine systemische Transplanat-gegen-Empfänger-Reaktion zu erzeugen, wo der Empfänger immungeschwächt ist. Da die Transplantat-gegen-Empfänger-Reaktion typischerweise gegen Humanleukozyten-Antigene gerichtet ist, ist das isolierte oder rekombinante HLA des Empfänger-Phänotyps oder ein Leukozytenextrakt vom Empfänger ein geeignetes induzierendes Antigen für die Zusammensetzung, die dem Donor gegeben wird. Das Anwenden der traditionellsten nicht-spezifischen Formen der Immunsuppression bei der Donorquelle würde mit den Zielen der Transplantation nicht vereinbar sein. Die Vorgehensweisen dieser Erfindung sind dadurch vorteilhaft, dass die induzierte Toleranz spezifisch ist, und sie sollten die Funktion des Transplantats nicht störend beeinflussen. In einem anderen Beispiel wird die hämolytische Aktivität aufgrund von Passenger-Lymphozyten ("passenger lymphocytes") spezifisch für Blutgruppen-Antigene in Lebertransplanaten minimiert, indem die Donorperson unter Verwendung von Antigenen oder roten Blutkörperchen des Empfängertyps tolerant gemacht wird.
Pharmazeutische Zusammensetzungen und ihre Verabreichung
Die Zusammensetzungen dieser Erfindung können für die Verabreichung an ein Individuum hergestellt werden, das deren bedarf, insbesondere menschliche Personen, die eine unerwünschte Immunantwort haben. Die Herstellung der Zusammensetzungen und ihre Verwendung wird in Übereinstimmung mit allgemein akzeptierten Verfahrensweisen für die Herstellung von pharmazeutischen Zusammensetzungen durchgeführt.
In bestimmten Ausführungsformen dieser Erfindung werden die Mucosabindungskomponente und das Antigen oder die Antigenmischung zusammen gegeben. Die Komponenten werden typischerweise in einem wirksamen Anteil innerhalb einer einzelnen pharmazeutischen Zusammensetzung kombiniert, oder durch Mischen direkt vor der Verabreichung. In anderen Ausführungsformen wird die Mucosabindungskomponente als eine von dem Antigen getrennte Formulierung verabreicht. Zum Beispiel, wenn das Antigen eine Nahrungsmittelkomponente ist, kann die Mucosabindungskomponente mit dem Lebensmittel gegeben werden oder während einer Dauer, die dem Nahrungsmittel vorausgeht oder folgt, und die es der Mucosabindungskomponente ermöglicht, die Toleranz gegenüber der Komponente zu fördern. Die Mucosabindungskomponente und das induzierende Antigen werden zeitlich so nah wie praktikabel beieinander gegeben; bevorzugt innerhalb von weniger als etwa 6 Stunden und stärker bevorzugt innerhalb von weniger als 30 Minuten. In einem anderen Beispiel wird ein Autoantigen, das bereits auf der Mucosaoberfläche vorhanden ist, mit einer Formulierung ergänzt, die die Mucosabindungskomponente enthält.
Vorgehensweisen zum Herstellen pharmazeutischer Zusammensetzungen sind in Remington's Pharmaceutical Sciences, E.W. Martin Hrsg., Mack Publishing Co., PA beschrieben. Die Mucosabindungskomponente und das Antigen (ob sie getrennt oder zusammen gegeben werden) werden optional mit anderen wirksamen bzw. aktiven Komponenten, Trägern und Exzipienzien und Stabilisatoren kombiniert. Zusätzliche aktive bzw. wirksame Komponenten von Interesse sind Mittel, die die tolerogene ("tolerogenic") Wirkung der Kombination an der Mucosaoberfläche verstärken. Ein Beispiel einer zusätzlichen aktiven bzw. wirksamen Komponente ist ein Zytokin, beispielhaft dargestellt durch IL-4. Obwohl nicht erforderlich, können die pharmazeutischen Zusammensetzungen in einer Einheitsdosierungsform, die für die Verabreichung einer genauen Menge geeignet ist, bereitgestellt werden.
Bestimmte Ausführungsformen dieser Erfindung beziehen sich auf Kits und Reagenzien, in denen eine oder mehrere Komponente(n) in einem getrennten Behälter, optional mit geschriebenen Anweisungen, für den Aufbau einer pharmazeutischen Zusammensetzung durch den Patienten oder den verabreichenden Mediziner bereitgestellt werden. In einem Beispiel werden ein induzierendes Antigen und eine Mucosabindungskomponente in getrennten Behältern eines Kits bereitgestellt, um direkt vor der Verabreichung kombiniert zu werden. In einem zweiten Beispiel, das für eine Transplantation von Interesse ist, wird ein Panel von möglichen induzierenden Antigenen (angenommen, ein Panel von rekombinanten HLA-Antigenen oder Leukozyten-Extrakten von verschiedenen Donoren) zusammen mit einer Mucosabindungskomponente bereitgestellt, so dass der verabreichende Fachmann das geeignete induzierende Antigen zur Verwendung in der Zusammensetzung wählen kann. In einem dritten Beispiel wird ein Mucosabindungsprotein für sich bereitgestellt, optional mit anderen Inhaltsstoffen, wie Puffern und Co-Faktoren, wie IL-4, für Zwecke des Kombinierens mit dem induzierenden Antigen, insbesondere Zellen oder einem Zellextrakt, der zeitnah zur Verabreichung durch den Fachmann hergestellt wurde.
Da die Zusammensetzungen für die Mucosaverabreichung vorgesehen sind, ist es nützlich, Zusammensetzungen herzustellen, die nicht nur über die erwartete Lagerdauer hinweg stabil sind, sondern die auch resistent gegen pH-Extreme, Enzyme und andere Angriffe der Mucosaumgebung sind. Zum Beispiel können Bindemittel, die Peptide zusammenhalten, ohne ihre Fähigkeit, zu binden oder die Mucosaoberfläche zu durchdringen zu schaden, ein hilfreicher Zusatz sein.
Insulin wird durch die Gegenwart von Metallkationen, insbesondere Zink, stabilisiert. In neutralen oder mäßig alkalischen Lösungen (typisch für den Darm) ist die vorherrschende Form von Insulin ein Hexamer mit etwa zwei Zinkionen pro Hexamerkomplex. An der Polymerassoziation sind hauptsächlich die nicht-polaren Reste des Insulinmonomers beteiligt, was eine Oberfläche hinterlässt, die fast vollständig polar ist. Demgemäß wird die Verwendung von ausreichend Metallkation, insbesondere Zink, für Zusammensetzungen, die Insulin enthalten, empfohlen. Viele kommerzielle Insulinpräparate kommen mit einer bestimmten Menge von bereits vorhandendem Zink, aber andere tun dies nicht und werden daher ergänzt werden müssen, wenn sein Vorhandensein gewünscht ist. Die erforderliche Menge ist 0,38 Gew.-% für zwei Zinkionen pro Insulinhexamer oder 0,76 Gew.-% für vier pro Hexamer.
Ohne zu beabsichtigen, durch die Theorie eingeschränkt zu werden, ist ein möglicher Grund, dass das Insulin, das Zink enthält, in bestimmten Ausführungsformen besser arbeitet als Insulin ohne Zink, eine größere Größe des Zink-enthaltenden Insulinkomplexes, verglichen mit dem freien Insulin. Es wurde gezeigt (Frey et al., J. Exp. Med. 184:1045–1059, 1996), dass kleine Moleküle hauptsächlich gegen Epithelzellen des Darms gerichtet sind und größere Moleküle gegen M-Zellen. M-Zellen sind verantwortlich für den Transport von Protein zu der Peyer'schen Plaque für die Wechselwirkung mit T-Zellen, die dann in den systemischen Kreislauf eintreten (Weiner et al., Immunology Today, 18:335–343, 1997). Regulatorische T-Zellen aus der Peyer'schen Plaque können für das Zurück-Übermitteln von Toleranz, die durch diese Erfindung induziert wurde, zu dem Zielort verantwortlich sein. Es kann die Theorie aufgestellt werden, dass Zink enthaltende Komplexe aufgrund ihrer größeren Größe direkter gegen die M-Zellen gerichtet sind, was ihre Wirksamkeit beim Induzieren von Toleranz ausmacht.
Die genaue Natur der pharmazeutischen Zusammensetzungen dieser Erfindung wird häufig teilweise von dem beabsichtigten Verabreichungsweg abhängen. Die Auswahl eines Verabreichungswegs einer pharmazeutischen Zusammensetzung für eine Mucosaoberfläche wird wiederum inter alia von dem behandelten klinischen Zustand und der Leichtigkeit der Verabreichung an diese besondere Oberfläche abhängen. Die typischsten verwendeten Mucosaoberflächen sind diejenigen des Gastrointestinaltrakts, die nasale Mucosa und die Luftwegsmucosa.
Die Verabreichung an den Gastrointestinaltrakt kann durch orale Verabreichung, Suppositorien, Intubation, Endoskopie oder jede andere geeignete Technik durchgeführt werden. Zusammensetzungen für orale Verabreichung sind typischerweise Flüssigkeiten, Pillen oder Kapseln. Flüssige Zusammensetzungen können als flüssige Lösungen oder Suspensionen oder als feste Formen, die für die Auflösung oder Suspension in Flüssigkeit vor der Verwendung geeignet sind, bereitgestellt werden.
Orale Zusammensetzungen, die Insulin enthalten, profitieren insbesondere von der Anwesenheit ausreichender Zinkmengen für die Hexamerbildung. Flüssige oder leichtlösliche Zusammensetzungen können ebenfalls das Insulin dem Risiko eines Abbaus in dem niedrigen pH des Magens unterwerfen, und es kann günstig sein, dieses Risiko unter Verwendung von Hydrogencarbonat oder einem anderen anerkannten Antiacidpräparat zu verringern, entweder vor oder begleitend mit dem Insulin, um den Magen-pH über ~ 4 zu heben. Andere Insulinzusammensetzungen, die insbesondere für die orale Verabreichung geeignet sind, sind darmlösliche bzw. magensaftresistente Pillen, eingeschlossen in Gelatinekapseln, oder anderweitig formuliert, so dass ihre Inhalte nach dem Durchgang durch den Magen freigesetzt werden. Mikropartikelzubereitungen, wie Liposome und gelierbare Hydrokolloide, die das induzierende Antigen und das Mucosabindungsprotein einkapseln, können ebenfalls wirksam sein (z.B. EP-Patentanmeldung 0 063 261 A1). Wo das Antigen der Zusammensetzung etwas anderes als Insulin ist, wird die Wichtigkeit des Schützens des Antigens durch eine oder mehrere dieser Strategien von seiner Anfälligkeit gegenüber der gastrointestinalen Umgebung abhängen. Für einen allgemeinen Überblick über Zielwirkstoffe für den Darm siehe Wilding et al. (Pharmac. Ther. 62:97, 1994).
Nasale Verabreichung beinhaltet typischerweise die Verwendung einer frei fließenden Flüssigkeit, einer Creme oder eines Gels, das eine wirksame Konzentration in einem komfortablen Volumen enthält. Weil die nasale Mucosa vergleichsweise untätiger ist, und es eine relative Armut an proteolytischen Enzymen gibt, kann in manchen Fällen eine Wirkung unter Verwendung einer geringeren Antigenmenge erhalten werden.
Die Verabreichung an die Mucosa des Luftwegs beinhaltet typischerweise die Bildung und Inhalation eines Aerosols. Das Aerosol kann entweder eine fein verteilte Flüssigkeit oder ein Pulver sein. Eine Vorrichtung und Verfahren zum Bilden von Aerosolen sind in Kirk-Othmer "Encyclopedia of Chemical Technology", 4. Ausgabe, Band 1, Wiley NY, S. 670–685, 1991; und Newman, "Aerosols and the Lung", Clarke & Davia, Hrsg., Buttersworths, London, Engl., S. 197–224, 1984 beschrieben. Der Leser kann auch die US-Patente mit den Nummern 4,624,251; 3,703,173; 3,561,444 und 4,635,627 zu Rate ziehen. Tragbare Inhalatoren erlauben es, Dosierungen zweckmäßig mehrmals pro Tag zu verabreichen, wo erforderlich.
Die Größe der Dosis wird ausgewählt, unter Berücksichtigung des erwarteten Verteilungsvolumens der Zusammensetzungen, bevor sie den beabsichtigten Wirkungsort erreicht, des Abbaugrades und des Durchdringungsgrades, der für die Art der Verarbeitung erwartet wird, der Häufigkeit der Verabreichung und anderer relevanter Merkmale, wie des Alters und der klinische Zustand der behandelten Person. Allgemein wird eine einzelne Verarbeitung für orale Verabreichung an eine menschliche Person zwischen 10 μg und 50 mg des Antigens oder der Antigenmischung liegen, mit einem typischen Bereich, der etwa 100 μg bis 2 mg ist.
Die Bewertung der klinischen Merkmale und die Gestaltung eines geeigneten therapeutischen Behandlungsplans für den individuellen Patient ist letztendlich die Verantwortlichkeit des verschreibenden Arztes.
Die vorangehende Beschreibung stellt inter alia eine detaillierte Erklärung bereit, wie immunologische Toleranz bei einer Person induziert werden kann, unter Verwendung von wirksamen Kombinationen und Komponenten. Es wird verstanden, dass Variationen hinsichtlich sowohl der Beschaffenheit der Zusammensetzungen als auch ihrer Verwendung gemacht werden können, ohne dass vom Gehalt dieser Erfindung abgewichen wird.
Alle hierin erwähnten Patente, Patentanmeldungen, Artikel und Veröffentlichungen, sowohl oben als auch unten, sind hierin durch Bezugnahme in ihrer Gesamtheit eingeschlossen.
Die unten dargestellten Beispiele werden weiterhin als weiterer Führer für einen Fachmann mit gewöhnlicher Ausbildung in dem einschlägigen Stand der Technik bereitgestellt und sind in keiner Weise einschränkend gedacht.
BEISPIELE
Beispiel 1: Behandlung von NOD-Mäusen auf Symptome von Diabetes unter Verwendung einer nicht-kovalenten Mischung von Insulin und Choleratoxin B
Dieses Experiment wurde durchgeführt, um die Fähigkeit von mit Insulin gemischter CTB, eine immunologische Toleranz zu induzieren und die Diabetessymptome in einem NOD-Mausmodell zu verhindern, zu charakterisieren. Insulin-pflichtige Diabetes entsteht bei NOD-Mäusen spontan, bei einer mittleren Zeit von etwa 20 Wochen nach der Geburt.
Rekombinantes Humaninsulin und gereinigtes Schweineinsulin wurden von Novo Nordisk, Bagsvaerd, Dänemark erhalten. Beide dieser Präparate sind kristallisiert und enthalten Zink. Der Insulinvorläufer "M13", der die Aminosäuresequenz AAK zwischen der B-Kette und der A-Kette umfasst (aber frei ist von der Leader-Sequenz), wurde durch rekombinante Expression des für den Vorläufer codierenden Bereichs erhalten. Die Choleratoxin-Untereinheit B (CTB) wurde mittels einer Kombination von Hexametaphosphat-Präzipitation und Sephadex^TM G-75-Gelfiltrationschromatographie aus dem Kulturfiltrat eines Mutantenstamms von Vibrio cholerae aufgereinigt, bei dem die Choleratoxingene deletiert waren und der mit einem für CTB codierenden rekombinanten Überexpressionsplasmid komlementiert war (Lebens et al., Bio/Technology 11:1574, 1993).
Das Insulin wurde in 0,35 M Natriumhydrogencarbonat zu 20 mg/ml gelöst. Die CTB wurde in Phosphat-gepufferter Salzlösung, pH 7,4, (PBS) zu 5 mg/ml gelöst. Die Lösungen wurden in einem gleichen Gewichtsverhältnis gemischt und dann mit PBS verdünnt, um die gewünschte Menge in einem 250 μl-Volumen zu ergeben. Weitere 250 μl Hydrogencarbonat wurden zugefügt, um die Magensäure zu puffern. Die Zusammensetzungen wurden weiblichen NOD-Mäusen mittels oraler Sondenfütterung durch eine 18-Gauge-Fütterungsnadel aus rostfreiem Stahl verabreicht.
Die Mäuse wurden in die in Tabelle 2 gezeigten Gruppen eingeteilt. Die Dosen wurden in einem 2-wöchigen Zeitplan zu den Wochen 10, 12, 14, 16, 18 und 20 nach der Geburt verabreicht.
Die Tiere wurden während der Behandlung und den folgenden Wochen wöchentlich auf Zeichen von Diabetes überwacht. Ein Tier wurde als diabetisch betrachtet, wenn es einen positiven Uringlucosetest hat (gemessen unter Verwendung von Chemistrips von Bayer, Deutschland), und die zufällig-erhobenen Blutglucosespiegel über 15 mM andauern.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 gezeigt. Alle Tiere überlebten den 27-Wochen-Punkt und wurden in den Daten mitgezählt. Die Wahrscheinlichkeit eines signifikanten Unterschieds von der zum Schein behandelten Gruppe wurde unter Verwendung des Fisher's Exact Test berechnet.
Die Ergebnisse der zum Schein behandelten Gruppe folgen der Geschwindigkeit des Fortschreitens von spontanen diabetischen Symptomen in diesem Stamm. Eine signifikant geringere Häufigkeit von Symptomen in einer Behandlungsgruppe zeigt an, dass die Behandlung den Krankheitsausbruch bei einem Anteil von Tieren in der Gruppe verzögerte.
Drei Wochen nach der letzten Verabreichung war die Häufigkeit der Symptome in den Gruppen 2 und 5, denen 100 μg Insulin in Kombination mit 100 μg CTB gegeben wurde, geringer. Das rekombinante Humaninsulin und das gereinigte Schweineinsulin waren gleich wirksam, vorausgesetzt, die Insulinzubereitung enthielt Zinn. Die Gruppe 8 zeigte ebenfalls eine geringere Häufigkeit der Symptome nach der Behandlung mit Insulin allein, aber auf dem deutlich höheren Level von 1000 μg.
Die Kombination von 100 μg Zink-freiem Insulin und 100 μg CTB, die bei Gruppe 6 verwendet wurde, war unwirksam, übereinstimmend mit einer Rolle des Zinks beim Aufrechterhalten der Leistungsfähigkeit der Kombination. Es wird angenommen, dass Zink das Insulin als Hexamer zusammengefügt hält, das es während des Durchgangs in das gastrointestinale System schützen kann, und/oder eine bessere Durchdringung der Mucosaoberfläche oder die Aufnahme durch Antigen-präsentierende Zellen unterstützen kann. Die Kombination von 100 μg M13-Insulinvorläufer und 100 μg CTB war unwirksam, und das wurde ebenfalls einem Zinkmangel zugeordnet (Gruppe 4). Ansonsten wird vorhergesagt, dass der Vorläufer wirksam ist. Die Mischung von Insulin im CTB ist unwirksam, wenn sie mit der höheren Dosis von 1000 μg Insulin gegeben wird (Gruppe 3).
Sieben Wochen nach der letzten Verabreichung war das Fortschreiten der diabetischen Symptome bei den Gruppen 2 und 5 noch immer signifikant verzögert, mit einer auf 44 % reduzierten Häufigkeit der Symptome, verglichen mit 77 % bei den Kontrollen. Gruppe 8 war nicht länger signifikant verschieden von den Kontrollen. Dies zeigt an, dass 1000 μg Insulin allein die Symptome wurde temporär verzögert. 100 μg Insulin in Kombination mit 100 μg CTB jedoch resultiert in anhaltender immunologischer Toleranz, die den Ausbruch der Symptome bei einem signifikanten Anteil von Tieren von wenigstens 7 Wochen nach der Beendigung der Behandlung verzögert. Das Verhältnis der betroffenen Tiere in behandelten versus Kontrollgruppen (44 %/77 %) zeigt an, dass die Behandlung bei etwa 43 % der Tiere wirkungsvoll war, die ansonsten Symptome am 27-Wochen-Punkt entwickelt hätten.
Beispiel 2: Immunanregende ("immunostimulatory") Wirkungen von Choleratoxin B in vitro
Dieses Beispiel zeigt, dass CTB Zytokinabscheidung durch Antigen-spezifische Lymphozyten induziert und die Antigen-Präsentation in Kultur fördert.
10 Wochen alte BALB/c-Mäuse wurden subkutan mit 200 μg KLH (in PBS zu 2 mg/ml) in komplettem Freund'schen Adjuvans (0,4 ml Endvolumen) immunisiert. Zwei Wochen später wurden Milzzellen präpariert und zu 5 × 10⁵ Zellen/Well plattiert. Die Zellen wurden mit einem anregenden ("stimulatory") Mittel inkubiert, und die Platten wurden gemäß dem folgenden Assay entwickelt.
Jeder Well einer MultiScreen^TM-Platte (Millipore Cat. MAIPS4510) wird mit 100 μl von 5 μg/ml Zytokinantikörper (Anti-IL-2, Anti-IL-4 oder Anti-IFN-γ) über Nacht bei 4°C beschichtet. Die Platten werden mit PBS, die 1 % Rinderalbumin und 0,1 % Tween^TM 20 enthält, für 1 h bei 20°C geblockt. Die Platten werden mit RPMI 1640, das 10 % fötales Kälberserum enthält, gewaschen und der Splenozyt inkubiert bei 37°C und 5 % CO₂ für 16 bis 24 h. Nach 10 Waschungen werden 100 μl Well- von biotinyliertem Anti-Zytokin-Antikörper (Pharmingen) bis zu 2 μg/ml hinzugefügt und für 2 h bei 37°C inkubiert. Die Platten werden erneut gewaschen, und das Meerrettichperoxidase-konjugierte Anti-Immunglobulin mit 2 μg/ml wird in den Wells für 2 h bei Raumtemperatur inkubiert. Nach Waschen wird das Chromogensubstrat zugefügt, um die Reaktion gemäß den Herstelleranweisungen (Vector AEC substrate kit for HRP, Cat. SK-4200) zu entwickeln. Nach Waschen und Trocknen werden die Punkte unter einem Mikroskop gezählt.
Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle gezeigt:
Dies zeigt, dass das Zufügen von CTB die Antigen-spezifische T-Zellantwort in vitro um das 5- bis 10-Fache in Abhängigkeit von dem Zytokin, das für das Anzeigen verwendet wird, verstärkt. Da CTB-Splenozyten in Abwesenheit von KLH nicht stimulierte, kann geschlossen werden, dass die anregende (stimulatorische) Wirkung Antigen-spezifisch ist.
In einem getrennten Versuch wurde die Wirkung von CTB auf die Antigenpräsentierenden Zellen charakterisiert. Splenozyten von 10 Wochen alten BALB/c-Mäusen wurden mit CTB (5 μg/ml) für 20 min bei 37°C vorinkubiert. Die ungebundene CTB wurde fortgewaschen und die behandelten Zellen wurden in einem Verhältnis von 1:1 mit 2,5 × 10⁵ Splenozyten der KLH-immunisierten Tiere gemischt und dann mit oder ohne KLH, wie oben beschrieben, stimuliert.
Die Ergebnisse waren wie folgt:
Die Antigen-spezifische Antwort gegen KLH wurde um etwa das 5-Fache, wie durch einen Anstieg in der IL-4-Produktion gemessen, verstärkt. Es gab keine Wirkung auf eine Mitogen-induzierte ("mitogen-induced") Antwort (Con A) oder nicht reagierende Zellen (Medium-Kontrolle). Dies unterstützt eine immunanregende ("immunostimulatory") Wirkung von CTB über verstärkte Antigen-Präsentation. Eine 1- bis 2-tägige Inkubation zum CTB mit der Maus-Antigen-präsentierenden Zelllinie RAW 264 resultierte in einer Heraufregulation der folgenden co-anregendem ("costimulatory") Moleküle: B7-1, B7-2, VCAM, Klasse II-MHC-Antigen und MAC-1.
Beispiel 3: Behandlung in einem viralen Induktionsmodell von Typ I-Diabetes
Es wird angenommen, dass die Etiologie des Insulin-pflichtigen (Typ I)-Diabetes mellitus beim Menschen typischerweise eine genetische Prädisposition einer Gewebespezifischen Autoimmunkrankheit und ein auslösendes Ereignis, das die β-Zellzerstörung auslöst, beinhaltet. Das auslösende Ereignis kann eine Infektion durch ein fremdes etiologisches Mittel, wie ein Virus, das eine Komponente des Wirts, die durch β-Zellen exprimiert wird, imitiert, sein.
Ein anderes Tiermodell von Interesse ist das transgene Mausmodell von Herrath et al. (J. Clin. Invest. 98:1324, 1996). Die Mäuse exprimieren das virale Nukleoprotein des lymphozytischen Choriomeningitis-Virus (LCMV) unter Kontrolle eines Ratten-Insulin-Promotors in ihren β-Zellen. Weniger als 2 % der transgenen Mäuse entwickeln spontan diabetische Symptome, aber 2 Monate nach der Provokation mit LCMV ist die Antworthäufigkeit > 95 %. Eine orale Behandlung mit 1 mg Insulin zweimal wöchentlich für 2 Monate verhindert. Diabetes bei 50 % der Mäuse, wenn sie mit LCMV in der Mitte des Verlaufs der Therapie provoziert werden.
In dem Versuch dieses Beispiels werden die transgenen Mäuse mit Kombinationen dieser Erfindung behandelt, mit LCMV provoziert, um die Entwicklung von Diabetes auszulösen, und dann für bis zu 2 Monate auf Symptome hin überwacht. Die Mischungen und die Verabreichung werden wie in Beispiel 1 durchgeführt, unter Verwendung von Zusammensetzungen, die 100 μg Humaninsulin, das Zink enthält, gemischt mit 100 μg CTB pro Verabreichung umfassen. Die Sondenfütterung wird zweimal wöchentlich für 2 Wochen entweder vor oder nach der LCMV-Provokation oder beides durchgeführt. Die Mäuse werden zufälligerhobenen Glucosebestimmungen von >350 mg/ml in zwei aufeinander folgenden Messungen als diabetisch definiert. Die Wirkung wird zwischen Gruppen verglichen, die mit der Mischung behandelt wurden, und Gruppen, die mit Insulin allein behandelt wurden, oder der Pufferkontrolle.
Beispiel 4: Antigen-CTB-Mischungen zur Behandlung anderer immunologisch-vermittelter Zustände
Die Zusammensetzungen dieser Erfindung werden in Tiermodellen für andere Krankheiten getestet, die eine unerwünschte Immunantwort einschließen.
Als Modell für Multiple Sklerose wird bei 7-8 Wochen alten weiblichen Lewis-Ratten eine experimentelle Autoimmunencephalomyelitis (EAE) induziert. Den Tieren wird in die hintere Fußsohle 50 μg basisches Myelinprotein ("myelin basic protein" = MBP) in komplettem Freund'schen Adjuvans injiziert. Die Toleranz wird durch Magenintubation mit einer Mischung von 100 μg MBP und 100 μg CTB induziert. Den Tieren wird das Tolerogen ("tolerogen") entweder 1-, 3- oder 6-mal entweder vor oder nach der Induktion von EAE mit entweder 2- oder 5-Tageintervallen zwischen den Verabreichungen gefüttert.
Die Tiere werden täglich auf klinische Zeichen von EAE gemäß der folgenden Skala untersucht: 0 – keine erkennbare Krankheit; 1 – schlaffer Schwanz; 2 – Schwanzlähmung und Gliedmaßenschwäche; 3 – Lähmung der hinteren Extremitäten; 4 – Tetraplegie; 5 – Tod. Die Wirkung von MBP-CTB-Mischungen wird mit der Wirkung von MBP allein und zwischen den unterschiedlichen Behandlungszeitplänen verglichen.
Als Modell für Arthritis werden 8 bis 14 Wochen alte DBA/1 Lac J-Mäuse mit einer intradermalen Injektion von 300 μg Typ-II-Kollagen (Sigma) in komplettem Freund'schen Adjuvans vorbehandelt, 21 Tage später gefolgt von einer Aufftischungsdosis von 100 μg Typ-II-Kollagen. Die Toleranz wird durch Magenintubation mit einer Mischung von 10 oder 100 μg Typ-II-Kollagen und einer gleichen Einwaage von CTB induziert. Den Tieren wird das Tolerogen ("tolerogen") entweder 1, 3 oder 6 Mal entweder vor oder nach der Induktion der Arthritis mit entweder 2- oder 5-Tage-Intervall zwischen den Verabreichungen gefüttert.
Die Mäuse werden 2 bis 3 Mal pro Woche auf Schwellungen des distalen Gelenks und auf Erythem (Fußdicke und Knöchelbreite, gemessen unter Verwendung einer Konstantspannungsschieblehre ("constant tension caliper")) untersucht.
Eine Maus wird als arthritisch betrachtet, wenn die Schwellung und Erythem mit einer erheblichen Änderung in aufeinander folgenden Messungen an mindestens einer Pfote beobachtet wurden. Die folgende Einstufungsskala wird verwendet: 0 – keine erkennbare Arthritis, 1 – milde Schwellung und Erythem; 2 – Schwellung und Arythem von sowohl Tarsus als auch Knöchel; 3 – Ankylosis und Knochenverformung ("boney deformity"). Die Wirkung der MBP-CTB-Mischungen wird mit der Wirkung von MBP allein und zwischen den verschiedenen Behandlungszeitplänen verglichen.
Beispiel 5: Toleranzinduktion gegen Tetanustoxin durch nasale oder orale Verabreichung
In diesem Versuch wurde Tetanustoxin als ein alternatives Zielantigen getestet, und es wurden Vergleiche zwischen gastrointestinaler und nasaler Verabreichung gemacht.
Das Protokoll für diesen Versuch war wie folgt. Vollständiges Tetanustoxin (TT) wurde von Connaught Laboratories, Toronto, Kanada erhalten. Balb/c-Mäuse (weiblich, 7-8 Wochen alt) wurden, wie unten angezeigt, gefüttert und mit komplettem Freund'schen Adjuvans in die hintere Fußsohle, 1:1 gemischt mit 50 μg Tetanustoxin (TT) in PBS (Endvolumen: 10 μl), immunisiert. Nach 10 Tagen wurden die ableitenden Lymphknoten entfernt und zu einer Einzelzellsuspension gemacht. Sie wurden in eine 96-Well-Platte mit 100 μg/ml Tetanustoxin für 50 h (200.000 Zellen/200 μl in RPMI 1640, enthaltend 5 % fötales Kälberserum, 100 E/ml Penicillin, 100 g/ml Streptomycin und 2 mM Glutamin) stimuliert und dann mit 1 μCi Methyl-³H-Thymidin für 24 h gepulst ("pulsed"). Die Zellen wurden geerntet und der Thymidineinbau durch Szintillationszählung gemessen. Der Stimulationsindex (S.I.) wurde als T-Zellen im Medium ohne Antigene geteilt durch Antigen-stimulierte T-Zellen berechnet. Für die orale Fütterung wurden die Antigene in 0,35 M NaHCO₃ verdünnt, und ein Endvolumen von 0,5 ml wurde gefüttert. Für die nasale Verabreichung wurden die Antigene in PBS verdünnt, und ein Endvolumen von 0,01 ml wurde verabreicht.
Die Behandlungsgruppen sind in der folgenden Tabelle gezeigt.
Die Ergebnisse sind in der oben stehenden Tabelle gezeigt. Sowohl orale als auch nasale Verabreichung von TT verhinderte die Antwort (Gruppe 3 und 7). Durch Zusammenmischen von TT und CTB wurde die Wirkung jedoch bei oraler Abgabe um etwa das 10-Fache verstärkt, da die orale Fütterung mit 10 μg TT + 10 μg CTB die T-Zellproliferation so stark inhibierte, wie 100 μg des Tetanustoxins allein bzw. 6,0 SI gegenüber 6,1 SI, 100 μg TT + 100 μg CTB, oral, zerstörte die Inhibierung weiter, d.h. 4,5 S.I. Die nasale Verabreichung war beim Inhibieren der T-Zellproliferation ebenfalls wirksam. Beim Vergleichen von 10 μg TT allein mit 10 μg TT + 10 μg CTB wurde die beste Wirkung auf die T-Zellproliferationsinhibierung mit der gemischten Zubereitung erhalten, entsprechend 4,9 SI gegenüber 4,4 SI. Insgesamt wurde die stärkste Wirkung auf das Inhibieren der T-Zellproliferation bei der nasalen Verabreichung von 10 μg TT + 10 μg CTB, nasal, erhalten, verglichen mit entweder 10 μg TT, nasal, 10 μg TT + 10 μg CTB, oral, 100 μg TT + oral oder 5000 μg TT, oral.
Es wurde geschlossen, dass die TT-Mischung die orale Toleranz etwa um das 10-Fache verstärkt, verglichen mit der Verwendung von TT allein. Darüber hinaus verstärkt die nasale Verabreichung die Wirkung auf die inhibierende T-Zellproliferation etwa um das 10-Fache, wenn sie mit der oralen Verabreichung verglichen wird, d.h. es wirkt 10 μg TT + 10 μg CTB, nasal, so gut wie 100 μg TT und 100 μg CTB, oral, entsprechend 4,4 SI gegenüber 4,5 SI.

Claims

Pharmazeutische Zusammensetzung zum Induzieren anhaltender immunologischer Toleranz gegenüber Insulin, umfassend eine wirksame Kombination von Insulinpeptid zusammen mit Choleratoxinuntereinheit B (CTB, „cholera toxin subunit B") oder Hitze-labilem Enterotoxin B (LTB, „heat-labile enterotoxin B"), wobei das Insulinpeptid und CTB/LTB in einer unkonjugierten Form sind, und ein Metallkation.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei das Metallkation Zn⁺⁺ ist.
Verfahren zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung nach Anspruch 1 oder 2, umfassend Kombinieren des Insulinpeptids mit der Mucosabindungskomponente bei dem Gewichtsverhältnis der wirksamen Kombination.
Verwendung eines induzierenden Antigens und einer Mucosabindungskomponente, ausgewählt aus Choleratoxinuntereinheit B (CTB) und Hitze-labilem Enterotoxin B (LTB) bei der Herstellung eines Medikaments zum Induzieren anhaltender immunologischer Toleranz in einem Individuum gegenüber einem Zielantigen, wobei das induzierende Antigen Toleranz gegenüber dem Zielantigen induziert, und das induzierende Antigen und die Mucosabindungskomponente in dem Medikament in einer unkonjugierten Form vorliegen.
Verwendung eines induzierenden Antigens und einer Mucosabindungskomponente, ausgewählt aus Choleratoxinuntereinheit B (CTB) und Hitze-labilem Enterotoxin B (LTB) bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung eines Autoimmunzustands in einem Individuum, wobei der Autoimmunzustand mit immunolo gischer Reaktivität gegen ein Zielantigen assoziiert ist, wobei das induzierende Antigen Toleranz gegenüber dem Zielantigen induziert, und das induzierende Antigen und die Mucosabindungskomponente in dem Medikament in einer unkonjugierten Form vorliegen.
Verwendung eines induzierenden Antigens und einer Mucosabindungskomponente, ausgewählt aus Choleratoxinuntereinheit B (CTB) und Hitze-labilem Enterotoxin B (LTB) bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Hypersensitivität gegen ein Zielantigen in einem Individuum, wobei das induzierende Antigen Toleranz gegenüber dem Zielantigen induziert, und das induzierende Antigen und die Mucosabindungskomponente in dem Medikament in einer unkonjugierten Form vorliegen.
Verwendung eines induzierenden Antigens und einer Mucosabindungskomponente, ausgewählt aus Choleratoxinuntereinheit B (CTB) und Hitze-labilem Enterotoxin B (LTB) bei der Herstellung eines Medikaments zum Verringern des Risikos einer Abstoßung eines Gewebetransplantats, transplantiert von einem Donor, in einem Empfänger, wobei das induzierende Antigen allotypische Determinanten des Donors umfasst, und das induzierende Antigen und die Mucosabindungskomponente in dem Medikament in einer unkonjugierten Form vorliegen.
Verwendung eines induzierenden Antigens und eines Mucosabindungsmittels, ausgewählt aus Choleratoxinuntereinheit B (CTB) und Hitze-labilem Enterotoxin B (LTB) bei der Herstellung eines Medikaments zum Verringern des Risikos von Transplantat gegen Emfänger-Reaktion in einem Empfänger von einem Gewebetransplantat, transplantiert von einem Donor, wobei das induzierende Antigen allotypische Determinanten des Empfängers umfasst, und das induzierende Antigen und die Mucosabindungskomponente in dem Medikament in einer unkonjugierten Form vorliegen.
Verwendung nach irgendeinem der Ansprüche 4–8, wobei das Medikament für Verabreichung auf eine Mucosaoberfläche formuliert ist.
Verwendung nach irgendeinem der Ansprüche 4–9, wobei das Medikament für orale Verabreichung, nasale Verabreichung oder Luftwegverabreichung formuliert ist.
Verwendung nach irgendeinem der Ansprüche 4–10, wobei das induzierende Antigen und die/das CTB oder LTB in dem Medikament unassoziiert sind.
Verwendung nach irgendeinem der Ansprüche 4–11, wobei eine der folgenden Bedingungen besteht a) das induzierende Antigen umfasst das Zielantigen; b) das induzierende Antigen umfasst einen „Bystander" für das Zielantigen; c) das Zielantigen ist ein Autoantigen; d) das Zielantigen ist ein Allergen; e) das Zielantigen ist ein Alloantigen oder ein Xenoantigen.
Verwendung nach irgendeinem der Ansprüche 4–12, wobei das Medikament beim Induzieren anhaltender Immuntoleranz, die wenigstens fünf Wochen andauert, wirksam ist.
Verwendung nach Anspruch 5, wobei entweder: a) der Autoimmunzustand rheumatoide Arthritis ist und das induzierende Antigen ein Typ-II-Kollagen-Peptid ist; b) der Autoimmunzustand Multiple Sklerose ist und das induzierende Antigen ein basisches Myelinprotein-Peptid („myelin basic protein peptide") ist; oder c) der Autoimmunzustand Typ-I-Diabetes ist und das induzierende Antigen ein Insulinpeptid ist.
Verwendung nach Anspruch 7 oder 8, wobei das induzierende Antigen entweder: a) ein isoliertes oder synthetisches humanes Leukozytenantigen („human leukocyte antigen") oder Gemisch davon, das allotypische Determinanten aufweist, gegen welche der behandelte Empfänger oder Donor tolerant gemacht werden soll; oder b) ein Gemisch induzierender Antigene in der Form einer Zelle, einer Zellmembran oder eines Zellextraktes aus dem Donor bzw. Empfänger ist, oder aus einem Individuum, das Haupthistokompatibilitätskomplexallotypen mit dem Donor bzw. Empfänger gemeinsam hat, ist.
Verwendung von einem Insulinpeptid und CTB oder LTB bei der Herstellung eines Medikaments, wobei das Insulinpeptid und CTB/LTB in unkonjugierter Form sind, für die Behandlung von Insulitis.
Verwendung nach Anspruch 14, Variante c, oder 16, wobei das Medikament ferner ein Metallkation umfasst.
Verwendung nach Anspruch 17, wobei das Metallkation Zn⁺⁺ ist.