DE69806841T2 - Enzym-markierter Immunoassay und Behelf hierfür - Google Patents
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Description
- Die vorliegende Erfindung betrifft einen Enzym-markierten Immunoassay, der folgende Stufen umfasst: Man lässt eine Testprobe mit einem Enzym-markierten Reagenz reagieren; man lässt ein Substrat mit dem Enzym reagieren, so dass ein Signal gebildet wird; und das Enzym-markierte Reagenz wird immobilisiert, wobei eine weitere Signalbildung von einem festgelegten Zeitpunkt nach der Immobilisierung des Enzym-markierten Reagenzes an unter Verwendung eines Enzyminhibitors verhindert wird. Die vorliegende Erfindung betrifft auch eine Vorrichtung zur Durchführung dieses Enzym-markierten Immunoassays.
- In jüngster Zeit sind Immunoassays unter Verwendung eines Enzyms als Markierungsmaterial und einer Vorrichtung, die ein Absorptionsmaterial umfasst, das zum Transport eines Enzym-markierten Reagenzes durch Kapillarwirkung imstande ist, wobei eine Entwicklungslösung verwendet wird, als zweckmäßige und einfache Assays für den Nachweis von Analytsubstanzen in biologischen Flüssigkeiten und medizinischen Substanzen in Testproben bekannt geworden, wobei Immunreaktionen genutzt werden (vergl. z. B. japanische Offenlegungsschrift 61-145459; europäisches Patent 186799; japanische Offenlegungsschrift 63-501595; US-Patent 5 604 110 und europäisches Patent 225 054). Bei Verwendung eines Teststreifens, der eine derartige Vorrichtung umfasst, lässt man z. B. eine Testprobe, die einen Analyten enthält, mit einem Enzym-markierten Reagenz reagieren. Man lässt dann ein Substrat mit dem Enzym unter Bildung eines Signals reagieren, und das Enzymmarkierte Reagenz, das mit der Testprobe reagiert hat, wird unter Verwendung einer immun reaktiven Substanz in einer Indikatorreagenzzone immobilisiert, und in einer festgelegten Zeitspanne nach der Reaktion der Testprobe und des Enzym-markierten Reagenzes wird der Grad der Signalbildung, wie der Färbungsgrad der Indikatorreagenzzone, gemessen oder bewertet, wobei die Menge des Analyten, die in der Testprobe enthalten ist, bestimmt wird.
- Um die Bildung des Signals (Farbgebung oder Lumineszenz) zu verhindern, sofern nicht Enzym-markiertes Reagenz in der Indikatorreagenzzone immobilisiert wird, wird ein Immunoassay-Teststreifen vorgeschlagen, bei dem ein Signalbildungsinhibitor enthalten ist, um die Reaktion zwischen dem Enzym und dem Substrat zu verhindern, bis die Entwicklungslösung die Indikatorreagenzzone erreicht (japanische Offenlegungsschrift 1-503439; US-Patent 5 641 639; europäisches Patent 312 565; japanische Offenlegungsschrift 5-149951 und europäisches Patent 512 390). Bei einem derartigen Immunoassay unter Verwendung des vorstehenden Teststreifens ist es möglich, die Bildung eines Signals bis zur Indikatorreagenzzone zu verhindern, indem eine Signalbildungsinhibitorzone stromaufwärts von der Indikatorreagenzzone im Hinblick auf die Transportrichtung der Entwicklungslösung bereitgestellt wird, gegebenenfalls mit Bereitstellung einer Signalinitiationszone, wodurch ein Immunoassay mit hoher Empfindlichkeit für viele analytische Fragestellungen durchgeführt werden kann.
- Bei dem Immunoassay unter Verwendung des vorstehend genannten Signalbildungsinhibitors ist es zwar möglich, dass die Bildung des Signals durch Reaktion zwischen dem Enzym und dem Substrat von der Einleitung des Assays mit dem Auftragen der Entwicklungslösung auf den Streifen inhibiert wird, bis die Entwicklungslösung die Indikatorreagenzzone erreicht; die Bildung des Signals, die kontinuierlich in der Indikatorreagenzzone nach einer spezifischen Zeitspanne stattfindet, kann jedoch nicht inhibiert werden.
- Ferner wird bei dem Immunoassay unter Verwendung eines farbgebenden Substrats der Grad der Färbung der Indikatorreagenzzone durch visuelle Beobachtung oder unter Verwendung eines Farbdifferenzmessgerätes nach der Reaktion zwischen dem Enzym und dem Substrat für eine festgelegte Zeitspanne bewertet, wobei ein Assayergebnis erhalten wird. Bei einem derartigen herkömmlichen Immunoassay nimmt, wenn eine negative oder positive Bewertung oder Beurteilung unter Ausnutzung der Differenz in der Farbdichte in der Indikatorreagenzzone erfolgt, die Farbdichte mit der Zeit im Verlauf des Assays zu, so dass die Bewertung oder Beurteilung sich von "negativ" zu "positiv" ändern kann. Es ist daher erforderlich, den Assay so durchzuführen, dass die Assayzeit genau eingehalten wird, wenn der Assay durchgeführt wird, wobei die Änderungen der Farbdichte in der Indikatorreagenzzone bewertet werden.
- Unter solchen Umständen besteht ein Bedarf an einem Enzym-markierten Immunoassay, der geeignet ist, genaue Assayergebnisse unter Bildung eines Signals in der Indikatorreagenzzone, das vom Assayergebnis abhängt, zu liefern, jedoch ohne weitere Signalbildung von einem festgelegten Zeitpunkt an im Verlauf des Assays.
- Es ist daher eine erste Aufgabe der vorliegenden Erfindung, einen Enzym-markierten Immunoassay bereitzustellen, der geeignet ist, ein genaues Assayergebnis unter Bildung eines Signals zu liefern, das von dem Assayergebnis abhängt, und zwar ohne weitere Signalbildung von einem festgelegten Zeitpunkt an im Verlauf des Assays.
- Eine zweite Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, eine Vorrichtung zur Durchführung des vorstehenden Enzym-markierten Immunoassays bereitzustellen.
- Die erste Aufgabe der vorliegenden Erfindung kann durch einen Enzym-markierten Immunoassay gelöst werden, der folgende Stufen umfasst: Man lässt eine Testprobe mit einem Enzym-markierten Reagenz reagieren; man lässt ein Substrat mit dem Enzym unter Bildung eines Signals reagieren; und das Enzym-markierte Reagenz wird immobilisiert, wobei eine weitere Signalbildung von einem festgelegten Zeitpunkt nach der Immobilisierung des Enzym-markierten Reagenzes an unter Verwendung eines Enzyminhibitors verhindert wird.
- Die zweite Aufgabe der vorliegenden Erfindung kann durch eine Vorrichtung gelöst werden, die ein Absorptionsmaterial umfasst, das, eine Entwicklungslösung durch Kapillarwirkung transportieren kann, wobei das Absorptionsmaterial (a) eine Entwicklungslösungsauftragungszone, auf die die Entwicklungslösung aufgetragen wird, (b) eine Enzym-markierte Reagenzzone, die ein Enzym-markiertes Reagenz umfasst, (c) eine Probenaufnahmezone, auf die eine Testprobe aufgetragen wird, und (d) eine Indikatorreagenzzone, die ein Indikatorreagenz umfasst, das zur Immobilisierung des Enzym-markierten Reagenzes nach Reaktion der Testprobe mit dem Enzym-markierten Reagenz in einer Menge, die vom Assayergebnis abhängt, geeignet ist, umfasst, wobei die Zonen nacheinander in Richtung des Transports der Entwicklungslösung angeordnet sind, wobei ein Substrat für ein Enzym auf einen Abschnitt des Absorptionsmaterials stromaufwärts von der Enzym-markierten Reagenzzone aufgetragen wird und ein Enzyminhibitor auf einen Abschnitt des Absorptionsmaterials stromaufwärts von der Enzym-markierten Reagenzzone aufgetragen wird, wobei der Enzyminhibitor die Bildung eines Signals verhindert, die durch Reaktion des Enzyms und des Substrats stattfindet, und zwar von einem festgelegten Zeitpunkt an, nachdem das Enzym-markierte Reagenz in der Indikatorreagenzzone immobilisiert worden ist.
- Eine vollständigere Würdigung der Erfindung und vieler der damit verbundenen Vorteile ist ohne weiteres möglich, so wie die Erfindung unter Bezugnahme auf die nachstehende ausführliche Beschreibung bei Betrachtung im Zusammenhang mit den beigefügten Zeichnungen besser verstanden wird, worin gilt:
- Fig. 1 ist ein Querschnittdiagramm eines bevorzugten Beispiels eines Teststreifens für die Verwendung in dem erfindungsgemäß Enzym-markierten Immunoassay.
- Fig. 2 ist ein Querschnittdiagramm einer Probe eines Teststreifens, der in den Beispielen 1 und 2 der vorliegenden Erfindung verwendet wird.
- Fig. 3 ist ein Graph, der die Nachweiszeit jeweils für einen FOBT-positiven Standardanalyten (Hämoglobin 20 ng/ml) und einen FOBT-negativen Standardanalyten (Hämoglobin 5 ng/ml) zeigt, wenn ein erfindungsgemäßer Teststreifen und ein Vergleichsteststreifen verwendet werden.
- Fig. 4 ist ein Graph, der die Zeitabhängigkeit des Färbungsgrades einer Indikatorreagenzzone eines erfindungsgemäßen Teststreifens und die Zeitabhängigkeit des Färbungsgrades einer Indikatorreagenzzone eines Vergleichsteststreifens zeigt, wenn ein FOBT-positiver Standardanalyt (Hämoglobin 20 ng/ml) untersucht wird.
- Fig. 5 ist ein Graph, der die Zeitabhängigkeit des Färbungsgrades einer Indikatorreagenzzone eines erfindungsgemäßen Teststreifens und die Zeitabhängigkeit des Färbungsgrades einer Indikatorreagenzzone eines Vergleichsteststreifens zeigt, wenn ein FOBT-negativer Standardanalyt (Hämoglobin 5 ng/ml) untersucht wird.
- Mit Bezug auf Fig. 1 wird nun ein bevorzugtes Beispiel einer Vorrichtung zur Durchführung des erfindungsgemäßen Enzym-markierten Immunoassays erläutert.
- Wie in Fig. 1 gezeigt, umfasst das Beispiel für die Vorrichtung einen Teststreifen 1, der einen Absorptionsmaterialstreifen 2 umfasst, der eine Entwicklungslösung 5 durch Kapillarwirkung transportieren kann. Beispiele für ein Material für den Absorptionsmaterialstreifen 2 sind Cellulose- oder Nitrocellulosederivate, wie Cellulose und Nitrocellulose, Filterpapier, hergestellt aus Glasfasern, und eine poröse Folie. Es gibt keine spezielle Beschränkung hinsichtlich der Größe des Absorptionsmaterialstrei fens 2; es ist jedoch bevorzugt, wenn der Absorptionsmaterialstreifen 2 in Form eines Streifens mit einer Breite von etwa 3 bis 10 mm, einer Länge von etwa 30 bis 100 mm und einer Dicke von etwa 3 um bis 1 mm für die handliche Verwendung vorliegt.
- An den gegenüberliegenden Endabschnitten des Absorptionsmaterialstreifens 2 werden eine Entwicklungslösungszufuhrzone 3, die ein Entwicklungslösungszufuhrkissen umfasst, und eine Entwicklungslösungsabsorptionszone 10, die ein Wasserabsorptionskissen umfasst, bereitgestellt. Diese Kissen können aus dem gleichen Material wie dem für den Absorptionsmaterialstreifen 2 oder einem wasserabsorbierenden Material, wie Schwamm oder wasserabsorbierendem Faservlies, hergestellt werden. Die Entwicklungslösungszufuhrzone 3 und die Entwicklungsabsorptionszone 10 werden üblicherweise dicker als der Absorptionsmaterialstreifen 2 ausgebildet; es ist jedoch keine essentielle Anforderung an die Entwicklungslösungszufuhrzone 3 und die Entwicklungslösungsabsorptionszone 10. Die Entwicklungslösungszufuhrzone 3 und die Entwicklungslösungsabsorptionszone 10 können auch durch Ausbildung entgegen gesetzter Endabschnitte des Absorptionsmaterialstreifens 2 in Form des Entwicklungslösungszufuhrkissens und des Entwicklungslösungsabsorptionskissens gebildet werden.
- Der Enzyminhibitor für die Verwendung in der Erfindung kann auf einen Abschnitt des Teststreifens 1 stromaufwärts einer Enzym-markierten Reagenzzone 8 im Hinblick auf die Transportrichtung durch Kapillarwirkung der Entwicklungslösung 5 aufgetragen werden. Der Enzyminhibitor kann in der Entwicklungslösung 5 oder der Entwicklungslösungszufuhrzone 3 oder sowohl in der Entwicklungslösung 5 als auch der Entwicklungslösungszufuhrzone 3 enthalten sein. Als Enzyminhibitor für die Verwendung in der vorliegenden Erfindung kann ein beliebiger Enzyminhibitor verwendet werden, so lange der Inhibitor die Reaktion zwischen dem Enzym des Enzymmarkierten Reagenzes und dem Substrat inhibieren kann. Ein Enzyminhibitor, der für das Enzym-markierte Reagenz geeignet ist, kann selbstverständlich in selektiver Weise verwendet werden.
- Beispiele für das Enzym zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung sind Phosphatase, wie alkalische Phosphatase; Peroxidase; und β-Galactosidase.
- Wenn alkalische Phosphatase als das Enzym verwendet wird, dann können als der Enzyminhibitor Phosphorsäure; Phosphate, wie Natriumphosphat und Kaliumphos phat; und Phosphorsäureverbindungen, wie Phosphorsäuremonoester, Naphtholphosphorsäure, Glycerophosphorsäure, Phenylphosphat, Phosphoethanolamin, Phosphorylcholin und Glucosephosphorsäure; und Chelatverbindungen, wie Ethylendiamintetraessigsäure, Phenanthrolin und Ethylenglycosetetraessigsäure, verwendet werden.
- Wenn Peroxidase als das Enzym verwendet wird, dann können Reduktionsmittel, wie Ascorbinsäure, und Azidverbindungen, wie Natriumazid und Kaliumazid, als Enzyminhibitoren verwendet werden.
- Wenn ferner β-Galactosidase als das Enzym verwendet wird, dann kann Galactose als Enzyminhibitor verwendet werden.
- Selbst bei Verwendung eines beliebigen Enzyms kann eine Säure oder Base als der Enzyminhibitor verwendet werden, um den pH-Wert einer Indikatorreagenzzone 9 weg vom besonders geeigneten pH-Wert für dieses Enzym zu verschieben.
- Wenn der Enzyminhibitor auf die Entwicklungslösungszufuhrzone 3 aufgetragen wird, dann wird der Enzyminhibitor auf einen Teil der Entwicklungslösungszufuhrzone 3 oder den Gesamtbereich aufgetragen und dann unter Bildung einer Enzyminhibitorzone getrocknet.
- Wenn der Enzyminhibitor auf die Entwicklungslösungszufuhrzone 3 aufgetragen wird, dann hält die Inhibitionswirkung des Enzyminhibitors in der Indikatorreagenzzone 9 nicht an und ist schwindend, während wenn der Enzyminhibitor in der Entwicklungslösung 5 enthalten ist, die Inhibitionswirkung des Enzyminhibitors lang anhält. Wenn der Enzyminhibitor auf die Entwicklungslösungszufuhrzone 3 aufgetragen wird und auch in der Entwicklungslösung 5 enthalten ist, kann der Enzyminhibitor die weitere Signalbildung von einem festgelegten Zeitpunkt nach der Immobilisierung des Enzym-markierten Reagenzes an vollständig verhindern. Die Position der Auftragung des Enzyminhibitors kann beliebig entsprechend der Anwendung des Teststreifens 1 gewählt werden.
- Der Teststreifen 1 wird weiter mit einer Probenaufnahmezone 7 versehen, auf die eine Testprobe 6 aufgetragen wird. In der Probenaufnahmezone 7 ist das Absorptionsmaterial blockiert, um die nicht spezifische Adsorption von Proteinen zu verhindern, und ein Enzym-markiertes Reagenz ist darin in trockenem Zustand enthalten, wobei das Enzym-markierte Reagenz eine immunreaktive Substanz, wie einen Antikörper oder ein Antigen, umfasst, die mit einem Analyten, wie einem Antigen oder einem Antikörper, reagieren sollen, markiert mit einem Enzym.
- Es ist bevorzugt, wenn die Probenaufnahmezone 7 auch als eine Enzym-markierte Reagenzzone 8 ausgebildet ist, die aus einem Enzym-markierten Reagenzkissen besteht, wobei eine große Menge des Enzym-markierten Reagenzes darin enthalten sein kann und eine große Menge Testprobe darauf aufgetragen werden kann und damit die Assayempfindlichkeit signifikant verbessert werden kann.
- Es gibt keine besondere Beschränkung hinsichtlich des Materials für das Enzymmarkierte Reagenzkissen, so lange das Material wasserabsorbierend ist. Beispiele für das Material für die Enzym-markierte Reagenzzone sind ein Schwamm, wasserabsorbierendes Faservlies und Filterpapier, hergestellt aus einem porösen synthetischen oder natürlichen Polymermaterial, wie Polyvinylalkohol (PVA), Cellulose oder Nitrocellulose, oder hergestellt aus einem Verbundmaterial, zusammengesetzt aus derartigen Polymermaterialien. Es gibt keine besondere Beschränkung hinsichtlich der Größe des Enzym-markierten Reagenzkissens; es ist jedoch bevorzugt, wenn das Enzym-markierte Reagenzkissen eine Größe mit einer Breite von etwa 3 bis 10 mm, einer Länge von etwa 3 bis 10 mm und einer Dicke von etwa 0,5 mm bis 4 mm aufweist. Die Menge des Enzym-markierten Reagenzes, die in dem Enzymmarkierten Reagenzkissen enthalten sein kann, variiert abhängig von dem zu untersuchenden Analyten; üblicherweise liegt sie jedoch im Bereich von etwa 0,01 ug bis 5 ug auf Trockenbasis, was eine größere Menge als in dem Fall darstellt, dass das Enzym-markierte Reagenz direkt auf den Absorptionsmaterialstreifen 2 aufgetragen und getrocknet wird.
- Die Probenaufnahmezone 7 kann in dem Absorptionsmaterialstreifen 2 bereitgestellt werden, und zwar nicht nur in der Enzym-markierten Reagenzzone 8, wie vorstehend erwähnt, sondern auch stromaufwärts von der wasserabsorbierenden Zone 10 und stromaufwärts von der Enzym-markierten Reagenzzone 8 oder stromabwärts von der Enzym-markierten Reagenzzone 8 und stromaufwärts von der Indikatorreagenzzone 9, und zwar im Hinblick auf die Transportrichtung der Entwicklungslösung 5.
- Die Indikatorreagenzzone 9 ist stromaufwärts von der wasserabsorbierenden Zone 10 und stromabwärts von der Probenaufnahmezone 7 im Hinblick auf die Transportrichtung der Entwicklungslösung 5 angeordnet. Die Indikatorreagenzzone 9 kann be reitgestellt werden, indem eine immunreaktive Substanz, wie ein Antikörper oder ein Antigen, den man mit einem Analyten, wie einem Antigen oder einem Antikörper, in der Testprobe 6 reagieren lässt, an dem Absorptionsmaterialstreifen 2 durch chemische Bindung oder physikalische Adsorption fixiert wird. Ein Antikörper oder ein Antigen, die man mit einem Analyten, wie einem Antigen oder einem Antikörper, reagieren lässt, können an einen unlöslichen Träger, z. B. durch chemische Bindung, wie kovalente Bindungen, oder physikalische Adsorption, gebunden sein und können in dem Absorptionsmaterialstreifen 2 vor der Verwendung enthalten sein. Beispiele für derartige unlösliche Träger sind Teilchen, hergestellt durch Unlöslichmachen einer Mischflüssigkeit aus Gelatine, Gummi arabicum und Natriumhexametaphosphat (japanische Patentveröffentlichung 63-29223; US-Patent 4416813 und europäisches Patent 62 968), Polystyrollatex, Erythrozyten verschiedener Tiere und Glasfasern.
- Als Substrat für die Verwendung in der vorliegenden Erfindung können verschiedene Substrate in selektiver Weise abhängig von dem Enzym, das in Kombination damit verwendet werden soll, der Farbgebung oder der Lumineszenz eingesetzt werden.
- Beispiele für die Substrate für die Verwendung mit alkalischer Phosphatase sind Dinatrium-5-brom-4-chlor-3-indolylphosphat (BCIP), Dinatrium-5-brom-6-chlor-3-indolylphosphat, und Beispiele für Substrate für die Verwendung mit Peroxidase sind 1,2- Phenylendiamin, 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin, 2,2'-Azinobis-3-ethylbenzothiazolin-6- sulfonsäure (ABTS).
- Beispiele für Substrate für die Verwendung mit β-Galactosidase sind 5-Brom-4-chlor- 3-indolyl-β-galactopyranosid und 5-Brom-6-chlor-3-indolyl-β-galactopyranosid.
- Ein derartiges Substrat kann auf den Teststreifen 1 stromaufwärts von der Enzymmarkierten Reagenzzone 8 im Hinblick auf die Transportrichtung der Entwicklungslösung 9 in der gleichen Weise wie der vorstehend erwähnte Enzyminhibitor aufgetragen werden, und es kann in einer der Komponenten Entwicklungslösung 5, Absorptionsmaterialstreifen 2 oder Entwicklungslösungszufuhrkissen in der Entwicklungslösungszufuhrzone 3 enthalten sein. Es ist bevorzugt, eine Substratzone im Absorptionsmaterialstreifen 2 oder der Entwicklungslösungszufuhrzone 3, auf die Substrat aufgetragen wird und in der aufgetragenes Substrat getrocknet wird, bereitzustellen, um den Assay mit hoher Empfindlichkeit durchzuführen.
- In dem Enzym-markierten Immunoassay unter Verwendung des Teststreifens 1 entsprechend der vorliegenden Erfindung wird die Testprobe 6 auf die Probenaufnahmezone 7 aufgetragen, und gleichzeitig wird die Entwicklungslösung 5 auf die Entwicklungslösungszufuhrzone 3 aufgetragen. Die Entwicklungslösung 5 wird in einem Entwicklungslösungsreservoir 4 gehalten, das oberhalb oder unterhalb der Entwicklungslösungszufuhrzone 3 angeordnet ist. Für einen einfachen und handlichen Assay werden das Entwicklungslösungsreservoir 4 und die Entwicklungslösung 5 durch eine aufreißbare dünne Folie getrennt, und durch Reißen der dünnen Folie mit dem Finger kann die Entwicklungsflüssigkeit 5 leicht in Kontakt mit der Entwicklungslösungszufuhrzone 3 gebracht werden. Um diesen Assay leichter und handlicher zu machen, können der Teststreifen 1 und das Entwicklungslösungsreservoir 4 in ein Kunststoffgehäuse oder dergl. in Form eines Kits eingefügt werden.
- Als die Entwicklungslösung 5 für die Verwendung in der vorliegenden Erfindung können verschiedene Pufferlösungen, wie Essigsäurepuffer, Borsäurepuffer, Tris-HCl- Puffer und Diethanolaminpuffer, eingesetzt werden.
- Die Testprobe 6, die auf die Probenaufnahmezone 7 aufgetragen wird, reagiert mit dem Enzym-markierten Reagenz in der Enzym-markierten Reagenzzone 8 und wird durch die Entwicklungslösung 5, die von der Entwicklungslösungszufuhrzone 3 hin zur Indikatorreagenzzone 9 strömt, die sich stromabwärts im Hinblick auf die Transportrichtung der Entwicklungslösung 5 befindet, getragen. Die Testprobe 6, die mit dem Enzym-markierten Reagenz in der Enzym-markierten Reagenzzone 8 reagiert hat, erreicht die Indikatorreagenzzone 9. Wenn das Antigen oder der Antikörper, die in der Testprobe 6 enthalten sind, durch ein Antigen oder einen Antikörper, der an die Indikatorreagenzzone 9 fixiert und darin immobilisiert ist, eingefangen werden, dann wird, da das Antigen oder der Antikörper, die in der Testprobe 6 enthalten sind, an das Enzym-markierte Reagenz gebunden sind, das Enzym-markierte Reagenz in der Indikatorreagenzzone 9 immobilisiert. Das Enzym, das in der Indikatorreagenzzone 9 eingefangen wird, reagiert mit dem Substrat, das in der Entwicklungslösung 5 enthalten ist, so dass ein Signal, wie eine Farbgebung oder Lumineszenz, in der Indikatorreagenzzone 9 gebildet wird. Der Enzyminhibitor, der in der Entwicklungslösung 5 enthalten ist, behindert jedoch anschließend die Reaktion zwischen dem Enzym und dem Substrat, so dass die Bildung des Signals in einer festgelegten Zeitspanne beendet wird. Wenn also das Antigen oder der Antikörper, die als ein Analyt untersucht werden sollen, in der Testprobe enthalten sind, kann die Bildung des Signals in der Indikatorreagenzzone 9 beobachtet werden. Die Entwicklungslösung 5 und andere Komponenten, die nicht durch die Indikatorreagenzzone 9 eingefangen werden, werden dann durch das wasserabsorbierende Kissen in der Wasserabsorptionszone 10 absorbiert. Wenn kein Analyt, wie das Antigen oder der Antikörper, in der Testprobe enthalten ist, wird das Enzym-markierte Reagenz nicht durch die Indikatorreagenzzone 9 eingefangen, so dass das Enzym-markierte Reagenz vom Wasserabsorptionskissen in der Wasserabsorptionszone 10 absorbiert wird, wie es ist, und keine Signale werden in der Indikatorreagenzzone 9 beobachtet. Durch Bildung des Signals oder fehlende Bildung des Signals können das Vorhandensein oder die Abwesenheit des Analyten, wie des Antigens oder des Antikörpers, nachgewiesen werden. Das vorstehend genannte Enzym-markierte Reagenz und ein Anteil des Substrats können unter Bildung des Signals reagieren, bevor das Enzym-markierte Reagenz die Indikatorreagenzzone 9 erreicht. Die Entwicklungslösung 9 in der Indikatorreagenzzone 9 enthält jedoch eine ausreichende Menge des Substrats zur Durchführung des erfindungsgemäßen Enzym-markierten Immunoassays.
- In der vorstehenden Erklärung sind das Enzym-markierte Reagenz und die immunreaktive Substanz, die in der Indikatorreagenzzone 9 immobilisiert sind, als das Antigen oder der Antikörper bezeichnet. Der Ausdruck "das Antigen oder der Antikörper" in der vorliegenden Beschreibung bedeutet jedoch solche Substanzen, die geeignet für die Durchführung einer Antigen-Antikörper-Reaktion (Immunreaktion) und zur Bildung eines Immunkomplexes sind, wie polyklonale Antikörper oder monoklonale Antikörper und Fragmente dieser Antikörper, wie Fab, Fab und F(ab')&sub2;, sowie Haptene.
- Wie vorstehend erwähnt, sind die Analyten für die vorliegende Erfindung medizinische Substanzen, wie Theophyllin, Phenytoin und Valproinsäure; und Substanzen in Organismen, z. B. niedermolekulare Hormone, wie Thyroxin, Östrogen und Östradiol, Krebsmarker, wie CEA, AFP, Fäkalhämoglobin (für FOBT: Fecal Occult Blood Test); Viren, wie Humanimmunschwächevirus (HIV), Erwachsenen-T-Zellleukämievirus (HTLV-1), Hepatitis B-Virus (HBV) und Hepatitis C-Virus (HCV); hochmolekulare Hormone, wie Thyroid-stimulierendes Hormon (TSH) und Insulin, Zytokine, wie IL-1, IL-2 und IL-6; verschiedene Wachstumsfaktoren, wie EGF und PDG; DNA und RNA der vorstehend genannten Viren; Antigene von Proteinen, die im Zusammenhang mit Entzündung stehen, wie CRP, und Antikörper, die den Antigenen entsprechen. Beispiele für Testproben für den Assay derartiger Antigene und Antikörper sind Vollblut, Serum, Plasma, Urin, Körperflüssigkeiten, wie Lymphe, und Fäkalextrakt.
- Weitere Merkmale der vorliegenden Erfindung werden im Verlauf der nachstehenden Beschreibung beispielhafte Ausführungsformen verständlich, die zur Erläuterung der Erfindung vorgelegt werden und diese nicht beschränken sollen.
- Zu 2 ml polyklonalen Kaninchen-anti-Hämoglobin-Antikörpern (200 mM Natriumacetatpuffer (pH-Wert: 4,2)) mit einer Konzentration von 1 mg/ml wurden 40 ug Pepsin (Boehringer Mannheim Code 108057) gegeben, und das Gemisch wurde bei 37ºC für 10 Stunden inkubiert.
- 600 ug einer Fraktion von F(ab)2 mit einem Molekulargewicht von 100 000 wurden erhalten, und zwar unter Verwendung von Superdex 200 (16/60 Gelfiltrationssäule) (hergestellt von Pharmacia Co., Ltd.), das mit einer Pufferlösung (0,1 M Natriumphosphat, 1 mM EDTA·2Na-Pufferlösung (pH-Wert: 7,0)), so dass der pH-Wert auf 7,0 eingestellt wurde, äquilibriert war.
- Zu 600 ug der vorstehenden Fraktion von F(ab)2 wurde 2-Mercaptoethanolamin gegeben, wobei die Konzentration der Fraktion von F(ab)&sub2; auf 10 mM eingestellt wurde, und das Gemisch wurde bei 37ºC für 2 Stunden inkubiert. Nicht-umgesetztes 2-Mercaptoethanolamin wurde aus dem Gemisch entfernt, wobei eine Fraktion von Fab in einer Menge von 500 ug erhalten wurde.
- Zu 2,0 mg alkalischer Phosphatase aus Rinderdarm (hergestellt von Oriental Yeast Co., Ltd.) (0,1 M Natriumphosphatpuffer (pH-Wert: 7,0)) wurden 16 ul N-Succinimidyl-4-maleinimidbuttersäure (GMBS, hergestellt on Dojindo Laboratories Co., Ltd.), gelöst in DMF mit einer Konzentration von 10 mg/ml, gegeben, und das Gemisch wurde bei 25ºC für 1 Stunde inkubiert. Nicht-umgesetzte GMBS wurde aus dem Gemisch entfernt, wobei eine Maleinimid-umgesetzte alkalische Phosphatase in einer Menge von 1480 ug erhalten wurde.
- Zu 500 ug der in Referenzbeispiel 1 hergestellten Fab-Fraktion von polyklonalen Kaninchen-anti-Hämoglobin-Antikörpern wurden 1 400 ug der in Referenzbeispiel 2 hergestellten Maleinimid-umgesetzten alkalischen Phosphatase gegeben, und das Gemisch wurde bei 25ºC für 2 Stunden inkubiert. Aus diesem Gemisch wurde eine Fraktion von mit alkalischer Phosphatase markierten polyklonalen Kaninchen-anti- Hämoglobin-Antikörpern mit einem mittleren Molekulargewicht von 190 000 in einer Menge von 400 ug unter Verwendung von Superdex 200 (16/60 Gelfiltrationssäule) (hergestellt von Pharmacia Co., Ltd.) erhalten.
- Wie in Fig. 2 veranschaulicht, wurde auf einem Absorptionsmaterialstreifen 12, hergestellt aus einer 5 mm breiten und 50 mm langen Cellulosefolie (hergestellt on Millipore Corp.) in einer Position 15 mm vom rechten Ende eine Indikatorreagenzzone 19 in Form einer Linie so ausgebildet, dass sie das Absorptionsmaterial 12 kreuzt, indem ein polyklonaler Kaninchen-anti-Hämoglobin-Antikörper in einer Menge von 1,33 ug aufgetragen und der aufgetragene polyklonale Kaninchen-anti-Hämoglobin- Antikörper getrocknet wurde.
- 300 ng einer Lösung des in Referenzbeispiel 3 hergestellten, mit alkalischer Phosphatase markierten polyklonalen Kaninchen-anti-Hämoglobin-Antikörpers wurden auf eine 5 mm breite und 5 mm lange Polyvinylalkohol (PVA)-Lage aufgetragen und getrocknet, wobei ein Kissen hergestellt wurde. Dieses Kissen wurde auf dem Absorptionsmaterialstreifen 12 in einer Position etwa 25 mm vom rechten Ende bereitgestellt, wobei es nicht nur als eine Enzym-markierte Zone 18 diente, sondern auch als eine Probenaufnahmezone 17, wie in Fig. 2 veranschaulicht ist. Ein 10 mm breites und 20 mm langes Absorptionskissen 20 aus einem Filterpapier (hergestellt von Millipore Corp.) wurde auf dem Absorptionsmaterialstreifen 12 in einer Position etwa 10 mm vom rechten Ende davon bereitgestellt.
- Als eine Entwicklungslösung 15 wurde eine CHES-Pufferlösung (N-Cyclohexyl-2- aminoethansulfonsäure/NaOH (pH-Wert: 10,0)) eingesetzt. Die Entwicklungslösung 15 wurde in ein Entwicklungslösungsreservoir 14 gebracht, und das Entwicklungslö sungsreservoir 14 wurde unter Verwendung einer Aluminiumsiegelfolie fest verschlossen, bis der Assay eingeleitet wurde.
- Ein 5 mm breites und 20 mm langes Filterpapier (hergestellt von Millipore Corp.) wurde an dem Absorptionsmaterialstreifen 12 in einer Position etwa 10 mm vom linken Ende davon angebracht, wobei eine Entwicklungslösungszufuhrzone 13 ausbildete, wie in Fig. 2 veranschaulicht ist.
- Am rechten Endabschnitt der Entwicklungslösungszufuhrzone 13 wurde eine Substratzone 13a durch Auftragen von 100 ug Dinatrium-5-brom-4-chlor-3-indolylphosphat (BCIP) und Trocknen des aufgetragenen BCIP gebildet, wie in Fig. 2 veranschaulicht ist, wobei ein Immunoassay-Teststreifen 11 hergestellt wurde.
- Zu der Entwicklungslösung 15 wurden 4 mM Mononatriumphthalat gegeben, und 50 mM Mononatriumphthalat wurden auf die Entwicklungslösungszufuhrzone 13 aufgetragen, wobei ein erfindungsgemäßer Immunoassay-Teststreifen 11-1 hergestellt wurde. Der auf diese Weise hergestellte Immunoassay-Teststreifen 11-1 der vorliegenden Erfindung ist in den Figg. 3 und 4 als "Teststreifen 11-1 (Entwicklungslösung + Filterpapier +)" dargestellt.
- Der vorstehend hergestellte Immunoasay-Teststreifen 11 wurde so, wie er war, als ein Vergleichs-Immunoassay-Teststreifen 11-2 verwendet, d. h. ohne Zugabe der vorstehend genannten 4 mM Mononatriumphthalat zu der Entwicklungslösung 15 und ohne Auftragen der vorstehend genannten 50 mM Mononatriumphthalat auf die Entwicklungslösungszufuhrzone 13. Der auf diese Weise hergestellte Vergleichs- Immunoassay-Teststreifen 11-2 ist in den Figg. 3 und 4 als "Vergleichsteststreifen 11-2 (Entwicklungslösung-Filterpapier-)" dargestellt.
- Bei Raumtemperatur wurden 25 ul eines Fäkalextraktes mit einem Gehalt an 20 ng/ml Hämoglobin, der als eine positive Standardprobe verwendet wurde, auf die Probenaufnahmezone 17 des Immunoassay-Teststreifens 11-1 der vorliegenden Erfindung aufgetragen, und die Aluminiumsiegelfolie des Entwicklungslösungsreservoirs 14 wurde aufgerissen, wobei die Entwicklungslösung 15 in Kontakt mit der Entwicklungslösungszufuhrzone 13 gebracht wurde, und der Assay wurde eingeleitet.
- Die Farbgebung der Indikatorreagenzzone 19 wurde visuell im Verlauf der Zeit untersucht und außerdem unter Verwendung einer kommerziell erhältlichen Digitalkamera (Marke "RD-175", hergestellt von Minolta Co., Ltd.) photographiert und einer Bildbearbeitung unter Verwendung einer Bildbearbeitungssoftware EDAS (hergestellt von Cosmo Bio Co., Ltd.) unterzogen.
- Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 und in den Figg. 3 bis 5 gezeigt.
- Bei Raumtemperatur wurden 25 ul eines Fäkalextraktes mit einem Gehalt an 5 ng/ml Hämoglobin, der als eine negative Standardprobe verwendet wurde, auf die Probenaufnahmezone 17 des Immunoassay-Teststreifens 11-1 der vorliegenden Erfindung aufgetragen, und die Aluminiumsiegelfolie des Entwicklungslösungsreservoirs 14 wurde aufgerissen, wobei die Entwicklungslösung 15 in Kontakt mit der Entwicklungslösungszufuhrzone 13 gebracht wurde, und der Assay wurde eingeleitet.
- Die Farbgebung der Indikatorreagenzzone 19 wurde visuell im Verlauf der Zeit untersucht und außerdem unter Verwendung der gleichen kommerziell erhältlichen Digitalkamera, wie vorstehend erwähnt, photographiert und der gleichen Bildbearbeitung, wie vorstehend erwähnt, unterzogen.
- Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 und in den Figg. 3 bis 5 gezeigt.
- Bei Raumtemperatur wurden 25 ul eines Fäkalextraktes mit einem Gehalt an 20 ng/ml Hämoglobin, wobei es sich um die gleiche positive Standardprobe, wie sie in Beispiel 2 verwendet wurde, handelte, auf die gleiche Probenaufnahmezone 17 des Vergleichs-Immunoassay-Teststreifens 11-2 aufgetragen, und die Aluminiumsiegelfolie des Entwicklungslösungsreservoirs 14 wurde aufgerissen, wobei die Entwicklungslösung 15 in Kontakt mit der Entwicklungslösungszufuhrzone 13 gebracht wurde, und der Assay wurde eingeleitet.
- Die Farbgebung der Indikatorreagenzzone 19 wurde visuell im Verlauf der Zeit untersucht und außerdem unter Verwendung der gleichen kommerziell erhältlichen Digitalkamera, wie sie in Beispiel 2 verwendet wurde, photographiert und der gleichen Bildbearbeitung wie in Beispiel 2 unter Verwendung der gleichen Bildbearbeitungssoftware EDAS (hergestellt von Cosmo Bio Co., Ltd.) unterzogen.
- Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 und in den Figg. 3 bis 5 gezeigt.
- Bei Raumtemperatur wurden 25 ul eines Fäkalextraktes mit einem Gehalt an 5 ng/ml Hämoglobin, wobei es sich um die gleiche negative Standardprobe, wie sie in Beispiel 2 verwendet wurde, handelte, auf die Probenaufnahmezone 17 des Vergleichs- Immunoassay-Teststreifens 11-2 aufgetragen, und die Aluminiumsiegelfolie des Entwicklungslösungsreservoirs 14 wurde aufgerissen, wobei die Entwicklungslösung 15 in Kontakt mit der Entwicklungslösungszufuhrzone 13 gebracht wurde, und der Assay wurde eingeleitet.
- Die Farbgebung der Indikatorreagenzzone 19 wurde visuell im Verlauf der Zeit untersucht und außerdem unter Verwendung der gleichen kommerziell erhältlichen Digitalkamera, wie vorstehend erwähnt, photographiert und der gleichen Bildbearbeitung, wie vorstehend erwähnt, unterzogen.
- Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 und in den Figg. 3 bis 5 gezeigt. Tabelle 1
- Wie aus den vorstehenden Angaben ersichtlich ist, wurde bei Verwendung von Teststreifen 11-1 (Entwicklungslösung + Filterpapier +) eine klare Unterscheidung zwischen dem negativen Standard und dem positiven Standard im Verlauf von 8 Minuten Assayzeit erzielt, während bei Verwendung von Teststreifen 11-2 (Entwicklungslösung - Filterpapier -) keine Unterscheidung zwischen dem negativen Standard und dem positiven Standard im Verlauf von 8 Minuten Assayzeit erfolgte.
- Fig. 3 zeigt, dass bei Verwendung von Teststreifen 11-1 (Entwicklungslösung + Filterpapier +) der Unterschied in der Nachweiszeit zwischen dem positiven Standard und dem negativen Standard 440 Sekunden betrug, und in Bezug auf den negativen Standard das Bewertungsergebnis für 15 Minuten nach Einleitung des Assays negativ blieb, während bei Verwendung von Teststreifen 11-2 (Entwicklungslösung - Filterpapier -) der Unterschied in der Nachweiszeit zwischen dem positiven Standard und dem negativen Standard nur 41 Sekunden betrug.
- Die Figg. 4 und 5 zeigen, dass bei Verwendung von Teststreifen 11-1 (Entwicklungslösung + Filterpapier +) die Färbung sich nach einem festgelegten Zeitpunkt von der Nachweiszeit an nicht entwickelte, und zwar sowohl im Hinblick auf den positiven als auch den negativen Standard, während bei Verwendung von Teststreifen 11-2 (Entwicklungslösung - Filterpapier -) die Färbung sich mit der Zeit entwickelte.
- Bei dem Enzym-markierten Immunoassay unter Verwendung des erfindungsgemäßen Teststreifens ist also die Änderung der Färbung der Indikatorreagenzzone wesentlich kleiner als die bei dem herkömmlichen Enzym-markierten Immunoassay, und zwar von einem festgelegten Zeitpunkt von der Nachweiszeit an, so das die Bewertung oder Beurteilung selbst nach der Nachweiszeit erfolgen kann. Im Fall des FOBT (Fecal Occult Blood Test) z. B. kann die Färbung der Indikatorreagenzzone nach einer festgelegten negativen oder positiven Beurteilung (z. B. 8 Minuten) im wesentlichen beendet werden, so dass die Beurteilung zu jeder Zeit nach einer Zeitspanne von 8 Minuten durchgeführt werden kann. Der Enzym-markierte Immunoassay ist also effektiv für die Durchführung einer einfachen und genauen positiven oder negativen Beurteilung oder Bewertung eines Analyten entsprechend dem Farbunterschied, der sich in der Indikatorreagenzzone entwickelt, ohne dass die Notwendigkeit der Überwachung der Nachweiszeit besteht.
Claims (14)
1. Enzym-markierter Immunoassay, umfassend folgende Stufen:
Man lässt eine Testprobe mit einem Enzym-markierten Reagenz reagieren;
man lässt ein Substrat mit dem Enzym unter Bildung eines Signals reagieren;
und
das Enzym-markierte Reagenz wird immobilisiert, wobei eine weitere
Signalbildung von einem festgelegten Zeitpunkt nach der Immobilisierung des
Enzymmarkierten Reagenzes an unter Verwendung eines Enzyminhibitors verhindert
wird.
2. Enzym-markierter Immunoassay nach Anspruch 1, wobei es sich bei dem
Enzym um Phosphatase handelt und der Enzyminhibitor aus der Gruppe
ausgewählt ist, die aus einer Phosphorsäureverbindung und einer Chelatverbindung
besteht.
3. Enzym-markierter Immunoassay nach Anspruch 2, wobei die
Phosphorsäureverbindung aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Phosphorsäure, Phosphat,
Phosphorsäuremonoester, Naphtholphosphorsäure, Glycerophosphorsäure,
Phenylphosphat, Phosphoethanolamin, Phosphorylcholin und
Glucosephosphorsäure besteht.
4. Enzym-markierter Immunoassay nach Anspruch 2, wobei die Chelatverbindung
aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Ethylendiamintetraessigsäure,
Phenanthrolin und Ethylenglycosetetraessigsäure besteht.
5. Enzym-markierter Immunoassay nach Anspruch 1, wobei es sich bei dem
Enzym um Peroxidase handelt und der Enzyminhibitor aus der Gruppe ausgewählt
ist, die aus einer reduzierenden Verbindung und einer Azidverbindung besteht.
6. Enzym-markierter Immunoassay nach Anspruch 1, wobei es sich bei dem
Enzym um β-Galactosidase handelt und es sich bei dem Enzyminhibitor um
Galactose handelt.
7. Vorrichtung zur Durchführung eines Enzym-markierten Immunoassays (1),
umfassend ein Absorptionsmaterial (2), das zum Transport einer
Entwicklungslösung (5) durch Kapillarwirkung imstande ist, wobei das Absorptionsmaterial (a)
eine Entwicklungslösungsauftragungszone (3), auf die Entwicklungslösung
aufgetragen wird, (b) eine Enzym-markierte Reagenzzone (8), die ein
Enzym-markiertes Reagenz umfasst, (c) eine Probenaufnahmezone (7), auf die eine
Testprobe (6) aufgetragen wird, und (d) eine Indikatorreagenzzone (9), die ein
Indikatorreagenz umfasst, das zur Immobilisierung des Enzym-markierten
Reagenzes nach der Reaktion der Testprobe mit dem Enzym-markierten Reagenz in
einer Menge abhängig vom Assayergebnis imstande ist, umfasst, wobei die
Zonen der Reihe nach in der Richtung des Transports der Entwicklungslösung
angeordnet sind, wobei ein Substrat für ein Enzym auf einen Abschnitt in dem
Absorptionsmaterial stromaufwärts von der Enzym-markierten Reagenzzone
aufgetragen wird und ein Enzyminhibitor auf einen Abschnitt des
Absorptionsmaterials stromaufwärts von der Enzym-markierten Reagenzzone aufgetragen wird,
wobei der Enzyminhibitor eine Signalbildung verhindert, die durch Reaktion des
Enzyms und des Substrats auftritt, und zwar von einem festgelegten Zeitpunkt
nach der Immobilisierung des Enzym-markierten Reagenzes in der
Indikatorreagenzzone an.
8. Vorrichtung nach Anspruch 7, wobei die Entwicklungslösung ferner den
Enzyminhibitor umfasst.
9. Vorrichtung nach Anspruch 7, ferner umfassend eine den Enzyminhibitor
umfassende Enzyminhibitorzone, die stromaufwärts von der Enzym-markierten
Reagenzzone angeordnet ist.
10. Vorrichtung nach Anspruch 7, wobei es sich bei dem Enzym um Phosphatase
handelt und der Enzyminhibitor aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus einer
Phosphorsäureverbindung und einer Chelatverbindung besteht.
11. Vorrichtung nach Anspruch 10, wobei die Phosphorsäureverbindung aus der
Gruppe ausgewählt ist, die aus Phosphorsäure, Phosphat,
Phosphorsäuremo
noester, Naphtholphosphorsäure, Glycerophosphorsäure, Phenylphosphat,
Phosphoethanolamin, Phosphorylcholin und Glucosephosphorsäure besteht.
12. Vorrichtung Anspruch 10, wobei die Chelatverbindung aus der Gruppe
ausgewählt ist, die aus Ethylendiamintetraessigsäure, Phenanthrolin und
Ethylenglycosetetraessigsäure besteht.
13. Vorrichtung nach Anspruch 7, wobei es sich bei dem Enzym um Peroxidase
handelt und der Enzyminhibitor aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus einer
reduzierenden Verbindung und einer Azidverbindung besteht.
14. Vorrichtung nach Anspruch 7, wobei es sich bei dem Enzym um
β-Galactosidase handelt und es sich bei dem Enzyminhibitor um Galactose handelt.
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