DE69828079T2

DE69828079T2 - Styrolsulfone als antikrebsmittel

Info

Publication number: DE69828079T2
Application number: DE69828079T
Authority: DE
Inventors: E. Premkumar Reddy; M. Ramana REDDY
Original assignee: Temple University of Commonwealth System of Higher Education
Current assignee: Temple University of Commonwealth System of Higher Education
Priority date: 1997-10-03
Filing date: 1998-10-01
Publication date: 2005-12-22
Anticipated expiration: 2018-10-02
Also published as: CN1273580A; EP1027330A1; AU9595498A; US6359013B1; CN1163480C; ATE284386T1; CZ299718B6; CA2305790C; WO1999018068A1; HK1031373A1; BR9814059B1; CZ20001174A3; EP1027330A4; AU741042B2; NZ503479A; IL135438A; BR9814059A; CA2305790A1; JP4294217B2; DE69828079D1

Description

Gebiet der Erfindung
Die Erfindung bezieht sich auf Zusammensetzungen und Verfahren zur Behandlung von Krebs, insbesondere Brust- und Prostatakrebs.
Allgemeiner Stand der Technik
An Transmembranrezeptoren empfangene extrazelluläre Signale werden über die Signalübertragungswege (Pelech et al., Science 25:1335 (1992)), die mit einem weiten Bereich physiologischer Vorgänge in Verbindung gebracht werden, wie etwa der Induktion von Zellvermehrung, -differenzierung oder -apoptosis (Davis et al., J. Biol. Chem. 268:14553 (1993)) in die Zellen weitergeleitet. Die Mitogen aktivierte Protein Kinase (MAPK)-Kaskade ist ein wichtiges Signalsystem, durch das Zellen extrazelluläre Hinweise in intrazelluläre Reaktionen übertragen (Nishida et al., Trends Biochem. Sci. 18:128 (1993); Blumer et al., Trends Biochem. Sci. 19:236 (1994)). Viele Schritte dieser Kaskade sind konserviert, und Homologe für MAP-Kinasen sind in verschiedenen Arten entdeckt worden.
In Säugetierzellen sind durch extrazelluläre Signale regulierte Kinasen (ERK) ERK-1 und ERK-2 die archetypischen und am besten untersuchten Mitglieder der MAPK-Familie, die alle das einzigartige Merkmal aufweisen, durch Phosphorylierung an Threonin- und Tyrosin-Resten durch eine stromaufwärts liegende dualspezifische Kinase aktiviert zu werden (Posada et al., Science 255:212 (1992); Biggs III et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:6295 (1992); Garner et al., Genes Dev. 6:1280 (1992)).
Neueste Studien haben eine zusätzliche Untergruppe von MAPK, bekannt als c-Jun-NH2-terminale Kinasen 1 und 2 (JNK-1 und JNK-2), identifiziert, die unterschiedliche Substratspezifitäten aufweisen und durch unterschiedliche Stimuli reguliert werden (Hibi et al., Genes Dev. 7:2135 (1993)). JNK sind Mitglieder der Klasse von Stress aktivierten Proteinkinasen (SAPK). Bei JNK hat sich gezeigt, dass sie durch die Behandlung von Zellen mit UV-Strahlung, entzündungsfördernde Zytokine und umgebungsbedingte Beanspruchung aktiviert werden (Derijard et al., Cell 1025 (1994)). Die aktivierte JNK bindet sich an den Amino-Terminus des c-Jun-Proteins und erhöht die transkriptionale Aktivität des Proteins durch dessen Phosphorylierung an ser63 und ser73 (Adler et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA 89:5341 (1992); Kwok et al., Nature 370:223 (1994)).
Eine Analyse der abgeleiteten Primärsequenz der JNK deutet darauf hin, dass sie entfernt mit den ERK verwandt sind (Davis, Trends Biochem. Sci. 19:470 (1994)). Sowohl ERK als auch JNK werden als Reaktion auf externe Stimuli an Tyr und Thr phosphoryliert, was in deren Aktivierung resultiert (Davis, Trends Biochem. Sci. 19:470 (1994)). Die Stellen der Phosphorylierung (Thr und Tyr), die bei deren Aktivierung eine kritische Rolle spielen, sind zwischen ERK und JNK konserviert (Davis, Trends Biochem. Sci. 19:470 (1994)). Diese Stellen der Phosphorylierung befinden sich jedoch innerhalb ausgeprägter dualer Phosphorylierungsmotive: Thr-Pro-Tyr (JNK) und Thr-Glu-Tyr (ERK). Die Phosphorylierung von MAPK und JNK durch ein externes Signal umfasst oft die Aktivierung von Protein-Tyrosin-Kinasen (PTK) (Gille et al., Nature 358:414 (1992)), die eine große Proteinfamilie ausmachen, die mehrere Wachstumsfaktorrezeptoren und andere Signal übertragende Moleküle umspannt.
Protein-Tyrosin-Kinasen sind Enzyme, die eine wohldefinierte chemische Reaktion katalysieren: die Phosphorylierung eines Tyrosin-Rests (Hunter of al., Annu Rev Biochem 54:897 (1985)). Rezeptor-Tyrosin-Kinasen sind besonders attraktive Ziele für die Entwicklung von Medikamenten, da es wahrscheinlich ist, dass die Blocker für den Substratbereich dieser Kinasen ein wirksames und selektives antiproliferatives Mittel ergeben. Die potentielle Verwendung von Protein-Tyrosin-Kinase-Blockern als antiproliferative Mittel wurde bereits 1981 erkannt, als Querzetin als PTK-Blocker vorgeschlagen wurde (Graziani et al., Eur J. Biochem. 135:583-589 (1983)).
Der am besten verstandene MAPK-Weg umfasst durch extrazelluläre Signale regulierte Kinasen, die die Ras-Raf-MEK-ERK-Kinase-Kaskade ausmachen (Boudewijn et al., Trends Biochem. Sci. 20, 18 (1995)). Sobald dieser Weg durch verschiedene Stimuli aktiviert wird, phosphoryliert MAPK eine Vielfalt von Proteinen einschließlich mehrerer Transkriptionsfaktoren, die sich in den Nucleus verlagern und die Transkription von Genen aktivieren. Eine negative Regulierung dieses Wegs könnte die Kaskade dieser Ereignisse zum Stillstand bringen.
Neue antineoplastische Chemotherapeutika, die auf Rezeptor-Tyrosin-Kinasen abzielen und die die Ras-Raf-MEK-ERK-Kinase-Kaskade zum Stillstand bringen, werden benötigt. Es ist wahrscheinlich, dass Onkoproteine im Allgemeinen und Signal übertragende Proteine im Besonderen selektivere Ziele für die Chemotherapie sind, da sie eine Unterklasse von Proteinen repräsentieren, deren Aktivitäten für die Zellvermehrung von wesentlicher Bedeutung sind, und weil ihre Aktivität bei proliferativen Störungen bedeutend verstärkt wird.
Zusammenfassung der Erfindung
Gemäß einer Ausführungsform der Erfindung werden neuartige Verbindungen gemäß Formel I bereitgestellt:
wobei
R₁ und R₂ unabhängig aus der Gruppe, bestehend aus Chlor, Fluor und Brom, ausgewählt sind; und
R₃ aus der Gruppe, bestehend aus Wasserstoff und Fluor, ausgewählt ist;
R₁ und R₂ nicht beide Chlor sein können, wenn R₃ Wasserstoff ist; und
R₁ nicht Chlor sein kann, wenn R₂ Fluor ist und in derselben Verbindung R₃ Wasserstoff ist.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird eine pharmazeutische Zusammensetzung bereitgestellt, die einen pharmazeutisch akzeptablen Träger und eine Verbindung der Formel II beinhaltet,
wobei
n null oder eins ist;
R₁ aus der Gruppe, bestehend aus Wasserstoff, Chlor, Fluor und
Brom, ausgewählt ist;
R₂ aus der Gruppe, bestehend aus Wasserstoff, Chlor, Fluor, Brom, Methyl und Methoxy, ausgewählt ist; und
R₃ aus der Gruppe, bestehend aus Wasserstoff, Chlor und Fluor, ausgewählt ist;
vorausgesetzt, dass:
R₂ nicht Methyl oder Methoxy sein kann, wenn R₁ und R₃ beide Wasserstoff sind und n null oder eins ist; und
R₁, R₂ und R₃ nicht alle Wasserstoff sein können, wenn n eins ist.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform beinhaltet die pharmazeutische Zusammensetzung einen pharmazeutisch akzeptablen Träger und eine Verbindung der Formel II, wobei R₃ Wasserstoff ist und R₁ und R₂ unabhängig aus der Gruppe, bestehend aus Chlor, Fluor und Brom, ausgewählt sind.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird eine pharmazeutische Zusammensetzung bereitgestellt, die einen pharmazeutisch akzeptablen Träger und eine Verbindung der Formel III beinhaltet,
wobei
R₁ aus der Gruppe, bestehend aus Wasserstoff, Chlor, Fluor und Brom, ausgewählt ist.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird ein Verfahren zur Behandlung einer Einzelperson gegen Brust- oder Prostatakrebs bereitgestellt, das das Verabreichen einer wirksamen Menge einer Verbindung gemäß Formel I oder Formel III allein oder in Verbindung mit einem pharmazeutisch akzeptablen Träger, an die Einzelperson beinhaltet. In einer weiteren Ausführungsform wird ein Verfahren zum Hemmen des Wachstums von Brust- oder Prostatatumorzellen bei einer Einzelperson, die von Brust- oder Prostatakrebs befallen ist, bereitgestellt, das das Verabreichen einer wirksamen Menge einer Verbindung gemäß Formel III, allein oder in Verbindung mit einem pharmazeutisch akzeptablen Träger, an die Einzelperson beinhaltet. Des Weiteren wird ein Verfahren zum Induzieren von Apoptosis von Brust- oder Prostatatumorzellen bei einer Einzelperson, die von Brust- oder Prostatakrebs befallen ist, bereitgestellt, das das Verabreichen einer wirksamen Menge einer Verbindung gemäß Formel III, allein oder in Verbindung mit einem pharmazeutisch akzeptablen Träger, an die Einzelperson beinhaltet.
Die Erfindung bezieht sich ebenfalls auf eine pharmazeutische Zusammensetzung und therapeutische Verfahren wie oben beschrieben, wobei die Verbindung eine der Formel IV ist:
R₁ ist aus der Gruppe, bestehend aus Fluor und Brom, ausgewählt, und R₂ ist aus der Gruppe, bestehend aus 2-Chlorphenyl, 4-Chlorphenyl, 4-Fluorphenyl und 2-Nitrophenyl ausgewählt.
Beschreibung der Figuren
1A und 1B sind Balkendiagramme der Wirkung der Verbindungen E-2,4-Difluorstyryl-4-fluorbenzylsulfon (FRI-2), E-4-Fluorstyryl-4- brombenzylsulfon (FRI-6), E-4-Bromstyryl-4-fluorbenzylsulfon (FRI-7), E-4-Fluorstyryl-4-chlorbenzylsulfon (FRI-20) und E-4-Chlorstyryl-4-chlorbenzylsulfon (FR-22) auf NIH3T3-, MCF7-, BT-20- und LnCaP-Zellen. Die Zellen wurden mit den Verbindungen in Konzentrationen von 2,5 μM (1A) oder 5,0 μM (1B) behandelt, und Zelllebensfähigkeit wurde nach 48 Stunden durch das Trypanblau-Ausschlussverfahren bestimmt. Jeder Datenpunkt repräsentiert den Durchschnitt von drei unabhängigen Experimenten. Die Standardabweichung hat 10 % nicht überschritten.
2A ist ein Balkendiagramm der von der Konzentration abhängigen Hemmung von MCF7-, BT20-, LnCaP- und NIH3T3-Zellen durch die Behandlung mit FRI-20. Die Zellen wurden mit 0,250 nM, 500 nM, 1 μM, 2,5 μM und 5,0 μM FRI-20 48 Stunden lang behandelt. Der Prozentanteil von lebenden Zellen wurde durch Trypanblau Ausschluss bestimmt. Der Mittelwert von drei unabhängigen Experimenten wird gezeigt.
2B ist ein Balkendiagramm der Lebensfähigkeit von MCF7-, BT20-, LnCaP- und NIH3T3-Zellen nach der Behandlung mit FRI-20 zu unterschiedlichen Zeitspannen. Alle Zellen wurden mit FRI-20 bei 2,5 μM behandelt, und die Anzahl der lebensfähigen Zellen wurde nach 12, 24, 48 und 72 Stunden durch Trypanblau-Ausschluss bestimmt. Der Mittelwert von drei unabhängigen Experimenten wird gezeigt.
3A ist eine graphische Darstellung der Aktivität der Verbindung FRI-20 auf den normalen Zelllinien NIH3T3, HeLa und HFL; den Östrogenrezeptor positiven Brusttumorzelllinien MCF-7 und 361; den Östrogenrezeptor negativen Brusttumorzelllinien SKBR-3, 435 und BT-20. 3B ist 3A ähnlich, mit der Ausnahme, dass die behandelten Zellen die Androgen abhängige Prostatazelllinie LnCaP und die Androgen unabhängigen Prostatazelllinien DU-145 und PC-3 beinhalten. Alle Zellen wurden mit 2,5 und 5,0 μM Konzentrationen von FRI-20 behandelt und nach 48 Stunden durch Trypanblau-Ausschluss auf Zelllebensfähigkeit geprüft. Der Mittelwert von drei Experimenten wird gezeigt. Die Varianz hat 10 % nicht überschritten.
4 beinhaltet eine Reihe von Blots der Zellzyklusanalyse von mit FRI-20 behandelten oder kontrollbehandelten LnCaP-Zellen. LnCaP-Zellen wurden mit 120 ml DMSO (Kontrollzellen) oder 2,5 μM FRI-20 in 10 ml DMSO behandelt. Zellen wurden 6, 12, 24 und 48 Stunden auf die Behandlung folgend entnommen und mit Propidiumiodid gefärbt und Durchflusscytometrie unterzogen.
5 ist ein SDS-PAGE-Autoradiogramm der Wirkung von FRI-20 auf ERK/MAPK-Aktivität. Mit FRI-20 behandelte LnCaP-, MCF-7- und NIH3T3-Zellen wurden gemeinsam mit DMSO behandelten Zellen (Kontrolle) unter Verwendung von basischem Myelin-Protein (MBP) als Substrat für einen ERK/MAPK-Immunkomplex-Kinaseversuch verarbeitet. Die Aktivität von ERK-2 gegenüber MBP wurde dann in der Anwesenheit von [γ³²P]ATP geprüft. Das phosphorylierte MBP wurde auf 12 % SDS-PAGE getrennt und durch Autoradiographie sichtbar gemacht.
6 ist ein Blot der Verteilung von ERK-2 und JNK/SAPK-Proteinen in NIH3T3-, LnCaP- und MCF-7-Zellen. Lysate von gezüchteten Zellen, die 100 mg Proteine enthalten, wurden pro Spur geladen. Auf die Elektrophorese und den Transfer auf eine Polyvinylidenmembran folgend wurden Proteine gegen ERK-2 und JNK-2 polyklonale Antikörper geblottet und durch Chemilumineszenz sichtbar gemacht.
7 ist ein SDS-PAGE-Autoradiogramm der Wirkung von FRI-20 auf JNK/SAPK-Aktivität. JNK wurde aus 100 mg Lysaten gezüchteter Zellen mit JNK polyklonalem Antikörper immunpräzipiert, und eine Immunkomplex-Kinaseprüfung wurde unter Verwendung von GST-c-Jun (1-79) als Substrat ausgeführt. Die phosphorylierten Proteine wurden durch SDS-PAGE getrennt und durch Autoradiographie sichtbar gemacht. Das Experiment wurde dreimal mit ähnlichen Ergebnissen wiederholt.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Gemäß der vorliegenden Erfindung beeinträchtigen gewisse Styrylsulfon-Derivate den MAPK-Signalübertragungsweg, wodurch das Wachstum und die Lebensfähigkeit von Tumorzellen beeinträchtigt werden. Die Verbindungen hemmen das Wachstum und die Vermehrung von Brust- und Prostatatumorzellen auf eine dosisabhängige Weise, ohne das normale Zellwachstum zu beeinträchtigen. Diese Hemmung des Zellwachstums wird mit der Regulierung der ERK- und JNK-Typen von MAPK verbunden. Die Fähigkeit der Styrylsulfone, diese MAPKs zu regulieren und den Einhalt des Zellwachstums zu induzieren, wird durch die Beschaffenheit und die Position der in der Verbindung vorliegenden funktionellen Gruppen vorgeschrieben.
Die Behandlung von Brust- und Prostatatumorzellen mit den Styrylsulfon-Verbindungen der Erfindung führt zur Hemmung der Zellvermehrung und der Induktion von apoptotischem Zelltod. Die Wirkung wird sowohl bei Östrogenrezeptor (ER) positiven als auch bei Östrogenrezeptor negativen Zellen beobachtet, obwohl eine der getesten Brustkrebszelllinien, Zelllinie 361, beachtlichen Widerstand gegenüber Styrylsulfonen zeigte. Die Hemmung der Zellvermehrung und die Induktion von apoptotischem Zelltod werden ebenfalls sowohl bei Androgen abhängigen als auch bei Androgen unabhängigen Prostatatumorzellen beobachtet, obwohl die erstgenannten um einiges empfindlicher gegenüber Styrylsulfonen sind.
Mit den Verbindungen der Erfindung behandelte Tumorzellen akkumulieren in der G2/M-Phase des Zellzyklus. Während die Zellen aus der G2/M-Phase austreten, scheinen sie Apoptosis zu durchlaufen. Die Behandlung von normalen Zellen mit den Styrylsulfonen produziert keine ähnliche Wirkung auf das Fortschreiten des Zellzyklus. Normale Zellen besitzen ein normales Fortschreiten des Zellzyklus in der Anwesenheit und Abwesenheit eines Styrylsulfon-Arzneimittels.
Sowohl die mit den Styrylsulfon-Verbindungen der Erfindung behandelten Zellen als auch die unbehandelten Zellen besitzen ähnliche Niveaus intrazellulärer ERK-2, aber die biochemische Aktivität der ERK-2, beurteilt nach deren Fähigkeit, das Substrat basische Myelin-Protein (MBP) zu phosphorylieren, wird, verglichen mit unbehandelten Zellen, bei mit Arzneimitteln behandelten Zellen beträchtlich verringert. Bei Prostatatumorzellen reduzierte FR-20, eine bevorzugte Verbindung der Erfindung, den Phosphorylierungsstatus von MBP um mehr als 80 % im Vergleich zu Kontroll behandelten Zellen. Die Western Blot-Analyse von Lysaten des mit dem Arzneimittel behandelten und der Kontroll behandelten Zellen mit ERK-2-Antikörper zeigt die gleiche Menge an Protein in beiden Lysaten, was darauf hindeutet, dass die höheren Niveaus von phosphoryliertem MBP in Kontroll behandelten Zellen nicht aufgrund einer ungleichen Menge von ERK-2-Protein in den Lysaten auftraten. Diese Ergebnisse legen nahe, dass die Styrylsulfone der vorliegenden Erfindung die Phosphorylierungsfähigkeit von ERK-2 blockieren.
Die Styrylsulfone der vorliegenden Erfindung verbessern die Fähigkeit von JNK, c-Jun-Proteine im Vergleich zu Kontroll behandelten Zellen zu phosphorylieren. Ohne durch irgendeine Theorie gebunden sein zu wollen, legt dieses Ergebnis nah, dass die Styrylsulfone wie entzündungsfördernde Zytokine oder UV-Licht wirken können, indem sie den JNK-Weg aktivieren, der wiederum Gene anschalten kann, die für die Hemmung des Zellwachstums und Apoptosis verantwortlich sind.
Synthese von Styrylsulfonen
Die Verbindungen der Erfindung sind durch Diastereomerie gekennzeichnet, die aus dem Vorhandensein von einer oder mehreren Doppelbindungen resultiert. Die Verbindungen sind gemäß dem Cahn-Ingold-Prelog-System, den IUPAC-Empfehlungen von 1974, Abschnitt E: Stereochemistry, in Nomenclature of Organic Chemistry, Pergamon, Elmsford, NY, 1979 (das "Blaue Buch") benannt. Siehe ebenfalls March, Advanced Organic Chemistry, John Wiley & Sons, Inc., New York, NY, 4. Ausgabe, 1992, S. 127-138. Sterische Relationen um eine Doppelbindung werden als „Z" oder „E" bezeichnet.
(E)-Styryl- und Benzylsulfone werden durch Knoevenagel-Kondensation von aromatischem Aldehyden mit aktiven Methylenmolekülen wie beispielsweise Aryl, Benzyl, Styrylsulfon-Essigsäuren, Phenacyl-Aryl-Sulfonen und Sulfonyl-Acetessigsäure vorbereitet. Die Verfahrensweise wird durch Reddy et al., Acta. Chim. Hung. 115:269 (1984); Reddy et al., Sulfur Letters 13:83 (1991); Reddy of al., Synthesis 322 (1984); und Reddy et al., Sulfur Letters 7:43 (1987) beschrieben, deren gesamten Offenbarungen unter Bezugnahme hier eingeschlossen sind. (Z)-Benzyl- und (Z)-Styrylsulfone werden durch die nukleophile Zugabe von aromatischen und aliphatischen Thiolen zu Phenylacetylen und die nachfolgende Oxidation des Produkts mit 30 % Wasserstoffperoxid synthetisiert.
Zubereitung von Benzylsulfonyl- und Arylsulfonvl-Essigsäure
Aryl- und Benzylsulfonyl-Essigsäuren sind die Ausgangsverbindungen für die Synthese von (E)-Styrylaryl- und (E)-Styrylbenzylsulfonen. Arylsulfonyl-Essigsäuren können durch die Kondensation von Natriumarylsulfinat mit Chloressigsäure bei alkalischem pH-Wert zubereitet werden. Ein alternatives Verfahren für die Synthese von gleichen Verbindungen umfasst das Oxidieren der durch die Kondensation von Natriumarylthiolat mit Chloressigsäure erhaltenen Produkte.
Benzylsulfonyl-Essigsäuren können durch 30 % Wasserstoffperoxid-Oxidation der Kondensationsprodukte der Kondensation von Benzylchloriden mit Natrium-Thioglycolat synthetisiert werden. Alternativ können Benzylsulfonyl-Essigsäuren durch 30 % Wasserstoffperoxid-Oxidation der Produkte der Kondensation von Natriumsalzen von Benzylthiolen mit Chloressigsäuren synthetisiert werden.
Synthese von (E)-Styrylaryl und (E)-Benzylsulfonen
Um die (E)-Styryl-Benzyl- und (E)-Styrylbenzylsulfone vorzubereiten, wird eine Mischung der geeigneten Sulfonyl-Essigsäure (z. B. 10 mmol), eines aromatischen Aldehyds (z. B. 10 mmol) und einer katalytischen Menge von Benzylamin in Essigsäure (z. B. 15 ml) 2-3 Stunden lang refluxiert. Nach dem Abkühlen wird trockener Ether hinzugegeben und das Reaktionsgemisch wird über Nacht gekühlt. Die etherische Lösung wird nacheinander mit einer gesättigten Lösung aus Natriumhydrogencarbonat, Hydrogensulfit, verdünnter Salzsäure und schließlich mit Wasser gewaschen. Das Verdampfen der Natriumsulfat getrockneten etherischen Lösung ergibt feste Produkte aus (E)-Styrylaryl oder Benzylsulfonen, die mit 2-Propanol oder 95 % Ethanol rekristallisiert werden können.
Synthese von (Z)-Styrylaryl und (Z)-Styrylbenzylsulfonen (Z)-Styrylaryl und (Z)-Styrylbenzylsulfone können durch die Zugabe von Natriumarylthiolat oder Benzylthiolat, das aus einem geeigneten Thiol (z. B. 10 mmol) und Natriumhydroxid (z. B. 20 mmol) zubereitet wurde, zu frisch destilliertem Phenylacetylen in Methanol zubereitet werden. Die Mischung wird 24 Stunden lang refluxiert und auf zerkleinertes Eis gegossen. Die (Z)-Styrylaryl- und (Z)-Styrylbenzylsulfide werden mit 30 % Wasserstoffperoxid oxidiert, um (Z)-Styrylaryl- bzw. (Z)-Styrylbenzylsulfone bereitzustellen.
Synthese von (E),(E)- und (E),(Z)-Bis(styryl)sulfonen
(E),(E)-bis-(styryl)sulfone können durch die Kondensation von Sulfonyl-Acetessigsäure mit aromatischen Aldehyden in der Anwesenheit von Benzylamin als Katalysator zubereitet werden. Das Reaktionsgemisch wird 2 Stunden lang in Eisessig refluxiert. Nach dem Abkühlen wird absoluter Ether zu dem Reaktionsgemisch hinzugegeben, das nacheinander mit einer gesättigten Lösung aus Natriumhydrogencarbonat, Hydrogensulfit, verdünnter Salzsäure und Wasser gewaschen wird. Das Verdampfen der getrockneten etherischen Schicht ergibt (E),(E)-bis(styryl)sulfone.
(Z),(E)-bis(styryl)sulfone können zubereitet werden, indem eine Lösung aus (Z)-Styrylsulfonyl-Essigsäure in Eisessig mit Araldehyd und Benzylamin gemischt wird. Die Lösung wird 3 Stunden lang gekocht. Das Reaktionsgemisch wird abgekühlt und trockener Ether wird hinzugegeben. Jegliches abgesonderte Produkt wird gefiltert. Das Filtrat wird mit mehr Ether verdünnt und mit einer gesättigten Lösung aus Natriumhydrogencarbonat, Hydrogensulfit, verdünnter Salzsäure und Wasser gewaschen. Die Etherschicht wird getrennt, getrocknet und verdampft, um (Z),(E)-bis(styryl)sulfone zu ergeben.
Therapeutische Verabreichung
Die Styrylsulfone der Erfindung können in Form einer pharmazeutischen Zusammensetzung verabreicht werden, in Verbindung mit einem pharmazeutisch akzeptablen Träger. Der aktive Inhaltsstoff in derartigen Formulierungen kann in 0,1 bis 99,99 Gewichtsprozent vorliegen. Mit „pharmazeutisch akzeptablem Träger" ist jeder beliebige Träger, jedes Verdünnungs- oder Bindemittel gemeint, das mit den anderen Inhaltsstoffen der Formulierung kompatibel ist und nicht schädlich für den Empfänger ist.
Die Verbindungen der Erfindung können an Einzelwesen (Säuger, einschließlich Tieren und Menschen), die unter Brust- oder Prostatakrebs leiden, verabreicht werden. Die Verbindungen können auf jede Art verabreicht werden, einschließlich oraler und parenteraler Verabreichung. Parenterale Verabreichung umfasst zum Beispiel intravenöse, intramuskuläre, intraarterielle, intraperitoneale, intranasale, rektale oder subkutane Verabreichung. Das aktive Mittel wird vorzugsweise mit einem pharmazeutisch akzeptablen Träger, der auf der Basis der ausgewählten Art der Verabreichung und der pharmazeutischen Standardpraxis ausgewählt ist, verabreicht.
Das aktive Mittel kann in Dosierungsformen gemäß der Standardpraxis im Bereich der pharmazeutischen Zubereitungen formuliert werden. Siehe Gennaro Alphonso, Hrsg., Remington's Pharmaceutical Sciences, 18. Ausg., (1990) Mack Publishing Co., Easton, PA. Geeignete Dosierungsformen können zum Beispiel Tabletten, Kapseln, Lösungen, parenterale Lösungen, Pastillen, Zäpfchen oder Suspensionen beinhalten.
Für die parenterale Verabreichung kann das aktive Mittel mit einem geeigneten Träger oder Verdünnungsmittel wie etwa Wasser, einem Öl, Salzlösung, wässriger Dextrose (Glukose) und verwandten Zuckerlösungen oder einem Glykol wie etwa Propylenglykol oder Polyethylenglykol gemischt werden. Lösungen für die parenterale Verabreichung enthalten vorzugsweise ein wasserlösliches Salz des aktiven Mittels. Stabilisierungsmittel, Antioxidationsmittel und Konservierungsmittel können ebenfalls hinzugegeben werden. Geeignete Antioxidationsmittel umfassen Sulfat, Ascorbinsäure, Zitronensäure und deren Salze, und Natrium-EDTA. Geeignete Konservierungsmittel umfassen Benzalkoniumchlorid, Methyl- oder Propylparaben und Chlorbutanol.
Für die orale Verabreichung kann das aktive Mittel mit einem oder mehreren festen inaktiven Inhaltsstoffen für die Zubereitung von Tabletten, Kapseln oder anderen geeigneten oralen Dosierungsformen kombiniert werden. Das aktive Mittel kann zum Beispiel mit Carboxymethylcellulose-Calcium, Magnesiumstearat, Mannitol und Stärke kombiniert und dann durch herkömmliche Tablettierungsverfahren zu Tabletten geformt werden.
Die spezifische Dosis der Verbindung gemäß der Erfindung zum Erzielen eines therapeutischen Nutzens wird natürlich von den besonderen Umständen des individuellen Patienten bestimmt werden, einschließlich der Größe, des Gewichts, des Alters und des Geschlechts des Patienten, der Art und dem Stadium der Krankheit, der Aggressivität der Krankheit und der Art der Verabreichung. Eine tägliche Dosierung von ungefähr 0,05 bis ungefähr 50 mg/kg/Tag kann zum Beispiel benutzt werden. Höhere oder niedrigere Dosen werden ebenfalls in Erwägung gezogen.
Die Anwendung der Erfindung wird durch die folgenden, nicht einschränkenden Beispiele erläutert.
Verfahrensweise 1
Allgemeine Verfahrensweise zur Synthese von Styryl- und Benzylarylsulfonen
Zu einer Lösung aus (8 g, 0,2 mol) Natriumhydroxid in Methanol (200 ml) wird geeignetes Thiophenol oder Benzylmercaptan (0,1 mol) langsam hinzugegeben. Dann wird Chloressigsäure (0,1 mol) in Anteilen hinzugegeben und das Reaktionsgemisch wird 2-3 Stunden lang refluxiert. Der abgekühlte Inhalt wird auf zerkleinertes Eis gegossen und mit verdünnter Salzsäure (200 ml) neutralisiert. Die resultierenden Aryl- und Benzylthioessigsäuren (0,1 mol) werden Oxidierung mit 30 Wasserstoffperoxid (0,12 mol) in Eisessig (25 ml) durch Refluxieren 1-2 Stunden lang unterzogen. Der Inhalt wird abgekühlt und auf zerkleinertes Eis gegossen. Die abgesonderte Trockensubstanz wird aus heißem Wasser rekristallisiert, um reine Aryl- und Benzylsulfonyl-Essigsäuren zu ergeben.
Eine Mischung der geeigneten Aryl- oder Benzylsulfonyl-Essigsäure (0,001 mol), eines aromatischen Aldehyds (0,001 mol) und Benzylamins (1 ml) in Eisessig (15 ml) wird 2-3 Stunden lang refluxiert. Der Inhalt wird abgekühlt und mit trockenem Ether (50 ml) behandelt. Jegliches abgesonderte Produkt wird durch Filtration gesammelt. Das Filtrat wird mit mehr Ether verdünnt und nacheinander mit einer gesättigten Lösung aus Natriumhydrogencarbonat (20 ml), Hydrogensulfit (20 ml), verdünnter Salzsäure (20 ml) und schließlich mit Wasser (35 ml) gewaschen. Das Verdampfen der getrockneten etherischen Schicht ergibt in vielen Fällen eine Trockensubstanz. In manchen Fällen sondert sich jedoch ein sirupartiges Material ab und verfestigt sich bei Behandlung mit 2-Propanol. Die Reinheit der Verbindungen wird durch DC (Kieselsäuregel BDH, Hexan/Ethylacetat 3:1) überprüft.
Verfahrensweise 2
Allgemeine Verfahrensweise zur Synthese von (E)(E)- und (E)(Z)-bis(styryl)sulfonen
Zu frisch destilliertem Phenylacetylen (51,07 g, 0,5 mol) wird aus Thioglykolsäure (46 g, 0,5 mol) und Natriumhydroxid (40 g, 1 mol) in Methanol (250 ml) zubereitetes Natrium-Thioglycolat hinzugegeben. Die Mischung wird 24 Stunden lang refluxiert und nach dem Abkühlen auf zerkleinertes Eis (500 ml) gegossen. Die Styrylthio-Essigsäure, die nach der Neutralisierung mit verdünnter Salzsäure (250 ml) gebildet wird, wird gefiltert und getrocknet; Ertrag 88 g (90 %); Schmelzpunkt 84-86 °C.
Die Styrylthio-Essigsäure wird dann wie folgt zu Styrylsulfonyl-Essigsäure oxidiert. Eine Mischung aus Styrylthio-Essigsäure (5 g, 25 mmol) in Eisessig (35 ml) und 30 % Wasserstoffperoxid (15 ml) wird unter Reflux 60 Minuten lang erhitzt und die Mischung wird nach dem Abkühlen auf zerkleinertes Eis (200 ml) gegossen. Die abgesonderte Verbindung wird gefiltert und aus heißem Wasser rekristallisiert, um weiße kristalline Flocken aus (Z)-Styrylsulfonyl-Essigsäure zu ergeben; Ertrag 2,4 g (41 %); Schmelzpunkt 150-51 °C.
Eine Lösung aus (Z)-Styrylsulfon-Essigsäure (2,263 g, 10 mmol) in Eisessig (6 ml) wird mit einem aromatischen Aldehyd (10 mmol) und Benzylamin (0,2 ml) gemischt und 3 Stunden lang refluxiert. Das Reaktionsgemisch wird abgekühlt, mit trockenem Ether (50 ml) behandelt und jegliches abgesonderte Produkt wird durch Filtration gesammelt. Das Filtrat wird mit mehr Ether verdünnt und nacheinander mit einer gesättigten Lösung aus Natriumhydrogencarbonat (15 ml), Hydrogensulfit (15 ml), verdünnter Salzsäure (20 ml) und schließlich mit Wasser (30 ml) gewaschen. Das Verdampfen der getrockneten etherischen Schicht ergibt (E)(Z)-bis(styryl)sulfone.
(E),(E)-bis(styryl)sulfone werden nach der gleichen Verfahrensweise wie oben beschrieben zubereitet, mit der Ausnahme, dass Sulfonyl-Acetessigsäure anstelle von (Z)-Styrylsulfonyl-Essigsäure verwendet wird, und dass die doppelte Menge an aromatischem Aldehyd (20 mmol) verwendet wird.
Verfahrensweise 3
Allgemeine Verfahrensweise zur Synthese von 2-(Arylsulfonyl)-1-phenyl-3-aryl-2-propen-1-onen
Diese Verbindungen werden durch zwei Verfahren synthetisiert, die unterschiedliche Reaktionsbedingungen, Lösungsmittel und Katalysatoren einsetzen.
Verfahren 1: Phenacylarylsulfone werden durch das Refluxieren von α-Bromacetophenonen (0,05 mol) und Natriumarylsulfinaten (0,05 mol) in absolutem Ethanol (200 ml) über 6-8 Stunden hergestellt. Das Produkt, das sich beim Abkühlen absondert, wird gefiltert und einige Male mit Wasser gewaschen, um Natriumbromid zu entfernen. Das Produkt wird dann aus Ethanol rekristallisiert: Phenacylphenylsulfon, Schmelzpunkt 90-91 °C; Phenacyl-p-fluorphenylsulfon, Schmelzpunkt 148-149 °C; Phenacyl-p-bromphenylsulfon, Schmelzpunkt 121-122 °C; Phenacyl-p-methoxyphenylsulfon, Schmelzpunkt 104-105 °C; p-Nitrophenacylphenylsulfon, Schmelzpunkt 136-137 °C.
Eine Lösung aus Phenacylarylsulfon (0,01 mol) in Essigsäure (10 ml) wird mit einem Araldehyd (0,01 mol) und Benzylamin (0,02 ml) gemischt und 3 Stunden lang refluxiert. Die Lösung wird abgekühlt und trockener Ether (50 ml) wird) hinzugegeben. Die etherische Lösung wird nacheinander mit verdünnter Salzsäure, wässrigem 10 % NaOH, gesättigter NaHSO₃-Lösung und Wasser gewaschen. Das Verdampfen der getrockneten etherischen Schicht ergibt ein festes Produkt, das durch Rekristallisation gereinigt wird.
Verfahren 2: Trockenes Tetrahydrofuran (200 ml) wird in einem mit Stickstoff gespülten 500 ml-Erlenmeyerkolben genommen. Hierzu wird eine Lösung aus Titan(IV)-chlorid (11 ml, 0,01 mol) in absolutem Tetrachlormethan tröpfchenweise unter ständigem Rühren hinzugegeben. Der Inhalt des Kolbens wird während des Verlaufs der Zugabe bei –20 °C gehalten. Eine Mischung aus Phenacylarylsulfon (0,01 mol) und aromatischem Aldehyd (0,01 mol) wird zu dem Reaktionsgemisch hinzugegeben und Pyridin (4 ml, 0,04 mol) in Tetrahydrofuran (8 ml) wird langsam über den Zeitraum von 1 Stunde hinzugegeben. Der Inhalt wird 10-12 Stunden lang gerührt, mit Wasser (50 ml) behandelt, und dann wird Ether (50 ml) hinzugegeben. Die etherische Schicht wird abgesondert und mit 15 ml gesättigten Lösungen aus 10 % Natriumhydroxid, Hydrogensulfit und Salzlake gewaschen. Das Verdampfen der getrockneten etherischen Schicht ergibt 2-(Arylsulfonyl)-1-phenyl-3-aryl-2-propen-1-one.
Beispiel 1
E-Styrylphenylsulfon
Eine Lösung aus Phenylsulfonyl-Essigsäure (0,01 mol) und Benzaldehyd (0,01 mol) wurde Verfahrensweise 1 unterzogen. Die Titelverbindung wurde mit 68-72 % Ertrag erhalten.
Beispiel 2
E-4-Chlorstyrylphenylsulfon
Eine Lösung aus Phenylsulfonyl-Essigsäure (0,01 mol) und 4-Chlorbenzaldehyd (0,01 mol) wurde Verfahrensweise 1 unterzogen. Die Titelverbindung wurde mit 78-80 % Ertrag erhalten.
Beispiel 3
E-2,4-Dichlorstyrylphenylsulfon
Eine Lösung aus Phenylsulfonyl-Essigsäure (0,01 mol) und 2,4-Dichlorbenzaldehyd (0,01 mol) wurde Verfahrensweise 1 unterzogen. Die Titelverbindung wurde mit 60-65 % Ertrag erhalten.
Beispiel 4
E-4-Bromstyrylphenylsulfon
Eine Lösung aus Phenylsulfonyl-Essigsäure (0,01 mol) und 4-Brombenzaldehyd (0,01 mol) wurde Verfahrensweise 1 unterzogen. Die Titelverbindung wurde mit 78-80 % Ertrag erhalten.
Beispiel 5
E-4-Chlorstyryl-4-chlorphenylsulfon
Eine Lösung aus 4-Chlorphenylsulfonyl-Essigsäure (0,01 mol) und 4-Chlorbenzaldehyd (0,01 mol) wurde Verfahrensweise 1 unterzogen. Die Titelverbindung wurde mit 70-72 % Ertrag erhalten.
Beispiel 6
E-4-Methylstyryl-4-chlorphenylsulfon
Eine Lösung aus 4-Chlorphenylsulfonyl-Essigsäure (0,01 mol) und 4-Methylbenzaldehyd (0,01 mol) wurde Verfahrensweise 1 unterzogen. Die Titelverbindung wurde mit 60-64 % Ertrag erhalten.
Beispiel 7
E-4-Methoxystyryl-4-chlorphenylsulfon
Eine Lösung aus 4-Chlorphenylsulfonyl-Essigsäure (0,01 mol) und 4-Methoxybenzaldehyd (0,01 mol) wurde Verfahrensweise 1 unterzogen. Die Titelverbindung wurde mit 68-70 % Ertrag erhalten.
Beispiel 8
E-4-Bromstyryl-4-chlorphenylsulfon
Eine Lösung aus 4-Chlorphenylsulfonyl-Essigsäure (0,01 mol) und 4-Brombenzaldehyd (0,01 mol) wurde Verfahrensweise 1 unterzogen. Die Titelverbindung wurde mit 80 % Ertrag erhalten.
Beispiel 9
E-2-Chlorstyrylbenzylsulfon
Eine Lösung aus Benzylsulfonyl-Essigsäure (0,01 mol) und 2-Chlorbenzaldehyd (0,01 mol) wurde Verfahrensweise 1 unterzogen. Die Titelverbindung wurde mit 72 % Ertrag erhalten.
Beispiel 10
E-4-Chlorstyrylbenzylsulfon
Eine Lösung aus Benzylsulfonyl-Essigsäure (0,01 mol) und 4-Chlorbenzaldehyd (0,01 mol) wurde Verfahrensweise 1 unterzogen. Die Titelverbindung wurde mit 78 % Ertrag erhalten.
Beispiel 11
E-4-Fluorstyryl-4-chlorbenzylsulfon
Eine Lösung aus 4-Chlorbenzylsulfonyl-Essigsäure (0,01 mol) und 4-Fluorbenzaldehyd (0,01 mol) wurde Verfahrensweise 1 unterzogen. Die Titelverbindung wurde mit 72 % Ertrag erhalten.
Beispiel 12
E-4-Chlorstyryl-4-chlorbenzylsulfon
Eine Lösung aus 4-Chlorbenzylsulfonyl-Essigsäure (0,01 mol) und 4-Chlorbenzaldehyd (0,01 mol) wurde Verfahrensweise 1 unterzogen. Die Titelverbindung wurde mit 80 % Ertrag erhalten.
Beispiel 13
E-4-Fluorstyryl-4-fluorbenzylsulfon
Eine Lösung aus 4-Fluorbenzylsulfonyl-Essigsäure (0,01 mol) und 4-Fluorbenzaldehyd (0,01 mol) wurde Verfahrensweise 1 unterzogen. Die Titelverbindung wurde mit 73 % Ertrag erhalten.
Beispiel 14
E-2,4-Difluorstyryl-4-fluorbenzylsulfon
Eine Lösung aus 4-Fluorbenzylsulfonyl-Essigsäure (0,01 mol) und 2,4-Difluorbenzaldehyd (0,01 mol) wurde Verfahrensweise 1 unterzogen. Die Titelverbindung wurde mit 68 % Ertrag erhalten.
Beispiel 15
E-4-Fluorstyryl-4-brombenzylsulfon
Eine Lösung aus 4-Brombenzylsulfonyl-Essigsäure (0,01 mol) und 4-Fluorbenzaldehyd (0,01 mol) wurde Verfahrensweise 1 unterzogen. Die Titelverbindung wurde mit 82 % Ertrag erhalten.
Beispiel 16
E-4-Bromstyryl-4-brombenzylsulfon
Eine Lösung aus 4-Brombenzylsulfonyl-Essigsäure (0,01 mol) und 4-Brombenzaldehyd (0,01 mol) wurde Verfahrensweise 1 unterzogen. Die Titelverbindung wurde mit 88 % Ertrag erhalten.
Beispiel 17
E-4-Bromstyryl-4-fluorbenzylsulfon
Eine Lösung aus 4-Fluorbenzylsulfonyl-Essigsäure (0,01 mol) und 4-Brombenzaldehyd (0,01 mol) wurde Verfahrensweise 1 unterzogen. Die Titelverbindung wurde mit 82 % Ertrag erhalten.
Beispiel 18
E-4-Chlorstyryl-4-Brombenzylsulfon
Eine Lösung aus 4-Brombenzylsulfonyl-Essigsäure (0,01 mol) und 4-Chlorbenzaldehyd (0,01 mol) wurde Verfahrensweise 1 unterzogen. Die Titelverbindung wurde mit 88 % Ertrag erhalten.
Beispiel 19
E-4-Bromstyryl-4-chlorbenzylsulfon
Eine Lösung aus 4-Chlorbenzylsulfonyl-Essigsäure (0,01 mol) und 4-Brombenzaldehyd (0,01 mol) wurde Verfahrensweise 1 unterzogen. Die Titelverbindung wurde mit 92% Ertrag erhalten.
Beispiel 20
(Z)-Styryl-(E)-4-fluorstyrylsulfon
Eine Lösung aus (Z)-Styrylsulfonyl-Essigsäure (0,01 mol) und 4-4-Fluorbenzaldehyd (0,01 mol) wurde Verfahrensweise 2 unterzogen. Die Titelverbindung wurde mit 68 % Ertrag erhalten.
Beispiel 21
(Z)-Styryl-(E)-4-bromstyrylsulfon
Eine Lösung aus (Z)-Styrylsulfonyl-Essigsäure (0,01 mol) und 4-Brombenzaldehyd (0,01 mol) wurde Verfahrensweise 2 unterzogen. Die Titelverbindung wurde mit 70% Ertrag erhalten.
Beispiel 22
(Z)-Styryl-(E)-4-chlorstyrylsulfon
Eine Lösung aus (Z)-Styrylsulfonyl-Essigsäure (0,01 mol) und 4-Chlorbenzaldehyd (0,01 mol) wurde Verfahrensweise 2 unterzogen. Die Titelverbindung wurde mit 64 % Ertrag erhalten.
Beispiel 23
2-[(4-Fluorphenyl)sulfonyl]-1-phenyl-3-(4-fluorphenyl)-2-propen-1-on
Eine Lösung aus Phenacyl-4-fluorphenylsulfon (0,01 mol) und 4-Fluorbenzaldehyd (0,01 mol) wurde Verfahren 1 aus Verfahrensweise 3 unterzogen. Die Titelverbindung wurde mit 63 % Ertrag erhalten.
Beispiel 24
2-[(2-Chlorphenyl)sulfonyl]-1-phenyl-3-(4-fluorphenyl)-2-propen-1-on
Eine Lösung aus Phenacyl-2-Chlorphenylsulfon (0,01 mol) und 4-Fluorbenzaldehyd (0,01 mol) wurde Verfahren 1 aus Verfahrensweise 3 unterzogen. Die Titelverbindung wurde mit 58 % Ertrag erhalten.
Beispiel 25
2-[(2-Chlorphenyl)sulfonyl]-1-phenyl-3-(4-bromphenyl)-2-propen-1-on
Eine Lösung aus Phenacyl-2-chlorphenylsulfon (0,01 mol) und 4-Brombenzaldehyd (0,01 mol) wurde Verfahren 1 aus Verfahrensweise 3 unterzogen. Die Titelverbindung wurde mit 66 % Ertrag erhalten.
Beispiel 26
2-[(4-Chlorphenyl)sulfonyl]-1-phenyl-3-(4-bromphenyl)-2-propen-1-on
Eine Lösung aus Phenacyl-4-chlorphenylsulfon (0,01 mol) und 4-Brombenzaldehyd (0,01 mol) wurde Verfahren 1 aus Verfahrensweise 3 unterzogen. Die Titelverbindung wurde mit 60 % Ertrag erhalten.
Beispiel 27
2-[(2-Nitrophenyl)sulfonyl]-1-phenyl-3-(4-bromphenyl)-2-propen-1-on
Eine Lösung aus Phenacyl-2-Nitrophenylsulfon (0,01 mol) und 4-Brombenzaldehyd (0,01 mol) wurde Verfahren 1 aus Verfahrensweise 3 unterzogen. Die Titelverbindung wurde mit 56 % Ertrag erhalten.
Beispiel 28
Tumorzellenwachstumshemmung durch Styrylsulfone
A. Zellen
Die Wirkung von Styrylsulfonen auf das Wachstum von normalen und Tumorzellen der Brust und Prostata wurde unter Benutzung von vier Zelllinien, NIH3T3, MCF-7, BT-20 und LnCaP untersucht. NIH3T3-Zellen repräsentieren normale Fibroplasten, während LnCaP eine Androgen abhängige Prostatatumorzelllinie ist. MCF-7 ist eine Östrogen empfängliche Brusttumorzelllinie, während BT-20 eine Östrogen unempfängliche Brusttumorzelllinie ist. MCF-7 und BT-20 wurden in DMEM (Dulbecco's modified Eagle's medium) gezüchtet, das 10 % fötales Rinderserum, supplementiert mit Penizillin und Streptomyzin, enthielt. LnCaP wurden in RPMI mit 10 % fötalem Rinderserum, das Penizillin und Streptomyzin enthielt, kultiviert. NIH3T3-Zellen wurden in DMEM gezüchtet, das mit Penizillin und Streptomyzin supplementiertes 10 % Kalbsserum enthielt. Alle Zellkulturen wurden bei 37 °C in einer befeuchteten Atmosphäre von 5 % CO₂ gehalten.
B. Behandlung mit Styrylsulfonen und Prüfung der Lebensfähigkeit
Die Zellen wurden mit einer Testverbindung bei einer Konzentration von 2,5 μM oder 5,0 μM behandelt, und die Lebensfähigkeit der Zellen wurde nach 48 Stunden durch das Trypanblau-Ausschluss-Verfahren bestimmt. Die in Tabellen 1, 2 und 3 identifizierten Verbindungen hemmten das Zellwachstum und induzierten Zelltod in variierendem Ausmaß. Die Tabellen listen den Prozentsatz lebensfähiger LnCaP- und MCF-7-Zellen auf, die mit 5,0 μM Verbindung behandelt wurden.
Tabelle 1
Tabelle 2
Tabelle 3
Fünf der aktiveren Verbindungen, die die höchste Aktivität besaßen, wurden als FRI-2 (E-2,4-Difluorstyryl-4-fluorbenzylsulfon), FRI-6 (E-4-Fluorstyryl-4-brombenzylsulfon), FRI-7 (E-4-Bromstyryl-4-fluorbenzylsulfon), FRI-20 (E-4-Fluorstyryl-4-chlorbenzylsulfon) und FRI-22 (E-4-Chlorstryryl-4-chlorbenzylsulfon) bezeichnet. Es stellte sich heraus, dass diese Verbindungen im Wesentlichen das Wachstum von LnCaP-, BT-20- und MCF-7-Zellen hemmen und ihren Tod bei 2,5 mM (1A) und 5,0 mM (1B) induzieren, nach 48 Stunden Behandlung mit den Verbindungen. Unter identischen Bedingungen waren mehr als 80 NIH3T3-Zellen nach 48 Stunden Inkubation lebensfähig (1A und 1B). E-4-Chlorstyryl-4-brombenzylsulfon und E-4-Bromstyryl-4-chlorbenzylsulfon waren ebenfalls hoch aktiv.
C. Prüfung der Dosisabhängigkeit
Die Dosisabhängigkeit der Styrylsulfone wurde durch das Behandeln der Zellen mit FRI-20, einer der fünf aktivsten Verbindungen, ermittelt. NIH3T3-, MCF-7-, BT-20- und LnCaP-Zellen wurden mit FRI-20 behandelt, das in DMSO in Konzentrationen von 250 nM, 500 nM, 1 μM, 2,5 μM und 5 μM aufgelöst worden war und nach 48 Stunden auf ihre Vermehrung und Lebensfähigkeit untersucht (2A). Der Prozentanteil von lebenden Zellen wurde durch Trypanblau Ausschluss bestimmt. Die Kontrollzellen wurden mit DMSO behandelt, um die Wirkung von Lösungsmittel auf Zellen zu bestimmen. Bei einer Konzentration von 250 nM gab es ungefähr 10 % Zelltod bei MCF-7-, BT-20- und LnCaP-Zellen, und ungefähr 15-20 % Hemmung bei der Zellteilung verglichen mit unbehandelten Zellen nach 48 Stunden. Es gab ungefähr 30-50 % Hemmung bei der Zellvermehrung und 25-30 % Zelltod bei LnCaP, BT-20 und MCF-7 bei 500 nM Konzentration. Unter diesen Bedingungen waren nur 2-3 % NIH3T3-Zellen bei beiden Konzentrationen nicht lebensfähig. Das Wachstum von LnCaP-, BT-20- und MCF-7-Zellen wurde durch die 1 μM Konzentration von FRI-20 mit gleichzeitigem Verlust der Zelllebensfähigkeit stark gehemmt. Nach 48 Stunden Inkubation waren 60-75 % der LnCaP-, BT-20- und MCF-7-Zellen bei einer 2,5 mM FRI-20-Konzentration tot, während mehr als 90 % der NIH3T3-Zellen lebensfähig waren (2A). Die mit 5 μM FRI-20 (2A) behandelten LnCaP-, BT-20- und MCF-7-Zellen zeigten fast 90 % Zelltod. NIH3T3 zeigten wenig oder keine Änderung in ihrer Fähigkeit zu wachsen, und > 80 % Lebensfähigkeit in der Anwesenheit von FRI-2, -6, -7, -20 oder -22 bei einer 5 μM Konzentration beizubehalten.
D. Prüfung des Zeitablaufs
Der Zeitablauf der Aktivität von FRI-20 wurde wie folgt demonstriert. NIH3T3, MCF-7, BT-20 und LnCaP wurden mit FRI-20 bei 2,5 μM behandelt, und die Anzahl der lebensfähigen Zellen wurde nach 12, 24, 48 und 72 Stunden durch Trypanblau Ausschluss bestimmt. Der Mittelwert von drei unabhängigen Experimenten wird in 2B gezeigt. Die Zeitablaufstudie ergab, dass mehr als 95 % der MCF-7-, LnCaP- und BT-20-Zellen nach 72 Stunden Behandlung mit FRI-20 bei 2,5 μM (2B) tot waren.
Beispiel 29
Tumorzellenwachstumshemmung durch FRI-20
A. Zellen
Die Wirkung von FRI-20 auf das Wachstum von normalen und Tumorzellen der Brust und Prostata wurde unter Benutzung von neun Zelllinien untersucht: NIH3T3 und HFL (normale Fibroplast-Zelllinien); MCF-7 und 361 (Östrogenrezeptor negative Brusttumorzelllinien); BT-20, 435 und SKBR-3 (Östrogenrezeptor positive Brusttumorzelllinien); LnCaP (Androgen empfindliche Prostatatumorzelllinie); PC-3 und DU-145 (Androgen unempfindliche Prostatatumorzelllinie).
B. Behandlung mit FRI-20 und Prüfung der Lebensfähigkeit
Die Zellen wurden wie in Beispiel 22, A gezüchtet. FR-20 wurde in DMSO aufgelöst und zu den Zellen bei 2,5 μM- und 5,0 μM- Konzentration hinzugegeben. Zu Kontrollzellen wurde DMSO entsprechend dem Volumen des Lösungsmittels (DMSO), das bei der höchsten Konzentration der Verbindung vorlag, hinzugegeben. Die Aktivität der Verbindung wurde nach 48 Stunden durch Trypanblau Ausschluss evaluiert. Es stellte sich heraus, dass NIH3T3- und HFL-Zellen eine Lebensfähigkeit in Prozent von 85-90 % bei 2,5 und 5,0 μM Konzentration beibehalten. Von den sieben mit der FRI-20-Verbindung behandelten Brusttumorzelllinien zeigten MCF-7-, HTB126-, T470- und 435-Zellen eine sehr hohe Mortalität mit weniger als 25 % und 10 % Lebensfähigkeit bei 2,5 und 5,0 μM-Konzentrationen des Arzneimittels (3A). Fast 50 % der SKBR-3- und BT-20-Zellen waren bei 2,5 μM- und 75 % bei 5,0 μM-Konzentration der Verbindung tot. Andererseite zeigte die 361-Brusttumorzelllinie beträchtliche Widerstandsfähigkeit gegen FRI-20, wobei 50-75 % Zellen bei einer 2,5- und 5,0 μM-Konzentration lebensfähig waren. FRI-20 hatte tiefgreifende Wirkung auf die Lebensfähigkeit der Androgen abhängigen LnCaP-Prostatatumorzelllinie im Vergleich zu den Androgen unanhängigen DU-145- und PC-3-Prostatazelllinien. Bei 2,5 mM FRI-20 wurden 80 % der LnCaP-, 40 % der PC-3- und 20 % der DU-145-Zellen abgetötet. Bei 5,0 mM FRI-20 wurden 72 % der LnCaP-, 47 % der PC-3- und 40 % der DU-145-Zellen abgetötet (3B).
Beispiel 30
Wirkung von FRI-20 auf die Regulierung des Zellzyklus
Die Androgen abhängige Prostatatumorzelllinie LnCaP wurde wie in Bsp. 22 A. gezüchtet und mit 2,0 μM FRI-20, aufgelöst in DMSO, oder mit entsprechenden Mengen (10 ml) von DMSO allein behandelt. Zellen wurden 6, 12, 24 und 48 Stunden nach der Behandlung entnommen und mit Propidiumiodid gefärbt und Durchflusscytometrie zur Analyse des DNA-Gehalts unterzogen. Wie in 4 gezeigt, resultiert die Zugabe von FRI-20 zu dem Kulturmedium in der Akkumulierung von Zellen in der D2/M-Phase des Zellzyklus, und wenn die Zellen aus dieser Phase des Zellzyklus austaten, schienen sie Apoptosis zu durchlaufen. Zellen, die mit DMSO allein behandelt wurden, zeigten keinen derartigen Halt in der G2/M-Phase des Zellzyklus, wodurch nahe gelegt wird, dass die beobachtete Wirkung mit der Zugabe von FRI-20 assoziiert wird. Die Behandlung der normalen Zelllinien NIH3T3 oder NFL mit FRI-20 produzierte keine ähnliche Wirkung auf das Fortschreiten des Zelllzyklus. NIH3T3 und HFL besaßen ein normales Fortschreiten des Zellzyklus in der Anwesenheit und Abwesenheit des Arzneimittels.
Beispiel 31
Wirkung von FRI-20 auf den MAPK-Weg
A. Prüfung des Immunkomplexes ERK-2
Um die Wirkung von FRI-20 auf den MAPK-Weg zu untersuchen, wurden NIH3T3-, LnCaP- und MCF-7-Zellen mit FRI-20 bei einer Konzentration von 2,5 mM 48 Stunden lang inkubiert. Folgend auf die Inkubation von Zellen in der Anwesenheit und Abwesenheit von FRI-20 wurden die Zellen unter Verwendung von ERK-Lysepuffer, der 20 mM HEPES (pH-Wert 7,4), 50 mM β-Glycerinphosphat, 0,5 % Triton X-100, 2 mM MgCl₂, 1 mM EGTA, 1 mM Dithiothreit, 2 μg/ml Leupeptin, 2 μg/ml Aprotinin, 100 μM Phenylmethylsulfonylfluorid und 1 mM Benzamidin enthielt, lysiert. ERK-2 in 100 mg Zelllysat wurde durch das Inkubieren von Lysatprotein mit 1 mg polyklonalem ERK-2-Antikörper (Antikörper sc-154 an ERK-2 ist von Santa Cruz Biotechnology, Inc.) über eine Stunde, gefolgt von einer zusätzlichen Inkubation von 20 μl von Protein A-Sepharose (Pharmacia) für eine Stunde, immunpräzipiert. Die Immunkomplex gebundenen Protein A-Sepharose-Perlen wurden zweimal mit Lysepuffer und zweimal mit ERK/MAPK-Puffer, der 20 mM HEPES (pH-Wert 7,4), 50 mM β-Glycerinphosphat, 10 mM MgCl₂, 1 mM EGTA, 1 mM Dithiothreit und 100 MM NA₃VO₄ gewaschen.
Die Immunpräzipitate wurden dann durch eine In-Vitro-Prüfung, die basische Myelin-Proteine (MBP) als Substrat für ERK-2 in der Anwesenheit von [γ-³²P] ATP benutzt, auf MAP-Kinaseaktivität geprüft. Dementsprechend wurden die Perlen in 40 μl MAPK-Puffer, der 100 μM [γ-³²P] ATP (5000 cpm/pmol) enthält, resuspendiert, und die Kinase-Prüfung wurde 20 Minuten lang bei 30 °C unter Verwendung von 5 μg MBP als Substrat ausgeführt. Die Reaktion wurde durch die Zugabe von Laemmli-Puffer gestoppt, gefolgt von dem Kochen der Proben für 3 Minuten. Die Proteine wurden auf 12 % SDS-PAGE aufgelöst, das Gel wurde getrocknet, und ein Autoradiogramm wurde entwickelt. Die Ergebnisse zeigen, dass sowohl mit Arzneimittel behandelte als auch unbehandelte Zellen ähnliche Niveaus von intrazellulärer ERK-2 besitzen, aber die biochemische Aktivität von ERK-2, wie durch ihre Fähigkeit, MBP zu phosphorylieren, beurteilt, wurde in mit Arzneimittel behandelten Zellen im Vergleich zu nur mit DIMSO behandelten Zellen beträchtlich verringert. Bei Prostatatumorzellen reduzierte FRI-20 den Phosphorylierungsstatus von MBP um mehr als 80 % im Vergleich zu Kontroll behandelten Zellen (5).
B. Westernblot-Analyse
Zelllysate aus mit FRI-20 behandelten Zellen wurden für die Westernblot-Analyse wie folgt vorbereitet. NIH3T3-, LnCaP- oder MCF-7-Zellen wurden mit einer Dichte von 2 × 10⁵ Zellen/pro Loch in einer Platte mit sechs Löchern angeimpft und 24 Stunden lang wachsen gelassen. Frisches Medium wurde 2 Stunden vor der Behandlung mit FRI-20 zu jedem Loch hinzugegeben. Die Verbindung wurde in DMSO aufgelöst, um eine 2 mM Vorratslösung herzustellen und zu dem Medium (2 ml) hinzugegeben, um eine endgültige Konzentration von 2,5 und 5,0 μM zu erhalten. Nach 48 Stunden bei 37 °C wurden die Zellen zweimal mit 10 ml eiskalter Phosphat gepufferter Kochsalzlösung gewaschen und in 400 μl Lysepuffer, der 25 mM HEPES (pH-Wert 7,6), 0,1 % Triton X-100, 300 mM NaCl, 1,5 mM MgCl₂, 20 mM β-Glycerinphosphat, 100 μM NA₃VO₄, 0,2 mM EDTA, 0,5 mM Dithiothreit, 2 μg/ml Aprotinin, 2 μg/ml Leupeptin, 100 μM Phenylmethylsulfonylchlorid und 1 mM Benzamidin enthielt, entnommen. Die Zelllysate wurden 30 Minuten lang auf Eis gehalten und 10 Minuten lang in einer Mikrozentrifuge (16 000 X g) zentrifugiert. Die Zelllysate wurden von dem Debris getrennt und für den Proteingehalt normalisiert.
Westernblot-Analyse wurde an den Lysaten der mit Arzneimittel behandelten Zellen und den Kontroll behandelten Zellen mit ERK2-Antikörper ausgeführt. Gleiche Mengen Gesamteiweiß (100 μg) wurden in jeder Spur eines SDS-PAGE-Gels (10-12 %) geladen und auf Immobilon-P (Millipore, USA) transferiert. Nach dem Transfer wurden die Membrane in 3 % Milch geblockt, dann mit polyklonalen ERK-2- und JNK-1-Antikörpern vom Kaninchen (Santa Cruz Biotechnology Inc., Santa Cruz, CA) untersucht und dann mit Meerrettich-Peroxidase verbundenem sekundärem Anti-Kaninchen-1 g-Antikörper vom Esel (Amersham) (1:10000 Verdünnung) untersucht. Der Antikörper wurde unter Verwendung der ECL-Westernblot-Analyse-Ausstattung (Amersham) gemäß den Anweisungen des Herstellers ermittelt. Die Westernblot-Analyse der Lysate der mit Arzneimittel behandelten Zellen und den Kontroll behandelten Zellen mit ERK-2-Antikörper zeigt die gleiche Menge an Protein an beiden Lysaten (6), was darauf hindeutet, dass höhere Niveaus von MBP-Phosphorylierung in Kontroll behandelten Zellen nicht aufgrund einer ungleichen Menge von ERK-2-Protein in den Lysaten auftraten. Diese Ergebnisse legen nahe, dass FRI-20 die Phosphorylierungsfähigkeit von ERK-2 blockt.
Beispiel 32
Wirkung von FRI-20 auf die Aktivität Stress aktivierter Proteine
Um weiter zu ermitteln, ob die Aktivität von Stress aktivierten Protein-Kinasen (SAPK), von denen JNK ein Mitglied ist, in der Anwesenheit von FRI-20 beeinträchtigt wird, wurden Zellen (NIH3T3, MCF-7 oder LnCaP) mit in DMSO aufgelöstem FRI-20 oder mit DMSO allein behandelt. Achtundvierzig Stunden später wurden die Zellen mit dem Kinasepuffer lysiert, und die Lysate für die Schätzung der Menge von JNK, die in jedem Lysat vorlag, durch Westernblot-Analyse unter Verwendung eines polyklonalen JNK-Antikörpers verwendet. Die biochemische Aktivität der JNK, die in den Lysaten von mit FRI-20 behandelten Zelllysaten und den Kontroll behandelten Zellen vorliegen, wurden ebenfalls durch Immunpräzipitation von JNK, gefolgt von Inkubation mit GST-c-Jun-Protein als Substrat für JNK in der Anwesenheit von [γ-³²P]ATP, bestimmt.
Dementsprechend wurde JNK-1 in 100 mg Zellextrakten durch das Inkubieren des Lysats mit 1 mg polyklonalem JNK-1-Antikörper (von Santa Cruz Biotechnology) eine Stunde lang immunpräzipiert, gefolgt von einer zusätzlichen Inkubation mit 20 μl Protein A-Sepharose (Pharmacia) für eine Stunde. Die Perlen wurden zweimal mit JNK-Lysepuffer gewaschen (wie oben beschrieben), gefolgt von zwei Waschungen mit JNK-Reaktionspuffer. Die Perlen wurden in 40 μl JNK-Puffer, der 20 mM [γ-³²P] ATP (5000 cpm/pmol) enthielt, resuspendiert, und die Kinase-Reaktion wurde 20 Minuten lang bei 30 °C unter Verwendung von 3 μg gereinigtem GST-c-Jun (1-79) als Substrat ausgeführt. Die Reaktion wurde gestoppt, und die Radioaktivität in dem phosphorylierten GST-c-Jun-Protein wurde quantitativ bestimmt. Die Ergebnisse zeigen, dass die FRI-20-Behandlung die Fähigkeit der JNK, rekombinante GST-c-Jun-Proteine zu phosphorylieren, um 60-80 % im Vergleich zu Kontroll behandelten Zellen verbesserte (7).
Es hat sich gezeigt, dass JNK durch die Behandlung von Zellen mit UV-Strahlung, entzündungsfördernde Zytokine und umgebungsbedingte Beanspruchung aktiviert werden (Derijard et al., Cell 1025 (1994)). Die aktivierte JNK bindet sich an den Amino-Terminus des c-Jun und erhöht dessen transkriptionale Aktivität durch die Phosphorylierung an ser63 und ser73 (Adler et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 39:5341 (1992); Kwok et al., Nature 370:223 (1994)). Ohne durch irgendeine Theorie gebunden sein zu wollen, demonstrieren diese Ergebnisse, dass FRI-20 wie ein entzündungsförderndes Zytokin oder UV-Licht wirken kann, indem es den JNK-Weg aktiviert, der wiederum Gene anschalten kann, die für die Hemmung des Zellwachstums und Apoptosis verantwortlich sind.
Beispiel 33
Vergleich von FRI-20 und Cisplatin
Anti-Tumor Aktivitäten
Die tödliche Wirkung von FRI-20 auf Androgen empfindliche (LnCaP) und Androgen unempfindliche (DU-145) Prostatatumorzellen wurde mit der Wirkung von Cisplatin (cis-Diaminodichloroplatin II) verglichen, einem weitläufig verwendeten Anti-Prostatakrebsmittel. Die Zellen wurden wie in Beispiel 26 gezüchtet. FRI-20 oder Cisplatin wurde in DMSO aufgelöst und zu den Zellen in verschiedenen Konzentrationen hinzugegeben. Lebensfähigkeit wurde nach 72 Stunden durch Trypanblau-Ausschluss bestimmt. Die erforderliche Konzentration von FRI-20, um LnCaP und DU-145 vollständig abzutöten, war 2,5 μM bzw. 5,0 μM. Unter identischen Bedingungen erforderte das vollständige Abtöten von LnCaP- und DU-145-Zellen durch Cisplatin Konzentrationen von 25 μM bzw. 15 μM.
Folglich ist FRI-20 mindestens zehnmal aktiver als Cisplatin beim Abtöten von sowohl Hormon abhängigen als auch Hormon unabhängigen Prostatatumorzellen.

Claims

Die Verbindung der Formel I:
wobei R₁ und R₂ unabhängig aus der Gruppe, bestehend aus Chlor, Fluor und Brom, ausgewählt sind; und R₃ aus der Gruppe, bestehend aus Wasserstoff und Fluor, ausgewählt ist; R₁ und R₂ nicht beide Chlor sein können, wenn R₃ Wasserstoff ist; und R₁ nicht Chlor sein kann, wenn R₂ Fluor ist und in derselben Verbindung R₃ Wasserstoff ist.
Eine pharmazeutische Zusammensetzung, die einen pharmazeutisch akzeptablen Träger und eine Verbindung der Formel II beinhaltet
wobei n null oder eins ist; R₁ aus der Gruppe, bestehend aus Wasserstoff, Chlor, Fluor und Brom, ausgewählt ist; R₂ aus der Gruppe, bestehend aus Wasserstoff, Chlor, Fluor, Brom, Methyl und Methoxy, ausgewählt ist; und R₃ aus der Gruppe, bestehend aus Wasserstoff, Chlor und Fluor ausgewählt ist; vorausgesetzt, dass R₂ nicht Methyl oder Methoxy sein kann, wenn R₁ und R₃ beide Wasserstoff sind und n null oder eins ist; und R₁, R₂ und R₃ nicht alle Wasserstoff sein können, wenn n eins ist.
Eine Zusammensetzung gemäß Anspruch 2, wobei die Verbindung E-4-Bromstyrylphenylsulfon ist.
Eine Verbindung gemäß Anspruch 1 oder Zusammensetzung gemäß Anspruch 2, wobei die Verbindung E-2,4-Difluorstyryl-4-fluorbenzylsulfon ist.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 2, wobei R₃ Wasserstoff ist und R₁ und R₂ unabhängig aus der Gruppe, bestehend aus Chlor, Fluor und Brom, ausgewählt sind.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 2, wobei die Verbindung E-4-Chlorstyryl-4-chlorphenylsulfon ist.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 2, wobei die Verbindung E-4-Bromstyryl-4-chlorphenylsulfon ist.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 2, wobei die Verbindung E-4-Fluorstyryl-4-chlorbenzylsulfon ist.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 2, wobei die Verbindung E-4-Chlorstyryl-4-chlorbenzylsulfon ist.
Verbindung gemäß Anspruch 1 oder Zusammensetzung gemäß Anspruch 2, wobei die Verbindung E-4-Fluorstyryl-4-fluorbenzylsulfon ist.
Verbindung gemäß Anspruch 1 oder Zusammensetzung gemäß Anspruch 2, wobei die Verbindung E-4-Fluorstyryl-4-brombenzylsulfon ist.
Verbindung gemäß Anspruch 1 oder Zusammensetzung gemäß Anspruch 2, wobei die Verbindung E-4-Bromstyryl-4-brombenzylsulfon ist.
Verbindung gemäß Anspruch 1 oder Zusammensetzung gemäß Anspruch 2, wobei die Verbindung E-4-Bromstyryl-4-fluorbenzylsulfon ist.
Verbindung gemäß Anspruch 1 oder Zusammensetzung gemäß Anspruch 2, wobei die Verbindung E-4-Chlorstyryl-4-brombenzylsulfon ist.
Verbindung gemäß Anspruch 1 oder Zusammensetzung gemäß Anspruch 2, wobei die Verbindung E-4-Bromstyryl-4-chlorbenzylsulfon ist.
Eine pharmazeutische Zusammensetzung, die einen pharmazeutisch akzeptablen Träger und eine Verbindung der Formel III beinhaltet
wobei R₁ aus der Gruppe, bestehend aus Wasserstoff, Chlor, Fluor und Brom, ausgewählt ist.
Eine pharmazeutische Zusammensetzung, die einen pharmazeutisch akzeptablen Träger und die Verbindung der Formel IV beinhaltet,
wobei R₁ aus der Gruppe, bestehend aus Fluor und Brom, ausgewählt ist, und R₂ aus der Gruppe, bestehend aus 2-Chlorphenyl, 4-Chlorphenyl, 4-Fluorphenyl und 2-Nitrophenyl, ausgewählt ist.
Die Verwendung einer Zusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 2, 16 oder 17 bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Krebs.
Verwendung einer Zusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 2, 16 oder 17 bei der Herstellung eines Medikaments zum Hemmen des Wachstums von Tumorzellen.
Verwendung einer Zusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 2, 16 oder 17 bei der Herstellung eines Medikaments zur Induzierung von Apoptosis von Tumorzellen.
Verwendung gemäß einem der Ansprüche 18 bis 20, wobei das Medikament für die Behandlung von Brust- oder Prostatakrebs ist.