DE69800720T2 - Reagenz zur Färbung von Blutzellen - Google Patents

Reagenz zur Färbung von Blutzellen

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Description

  • Die Erfindung bezieht sich auf biologische Analysen und insbesondere auf Blutanalysen.
  • Insbesondere betrifft sie ein Färbereagens für die Bestimmung von Blutzellen, insbesondere von Retikulozyten, das zu einem Typ gehört, der ein Färbemittel aufweist, das geeignet ist, die Zellen nach einer Inkubation zu markieren.
  • Es sind bereits verschiedene Färbereagenzien dieser Art bekannt, die es ermöglichen, Blutzellen dank eines Färbemittels zu identifizieren und zu charakterisieren, was es ermöglicht, die Zellen nach einer Inkubation unter Bedingungen hinsichtlich der Dauer und der Temperatur zu markieren oder zu färben.
  • Solche Reagenzien greifen im allgemeinen auf ein fluoreszierendes Färbemittel oder auf ein nicht-fluoreszierendes Färbemittel zurück, das nach einer Inkubation die Zählung der gefärbten Zellen ermöglicht. Diese Zählung kann mit einer manuellen Färbung unter dem Mikroskop, mit einer äußeren Färbung oder mit einer Färbung mittels einer automatisierten Vorrichtung realisiert werden.
  • Die automatisierte Zählung wird im allgemeinen mit einer als Flußzytometrie bezeichneten Technik durchgeführt, die sich als zuverlässiger und schneller als eine manuelle Zählung erweist.
  • Es sind bereits verschiedene für die Bestimmung von Blutzellen, insbesondere von Retikulozyten verwendete Färbemittel bekannt, die für eine manuelle oder automatisierte Zählung verwendet werden können.
  • Unter diesen fluoreszierenden oder nicht-fluoreszierenden Färbemitteln sind insbesondere die folgenden zu nennen: Pyronin Y, Akridinorange, Thioflavin T, Thiazolorange, das neue Blau von Methylen ("neues Methylenblau"), der blaue Cresylglanz ("Brilliantcresylblau"), usw.
  • Beispiele von Färbereagenzien sind insbesondere in den folgenden Patentpublikationen beschrieben: CA 2 024 166, US 5 501 954, US 4 325 706, US 5 438 003, US 5 075 556, US 4 996 040, US 4 883 867, EP 0 545 314, EP 0 545 315, EP 0 430 719, EP 0 215 461, EP 0 226 272 und EP 0 114 462.
  • In dem besonderen Fall der Bestimmung von Retikulozyten, welche die Vorläufer von Erythrozyten oder reifen roten Globuli sind, dient das Färbemittel zum Färben oder Markieren der in der Zelle enthaltenen zurückbleibenden Ribonukleinsäure.
  • Einer der Nachteile der bekannten Färbereagenzien ist, daß sie eine erhöhte Inkubationszeit benötigen, was ihre Verwendung nicht nur bei den manuellen Techniken, sondern hauptsächlich bei den automatisierten Techniken schwierig macht.
  • Insbesondere benötigt das Thiazolorange eine Inkubationszeit in der Größenordnung von 30 Minuten bei Raumtemperatur, wenn es zum Reagieren mit 5 Mikroliter Blut eingesetzt wird. Diese Inkubationszeit ist viel zu lang, um eine vollständige Automatisation des Verfahrens zu ermöglichen.
  • Des weiteren sind gemäß der US-A-4 670 402 und der JP 61 079 163 A Färbereagenzien bekannt, die ein Detergens oder ein grenzflächenaktives Agens enthalten. Diese bekannten Reagenzien weisen jedoch ebenfalls die oben erwähnten Nachteile auf.
  • Die Erfindung hat dementsprechend insbesondere die Aufgabe, die vorgenannten Nachteile zu überwinden.
  • Es ist insbesondere eine Aufgabe der Erfindung, ein Färbereagens für die Bestimmung von Blutzellen, insbesondere von Retikulozyten anzugeben, das es ermöglicht, die Zellen nach einer Inkubationszeit zu markieren, die viel kürzer als die Inkubationszeiten ist, die mit bekannten Reagenzien möglich sind.
  • Es ist auch ein Ziel der Erfindung, solch ein Färbereagens anzugeben, das es ermöglicht, die Inkubationszeit von mehreren Minuten auf mehrere Sekunden abzusenken.
  • Die Erfindung schlägt zu diesem Zweck ein Färbereagens des im Oberbegriff definierten Typs vor, das weiterhin einen Zusatz aufweist, der geeignet ist, das Eindringen des Färbemittels in die Zellen zu fördern, wobei dieser Zusatz aus einer ionophoren Zusammensetzung und einer Mischung einer solchen ionophoren Zusammensetzung mit einem Detergens ausgewählt ist.
  • Auf diese Weise kombiniert das Färbereagens gemäß der Erfindung ein Färbemittel mit einem besonderen Zusatz, der die Aufnahme des Farbstoffs in die Zelle fördert, und infolgedessen die Inkubationszeit bedeutend verringert, die für die Reaktion des Färbemittels mit der Zelle notwendig ist.
  • Der Zusatz gemäß der Erfindung umfaßt im wesentlichen eine ionophore Zusammensetzung, d. h. eine Zusammensetzung, die geeignet ist, die Durchlässigkeit der Zellmembran zu fördern und den Stoffaustausch durch die Membran zu verstärken.
  • Diese Ionophoren sind Moleküle mit hydrophobem Charakter, welche die Durchlässigkeit der Zellmembran für bestimmte Ionen mit einer variablen Spezifizität erhöhen.
  • Diese Ionophoren sind bewegliche Transportsubstanzen oder Moleküle, die Kanäle durch Membranen ausbilden. Sie maskieren die Ladung des Ions des Färbemittels und erleichtern auf diese Weise sein Eindringen in die Lipiddoppelschicht der Membran.
  • Die ionophore Zusammensetzung kann mit einem Detergens gemischt sein, das ebenfalls das Eindringen des Färbemittels durch eine Förderung der Durchlässigkeit der Membran fördert. Das Detergens desorganisiert die Proteinstrukturen der Membran und fördert seine Destabilisierung, was zu einer besseren Aufnahme des Färbemittels beiträgt.
  • Die ionophore Zusammensetzung der Erfindung kann insbesondere ein Protonophor oder ein Antibiotikum sein.
  • Nicht einschränkende Beispiele von ionophoren Zusammensetzungen, die zur Ausführung der Erfindung geeignet sind, sind die folgenden:
  • - Monensin oder 2-[5-ethyltetrahydro-5-[tetrahydro-3- methyl-5-[tetrahydro-6-hydroxy-6-(hydroxymethyl)-3,5- dimethyl-2H-pyran-2-yl]-2-furyl]-2-furyl]-9-hydroxy-β- methoxy-α,γ,2,8-tetramethyl-1,6-dioxaspiro[4,5]decan-7- Buttersäure (antibiotischer Polyether der Summenformel: C&sub3;&sub6;H&sub6;&sub2;O&sub1;&sub1;);
  • - Nonactin oder 2,5,11,14,20,23,29,32-octamethyl- 4,13,22,31,37,38,39,40-octaoxapenta- cyclo[32.2.1.17,10.116,19.125,28]-tetraconan-3,12,21,30- tetron(antibiotisches Makrotetrolid der Summenformel: C&sub4;&sub0;H&sub6;&sub4;O&sub1;&sub2;);
  • - 3,5-Di-tert-butyl-4-hydroxy-benzylidenmalononitril;
  • - Carbonylcyanid m-chlorphenylhydrazon;
  • - Carbonylcyanid p-trifluormethoxyphenylhydrazon;
  • - Tetrachlorsalicylanilid;
  • - 4,5,6,7-Tetrachlor-2-trifluormethylbenzimidazol;
  • - Pentachlorphenol;
  • - 2,4-Dinitrophenol;
  • - Valinomycin (Cyclododekadepsi-Peptid, Antibiotikum der Formel: C&sub5;&sub4;H&sub9;&sub0;N&sub6;O&sub1;&sub8;);
  • - Salinomycin (antibiotischer Polyether der Formel: C&sub4;&sub2;H&sub7;&sub0;O&sub1;&sub1;);
  • - Gramicidin(S) (Polypeptid der Formel: C&sub6;&sub0;H&sub9;&sub2;N&sub1;&sub2;O&sub1;&sub0;).
  • Das Detergens, das in dem Färbereagens der Erfindung verwendet werden kann, ist vorzugsweise vom nichtionischen Typ oder vom zwitterionischen Typ.
  • Als nicht einschränkende Beispiele von Detergenzien, die zur Ausführung der Erfindung geeignet sind, sind folgende zu erwähnen:
  • - Propansulfonate, insbesondere 3-[(3-Cholamido-propyl)- dimethylammonium]-1-propan-sulfonat;
  • - Cholamide, insbesondere N,N-bis[3-D-gluconamidopropyl]- cholamid;
  • - Sulfobetaine;
  • - Alkylglucoside und Alkylmaltoside;
  • - Polyoxyethylenether;
  • - Polyoxyethylensorbitane;
  • - Polyglycolether.
  • Das Färbemittel, das in dem Färbereagens gemäß der Erfindung verwendbar ist, ist ein Markierungsmittel, das geeignet ist, intrazelluläre Zusammensetzungen, wie beispielsweise die Nukleinsäuren der Zelle, insbesondere die Ribonukleinsäure, durch Färbung hervorzuheben.
  • Obwohl es bevorzugt ist, ein fluoreszierendes Färbemittel und insbesondere ein fluoreszierendes Färbemittel für die Retikulozyten zu verwenden, fällt es gleichermaßen in den Umfang der Erfindung, von nicht-fluoreszierenden Färbemitteln Gebrauch zu machen.
  • Wenn es sich um ein fluoreszierendes Färbemittel handelt, ist das Färbemittel vorteilhafter Weise bei einer Wellenlänge im Bereich zwischen 0,1 nm und 1 mm anregbar.
  • Vorzugsweise handelt es sich um ein Färbemittel, das mit blauem Licht, insbesondere mit einer Wellenlänge von 488 nm anregbar ist.
  • Als nicht einschränkende Beispiele von Färbemitteln, die zur Durchführung der Erfindung verwendbar sind, sind folgende zu erwähnen:
  • - 3,3'-Dimethyloxacarbocyaninjodid (oder 3-methyl-2-[3-(3- methyl-2(3H)-benzoxazolyliden)-1-pro- penyl]benzoxazoliumjodid);
  • - Thiazolorange oder 1-Methyl-4-[(3-methyl-2-(3H)- benzothiazolyliden)methyl]chinolin p-tosylat;
  • - Chinolin, 4-[(3-methyl-2-(3H)-benzothiazolyliden)methyl]-1-[3-(trimethylammonium)propyl], dijodid (im Handel erhältlich unter der Bezeichnung TO-PRO 1, von Molecular Probes hinterlegte Marke);
  • - Styryl, insbesondere Styryl 7;
  • - neues Methylenblau;
  • - Brilliantcresylblau.
  • Wenn dieses bekannte Färbemittel in gewählten Anteilen mit einer ionophoren Zusammensetzung allein oder in einer Mischung mit einem Detergens kombiniert ist, passiert es schnell die Zellmembran, was es ermöglicht, die Inkubationszeit bedeutend zu verringern und sie im wesentlichen auf einen Wert von einigen zehn Sekunden zu bringen.
  • Auf diese Weise kann für den Fall von Thiazolorange die Inkubationszeit auf einen Wert im Bereich von 25 Sekunden, anstelle von 30 Minuten bei Raumtemperatur gebracht werden, wenn das Färbemittel allein angewendet wird.
  • Das Färbereagens gemäß der Erfindung kann außer den oben erwähnten Färbemitteln und Zusätzen auch andere Zusammensetzungen oder Substanzen beinhalten.
  • So kann das Färbereagens des weiteren ein organisches Lösungsmittel, insbesondere einen Alkohol, wie Methanol aufweisen, was nicht nur die Löslichkeit des Färbemittels, sondern auch die Solubilisation von Membranlipiden der Zelle fördert.
  • In einer Variante oder als Ergänzung kann das Färbereagens weiterhin ein Salz, zum Beispiel auf der Basis von Natrium oder Kalium enthalten.
  • Es ist in der Tat festgestellt worden, daß eine Konzentration von Salzen eine "ionische" Kraft induziert, die, sofern sie ausreichend ausgeprägt ist, die Zellmembranen destabilisieren kann, indem sie die Bindungen der Membranbestandteile verändert. Darüberhinaus ermöglicht es das Salz, auf das Volumen der Zellen einzuwirken.
  • Andere Zusammensetzungen, die an dem Reagens der Erfindung beteiligt sein können, umfassen ein chelatbildendes Agens, insbesondere EDTA, ein Konservierungsmittel und ein Puffersystem, um den pH-Wert zwischen 5 und 11 zu halten.
  • Der Reagens-Typ der Erfindung ist eine Färbe- oder Markierungslösung, die folgendes aufweist:
  • - ein Färbemittel in einer Konzentration, die im Bereich zwischen 0,1 uM und 0,5 M liegt,
  • - mindestens einen Zusatz, der ausgewählt ist aus einer ionophoren Zusammensetzung in einer Konzentration im Bereich von 0 M bis 1 M und einer Mischung einer solchen ionophoren Zusammensetzung mit einem Detergens in einer Konzentration im Bereich von 0% bis 20%,
  • - eine oder mehrere der nachstehend aufgezählten Zusammensetzungen:
  • Zusammensetzungen/Konzentrationen
  • Salze (NaCl/KCl) 0-1 M
  • Chelatbildner (EDTA) 0-100 mM
  • Lösungsmittel 0-15%
  • Konservierungsmittel 0-1%
  • - ein organisches oder anorganisches Puffersystem, das den pH-Wert im Bereich zwischen 5 und 11 hält.
  • Ein Beispiel eines Färbereagens gemäß der Erfindung ist das folgende:
  • Zusammensetzungen/Konzentrationen
  • Thiazolorange 2 uM
  • Valinomycin 1 uM
  • Polyglycolether 0,0003%
  • NaCl 155 mM
  • EDTA 2 mM
  • Methanol 1,5%
  • Das verwendete Puffersystem ist ein Phosphatpuffer, der den pH-Wert der Färbelösung auf einen neutralen Wert einstellt.
  • Die Erfindung wird nachstehend unter Bezugnahme auf beigefügte Zeichnungen erläutert, die Bilder zeigen, die mit einem Flußzytometer erhalten wurden und die jedesmal das mit einem Referenzfärbemittel erhaltene Bild und das mit einem Färbereagens gemäß der Erfindung erhaltene Bild vergleichen.
  • Diese Bilder zeigen die Fluoreszenz (X-Achse) und die Brechung (Y-Achse). Jede von diesen Figuren zeigt von links nach rechts drei Populationen: Population von roten Globuli (erscheinen in der Form einer Wolke), Population der Retikulozyten (eingerahmter Bereich) und die Population der Leukozyten (zerstreute Wolke).
  • Die Fig. 1A und 1B zeigen die Bilder, die von einem FACSCAN- Flußzytometer (von Becton Dickinson eingetragene Marke) unter Verwendung von Thiazolorange als Färbemittel erhalten wurden.
  • Die Fig. 1A zeigt das Bild, das mit dem Referenzfärbemittel erhalten wurde. Die erforderliche Inkubationszeit beträgt 30 Minuten bei Raumtemperatur. Der Prozentsatz von Retikulozyten ist 4,55%.
  • Die Fig. 1B zeigt das Bild, das mit einem Färbereagens gemäß der Erfindung erhalten wurde, das Thiazolorange in Anwesenheit von Ionophor enthält. Die notwendige Inkubationszeit beträgt nur 25 Sekunden bei 35ºC, der Prozentsatz von Retikulozyten betrug 4,89%.
  • Die Fig. 2A und 2B sind Bilder, die mit einem FACSCAN- Flußzytometer unter Verwendung eines Färbereagenses gemäß der Erfindung erhalten wurden, das 3,3'-Dimethylcarbocyaninjodid als Färbemittel in Anwesenheit von einem Ionophor und einem Detergens enthält.
  • Die zwei Färbungen wurden bei 35ºC realisiert. Es wurde ein Ergebnis erhalten, das äquivalent zu dem für 5 Minuten für das Referenzfärbemittel (Fig. 2A) und zu dem für 30 Sekunden für das Reagens gemäß der Erfindung (Fig. 2B) ist.
  • Die Prozentsätze von Retikulozyten der Bilder der Fig. 2A und 2B sind 1,5% und 1,3%.
  • Die Fig. 3A und 3B sind Bilder, die mit einem FACSCAN- Flußzytometer mit dem Farbstoff TO-PRO 1 (von Molecular Probes eingetragene Marke) unter Bestrahlung mit blauem Licht erhalten wurden.
  • Im Fall von Fig. 3A (Referenzfärbemittel) beträgt die Inkubationszeit 60 Minuten und der Prozentsatz von Retikulozyten 2,22%.
  • Im Fall der Fig. 3B (Färbemittel in Anwesenheit von Ionophor) beträgt die Inkubationszeit 5 Minuten und der Prozentsatz von Retikulozyten 2,14%.
  • Die Fig. 4A und 4B zeigen Bilder, die mit einem FACSTAR-Flußzytometer (von Becton Dickinson eingetragene Marke) mit einem Färbemittel vom Typ TO-PRO 3 (von Molecular Probes eingetragene Marke) unter Bestrahlung mit rotem Licht erhalten wurden.
  • Im Fall der Fig. 4A (Referenzfärbemittel) beträgt die Inkubationszeit 30 Minuten und der Prozentsatz von Retikulozyten 4,1%.
  • Im Fall von Fig. 4B (Färbemittel in Anwesenheit von Ionophor) beträgt die Inkubationszeit 2 Minuten und der Prozentsatz von Retikulozyten 4,9%.
  • Die vorhergehenden Bilder zeigen, daß die Verwendung eines Färbereagens gemäß der Erfindung es ermöglicht, die Inkubationszeit bezüglich der Verwendung eines Referenzfärbemittels signifikant zu verringern.

Claims (11)

1. Färbereagens für die Bestimmung von Blutzellen, insbesondere von Retikulozyten, wobei das Färbereagens ein Färbemittel aufweist, das geeignet ist, die Zellen nach einer Inkubation zu markieren, dadurch gekennzeichnet, daß es des weiteren einen Zusatz enthält, der geeignet ist, das Eindringen des Färbemittels in die Zellen zu fördern, wobei dieser Zusatz aus einer ionophoren Zusammensetzung und einer Mischung einer solchen ionophoren Zusammensetzung mit einem Detergens ausgewählt ist.
2. Färbereagens nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Zusatz nur eine ionophore Zusammensetzung aufweist.
3. Reagens nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Zusatz eine Mischung aus einer ionophoren Zusammensetzung und aus einem Detergens aufweist.
4. Reagens nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die ionophore Zusammensetzung ein Protonophor oder ein Antibiotikum ist, das ausgewählt ist aus der folgenden Gruppe:
- Monensin oder 2-[5-ethyltetrahydro-5-[tetrahydro-3- methyl-5-[tetrahydro-6-hydroxy-6-(hydroxymethyl)- 3,5-dimethyl-2H-pyran-2-yl]-2-furyl]-2-furyl]-9- hydroxy-β-methoxy-α,-γ,2,8-tetramethyl-1,6- dioxaspiro[4,5]decan-7-Buttersäure;
- Nonactin oder 2,5,11,14,20,23,29,32-octamethyl- 4,13,22,31,37,38,39,40-octaoxapentacyclo[32.2.1.17,10.116,19.125,28]-tetracontan- 3,12,21,30-tetron;
- 3,5-Di-tert-butyl-4-hydroxy-benzylidenmalononitril;
- Carbonylcyanid m-chlorphenylhydrazon;
- Carbonylcyanid p-trifluormethoxyphenylhydrazon;
- Tetrachlorsalicylanilid;
- 4,5,6,7-Tetrachlor-2-trifluormethylbenzimidazol;
- Pentachlorphenol;
- 2,4-Dinitrophenol;
- Valinomycin;
- Salinomycin;
- Gramicidin(S).
5. Färbereagens nach einem der Ansprüche 1 und 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Detergens nichtionisch oder zwitterionisch ist und ausgewählt ist aus der folgenden Gruppe:
- Propansulfonaten, insbesondere 3-[(3-Cholamidopropyl)-dimethylammonium]-1-propan-sulfonat;
- Cholamiden, insbesondere N,N-bis[3-D-gluconamidopropyl]-cholamid;
- Sulfobetainen;
- Alkylglucosiden und Alkylmaltosiden;
- Polyoxyethylenethern;
- Polyoxyethylensorbitanen;
- Polyglycolethern.
6. Färbereagens nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß das Färbemittel von einem fluoreszierenden Typ ist.
7. Färbereagens nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß das Färbemittel bei einer Wellenlänge im Bereich von 0,1 nm bis 1 mm anregbar ist.
8. Färbereagens nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß das Färbemittel mit blauem Licht, insbesondere bei einer Wellenlänge von 488 nm anregbar ist.
9. Färbereagens nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß das Färbemittel aus den folgenden Substanzen ausgewählt ist;
- 3,3'-Dimethyloxacarbocyaninjodit (oder 3-methyl-2- [3-(3-methyl-2(3H)-benzoxazolyliden)-1-propenyl]benzoxazoliumjodit);
- Thiazolorange oder 1-Methyl-4-[(3-methyl-2-(3H)- benzothiazolyliden)methyl]chinolin p-tosylat;
- Chinolin, 4-[(3-methyl-2-(3H)-benzothiazolyliden)methyl]-1-[3-(trimethylammonium)propyl], dijodit;
- Styryl, insbesondere Styryl 7;
- neuem Methylenblau;
- Cresylbrilliantblau.
10. Färbereagens nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß es weiterhin wenigstens eine Zusammensetzung enthält, die aus den folgenden ausgewählt ist:
- einem Salz, insbesondere von Natrium oder von Kalium,
- einem Chelatbildner, insbesondere EDTA,
- einem Lösungsmittel, insbesondere einem Alkohol,
- einem Konservierungsmittel, und
- einem Puffersystem, das den pH-Wert im Bereich zwischen 5 und 11 hält.
11. Färbereagens nach einem der Ansprüche 1 bis 10, gekennzeichnet durch die folgende Zusammensetzung:
- ein Färbemittel in einer Konzentration, die im Bereich zwischen 0,1 uM und 0,5 M liegt, - wenigstens einen Zusatz, der aus einer ionophoren Zusammensetzung ausgewählt ist in einer Konzentration im Bereich von 0 M bis 1 M und einer Mischung einer solchen ionophoren Zusammensetzung mit einem Detergens in einer Konzentration im Bereich von 0% bis 20%,
- eine oder mehrere der nachstehend aufgezählten Zusammensetzungen:
Zusammensetzungen/Konzentrationen
Salze (NaCl/KCl) 0-1 M
Chelatbildner (EDTA) 0-100 mM
Lösungsmittel 0-15%
Konservierungsmittel 0-1%
- ein organisches oder anorganisches Puffersystem, das den pH-Wert im Bereich zwischen 5 und 11 hält.
DE69800720T 1997-01-31 1998-01-12 Reagenz zur Färbung von Blutzellen Expired - Lifetime DE69800720T2 (de)

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