DE69830257T2

DE69830257T2 - Verwendung von Interleukin-15

Info

Publication number: DE69830257T2
Application number: DE69830257T
Authority: DE
Inventors: Johan Adriaan Marc Grooten; Hans Peter Raf Dooms; Walter Charles Fiers
Original assignee: Vlaams Instituut voor Biotechnologie VIB
Current assignee: Amgen Inc
Priority date: 1997-02-21
Filing date: 1998-02-23
Publication date: 2006-02-02
Anticipated expiration: 2018-02-24
Also published as: DE69810091D1; EP0971728A1; DE69830257D1; AU6726698A; ES2187946T3; DE69830257T3; ATE229342T1; EP1273304A3; DK1273304T4; WO1998036768A1; EP1273304B2; EP1273304A2; ZA981478B; EP0971728B1; ATE295736T1; DK1273304T3; US20020182178A1; EP1273304B1; US20070134718A1; DE69810091T2

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft die Herstellung pharmazeutischer Zubereitungen, die IL-15 stimulierende Verbindungen oder IL-15 inhibierende und/oder eliminierende Verbindungen enthalten.
Das Zytokin Interleukin-15 (IL-15) wurde ursprünglich in Kulturüberständen der Affennierenepithelzelllinie CV-1/EBNA und der T-Zell-Leukämiezelllinie HuT-102 (Grabstein et al., 1994; Burton et al., 1994; Barnford et al., 1994) identifiziert. Die IL-15-cDNA-Sequenz kodiert für ein Vorläuferprotein mit 162 Aminosäuren (AS), bestehend aus einem Peptid mit 48 AS und einem reifen Protein mit 114 AS (Grabstein et al., 1994). Obgleich keine Sequenzhomologie zu IL-2 besteht, sagt die Aminosäuresequenz vorher, dass IL-15 wie IL-2 ein Mitglied der Familie der Zytokine mit vier α-Helix-Bündeln ist. Außerdem üben IL-15 und IL-2 ihre biologische Aktivität durch die Bindung an die β- und γ-Kette des IL-2R aus, jeweils ergänzt durch ein spezifisches IL-15Ra, bzw. IL-2Rα-Polypeptid (Giri et al., 1995). Die ähnlichen funktionellen Aktivitäten der beiden Zytokine wie sie auf T-, B- und NK-Zellen beobachtet werden sind vermutlich auf diese gemeinsame Nutzung der Rezeptoruntereinheiten zurückzuführen. IL-15-mRNA ist in Fibroblasten, Epithelzellen und Monozyten weit verbreitet, jedoch nicht in ruhenden oder aktivierten T-Zellen, der hauptsächlichen Quelle von IL-2.
IL-15 und IL-2 haben verschiedene biologische Funktionen gemeinsam. Wie IL-2 wurde auch IL-15 als T-Zellwachstumsfaktor definiert. IL-15 wurde ursprünglich als Faktor entdeckt, der die Proliferation der IL-2-abhängigen zytotoxischen Maus-T-Zelllinie (CD8⁺)-CTLL-2 induzieren kann (Grabstein et al., 1994). Proliferation nach Zugabe von IL-15 wurde auch in Phytohämagglutinin(PHA)-aktivierten CD4⁺- oder CD8⁺-T-Lymphozyten aus menschlichem peripheren Blut (PBT) und γ-Untergruppen von T-Zellen beobachtet (Grabstein et al., 1994; Nishimura et al., 1996). Studien mit aus humanen PBT isolierten T-Zellen der Phänotypen Gedächtnis-T-Zelle (CD45RO⁺) und naive T-Zelle (CD56RO^-) ergaben, dass IL-15 wie IL-2 in CD4'- und CD8'-Gedächtnis-T-Zellen und in naiven CD8⁺-T-Zellen, jedoch nicht in naiven CD4⁺-T-Zellen, die Expression des Aktivierungsmarkers CD69 und Proliferation induziert (Kanegane et al., 1996). IL-15 war bei der in vitro-Erzeugung von alloantigenspezifischen zytotoxischen T-Zellen in gemischten Lymphozytenkulturen und bei der Förderung der Induktion von lymphozytenaktivierten Killer(LAK)-Zellen so effektiv wie IL-2 (Grabstein et al., 1994). Außerdem zeigten in vivo-Studien in einem Mausmodell die Fähigkeit von IL-15, die CD8⁺-T-zellvermittelte Immunität gegen eine Infektion mit Toxoplasma gondii zu verstärken (Khan and Kasper, 1996). Hier ergab die Impfung von Mäusen mit löslichem Parasitenantigen (Ag) und IL-15 eine signifikante Proliferation von Splenozyten, die den CD8⁺-Phänotyp exprimieren, und Schutz gegen eine letale Challenge mit Parasiten für mindestens 1 Monat nach der Immunisierung.
Natürliche Killer(NK)-Zellen gelten als wichtiges Ziel der Aktion von IL-15. Behandlung von NK-Zellen mit IL-15 führt zur Proliferation und zur Verstärkung der zytotoxischen Aktivität und zur Produktion von Interferon-γ (IFNγ), Tumornekrosefaktor-α (TNFα) und Granulozyten-Makrophagen-koloniestimulierendem Faktor (GM-CSF) (Carson et al., 1994). Des Weiteren ersetzt IL-15 die Mikroumgebung des Knochenmarks während der Reifung von NK1.1⁺-Zellen der Maus von nichtlytischen zu lytischen Effektorzellen (Puzanov et al., 1996).
Abgesehen von seiner Wirkung auf T- und NK-Zellen costimuliert IL-15 die Proliferation von B-Zellen, die mit immobilisiertem anti-IgM oder Phorbolester aktiviert sind, auf vergleichbare Weise wie IL-2 (Armitage et al., 1995). Stimulation von B-Zellen mit einer Kombination aus CD40L und IL-15 induziert wirksam die Immunglobulinsynthese. IL-15 hat keine stimulatorische Wirkung auf ruhende B-Zellen.
IL-15 hat noch andere biologische Aktivitäten. Chemokine Faktoren sind Zytokine oder Chemokine, die die Wanderung von Lymphozyten zu Entzündungsregionen regulieren.
IL-15 ist beschrieben als chemokiner Faktor für menschliche PBT und induziert Polarisation, Invasion von Kollagengels und Neuverteilung von Adhäsionsrezeptoren (Wilkinson and Liew, 1995; Nieto et al., 1996). Mastzellen der Maus proliferieren als Antwort auf IL-15, jedoch nicht als Antwort auf IL-2, wobei eine neuartige Rezeptor-Signalisierungsbahn verwendet wird, die nicht für IL-2 verwendet wird (Tagaya et al., 1996). Es wurde auch gezeigt, dass IL-15 und IL-2 unterschiedliche Wirkung auf die Differenzierung von bipotenten T/NK-Vorläuferzellen haben, wobei IL-15 hauptsächlich die Entwicklung von TCRγδ-T-Zellen und NK-Zellen fördert (Leclerq et al., 1996). Der auffälligste Unterschied zwischen IL-15 und IL-2 liegt jedoch in dem jeweiligen Expressionsmuster. Das Vorhandensein von IL-15-mRNA in einer Vielzahl von nichtlymphoiden Geweben deutet darauf hin, dass die Sezernierung des Zytokins nicht allein durch das Immunsystem reguliert wird, und/oder dass das Zytokin auch außerhalb des Immunsystems wirken kann. Entsprechend beeinflusst die Zugabe von IL-15 zu einer Myoblastenzelllinie die Parameter in Verbindung mit Skelettmuskelfaserhypertrophie, was darauf hindeutet, dass IL-15 anabolische Wirkung hat und die Skelettmuskelmasse erhöht (Quinn et al., 1995).
Aktivierte CD4⁺-T-Lymphozyten spielen bei der Entwicklung einer wirksamen Immunantwort gegen Pathogene eine Schlüsselrolle, indem sie die Wachstumsfaktoren bereit stellen, die zur Expansion der aktivierten CD4⁺-T-Lymphozyten (autokrines Wachstum) sowie zur Expansion von CD8⁺-zytolytischen Zellen und zur Differenzierung von B-Zellen zu antikörpersezernierenden Plasmazellen (parakrine „Helfer"-Aktivität) erforderlich sind.
Nach der Entfernung des Pathogens bleibt eine Unterfraktion der erzeugten Ag-spezifischen T-Zellen entweder im Lymphgewebe oder im Kreislauf als Gedächtniszellen erhalten. Während dieser Anwendung sind „Gedächtniszellen" definiert als antigenerfahrene Zellen. Diese Gedächtnislymphozyten sind kleine, ruhende Zellen, die nach einer Wiederbegegnung mit dem Priming-Ag optimal zur Erzeugung einer quantitativ und qualitativ überlegenen Sekundärantwort geprimt sind. Um den Übergang von aktivierter CD4⁺-Effektorzelle zur ruhenden CD4⁺-Gedächtniszelle zu vollziehen und ein langfristiges Überleben zu sichern, müssen diese Effektoren die folgenden Kennzeichen annehmen:

(i) Resistenz gegenüber oder Entkommen vor dem aktivierungsinduziertem Zelltod (AIZT); AIZT ist verantwortlich für ein Abschwächen der Immunreaktion;
(ii) Unabhängigkeit von autokrinen Wachstumsfaktoren, die während der Immunantwort produziert werden. Normalerweise führt das Verschwinden dieser Wachstumsfaktoren – eine Folge des Beendens der Immunaktivität – zum Zelltod durch Apoptose, induziert durch Depletion von Wachstumsfaktor.
(iii) Die Fähigkeit, durch Produktion der notwendigen autokrin und parakrin wirkenden Helfer-Zytokine wie z.B. IL-2 im Falle eines erneuten Kontaktes mit dem Antigen maximal zu expandieren.

Die Forschung, die zu der vorliegenden Erfindung führte, zeigte, dass IL-15 die Erzeugung und Fortdauer von CD4⁺-Gedächtniszellen fördert, indem die Annahme der oben erwähnten Kennzeichen durch aktivierte CD4⁺-T-Lymphozyten gefördert wird: Resistenz gegenüber AIZT, Unempfindlichkeit gegenüber Apoptose nach Wachstumsfaktorentzug am Ende des Antigenstimulus und hohe Responsivität gegenüber erneuter Antigen-Challenge. Resistenz gegenüber AIZT und Unempfindlichkeit gegenüber Apoptose bestimmen das Überleben der CD4⁺-T-Lymphozyten. Responsivität ist gekennzeichnet durch Zellteilung, Expansion der Zellzahl und Produktion von Helfer-Zytokinen.
Deshalb schaltet die Behandlung antigenstimulierter CD4⁺-Zellen mit IL-15 selbst bei sehr geringen Konzentrationen das Programm des Zelltods, das in Abwesenheit des Wachstumsfaktors abläuft, aus. Das Überleben von CD4⁺-Zellen mit IL-15 ist im Gegensatz zu IL-2 weder von DNA-Synthese noch von Proliferation begleitet, was zeigt, dass IL-15 in diesen Zellen einen ruhenden Phänotyp induziert. Darüber hinaus wird die Sensitivität von in Gegenwart von IL-2 kultivierten CD4⁺-T-Lymphozyten gegenüber AIZT durch IL-15 umgekehrt. Restimulation dieser mit IL-15 behandelten, ruhenden T-Zellen mit einem geeigneten Antigen (Ag) präsentiert von Ag-präsentierenden Zellen (APZ) führt zu maximaler Zellexpansion, angetrieben durch eine erneute Produktion von Helfer-Zytokinen. Diese Zellexpansion ist nicht durch einen massiven Zelltod als Folge von AIZT abgeschwächt. Im Gegensatz zu den Beobachtungen bei in Gegenwart von IL-2 kultivierten Zellen liefern die oben erwähnten Aktivitäten von IL-15 ein Verfahren zum Erreichen des Überlebens immunkompetenter CD4⁺-T-Lymphozyten, wobei hiermit die sekundäre Restimulation von CD4⁺-T-Lymphozyten stark verbessert wird. Mit anderen Worten kann die Bildung von immunologischen CD4⁺-Gedächtniszellen in einem positiven Sinn durch eine erhöhte IL-15-Aktivität oder in einem negativen Sinn durch eine verringerte IL-15-Aktivität kontrolliert werden.
Die vorliegende Erfindung betrifft die Fälle, in denen eine ungewollte oder schädliche CD4⁺-T-Zell-abhängige Immunreaktion für die Erkrankung (mit-)verantwortlich ist. Beispielsweise zeigten mehrere Berichte die Beteiligung autopathogener CD4⁺-T-Zellen bei autoimmunen Erkrankungszuständen. Infolgedessen wird angenommen, dass die Blockierung der IL-15-Aktivität das Langzeitüberleben autoreaktiver CD4⁺-Effektor-T-Zellklone unterdrückt sowie den Rückgang bereits gebildeter autoreaktiver CD4⁺-T-Zellen fördert, was folglich gute Auswirkungen auf Patienten haben wird, die an autoimmunen Erkrankungszuständen leiden. Eine auf die Inhibierung der IL-15-Aktivitäten gerichtete Therapie kann durch die Verabreichung von Mitteln erreicht werden, welche die Bindung von IL-15 an seinen Rezeptor stören. Zu diesen Mitteln zählen beispielsweise antagonistische Anti-IL-15-Antikörper oder Anti-IL-15 Rα-Antikörper oder Fab oder F(ab')₂-Fragmente dieser Antikörper, lösliche IL-15-Rα, Fusionsproteine, die aus löslichem IL-15 Rα und Fc-Fragment bestehen, oder Peptide, die mit hoher Affinität an IL-15 Rα binden, ohne eine Signalweiterleitung zu induzieren. Ein anderer Ansatz besteht darin, die IL-15 Synthese durch die Verabreichung von IL-15 Antisense Oligonukleotiden durch eine direkte Impfung der Patienten mit nackter DNA zu inhibieren, oder mittels Gentherapieansätzen.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung betrifft eine pharmazeutische Zubereitung, welche die Bildung von Gedächtniszellen inhibiert, wobei die Zubereitung IL-15 inhibierende und/oder eliminierende Verbindungen enthält, wie IL-15 Antikörper oder Verbindungen, welche die Bindung von IL-15 an seinen Rezeptor, beispielsweise löslicher IL-15 Rα, stören, gegebenenfalls in Anwesenheit eines geeigneten Exzipienten.
Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung einer Verbindung, die in der Lage ist, die Bindung von IL-15 an seinen Rezeptor zu stören, für die Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung für die Behandlung autoimmuner Erkrankungen, wobei die Verbindung aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus Anti-IL-15 Antikörper, Anti-IL-15 Rα-Antikörper oder den Fab- oder F(ab')₂-Fragmenten dieser Antikörper, löslichem IL-15 Rα, Fusionsproteinen, die aus löslichem IL-15 Rα und Fc-Fragment bestehen, oder Peptiden, die einen funktionalen IL-15-Rezeptor binden und/oder inhibieren.
Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin die Verwendung einer Verbindung, die in der Lage ist, die IL-15-Synthese zu inhibieren, zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung autoimmuner Erkrankungen, wobei diese Verbindung ein IL-15 Antisense Oligonukleotid ist.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch die oben genannte Verwendung, wobei die pharmazeutische Zusammensetzung die Verbindung in Anwesenheit eines geeigneten Exzipienten umfasst.
In dem Fachgebiet ist es bekannt, IL-15 oder IL-15-inhibierende und/oder eliminierende Verbindungen durch Bolusinjektion, kontinuierliche Infusion, anhaltende Freisetzung aus Implantaten oder durch eine andere geeignete Technik zu verabreichen. Die Verabreichung kann entweder durch intravenöse Injektion, subkutane Injektion oder parenterale oder intraperitoneale Infusion erfolgen. Das therapeutische IL-15-Agens oder das IL-15 inhibierende und/oder eliminierende Agens wird in Form einer pharmazeutischen Zusammensetzung verabreicht, welche gereinigtes Polypeptid in Verbindung mit physiologischen akzeptablen Trägern, Exzipienten oder Verdünnungsmitteln umfasst. Solche Träger sind in den verwendeten Dosismengen und Konzentrationen für Patienten nicht toxisch. Für gewöhnlich bringt die Zubereitung solcher Zusammensetzungen das Kombinieren eines IL-15-Polypeptids eines Säugetiers oder eines Derivats davon mit Puffern, Antioxidantien wie Ascorbinsäure, Polypeptiden mit geringem Molekulargewicht (weniger als etwa 10 Reste), Proteinen, Aminosäuren, Kohlenhydraten einschließlich Glucose, Sucrose oder Dextranen, Chelat bildenden Mitteln wie EDTA, Glutathion und andere Stabilisatoren und Exzipienten mit sich. Neutral gepufferte Salzlösung oder Salzlösung gemischt mit conspezifischem Serumalbumin sind Beispiele für geeignete Verdünnungsmittel. Erhöhte IL-15-Spiegel können auch durch adoptiven Transfer von Zellen, die mit Konstrukten bestehend aus einer IL-15-cDNA-Sequenz, angetrieben von einem potenten Promotor, ex vivo transfiziert werden, oder durch Einführen einer IL-15-cDNA-Sequenz in die Zielzellen nach einem geeigneten Promotor erhalten werden.
Geeignete IL-15-Quellen für die Zubereitung von Verbindungen, die in der Lage sind, die Bindung von IL-15 an seinen Rezeptor zu stören, für die Verwendung gemäß der vorliegenden Erfindung, sind das Kulturmedium von konstitutiv IL-15-produzierenden menschlichen Zelllinien wie T-102. Alternativ kann rekombinantes IL-15 angewendet werden. WO 95/27722 gibt die Information, die erforderlich ist, um rekombinantes IL-15 zuzubereiten. Rekombinantes IL-15 ist auch kommerziell erhältlich. Alternativ können Varianten von IL-15 verwendet werden, so lange sie die Aktivität haben, die erforderlich ist, um die Bildung von Gedächtniszellen zu stimulieren. Diese Varianten sind als „aktive Varianten" identifiziert. Aktive Varianten umfassen des weiteren IL-15-Fragmente mit einer IL-15-Aktivität, die ausreicht, um in der Erfindung nützlich zu sein. Darüber hinaus kann die Aktivität von IL-15 durch Zugabe von IL-15-induzierenden Verbindungen wie LPS zur Induktion der IL-15-Produktion in Monozyten, oder durch IL-15 induzierende Verfahren wie UVB-Bestrahlung von Keratinozyten, auf indirekte Weise stimuliert werden.
Isolierte IL-15 inhibierende oder eliminierende Verbindungen können gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Wenn diese Verbindungen (Poly-) Peptide sind können sie durch rekombinante DNA-Techniken hergestellt werden.
Die vorliegende Erfindung wird unter Bezugnahme auf die unten stehenden Beispiele weiter erläutert, welche nur der Erklärung dienen und in keiner Weise den Umfang der Erfindung einschränken.
BEISPIEL
1. Material und Methoden
1.1 CD4⁺-T-Zellklon
Der Influenza-A/H3-Hämagglutinin(HA)-spezifische und H-2^b-restringierte CD4⁺-Maus-T-Zellklon T-HA wurde in diesem Laboratorium durch eine initiale Immunisierung von C57B1/6-Mäusen mit 100 μg/ml mit Bromelain gespaltenem Hämagglutinin (BHA) und 0,5 mg/ml Adjuvans (Ribi, Immunochem Research Inc., Hamilton, MT, USA) und einer zweite Immunisierung mit 32 μg/ml BHA drei Wochen später entwickelt.
5 Tage nach dieser Boost-Immunisierung wurden die Lymphknoten isoliert, und 3 × 10⁷ Zellen wurden in vitro mit 0,5 μg/ml BHA in 25 cm² Kulturflaschen (Nunclon, Nunc, Roskilde, Dänemark) stimuliert. An Tag 4 wurden 10 E/ml Maus-IL-2 (von PHA-stimulierten EL4.IL-2-Zellen) zu den Kulturen gegeben.
Nach 2 weiteren zweiwöchentlichen Restimulationen mit 0,5 μg/ml BHA und APZ wurde ein Pool von optimal HA-reaktiven T-Lymphozyten erhalten. Diese T-HA-Zellen wurden langfristig durch zweiwöchentliche Restimulation mit 10 ng/ml BHA und 7 × 10⁷ syngenen Milzzellen (bestrahlt mit 3000 rad Gammastrahlung) in 25 cm² Kulturflaschen in vitro erhalten. An Tag 2 wurden 30 IE/ml rhIL-2 zugegeben, und die T-Zellen wurden durch Erneuerung des Mediums und Zugabe von IL-2 alle 4 Tage weiter kultiviert und expandiert. C57B1/6-Mäuse (Broekman Instituut, Eindhoven, Netherlands) wurden als Quelle der Milzzellen verwendet. T-HA-Zellen wurden in 12,5 mM Hepes-gepuffertem RPMI 1640-Medium (Life Technologies, Paisley, Schottland), ergänzt mit 10 % FKS (Life Sciences International), 2 mM Glutamax-I, Penicillin/Streptomycin, 1 mM Natriumpyruvat (alle von Life Technologies, Paisley, Schottland) und 5 × 10^-5 M 2-ME (BDH, Poole, England), kultiviert.
1.2. Zytokine
Rekombinantes humanes IL-2 (r-IL2) hatte eine spezifische Aktivität von 1,3 × 10⁷ IE/mg, wie im CTLL-2-Assay bestimmt, daher entspricht 1 IE 77 pg.
Rekombinantes humanes IL-15 (r-IL15) wurde von PeproTech (London, GB) erworben und hatte nach Angaben des Herstellers eine spezifische Aktivität von 2 × 10⁶ E/mg.
Im Folgenden werden „rIL-2" und „IL-2" sowie „r-IL-15 und „IL-15" im Wechsel verwendet, da es für die Erfindung nicht essenziell ist, eine rekombinante Form zu verwenden.
1.3. Vorbehandlung mit IL-2 oder IL-15
T-HA-Zellen wurden durch Inkubation in nicht enzymatischem Zelldissoziationspuffer von Kulturen geerntet (Sigma), und lebensfähige Zellen wurden von den übrigen bestrahlten Milzzellen und toten Zellen durch Zentrifugation für 25 Minuten bei 2000 rpm auf einem Histopaque-1077 (Sigma, Irvine, UK)-Dichtegradienten getrennt. 2-5 × 10⁵ T-HA-Zellen wurden 48 Stunden lang in Flachboden-Zellkulturplatten (Falcon) mit 24 Vertiefungen in Gegenwart verschiedener Konzentrationen von IL-2 oder IL-15 kultiviert.
1.4. Proliferations-Tests
Induktion der Proliferation durch IL-2, IL-15 oder Ag/APZ wurde gemessen, indem 1 × 10⁴ T-HA-Zellen mit seriellen Verdünnungen von IL-2, IL-15 oder 200 ng/ml BHA und 2 × 10⁵ bestrahlten C57B1/6-Milzzellen als APZ-Quelle in Flachboden-Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen (Falcon 3072, Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA) inkubiert wurden. Während der letzten 8-12 Stunden des angezeigten Inkubationszeitraums wurden 0,5 μCi ³H-Thymidin (Amersham) pro Vertiefung dazugegeben. Die Zellen wurden auf Glasfaserfilter geerntet und der Einbau des ³H-Thymidins wurde mit einem Topcount Betaplattenzähler (Packard) gemessen. Die aufgeführten Ergebnisse sind Mittelwerte aus Dreifachkulturen.
1.5. Zellmarkierung mit PKH2-GL
T-HA-Zellen wurden geerntet und in Propylenröhrchen zweimal in Medium ohne Serum gewaschen. 1 × 10⁶ – 1 × 10⁷-Zellen wurden in 1 ml Verdünnungsmittel A resuspendiert und mit 2 μM PKH2-GL (Sigma, St. Louis, MO, USA) nach Anleitung des Herstellers gefärbt. Gefärbte Zellen wurden zweimal mit Medium gewaschen, dem 18 % fetales Kälberserum (FKS) zugegeben wurde, und über Nacht in ihrem Kulturmedium inkubiert, um die Dissoziation überschüssiger Farbe von der Membran zu erlauben.
1.6. Analyse lebensfähiger und toter Zellpopulationen
Die Anzahl lebensfähiger Zellen wurde bestimmt, indem die Zellen in einem Hämozytometer gezählt wurden, die Trypan Blau-Farbe nicht aufgenommen hatten. Duplikate der Vertiefungen wurden stets zweimal gezählt, und die Ergebnisse sind gezeigt als Mittelwerte dieser 4 unabhängigen Zählungen. Apoptose wurde analysiert, indem 30 μM Propidiumiodid (PI) (ICN) zu den geernteten Zellen gegeben wurde und die Prozentzahl der Zellen, die PI aufgenommen hatten, mit einem EPICS 753-Flusszytometer (Coulter Electronics, Luton, UK), ausgestattet mit einem Argon-Ionenlaser mit einer Emission bei 488 nm, gemessen wurde, nachdem Zelltrümmer ausgegrenzt wurden. PI-Fluoreszenz wurde bei 610-630 nm entdeckt. Zusätzlich wurde durch „Forward-Scatter"-Analyse auch die Prozentzahl apoptotischer Zellen bestimmt (Ergebnisse sind nicht gezeigt). Die mit letzterem Verfahren erhaltenen Ergebnisse korrelierten gut mit den PI-Farbausschlussdaten.
In Mischkulturen von PKH2-GL-gefärbten T-HA-Zellen und APZ-Splenozyten wurde die Anzahl lebensfähiger und apoptotischer T-HA-Zellen durch flusszytometrische Analyse PI-negativer bzw. -positiver Zellen, die grüne Fluoreszenz (525 nm) von der PKH2-GL-Färbung emittierten, erhalten.
1.7. Antikörper und Reagenzien
Für die Immunfluoresenz wurden Ratte-anti-Maus-CD25 (Klon PC 61) und Ratte-anti-Maus-CD71 (Klon R217 17.1.3., freundlicherweise zur Verfügung gestellt von Dr. G. Leclercq) als primäre Antikörper verwendet. Bindung von Anti-CD25 und Anti-CD71 wurde mit FITC-konjugiertem Ziege-Anti-Ratte-IgG (Sera-Lab, Crawley Down, GB) entdeckt. Das Mitochondrienmembranpotential wurde gemessen, indem 1 μM Rhodamin 123 (Molecular Probes Inc., Eugene, OR) für 30 Minuten zu den Zellen gegeben und danach die Fluoreszenzintensität durch Flusszytometrie analysiert wurde.
1.8. Analyse des Zellzylus
T-HA-Zellen wurden geerntet, einmal in kaltem PBS gewaschen und in Krishan-Reagenz (0,05 mg/ml PI, 0,02 mg/ml Ribonuklase A, 0,3 % Nonidet P-40, 0,1 % Natriumzitrat) lysiert. Der DNA-Gehalt der Zellkerne wurde durch Flusszytometrie analysiert. Die Verteilung von Zellen in den verschiedenen Stadien des Zellzyklus wurde mit MDADS Paral-Software (Coulter Electronics) berechnet.
1.9. Experimente mit frisch isolierten Milzzellen
8 × 10⁸ Milzzellen wurden aus Milzen von naiven, 8 Wochen alten C57B1/6-Mäusen präpariert und in 25 cm² großen Gewebekulturflaschen (Falcon, Becton Dickinson) mit 1 μg/ml löslichem Anti-CD3-mAb (145-2C11) aktiviert. Nach 24 Stunden wurde überschüssiger Antikörper entfernt, und die Zellen wurden ohne Zugabe von exogenem Zytokin für 72 Stunden weiter kultiviert. Nach diesem Stimulationszeitraum wurden die Kulturen geerntet und CD4⁺-T-Zellen wurden durch immunmagnetische Zellsortierung isoliert. Es wurde gemäß den Angaben des Herstellers ein negatives Selektionsverfahren mit einem Ab-Cocktail, der zur Anreicherung von CD4⁺-T-Zellen der Maus konzipiert ist (StemSep, Stem Cell Technologies, Vancouver, Kanada), durchgeführt. 7,5 × 10⁶ gewonnene Zellen wurden 10 Tage lang weiter kultiviert und (jeden vierten Tag) mit ihren jeweiligen Zytokinen (keine, 10 ng/ml IL-15 oder 10 ng/ml IL-2) ergänzt. Am Tag 14 wurde beruhend auf dem Ausschluss der Trypan Blau-Farbe die Zahl der lebensfähigen Zellen bestimmt. Zur Restimulierung wurde 1 μg/ml löslicher Anti-CD4-mAb und die immortalisierte Makrophagenzelllinie Mf4/4 (frei erhältlich von De Smedt, Universiteit Gent) verwendet. Vor der Verwendung wurden die Mf4/4-Zellen 24 Stunden lang mit 400 E/ml IFN-γ aktiviert, um die Expression von costimulatorischen Molekülen zu verstärken. Danach wurden sie 90 Minuten lang mit 30 μg/ml Mitomycin-C (Duchefa, Haarlem, Niederlande) behandelt, um ihre Proliferation zu blockieren, wodurch Interferenz mit Proliferationsmessungen von den restimulierten Lymphozyten verhindert wird. Für die Bestimmung der Empfindlichkeit für Anti-CD3-induzierten Tod wurden alternativ frisch isolierte, unsortierte Milzzellen 72 Stunden lang in Platten mit 24 Vertiefungen mit 1 μg/ml löslichem Anti-CD3-mAb (145-2C11) ohne exogene Zytokine aktiviert und an Tag 3 mit 10 ng/ml IL-15 oder IL-2 ergänzt. Nach einem zusätzlichen Kulturzeitraum von 8 Tagen wurden die Zellen geerntet und mit plattengebundenem Anti-CD3-mAb (10 μg/ml) restimuliert. Die Anzahl apoptotischer Zellen wurde nach 24 Stunden durch Aufnahme von PI-Farbe bestimmt. Das CD4/CD8-Verhältnis wurde bestimmt, indem 1 × 10⁵ Zellen mit 0,5 μg PE-konjugiertem Ratte-Anti-Maus-CD4-mAb (Pharmingen, San Diego, CA) und 0,5 μg/ml FITC-markiertem Ratte-Anti-Maus-CDR-mAb (Klon 53-6.7, freundlicherweise zur Verfügung gestellt von Dr. G. Leclercq, Ghent, Belgien) markiert wurden, sowie durch Analyse der gefärbten Populationen auf einem FACScalibur Flusszytometer (Becton-Dickinson) nach dem Ausgrenzen von toten Zellen und Zelltrümmern. Die Gesamtanzahl von CD4⁺-T-Zellen in den jeweiligen Kulturen wurde aus den erhaltenen Prozentzahlen und der Zählung lebensfähiger Zellen durch Ausschluss von Trypan-Blau-Farbe berechnet.
2. ERGEBNISSE
2.1. IL-15 ist ein Überlebensfaktor, der CD4⁺-T-Zellen vor Zelltod nach Wachstumsfaktorentzug schützt, ohne Proliferation zu induzieren.
Während der akuten Phase der Aktivierung durch Antigen produzieren CD4⁺-Effektorzellen vorübergehend hohe Spiegel von IL-2, was autokrines Wachstum und starke Expansion der Lymphozyten bewirkt. Nach Beendigung der Effektorphase und daher auch nach der Zytokinproduktion werden die erzeugten Lymphozyten jedoch abhängig von der exogenen Zufuhr von Wachstumsfaktoren, hauptsächlich IL-2, um zu überleben. Wir haben das Überleben aktivierter T-HA-Zellen, die vier Tage nach der Stimulation mit Ag/APZ geerntet wurden, in Gegenwart steigender Konzentrationen von IL-2 oder IL-15 untersucht. Nach dreitägiger Behandlung mit unterschiedlichen Konzentrationen an Zytokinen wurde die Aufnahme von ³H-Thymidin als ein Maß für die Zellteilung, die Gesamtzahl lebensfähiger Lymphozyten und die Prozentzahl apoptischer Zellen in den verschiedenen Kulturen bestimmt (1).
Im Gegensatz zu der Behandlung mit IL-2 bewirkte die Behandlung mit IL-15 keine Zellteilung (1A). Diese Ergebnisse stehen im Gegensatz zu den Ergebnissen, die von Kanegane & Tosato (1996) erhalten wurden, die behaupteten, dass CD4⁺-Zellen nach Zugabe von IL-15 proliferieren. Diese Diskrepanz ist wahrscheinlich auf das Vorhandensein geringer Mengen von IL-2 (neben IL-15) in ihren Experimenten zurückzuführen. Unerwarteterweise und trotz der Abwesenheit von Wachstumsfaktoraktivität durch vor Zelltod geschützt, der normalerweise in Abwesenheit von Wachstumsfaktoraktivität auftritt: die Zellzahlen blieben bei einer IL-15-Konzentration von 0,1 ng/ml oder höher (1B) unverändert, und es wurde kein Anstieg der Prozentzahl apoptotischer Zellen beobachtet (1C). Dies steht in deutlichem Gegensatz zu der expliziten Verringerung der Anzahl lebensfähiger Zellen und dem korrespondierenden Anstieg toter Zellen in Abwesenheit von Zytokin, eine Reflexion des durch Depletion von Wachstumsfaktor induzierten Zelltods, sowie zu dem mit Zellwachstum assoziierten Überleben von mit IL-2 behandelten T-HA-Lymphozyten (1).
Wir ziehen aus diesen Daten den Schluss, dass IL-15, jedoch nicht IL-2, ein Überlebenssignal in CD4⁺-T-Lymphozyten induzieren kann, ohne die Zellen in den proliferativen Zellzyklus zu treiben. So etabliert IL-15 einen ruhenden Phänotyp in T-HA-Lymphozyten, der jedoch mit einem Überleben verbunden ist. Darüber hinaus war der Nettoertrag von lebensfähigen T-HA-Zellen unter Bedingungen geringer Zytokinkonzentration, im Bereich von 0,1 ng/ml, erheblich höher, wenn Zellen mit IL-15 anstatt mit IL-2 kultiviert wurden. Gestützt auf dem Erhalt der Lebensfähigkeit in Abwesenheit aktiver Zellteilung nach IL-15 Behandlung zeigt dieses Beispiel, dass das IL-15-Polypeptid den antigenaktivierten CD4⁺-T-Lymphozyten die Eigenschaft verleiht, in Abwesenheit von Zytokin als ruhende Zelle mit inhärenter Wachstumsaktivität zu überleben. Auf diese Art wirkt IL-15 als ein Faktor, der das Überleben von antigengeprimten CD4⁺-T-Lymphozyten, die durch eine vorausgehende Antigenaktivierung erzeugt wurden, als ruhende Zellen ermöglicht.
2.2. IL-15 induziert einen ruhenden Phänotyp
Es wird angenommen, dass nach Abschluss einer primären Immunantwort eine Fraktion von aktivierten Effektorzellen zu einem Ruhestadium zurückkehrt und in dem Tier als eine Population von kleinen Lymphozyten verbleibt, die im Falle eines Wiederauftauchens ihres Antigens zu einer „Gedächtnis"-Antwort bereit sind. Es besteht die Frage, ob T-HA-Lymphozyten, die mit IL-15 ohne periodisches Durchlaufen des Zellzyklus überleben, als kleine, ruhende Lymphozyten phänotypisiert werden können. Es wurde daher eine Reihe von Eigenschaften, die im Allgemeinen als Parameter für einen Ruhezustand der Lymphozyten gelten, untersucht. Es wurde bestimmt, ob der beobachtete Wachstumsstopp in einer spezifischen Phase des Zellzyklus stattfand. Zellzyklusanalyse durch Flusszytometrie ergab, dass mit IL-15 behandelte Zellen sich in G₀/G₁ ansammelten (2), was die Induktion eines Anhaltens durch IL-15 zu Anfang des Zellzyklus anzeigt. Periodisch den Zellzyklus durchlaufende Zellen, die mit IL-15 behandelt sind, werden daher weder sofort noch zufällig angehalten, was in der Tat apoptoseinduzierend wäre, sondern setzen ihren Zyklus fort, bis sie G₀/G₁ erreichen, und dann den Zellzyklus in ordentlicher Weise verlassen, d.h. ohne programmierten Zelltod auszulösen.
Zusätzlich wurden Zellgröße, Expression von Aktivierungsmarkern und das mitochondriale Transmembranpotential (ΔΨ_m) als ein Indikator des metabolischen Status der Zellen evaluiert. Mit IL-15 behandelte T-HA-Zellen zeigen alle Kennzeichen ruhender Zellen: die Zellen waren klein, expimierten kleine Mengen der Aktivierungsmarker CD25 (IL-2Rα) und CD71 (Transferrinrezeptor) und hatten ein geringes ΔΨ_m (2). Im Gegensatz dazu waren mit IL-2 kultivierte Zellen große blastoide Zellen mit hohen CD25- und CD71-Expressionsmengen und einem hohen oxidativen Metabolismus wie durch das erhöhte ΔΨ_m angezeigt wird. Das durch IL-15 induzierte Anhalten der T-HA-Zellen in G₀/G₁ ist begleitet von der Annahme eines typischen ruhenden Phänotyps.
2.3. IL-15 schützt den CD4⁺-Helfer-T-Zellklon T-HA gegen AIZT.
AIZT von reifen T-Lymphozyten gilt im Allgemeinen als Schlüsselmechanismus, der Stärke und Dauer einer Immunantwort eingrenzt (Critchfield et al., 1995). Es wurde gezeigt, dass klonale Expansion und konsequenterweise IL-2 ein wichtiger Regulator der Empfindlichkeit gegenüber AIZT ist, da bei T-Lymphozyten, die in Gegenwart von IL-2 kultiviert werden, nach Vernetzung des T-Lymphozytenrezeptors für Antigen (TZR) leicht Apoptose stattfindet (Lenardo, 1991). Wir verglichen den Einfluss einer Behandlung mit IL-2 und IL-15 auf die Empfänglichkeit von T-HA-Zellen gegenüber einer Stimulation durch Ag/APZ. T-HA-Zellen wurden vor der Restimulation mit Antigen 48 Stunden lang mit IL-15 (1 ng/ml) oder IL-2 (100 IE/ml (7,7 ng/ml) oder 1 IE/ml (0,077 ng/ml)) behandelt.
Wie oben beschrieben, unterschieden sich die Zellen funktional beim Augenblick der Restimulation entsprechend dem zugefügten Zytokin: IL-15 hielt die T-HA-Zellen voll lebensfähig jedoch nicht proliferierend, während hoch dosiertes IL-2 (7,7 ng/ml) kräftiges periodisches Durchlaufen des Zellzyklus induzierte und die Behandlung mit niedrig dosiertem IL-2 (0,077 ng/ml) zu extensivem Zelltod führte. T-HA-Zellen, die mit IL-15 vorbehandelt wurden, proliferierten als Antwort auf Antigenstimulation dramatisch stärker im Vergleich zu Zellen, die in Gegenwart von 100 IE IL-2 kultiviert wurden (3). Die kleine Fraktion von T-HA-Zellen, die die Inkubation mit I IE/ml IL-2 überlebte, wies eine Reaktivität gegenüber Ag/APZ auf, die mit den mit IL-15 vorbehandelten Zellen vergleichbar war.
In einem nächsten Schritt wollten wir die Frage beantworten, ob diese differenzielle Responsivität eine differenzielle Sensitivität gegenüber AIZT oder vielmehr die Konsequenz unterschiedlicher proliferativer Kapazitäten von mit IL-2 behandelten im Gegensatz zu mit IL-15 behandelten Zellen widerspiegelte. Zu diesem Zweck wurden T-HA-Zellen vor der Ag/APZ-Stimulation mit einer grünen Fluoreszenzfarbe markiert, was eine Unterscheidung dieser Zellen von den in diesen Kulturen vorhandenen APZ während der Analyse der Anzahl lebensfähiger und toter Zellen durch Flusszytometrie erlaubt.
Die in 4A gezeigten Ergebnisse zeigen deutlich, dass die defektive Immunresponsivität, die bei mit 7,7 ng/ml IL-2 vorbehandelten Zellen beobachtet wurde, die Folge extensiven Zelltods ist, was 48 Stunden nach dem Beginn der Aktivierung mit Ag/APZ offensichtlich ist. Dies stimmt mit der allgemein akzeptierten Ansicht überein, dass IL-2 T-Zellen für AIZT sensitiviert. T-HA-Zellen, die in Gegenwart von IL-15 kultiviert werden, waren dagegen während der Antigenaktivierung wirksam vor Zelltod geschützt, was zur Erzeugung einer hohen Anzahl von Effektorzellen führte (4). Vergleichbare Ergebnisse wurden mit einer kleinen Population von T-HA-Zellen erhalten, die eine Behandlung mit niedrig dosiertem IL-2 mit 0,077 ng/ml überlebten. Dieses Ergebnis veranschaulicht die inhibitorische Aktivität von IL-15 auf Ag/APZ-induzierten Zelltod (AIZT) und, als ein Ergebnis dieser Aktivität, die erheblich verstärkte Bildung von Effektor-T-Lymphozyten nach einer erneuten, sekundären Stimulation der mit IL-15 behandelten, ruhenden CD4⁺-T-Lymphozyten mit Antigen.
2.4. Schutz vor Zelltod und vor Wachstumsfaktorentzug-induzierter Apoptose durch IL-15 potenziert stark die Immunresponsivität nach erneuter Antigenchallenge.
In diesem Beispiel ist die Wirkung der IL-15 Behandlung auf die Stärke der sekundären Immunantwort auf CD4⁺-T-Lymphozyten veranschaulicht. T-HA-Lymphozyten wurden in Gegenwart von IL-15 oder von hoch oder niedrig dosiertem IL-2 vor und nach Restimulation mit Ag/APZ kultiviert.
Wie in 5A gezeigt, führte das Vorhandensein von IL-15 über eine lange Zeit zum Erhalt der höchsten Anzahl von T-Lymphozyten, die als Antwort auf eine vorhergehende antigene Stimulation erzeugt worden sind. Ausgehend von einer festen Anzahl von mit IL-15 behandelten T-Lymphozyten führte die Kombination von optimaler Proliferation als Antwort auf Ag/APZ-Stimulation und optimaler Persistenz der erzeugten Effektorzellen durch Zugabe von IL-15 nach Beendigung der Antwort auf das Antigen zu einer 31-fachen Vermehrung der T-Zellen, die für eine zweite Ag/APZ-Antwort verfügbar sind. Hoch dosiertes IL-2, Sensitivierung gegenüber AIZT bzw. niedrig dosiertes IL-2, unzureichend unterstütztes Wachstum und Lebensfähigkeit erhöhte die Anzahl der T-Zellen um das 27,3-Fache, bzw. um das 6,7-Fache (5A).
T-Zellen, die mit IL-15 überleben, blieben gegenüber nachfolgender Aktivierung mit Antigen (5B) optimal sensitiviert. Die Kombination aus einem hohen Ertrag von T-Lymphozyten nach primärer Stimulation mit Antigen, optimaler Persistenz und hoher Reaktivität nach erneuter Stimulation mit Antigen der mit IL-15 behandelten CD4⁺-T-Lymphozyten führte zu einem maximalen Reaktivitätsindex der so behandelten T-HA-Zellen (5C). Zudem führt der kumulative Effekt dieser Reaktivität zu einem 105-fachen Ertrag an Effektorzellen, wie in 6 gezeigt. T-HA-Lymphozyten, die aufgrund der hohen oder niederen Dosismengen von IL- 2 überleben, erzeugten 3 Tage nach der zweiten Stimulation einen erheblich schwächeren Reaktivitätsindex (5C) und, als Konsequenz, nur eine Erhöhung der Zellzahlen um das 20-Fache bzw. 8-Fache (6).
Offensichtlich verstärkt IL-15 sowohl die Verfügbarkeit als auch die Responsivität der Zellen, was zu maximalen sekundären Antworten führt, welches Merkmale sind, die durch keine IL-2-Dosis erreicht werden können. Diese Ergebnisse zeigen deutlich, dass IL-15, aber nicht IL-2 die Eigenschaften besitzt, die für die Erzeugung eines effizienten Immungedächtnisses erforderlich sind, d.h. für das Bereitstellen eines starken Überlebenssignals, das die Persistenz von Immuneffektoren in einem Ruhezustand erlaubt und diese Gedächtniszellen für optimale Antwort in Falle einer erneuten Ag-Stimulation primt, indem Unempfindlichkeit gegenüber AIZT induziert wird. Insgesamt definiert unsere Studie eine einzigartige, neuartige Pro-Gedächtnisfunktion für IL-15, die sich deutlich von den von IL-2 oder von anderen Zytokinen mit Wachstumsfaktoraktivität ausgeübten physiologischen Aktivitäten unterscheidet.
2.5. Induktion eines Ruhezustands und Schutz vor Apoptose durch IL-15 erfolgt auch bei ex-vivo isolierten T-Zellen.
Frische unsortierte Milzzellen von naiven C57B1/6-Mäusen wurden isoliert und in vitro polyklonal stimuliert. Der Stimulus bestand aus löslichem Anti-CD3-mAb (1 μg/ml), der in Gegenwart von Costimulation durch Milz-APZ naive T-Zellen polyklonal aktiviert (Tamura, T. und Nariuchi, H., J. Immunol. 148: 2370, 1992). Nach 24 Stunden wurde verbleibender Anti-CD3-mAb entfernt und die aktivierten T-zellen wurden in Abwesenheit exogenen Zytokins weiter kultiviert. Um zu bestätigen, dass eine Aktivierung stattfand, wurden mit Anti-CD3-mAb aktivierte Zellen und unstimulierte Zellen mit ³H-Thymidin gepulst. Löslicher Anti-CD3-mAb induzierte eine starke proliferative Antwort: 25.304 cpm im Gegensatz zu 2.581 cpm bei unstimulierten Zellen. An Tag 4 wurden CD4⁺-Zellen durch immunmagnetische Zellsortierung isoliert und ohne Zytokin oder in Gegenwart von IL-15 (1 ng/ml) weiter kultiviert.
Nach 10 Tagen Kultur in Abwesenheit exogenen Zytokins war die Anzahl lebensfähiger Zellen auf 15 % der Zelleingabemenge gefallen, während IL-15 die Anzahl der Zellen bei zirka 60 % der Zelleingabemenge hielt (7A). Zellen, die mit IL-15 überlebten, erschienen als kleine, ruhende Lymphozyten und wiesen keine DNA-Synthese auf (59 cpm mit 10 ng/ml IL-15), wohingegen Proliferation mit IL-2 induziert werden konnte (4.184 cpm mit 10 ng/ml). IL-15 agiert daher auch bei frisch isolierten und TZR-aktivierten CD4⁺-T-Zellen als ein Überlebensfaktor und induziert einen Ruhezustand.
Als nächstes wurde in diesen polyklonal aktivierten T-Zellkulturen der Widerstand gegenüber TZR-induziertem Zelltod, getriggert durch immobilisierten Anti-CD3-mAb, untersucht. Die CD4⁺-T-Zellpopulation, die während der ganzen Zeit mit IL-15 erhalten wurde, war weitgehend resistent, wohingegen die Zellen, die mit IL-2 kultiviert wurden, extensiven Zelltod zeigten (7B). Schließlich proliferierten die CD4⁺-T-Zellen, die in einem durch IL-15 induzierten, Ruhestadium verblieben, als Antwort auf eine erneute Stimulation mit löslichem Anti-CD3 und APZ, was bei Zellen, die mit IL-2 erhalten wurden, nicht der Fall war (7C). Außerdem verstärkte die Zugabe von IL-15 zu den mit IL-15 vorbehandelten Kulturen die proliferative Antwort, was daher die wachstumsfördernde Aktivität von IL-15 in Gegenwart von TZR-Aggregation bestätigt. Diese Experimente zeigen, dass die Merkmale, die durch IL-15 in den klonalen CD4⁺-T-HA-Zellen induziert werden, nämlich langfristiges Überleben als ruhende Population, Resistenz gegenüber Apoptose und erhöhte Responsivität gegenüber TZR-Stimulation, auch von frisch isolierten CD4⁺-T-Zellen, die mit IL-15 behandelt werden, angenommen werden.
2.6. In vivo Evaluation der Fähigkeit von IL-15, die Gedächtnisantwort zu verstärken.
In vitro zeigen die hier beschriebenen Aktivitäten von IL-15, dass dieses Zytokin ein Faktor ist, der die Erzeugung und Persistenz von Gedächtnis-CD4⁺-T-Zellen fördert und so die sekundäre Immunantwort/Gedächtnisimmunantwort auf ein Antigen verstärkt. Es wurde untersucht, ob die Verabreichung von IL-15 in vivo während und/oder nach einer primären Immunantwort auf ein Antigen die sekundäre Immunantwort/Gedächtnisimmunantwort auf dieses Antigen verstärken kann.
IL-15 wurde daher mit einer osmotischen Minipumpe mit langsamer Freisetzung oder durch Bolusinjektion in Mäuse, die mit Hämagglutinin (HA9 immunisiert wurden, verabreicht, und die Responsivität auf eine erneute Challenge mit diesem Antigen wurde evaluiert. Im ersten Experiment bestand die anfängliche Immunisierung aus zwei Injektionen mit HA: 5 μg intraperitoneal (i.p.) injiziert an Tag 0 und weitere 5 μg subkutan (s.k.) in die rechte Flange injiziert an Tag 3. An Tag 4 wurde eine Bolusinjektion von 1 μg hIL-15 in einem Volumen von 100 μl PBS verabreicht (oder 100 μl PBS als Kontrolle). Zwei Stunden nach dieser anfänglichen Verabreichung wurde eine osmotische Minipumpe des Typs ALZET (Modell 2002, Alza Corp., Palo Alto. CA), gefüllt mit 10 μg hIL-15 in 235 (± 5,7) μl PBS oder mit PBS ohne Zytokin, auf den Rücken der Maus implantiert. Die Öffnung der Pumpe wurde zu der Stelle ausgerichtet, an der die s.k.-Injektion von HA verabreicht wurde. Das Befüllen der Pumpe erfolgte nach Angaben des Herstellers. Die Pumpen setzten IL-15 während 14 Tagen mit einer Flussrate von 0,52 (± 0,03) μg/Std. in dem Tier frei.
An Tag 21 nach der ersten HA- Injektion wurden die Mäuse getötet, und die abführenden Lymphknoten (LK) von Mäusen, die mit IL-15 oder PBS behandelt wurden, sowie LK von naiven Mäusen wurden isoliert, die LK-Zellen wurden präpariert und in vitro mit 500 ng/ml HA oder Hühnereilysozym (HEL) als irrelevantes Antigen restimuliert. Die durch diese Antigene induzierte Proliferation wurde durch ³H-Thymidin-Einbau gemessen. Die in 8 gezeigten Ergebnisse stellen die spezifische Proliferation der LK-Zellen von zwei Mäusen auf HA dar, d.h. die mit HEL erhaltenen cpm werden subtrahiert von dem absoluten cpm-Wert, der mit HA erhalten wurde. Sowohl die Proliferation von LK-Zellen von mit IL-15 behandelten Mäusen nach 72 Std. (8) als auch nach 120 Std. (8B) war im Vergleich zu mit PBS behandelten oder naiven Mäusen merklich erhöht. Auch die Zugabe von exogenem IL-15 während des Restimulationszeitraums konnte die Ag-spezifische proliferative Antwort verlängern (8C). Auch hier waren die LK-Zellen von IL-15 behandelten Mäusen gegenüber diesem exogenen I1-15 am responsivsten.
Diese Daten zeigen, dass eine Verabreichung von IL-15 mit langsamer Freisetzung während und/oder nach einer primären Immunantwort zu einer verstärkten proliferativen Responsivität gegenüber dem immunisierenden Antigen von Zellen aus den abführenden LK führt, was das Vorhandensein einer höheren Frequenz von Gedächtnis-T-Zellen in dem immunisierten Tier anzeigt.
In einem zweiten Experiment wurden die Mäuse mit einer einzigen Bolusinjektion von 2,5 μg HA (Tag 0) s.k. in der rechten Flanke immunisiert und, beginnend an Tag 4 nach dieser anfänglichen Immunisierung, mit täglichen Bolusinjektionen von I1-15 über 10 aufeinander folgende Tage behandelt. Es wurden die folgenden Dosismengen verabreicht: Tag 5, 5 μg; Tag 5-7, 4 μg; Tag 8-10, 3 μg und Tag 11-13, 2 μg. Das Zytokin wurde in einem Volumen von 100 μl PBS an derselben Stelle wie das Ag s.k. injiziert. Kontrollmäuse wurden mit PBS ohne Zytokin injiziert. An Tag 14 wurde den mit IL-15 und mit PBS behandelten Mäusen eine neue Challenge von 2,5 μg HA verabreicht, an derselben Stelle s.k. injiziert wie die anfängliche Immunisierung. Zwei Wochen später wurde retroorbital Blut abgenommen und das Serum wurde durch Inkubation der Blutproben bei 37°C für 20 Minuten sofort präpariert. Die Titer der gegen HA gerichteten Antikörper(Ab) wurden durch indirekten ELISA bestimmt.
9 zeigt, dass der Anti-HA-Ab-Titer der beiden mit IL-15 behandelten Mäuse im Vergleich zu den vier mit PBS behandelten Mäusen erhöht wurde. Titer in naiven Mäusen sind als eine zusätzliche Kontrolle der ELISA-Hintergrundspiegel gezeigt. Die erhöhten Anti-HA-Ab-Titer zeigen, dass eine verstärkte Immunantwort gegen eine zweite HA-Challenge in mit IL-15 behandelten Mäusen nach der ersten Antwort erfolgte. Insgesamt ist gezeigt, dass die Verabreichung von IL-15 in vivo während und/oder nach einer stattfindenden Immunantwort die sekundäre Immunantwort/Gedächtnisantwort, die durch einen erneuten Kontakt mit dem involvierten Ag hervorgerufen wird, verstärkt.
LISTE DER ABKÜRZUNGEN

AS:

Aminosäure

Ab:

Antikörper

Ag:

Antigen

AIZT:

aktivierungsinduzierter Zelltod

APZ:

antigenpräsentierende Zelle

BHA:

durch Bromelain gespaltenes Hämagglutinin

IL:

Interleukin

LAK:

lymphokinaktivierte Killerzelle

2-ME:

β-Mercaptoethanol

PBT:

T-Lymphozyten aus dem peripheren Blut

PHA:

Phytohämagglutinin

TZR:

T-Zellrezeptor

Th:

T-Helfer-Lymphzyt

Cpm:

Counts pro Minute

LEGENDEN DER FIGUREN
1: IL-15 ist hauptsächlich ein Überlebensfaktor, während IL-2 hauptsächlich ein proliferationsinduzierender Faktor ist.
T-HA-Zellen wurden an Tag 4 nach antigener Restimulation geerntet und 72 Stunden lang in 200 μl mit den angezeigten Konzentrationen von IL-2 oder IL-15 inkubiert.

(A) 1 × 10⁴ T-HA-Zellen wurden 72 Stunden lang mit steigenden Konzentrationen von IL-2 oder IL-15 kultiviert. Die Kulturen wurden während der letzten 8 Stunden mit ³H-Thymidin gepulst.
(B) Die Anzahl lebensfähiger Zellen in den Mikrokulturen, die mit 2 × 10⁴ T-HA-Zellen ausgesät wurden, wurde an Tag 3 der Kultur durch Trypan Blau-Ausschluss bestimmt. Die gezeigten Ergebnisse sind Mittelwerte von 2 Hämozytometerzählungen von 2 Vertiefungen.
(C) Die %-Zahl apoptotischer Zellen in den ursprünglichen Kulturen wurde durch flusszytometrische Quantifizierung von Zellen, die den Ausschlussfarbstoff PI aufgenommen hatten, bestimmt.

2: IL-15 induziert einen ruhenden Phänotyp.
2 × 10⁴ T-HA-Zellen wurden mit IL-2 (10 ng/ml) oder IL-15 (1 ng/ml) für 48-72 Stunden kultiviert. Es wurden der Zellzyklusstatus, die Zellgröße und die Expression von Aktivierungsmarkern analysiert. (A) PI-Fluoreszenz als Maß für den zellulären DNA-Gehalt und die Prozentzahl der Verteilung im Zellzyklus. (B) Forward-Light-Scatter als Maß für die Zellgröße. (C) (D) Expression von CD25 und CD71. Die gepunktete Linie stellt die Markierung nur mit sekundärem Ab dar. (E) Einbau von Rhodamin 123, der die Werte des mitochondrialen Membranpotentials anzeigt (MFI: mittlere Fluoreszenzintensität).
3: T-HA-Zellen, die mit IL-15 oder niedrig dosiertem IL-2 behandelt wurden, zeigen einer erhöhte Proliferation als Antwort auf Ag/APZ-Stimulation.
T-HA-Lymphozyten wurden an Tag 12 nach Antigenrestimulation 48 Stunden lang in Platten mit 24 Vertiefungen mit den angezeigten Konzentrationen von IL-2 oder IL-15 kultiviert. Als nächstes wurden vorbehandelte Zellen geerntet, das Zytokin wurde weggewaschen und 1 × 10⁴ Zellen wurden mit 2 × 10⁵ bestrahlten Milzzellen als APZ und 200 ng/ml gereinigtem BHA als Antigen stimuliert. Während der letzten 12 Stunden der 84-stündigen Kulturperiode wurde ³H-Thymidin zugegeben. Die Daten sind ausgedrückt als cpm des eingebauten ³H-Thymidin.
4: Behandlung von T-HA-Zellen mit IL-15 oder niedrig dosiertem IL-2 führt zu verstärkter Erzeugung von Effektorzellen während einer Ag/APZ-Antwort.
T-HA-Lymphozyten wurden an Tag 12 nach Antigenrestimulation geerntet und 48 Stunden lang mit IL-2 (7,7 ng/ml oder 0,077 ng/ml) oder IL-15 (1 ng/ml) vorbehandelt, gefolgt von einer Markierung mit dem grün fluoreszierenden Membranmarker PKH2-GL. 1 × 10⁴ markierte Zellen wurden mit 2 × 10⁵ bestrahlten Milzzellen als APZ und 200 ng/ml gereinigtem BHA als Antigen stimuliert. Die Kulturen wurden zu den angezeigten Zeitpunkten geerntet und die Anzahl der toten (A) und lebensfähigen (B) Zellen der gefärbten Zellpopulation wurde durch Flusszytometrie und PI-Aufnahme bestimmt, wobei die unmarkierten Milzzellen als ein interner Standard verwendet wurden. Die Zählungen sind Mittelwerte aus Dreifachkulturen.
5: Kultur von T-HA-Zellen in Gegenwart von IL-15 führt sowohl zu einer optimalen Ausbeute von Zellen nach primärer antigener Restimulation als auch zu optimaler proliferativer Responsivität nach sekundärer antigener Restimulation.
1 × 10⁵ T-HA-Lymphozyten, die 48 Stunden lang mit IL-2 (10 oder 0,1 ng/ml) oder mit IL-15 (1 ng/ml) vorbehandelt worden waren, wurden in 1 ml mit 2 × 10⁶ bestrahlten Milzzellen und 200 ng/ml BHA stimuliert. An Tag 4 wurden diese Kulturen mit derselben Konzentration an Zytokinen wie während der Vorbehandlung ergänzt und unter diesen Bedingungen für weitere 8 Tage inkubiert.

(A) Lebensfähige Zellen wurden an Tag 12 nach Beginn der oben beschriebenen antigenen Restimulation durch Ausschluss von Trypan Blau-Farbe gezählt. Die Daten sind dargestellt als ein Index der Zellausbeute, d.h. der Faktor, um den die Eingabezellzahl an Tag 12 multipliziert hatte.
(B) 1 × 10⁴ der wiedergewonnenen Zellen wurden ein zweites Mal mit Ag/APZ stimuliert und die Proliferation wurde durch ³H-Thyrnidin-Einbau bestimmt.
(C) Die gesamte proliferative Antwort, die während der zweiten antigenen Restimulation erwartet wurde, ist als Reaktivitätsindex dargestellt, der wie folgt berechnet wird: (Index der Zellausbeute, beschrieben in 5(A)) × (CPM gemessen an Tag 15 (5(B))

6: Kultur von T-HA-Zellen in Gegenwart von IL-15 führt zu einer stark erhöhten Bildung von Immuneffektorzellen.
Beginnend an Tag -2 wurden T-HA-Lymphozyten 48 Stunden lang mit den angezeigten Konzentrationen von IL-2 oder IL-15 vorbehandelt. An Tag 0 wurden 1 × 10⁵ T-HA-Zellen in 1 ml mit 2 × 10⁶ bestrahlten Milzzellen und 200 ng/ml BHA stimuliert. An Tag 4 wurden diese Kulturen mit denselben Konzentrationen von Zytokinen wie während der Vorbehandlung ergänzt und unter diesen Bedingungen für 8 weitere Tage inkubiert. An Tag 12 nach der ersten antigenen Stimulation wurden 1 × 10⁴ Zellen mit Ag/APZ restimuliert und an Tag 15 wurde die Anzahl von gebildeten Effektoren wie zuvor beschrieben bestimmt. Die Gesamtanzahl von an Tag 15 gebildeten Effektorzellen pro Zelle, die an Tag 0 stimuliert worden war, ist dargestellt als ein Index der Zellausbeute, der wie folgt berechnet wird:
7: IL-15 schützt aktivierte polyklonale CD4⁺-T-Zellpopulationen vor durch Wachstumsfaktorentzug induziertem PZT und vor TZR-induziertem Tod.
Frisch isolierte, unsortierte Milzzellen von C57B1/6-Mäusen wurden polyklonal mit löslichem Anti-CD3-mAb (1 μg/ml) aktiviert. An Tag 4 wurden CD4⁺-T-Zellen durch magnetische Zellsortierung isoliert und 7,5 × 10⁶ Zellen wurden 10 Tage lang ohne exogen zugegebenes Zytokin oder unter Zugabe von IL-15 (10 ng/ml) oder IL-2 (10 ng/ml) weiter kultiviert. An Tag 14 nach der anfänglichen Stimulation wurden die Kulturen geerntet und es wurden das Überleben, die Empfindlichkeit gegenüber TZR-induziertem Tod und die TZR-Responsivität evaluiert. (A) Die Anzahl der lebensfähigen Zellen wurde nach Zugabe von Trypan Blau gezählt. Überleben ist dargestellt als die Prozentzahl des Ertrags der Eingabezellzahlen. Es wurden 3 unabhängige Zählungen durchgeführt, SA < 15 %. (B) Die Empfindlichkeit gegenüber TZR-induziertem Tod wurde evaluiert, indem 1 × 10⁴ lebensfähige, mit IL-15 oder mit IL-2 kultivierte Zellen, die durch Dichtegradientenzentrifμgation isoliert wurden, mit plattengebundenem Anti-CD3-mAb (10 μg/ml) 24 Stunden lang restimuliert und die Prozentzahlen apoptotischer CD4⁺-T-Zellen durch PI-Aufnahme bestimmt wurden. Die Ergebnisse stellen 3 gepoolte Vertiefungen dar. (C) Die sekundäre Responsivität aktivierter CD4⁺-T-Zellpopulationen gegenüber geeigneter TZR-Stimulation wurde durch Restimulation von 1 × 10⁴ vorbehandelten T-Lymphozyten mit 1 μg/ml löslichem Anti-CD3-mAb und 2 × 10⁴ IFN-γ aktivierten Makrophagen (Mf4/4)gemessen, entweder in Abwesenheit oder in Gegenwart von 1 ng/ml IL-15 oder IL-2. Als Kontrolle wurden naive CD4⁺-T-Zellen zugegeben, um eine angemessene Induktion einer proliferativen Antwort unter diesen Stimulationsbedingungen sicherzustellen. Proliferation wurde durch Zugabe von ³H-Thymidin während der letzten 12 Stunden des 84-stündigen Testzeitraums gemessen. In den Kulturen von T-Zellen und Mf4/4 ohne löslichen Anti-CD3-Ab konnte keine Proliferation entdeckt werden (cpm < 500), was anzeigt, dass die beobachtete Antwort strikt von dem TZR-Triggering abhängig war. Die Ergebnisse stellen Mittelwerte aus Dreifachkulturen dar. Experimente mit frisch isolierten Milzzellen wurden zweimal mit ähnlichen Ergebnissen durchgeführt.
8: In vivo-Verabreichung von IL-15 während/nach einer primären Antigen-Challenge verstärkt die proliferative Responsivität geprimter LK-Zellen gegenüber einer sekundären Antigen-Challenge.
Mäuse wurden mit HA immunisiert und 14 Tage lang mit IL-15 oder PBS behandelt, die durch eine osmotische Minipumpe des Typs ALZET verabreicht wurden. An Tag 21 nach der anfänglichen HA-Injektion wurden die Mäuse getötet und die abführenden Lymphknoten präpariert. 2 × 10⁵ LK-Zellen wurden in Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen mit 500 ng/ml HA oder HEL ohne exogenes Zytokin restimuliert. Die Ergebnisse zeigen die HA-spezifische Proliferation, d.h. die absolute HA-induzierte Proliferation minus der HEL-induzierten Proliferation von LK-Zellkulturen von mit IL-15 (schraffiert) oder mit PBS (gepunktet) behandelten Mäusen, gemessen durch Zugabe von ³H-Thymidin nach 72 Stunden (A) oder 120 Stunden (B) für weitere 12 Stunden. Die in (C) gezeigten Daten stellen auch die HA-spezifische Proliferation zum Zeitpunkt 120 Stunden dar, allerdings wurde hier während des Kulturzeitraums 1 ng/ml exogenes IL-15 zugegeben. Jeder Balken stellt die Proliferation von LK-Zellen dar, die von einer einzelnen Maus stammen, außer im Fall der naiven Mäuse (schwarz), bei denen LK von drei Individuen gepoolt wurden.
9: In vivo-Verabreichung von IL-15 während/nach einer primären Antigen-Challenge verstärkt die Ag-spezifischen Ab-Titer hervorgerufen durch eine sekundäre Antigen-Challenge. Mäuse wurden mit HA immunisiert und 10 Tage lang mit IL-15 oder PBS behandelt, verabreicht durch tägliche Bolus-Injektionen. Einen Tag nach der letzten Verabreichung erhielten die mit IL-15 oder PBS behandelten Mäuse eine erneute Challenge mit HA. Zwei Wochen später wurden Blutproben abgenommen, die Seren präpariert und Anti-HA-Ab mit einem indirekten ELISA entdeckt. Die Seren wurden in Maxisorp-Platten mit 96 Vertiefungen (Nunc, Roskilde, Dänemark), welche zuvor über Nacht mit HA beschichtet wurden und zwar bei 4 °C mit 0,5 μg/ml Stammlösung des Ag, seriell verdünnt. Gebundener Ab wurde mit Ziege-Anti-Maus-IgG-Ab (Sigma) entdeckt, wobei mit alkalischer Phosphatase konjugierter Kaninchen-Anti-Ziege-IgG als entdeckender Ab (Sigma) verwendet wurde. Die Ergebnisse sind dargestellt als O.D.-Werte als eine Funktion des Serumverdünnungsfaktors. Jede Kurve stellt das Serum eines einzelnen Tieres dar. Die Seren naiver Mäuse wurden als Kontrolle für das Hintergrundsignal verwendet.
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Claims

Verwendung einer Verbindung, die in der Lage ist, die Bindung von IL-15 an seinen Rezeptor zu stören, zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung für die Behandlung von Autoimmunerkrankungen, wobei die Verbindung ausgewählt wird aus einem Anti-IL15-Antikörper, einem Anti-IL-15R-Alpha-Antikörper oder den Fab- oder F(ab')2-Fragmenten dieser Antikörper, löslichem IL-15R-Alpha, Fusionsproteinen bestehend aus löslichem IL-15R-Alpha und Fc-Fragment, oder Peptiden, die den funktionalen IL-15-Rezeptor binden und/oder inhibieren.
Verwendung einer Verbindung, die in der Lage ist, die IL-15-Synthese zu inhibieren, zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung für die Behandlung von Autoimmunerkrankungen, wobei die Verbindung ein IL-15-Antisense-Oligonukleotid ist.
Verwendung gemäß Anspruch 1, wobei die pharmazeutische Zusammensetzung die Verbindung in Gegenwart eines geeigneten Arzneimittelträgers umfasst.