DE69738600T2

DE69738600T2 - Neuroaktive peptide

Info

Publication number: DE69738600T2
Application number: DE69738600T
Authority: DE
Inventors: Frederick A. Eltham MENDELSOHN; Siew Yeen Burwood East CHAI; Ingrid Northcote MOELLER; Peter G. Brunswick ALDRED; Ian A. Hampton SMITH; Rebecca A. Port Melbourne LEW
Original assignee: Howard Florey Institute of Experimental Physiology and Medicine
Current assignee: Florey Institute of Neuroscience and Mental Health
Priority date: 1996-07-09
Filing date: 1997-07-09
Publication date: 2009-07-23
Anticipated expiration: 2017-07-10
Also published as: CA2259137A1; JP2001504803A; EP0917535A4; NZ333632A; US20020147129A1; DE69738600D1; EP0917535A1; JP4275738B2; ATE390440T1; WO1998001465A1; AUPO089396A0; EP0917535B1; US7026280B2

Description

Diese Erfindung betrifft neuroaktive Peptide und im Besonderen Peptide, weiche die Fähigkeit aufweisen, als Analoge von Angiotensin IV zu fungieren. Die Peptide der Erfindung binden mit hoher Affinität und Spezifität an eine Vielzahl von Stellen im zentralen Nervensystem und sind als Modulatoren von motorischen und kognitiven Funktionen sowie auch von neuronaler Entwicklung nützlich.
Stand der Technik
Das Renin-Angiotensin-System hat verschiedene Aufgaben bei der Regulation von Körperflüssigkeiten und dem Elektrolytgleichgewicht und bei der Steuerung des Blutdruckes. Diese Wirkungen werden in einer Vielzahl von Zielorganen eingesetzt, einschließlich des Herz-Kreislaufsystems, der Nebennieren, Nieren und des zentralen und peripheren Nervensystems, sowohl durch die zirkulierenden Hormone und die örtlich in den Geweben produzierten Hormone. Die meisten dieser Wirkungen werden durch das Oktapeptid Angiotensin II ausgeübt, obwohl das C-terminale Heptapeptid Angiotensin III auch etwas Wirksamkeit aufweist. Das Hexapeptid NH₂-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe-COOH, das dem 3–8-Fragment von Angiotensin II entspricht (d. h. den Aminosäuren 3–8) wird auch Angiotensin IV (Ang IV) genannt und von ihm wurde bis vor kurzem angenommen, dass es ein inaktives Abbauprodukt ohne jegliche biologische Aktivität ist.
Harding und Mitarbeiter haben jedoch einen früheren Bericht (Braszko et al., 1988) bestätigt, nachdem Ang IV Aktivität im zentralen Nervensystem aufweist und Lernen und Verhalten verändern kann (Wright et al, 1995). Außerdem hat Ang IV vasoaktive Wirkungen, und kann zerebrale Arterien erweitern (Habers et al, 1991) und die Durchblutung der Niere verstärken (Swanson et al, 1992). Das gemeinsam mit der Entdeckung von hoch spezifischen Hochaffinitätsstellen für die Ang IV-Bindung in Rinder-Nebennieren und anderen Geweben hat das Interesse an dem Hexapeptid wieder erwachen lassen und das Thema ist ausführlich besprochen worden (Wright et al, 1995).
Ang IV ist mit den Wirkungen des zentralen Nervensystems der Verstärkung des stereotypen Verhaltens (Braszko et al, 1988) und der Förderung des Gedächtnisabrufs in passiven Vermeidungsstudien ("avoidance studies") (Braszko et al, 1988; Wright et al, 1995) in Zusammenhang gebracht worden. Ang IV erweitert auch zerebrale Arterien (Haberl et al, 1991) und erhöht die Durchblutung der Nieren (Swanson et al, 1992).
Rezeptor-Autoradiographiestudien haben eine allgemein häufige, aber selektive und charakteristische Verteilung der Bindungsstellen für [¹²⁵I] Ang IV (bekannt als AT₄-Rezeptor) in den zentralen Nervensystemen von Meerschweinchen, Schafen und Affen gezeigt, in Bereichen, die mit cholinergischen Neuronen in Zusammenhang stehen, und in somatischen motorisch- und sensorisch-assoziierten Gebieten (Miller-Wing et al, 1993; Moeller et al, 1995; Moeller et al, 1996). Zusätzlich kommen die Ang IV-Bindungsstellen in den supraspinalen Komponenten des autonomen Nervensystems häufig vor und werden im Rückenmark in den sympathischen präganglionischen Neuronen, in den dorsalen Wurzelganglien und in Lamina II des dorsalen Horns und in den motorischen Neuronen des ventralen Horns gefunden (Moeller et al, 1995).
Die Verteilung der Ang IV-Bindungsstelle unterscheidet sich von der Lokalisation der Ang II-AT₁- oder -AT₂-Rezeptoren. Zusätzlich ist die Pharmakologie von jedem Rezeptor insofern unterschiedlich, als die Ang IV-Stelle eine niedrige bis sehr niedrige Affinität für [Sar¹Ile⁵]Ang II aufweist, dem nicht-Subtyp-selektiven Ang II-Antagonisten und Losartan (du Pont-Merk) und PD 123319 (Parke-Davis), den spezifischen AT₁- bzw. AT₂-Rezeptor-Antagonisten (Miller-Wing et al, 1993; Swanson et al, 1992; Hanesworth et al, 1993). Im Gegensatz dazu zeigen Ang II-Rezeptoren eine niedrige Affinität für die Ang IV-Bindungsstelle (Bennett und Snyder, 1976).
Die weite Verbreitung der Ang IV-Bindungsstelle in motorischen, sensorischen und cholinergischen Bereichen deutet auf wichtige Rollen für dieses Peptid im zentralen Nervensystem hin. Eine physiologische Wirksamkeit des Peptids in Neuronen ist jedoch klar zu definieren.
Zahlreiche Neurotransmitter und Neuropeptide sind mit der Regulation von neuronaler Entwicklung in Zusammenhang gebracht worden. Achetylcholin hemmt den Auswuchs von Neuriten aus Ziliarganglienzellen und sympathischen Neuronen von Hühnerembryonen, (Pugh und Berg, 1994; Small et al, 1995) und hippocampalen Rattenneuronen (Muttson, 1988). Umgekehrt stimuliert das vasoakive Darmpeptid die Verzweigung des oberen Halsganglions (Pincus et al, 1990) und Somatostatin erhöht das neuronale Sprossen von buccalen Ganglionneuronen von Helisoma (Bulloch, 1987).
Wir haben jetzt überraschenderweise herausgefunden, dass das Peptid LVV-Haemorphin-7, das von β-Globin stammt, als ein Antagonist des AT₄-Rezeptors wirkt und der endogene Ligand für die AT₄-Rezeptoren im Gehirn ist. Wir haben seine pharmakologische Aktivität charakterisiert. Das ermöglicht es, uns neue Agonisten und Antagonisten der Ang IV-Wirkung zu finden.
Zusammenfassung der Erfindung
Gemäß einem ersten Aspekt stellt die Erfindung die Verwendung eines neuroaktiven Peptids zur Verfügung, das mindestens eine biologische Aktivität von Angiotensin IV aufweist, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Modifizierung des Lernens, Verhaltensmodifizierung, vasoaktiven Wirkungen, Dilatation von Gehirnarterien, Erhöhung des renalen Blutflusses, Verstärkung des stereotypen Verhaltens, Förderung von Gedächtnisabruf, Neuritmusterbildung und Minderung der Wirkung von Rückenmarksverletzungen, und die Aminosäuresequenz: Leu-Val-Val-Tyr-Pro-Trp-Thr-Gln-Arg-Phe, (SEQ ID NO: 1), umfasst oder ein biologisch aktiven Analogs oder Fragments des Peptids für die Herstellung eines Arzneimittels zur Modulierung neuronaler Aktivität bei einem Säuger.
Es wird klar verstanden werden, dass die Sequenz der Erfindung durch konservative Aminosäuresubstitutionen, Insertionen, Deletionen oder Verlängerungen modifiziert werden kann, vorausgesetzt, dass die biologische Aktivität erhalten bleibt. Solche Varianten können zum Beispiel Sequenzen beinhalten, umfassend D-Aminosäuren, nicht natürlich vorkommende Aminosäuren, oder Aminosäureanaloge. Das Analog kann daher eine peptidmimetische Verbindung sein.
Vorzugsweise ist der Säuger ein Mensch.
Die neuroaktiven Peptide gemäß der Erfindung sind für die Behandlung einer Vielzahl an Zuständen geeignet, einschließlich, aber nicht beschränkt auf:

• Demenz, einschließlich Alzheimer-Krankheit
• Andere neurodegenerative Störungen, die cholinergische Bahnen, motorische Bahnen oder sensorische Bahnen betreffen, wie zum Beispiel Motoneuronerkrankung
• Periphere sensorische oder motorische Neuropathien
• Gehirn- oder Rückenmarksverletzungen aufgrund von Trauma, Hypoxie oder Gefäßkrankheit.

Die Erfindung betrifft ein nicht-Peptidanalog des Peptids der Erfindung. Dieses nicht-Peptidanalog soll so aufgefasst werden, dass es Modifikationen oder Substitutionen der Peptidstruktur enthält, die im Hinblick darauf entworfen wurden, um die Bioverfügbarkeit, die Stabilität im Stoffwechsel, die Halbwertszeit im Körper der Verbindung der Erfindung zu verbessern, oder die biologische Aktivität der Verbindung der Erfindung zu modifizieren. Solche nicht-Peptidanaloge sind im Fachgebiet bekannt, zum Beispiel Verbindungen, in welchen das Peptidrückgrat durch eine nicht-Peptidkette ersetzt ist, und sie werden oft als peptidmimetische Verbindungen bezeichnet. Alternativ kann in einer oder mehreren der Peptidverbindungen die Abfolge der Stickstoff- und Kohlenstoffatome umgekehrt sein, um eine Pseudo-Peptidbindung zu bilden. Eine oder mehrere der Aminosäurenseitenketten können durch eine analoge Struktur von größerer Stabilität ersetzt werden. Viele andere solcher Variationen werden einem Fachmann bewusst werden. Die einzige Voraussetzung ist, dass die gesamte 3-dimensionale Struktur ausreichend konserviert ist und dass die Fähigkeit, mit ausreichender Affinität an den AT₄-Rezeptor zu binden, erhalten bleibt. Unter Verwendung von modernen Verfahren der Peptidsynthese und der kombinatorischen Chemie ist es möglich, sehr große Mengen an Analogen innerhalb einer kurzen Zeit zu synthetisieren, und eine solche Synthese und Durchmusterung wird von Pharmafirmen routinemäßig durchgeführt.
Beträchtliche Information ist bezüglich der strukturellen Merkmale der Ang IV-Peptide vorhanden, die für die hohe Affinität notwendig sind, und diese Ergebnisse können als Richtlinien für die Modifikation der Peptide der Erfindung verwendet werden. Siehe zum Beispiel Wright et al, 1995.
Es wird für den Fachmann offensichtlich sein, dass die Aktivität der Verbindung der Erfindung durch die Modifizierung der Sequenz oder durch die Konstruktion eines nicht-Peptidanalogs sehr stark verändert werden kann. Es kann nicht nur eine Verbesserung in der Aktivität erhalten werden, es ist auch möglich, Verbindungen zu erhalten, die den AT₄-Rezeptor in einer solchen Weise binden, dass die Ang IV-Aktivität gehemmt ist. Solche hemmende Verbindungen können die Fähigkeit haben, der Aktivität von Ang IV entgegenzuwirken. Der Fachmann wird leicht im Stande sein, modifizierte Peptide und Peptidanaloge zu synthetisieren und zu testen, ob sie Aktivität als Ang IV-Agonisten oder -Antagonisten aufweisen, indem er im Fachgebiet bekannte Verfahren verwendet.
Die Beschreibung beschreibt ein Verfahren der Durchmusterung auf mutmaßliche Agonisten oder Antagonisten der Wirkung von LVV-Haemorphin-7 auf neuronale Aktivität, umfassend den Schritt des Testens der Fähigkeit der Verbindung, den Effekt von LVV-Haemorphin-7 auf eine biologische Aktivität zu stimulieren oder zu hemmen, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Modifizierung des Lernens, Verhaltensmodifizierung, vasoaktiven Wirkungen, Dilatation von Gehirnarterien, Erhöhung des renalen Blutflusses, Verstärkung des stereotypen Verhaltens, Förderung von Gedächtnisabruf, Neuritmusterbildung und Minderung der Wirkung von Rückenmarksverletzungen.
Genaue Beschreibung der Erfindung
Die Erfindung wird jetzt genau nur durch Bezugnahme auf die folgenden, nicht einschränkende Beispiele und die Figuren beschrieben werden, in welchen
1 Kompetitionskurven zeigt, die aus präfrontalen cortikalen Schnitten erhalten werden, inkubiert mit [¹²⁵I]Ang IV in der Anwesenheit von zunehmenden Konzentrationen der folgenden, nicht markierten Liganden:
Ang IV, ⎕ Ang II, ∎ Ang III, Δ Ang II (1–7), ⦁ Losartan und O PD 123319. Die Werte sind der Mittelwert von vier Abschnitten, jeder von zwei Tieren. B/Bo × 100 ausgedrückt als der Prozentsatz der vorhandenen besetzten Rezeptoren;
2 die Ergebnisse von Kompetitionsbindungsstudien zeigt, welche die Hemmung der [¹²⁵I]Ang IV-Bindung an Chorioallantoismembranen von E13-Hühnern mit unterschiedlichen Konzentrationen von nicht markierten Verbindungen zeigen: Ang IV, ♢ Nle^1–AIV, Δ CGP 42112, ☐ Ang II,
Nle¹-Y-I-Amid, ♦ WSU-4042, [Sar¹Ile⁸]Ang II, ⦁ PD 123319 und O Losartan. Die Werte werden als der Prozentsatz der Gesamtbindung ausgedrückt und werden aus zwei Experimenten zusammengefasst. B/Bo × 100 = % der vorhandenen besetzten Rezeptoren.
3 die Kompetitions-Bindungsstudien zusammenfasst, welche die Hemmung der ¹²⁵I[Sar¹Ile⁸]Ang II-Bindung an Chorioallantois-Membranen von E13-Hühnern mit unterschiedlichen Konzentrationen von nicht markierten Verbindungen zeigt;
∎ [Sar¹Ile⁸]Ang II, ⎕ Ang II, Δ CGP 42112, ♢ Nle^1–AIV,
Ang IV, O Losartan, ⦁ PD 123319, ♦ WSU-4042 und
Nle¹-Y-I-Amid. Die Werte werden als der Prozentsatz der Gesamtbindung ausgedrückt und werden aus zwei Experimenten zusammengefasst. B/Bo × 100 = % der vorhandenen besetzten Rezeptoren;
4 die Wirkung von Ang IV auf Neuriten-Auswuchs von sympathischen Neuronen von E11-Hühnern zeigt. Die Werte werden als ein Prozentsatz von Kontrollmengen ausgedrückt und werden als der Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwerts (SEM) dargestellt. Die Ergebnisse werden aus 3 Experimenten zusammengefasst, jedes mit mindestens 40 Neuritenmessungen. * zeigt einen signifikanten Unterschied von den Kontrollwerten unter Verwendung des Bonferroni-Tests an;
5 den Effekt von 10 nM Ang IV auf Neuriten-Auswuchs in der Anwesenheit von 1 μM Nle¹-Y-I-Amid, WSU-4042, Nle^1–AIV [Sar¹Ile⁸]Ang II, Losartan, PD 123319 und CGP 42112 zeigt. Die Werte werden als ein Prozentsatz von Kontrollmengen ausgedrückt und werden als die Mittelwerte ± SEM dargestellt. Die Ergebnisse werden aus 3 Experimenten zusammengefasst, jedes mit mindestens 40 Neuritenmessungen. * zeigt einen signifikanten Unterschied von den Kontrollwerten unter Verwendung des Bonferroni-Tests an;
6 den Effekt von 10 nM Ang II auf Neuriten-Auswuchs in der Anwesenheit von 1 μM Nle¹-Y-I-Amid, WSU-4042, Nle^1–AIV, [Sar¹Ile⁸]Ang II, Losartan, PD 123319 und CGP 42112 zeigt. Die Werte werden als ein Prozentsatz von Kontrollmengen ausgedrückt und werden als die Mittelwerte ± SEM dargestellt. Die Ergebnisse werden aus 3 Experimenten zusammengefasst, jedes mit mindesten 40 Neuritenmessungen. * zeigt einen signifikanten Unterschied von den Kontrollwerten unter Verwendung des Bonferroni-Tests an;
7 die Bindung von ¹²⁵I-Angiotensin IV an das Rückenmark von Schafen darstellt. Der Pfeil zeigt die verletzte Stelle im Rückenmark an;
8 die Ergebnisse der Kompetitionsbindungstudien zusammenfasst, die die Hemmung der [¹²⁵I]-LVV-Haemorphin-7-Bindung an cerebellare kortikale Schaf-Membranen mit unterschiedlichen Konzentrationen von nicht-markierten Verbindungen zeigten:
Ang IV, Δ LLV-Haemorphin-7, ∎ Ang III, ☐ Ang II, O PD 123319, • Losartan, * Naloxon und ∇ Haloperidol. Die Werte sind die Mittelwerte von drei Experimenten. B/Bo × 100 = % von vorhandenen besetzten Rezeptoren.
9 die Ergebnisse der Kompetitionsbindungsstudien zusammenfasst, die die Hemmung der [¹²⁵I]-Ang IV-Bindung an cerebellare kortikale Schaf-Membranen mit unterschiedlichen Konzentrationen von nicht-markierten Verbindungen zeigten: Ang IV, Δ LVV-Haemorphin-7, ∎ Ang III, ☐ Ang II, O PD 123319, ⦁ Losartan, * Naloxon und ∇ Haloperidol. Die Werte sind die Mittelwerte von drei Experimenten. B/Bo × 100 = % von vorhandenen besetzen Rezeptoren.
10 ein schematisches Diagramm ist, das die Position der Oligonucleotidsonden darstellt, die für die Clonierung und die PCR-Experimente verwendet wurden. (A) Schematisches Diagramm des β-Globin-Vorläufers, das die relevante Position und Richtung der verwendeten Oligonucleotide zeigt. Die schattierte Region stellt die LVV-Haemorphin-7-Sequenz dar, die nachstehend angegeben ist. (B) Sequenzen der Oligonucleotide H170 und H173 (SEQ ID NO: 2 bzw. 5), die in dieser Untersuchung verwendet wurden;
11 den Nachweis der β-Globin-mRNA durch RT-PCR und Southern-Blot-Verfahren in cerebellaren/m und cerebralen/m Schaf-Hirnrinden, -Herz und -Leber veranschaulicht. Molekulargewichtsmarker sind auf der linken Seite gezeigt;
12 die vollständige Nucleotidsequenz von Clon EX (SEQ ID NO: 6) zeigt; und
13 die Nucleotidsequenz (SEQ ID NO: 7) und die davon abgeleitete Aminosäuresequenz des Ratten-EX-Clons zeigt. Die Region des mutmaßlichen LVV-Haemorphin-7 ist fett gedruckt gezeigt.
14 die Effekte von LVV-Haemorphin-7 auf die Leistung von mit Scopolamin behandelten Ratten in einer passiven Vermeidungsaufgabe ("avoidance task") zusammenfasst.
15 die Wirkungen von LVV-Haemorphin-7 auf die Leistung von mit Scopolamin behandelten Ratten in Wasser-Labyrinth-Lernversuchen zusammenfasst.
Die nicht markierten Liganden Ang IV (Peninsula Laborstories, Kalifornien USA), Ang II und der Ang II-Antagonist [Sar¹Ile⁸]Ang II (Sigma, Missouri USA), der teilweise Ang II-Agonist CGP 42112 (Ciba-Geigy, Basel, Schweiz), der Ang II-AT₁-Antagonist, Losartan (Du Pont Merck Pharmaceutical Company, Delaware USA), der Ang II-AT₂-Antagonist, PD 123319 (Parke-Davis, Michigan USA-Ms. C.L. Germain) und die Ang IV-Analogen WSU 4042, Nle¹-Y-I-Amid und Nle¹-AIV (hergestellt, wie kürzlich von Sardinia et al, 1993 beschrieben) wurden mit Endkonzentration verwendet, die von 10^–9 bis 10^–4 M reichten.
Beispiel 1 Kartierung von Angiotensin-AT₄-Rezeptoren in Affenhirnen
Wir haben die Verteilung der Rezeptoren für Ang IV (AT₄-Rezeptoren) im Gehirn von Macaca fascicularis unter Verwendung von in vitro-Rezeptor-Autoradiographie gemessen, um festzustellen, ob die weit verbreitete und eindeutige Verteilung der Rezeptoren, die im Gehirn von Meerschweinchen festgestellt wurde, auch in Primaten festgestellt wird. Die Bindungsstellen wurden anfänglich pharmakologisch in Kompetitionsstudien auf präfrontalen kortikalen Gehirnschnitten charakterisiert. Diese Ergebnisse werden in 1 zusammengefasst. Ang IV, Ang III und Ang II haben um die [¹²⁵I]-Ang IV-Bindung mit IC₅₀ von 5 nM, 80 nM bzw. 730 nM kompetitiert, wohingegen Ang II (1–7) ein schwacher Kompetitor war (IC₅₀ von 24 mM). Der AT₁-Rezeptor-Antagonist Losartan (du Pont-Merck) und der AT₂-Rezeptor-Antagonist PD 123319 (Parke-Davis) waren sogar bei Konzentrationen von 10 mM inaktiv. Diese pharmakologischen Eigenschaften sind ähnlich jenen, die kürzlich für den AT₄-Rezeptor in adrenalen Rinder- und septalen Meerschweinchen-Membranen beschrieben wurden, was bestätigt, dass wir die Verteilung des gleichen Rezeptors kartiert haben.

Die Verteilung des AT₄-Rezeptors war insofern außergewöhnlich, als sich seine Verteilung durch mehrere neurale Systeme erstreckte. Das ist in Tabelle 1 zusammengefasst. Das auffälligste Ergebnis war die Lokalisierung von diesem Rezeptor in motorischen Kernen und motorisch-assoziierten Bereichen. Diese umfassten die Motoneuronen des Vorderhorns des Rückenmarks, alle motorischen Hirnnervenkerne, einschließlich des Oculomotoriuskerns, Trochleariskerns, Fazialiskerns und Hypoglossuskerns und den motorischen Nucleus thoracicus des Vagus. Die Rezeptoren waren auch in den Vestibulariskernen, den Nuclei reticulares und im Olivenhauptkern, der granulären Schicht des Cerebellums und den Betz-Zellen des motorischen Cortex vorhanden. Mäßige AT₄-Rezeptordichte wurde in allen cerebellaren Kernen, den ventralen Thalamuskernen und der Substantia nigra Pars compacta beobachtet, wobei im Nucleus caudatus und Putamen eine geringere Rezeptordichte beobachtet wurde. Die Lokalisierung des AT₄-Rezeptors auf allen Ebenen der motorische Hierarchie im zentralen Nervensystem deutet auf eine wichtige Rolle für die Bindungsstelle in der motorischen Aktivität hin. Tabelle 1 Lokalisation und Quantifizierung des AT₄-Rezeptors in dem Gehirn von Macaca fascicularis

Region	AT4-Rezeptor-Dichte ZpM/mm²⁺ (Mittelwert ± SA)
Nucleus caudatus	48 ± 2
Vertikales Glied des Diagonalbandes*	86 ± 3
Basalkern von Meynert*	81 ± 5
Granuläre Schicht des Gyrus dentatus	117 ± 11
CA1	45 ± 4
CA3	41 ± 3
Retrochiasmaler Nucleus supraopticus	93 ± 7
Ventrale posteriore Nuclei lateralis/medialis	35 ± 2
Roter Kern	44 ± 2
Oculomotorischer Kern	44 ± 1
Nucleus pontis	50 ± 2
Nucleus genicu latus lateralis	52 ± 2
Mo5*	84 ± 3
Fazialiskern*	90 ± 4
Hypoglossuskern*	93 ± 8
Olivenhauptkern	76 ± 10
Granuläre Schicht des Cerebellums	126 ± 10
Molekulare Schicht des Cerebellums	47 ± 6

Die Werte sind der Durchschnitt von vier Schnitten aus einem Tier und sind für die relativen Dichten der AT₄-Rezeptoren repräsentativ. * Die Werte werden aus dem gesamten Gebiet bestimmt und nicht aus einzelnen Zellkörpern, die höhere Bindung aufweisen +ZpM/mm²: engl. dpm/mm² für Zerfälle pro Minute/mm².
Zusätzlich zu den somatischen motorischen Kernen und den autonomen präganglionären motorischen Kernen, wurden häufig vorkommende AT4-Rezeptoren auch in anderen cholinergischen Systemen und in ihren Fortsätzen, einschließlich des Nucleus basalis von Meynert, des vertikalen Glieds des Diagonalbandes und des Hippocampus festgestellt. Abgesehen davon, dass Acetylcholin ein Neurotransmitter in Motoneuronen ist, wird es auch mit der Wahrnehmung in Zusammenhang gebracht, da anti-cholinergische Arzneistoffe Gedächtnisstörungen und Verwirrung auslösen; bei der Alzheimer-Krankheit findet neuronaler Verlust im cholinergisch reichen Basalnucleus von Meynert statt. Von Ang IV ist durch zwei unabhängige Studien gezeigt worden, dass es den Gedächtnisabruf in passiven und konditionierten Vermeidungstests ("avoidance tests") fördert (Braszko et al, 1988; Wright et al, 1993) und, wenn es intracerebroventrikulär verabreicht wird, induziert es die c-fos-Expression im Hippocampus (Roberts et al, 1995). Gemeinsam mit der Anwesenheit von hohen Dichten an AT₄-Rezeptoren in diesem Bereich deuten diese Beobachtungen darauf hin, dass Ang IV eine wichtige Rolle bei der Modulation der kognitiven Funktion spielt.
AT₄-Rezeptoren wurden auch in sensorischen Bereichen mit mäßigen Mengen im Trigeminusnucleus des Rückenmarks, Nucleus gracilis, Nucleus cuneatus und in den Nuclei ventrales posteriores thalami und im somatosensorischen Kortex beobachtet. Während die Rezeptordichte in sensorischen Neuronen niedrig war, wenn sie mit der verglichen wurde, die in motorischen und kognitiven Bereichen beobachtet wurde, ist der AT4-Rezeptor überall in den meisten sensorisch-assoziierten Gebieten gefunden worden, einschließlich der Lamina II des Rückenmarks, des Nucleus gracilis, des Nucleus cuneatus und des Trigeminaluskerns des Rückenmarks, der Nuclei ventrales posteriores thalami, des Nucleus geniculatus lateralis und des sensorischen Cortex, was auf eine wesentliche Beteiligung bei sensorischer Aktivität hinweist. Dieses Verteilungsmuster ist auch in Meerschweinchen- und Schafgehirnen beobachtet worden. Wie in Beispiel 2 gezeigt wird, wurden auch in dorsalen Wurzelganglien von Schafen AT₄-Rezeptoren häufig beobachtet.
Beispiel 2 Kartierung von Angiotensin-AT₄-Rezeptoren im Rückenmark von Schafen
Wir haben die Lokalisierung der AT₄-Rezeptoren auf das Rückenmark von Schafen ausgedehnt, um zu untersuchen, ob die ausgeprägte Anwesenheit von AT₄- Rezeptoren in den supraspinalen motorischen und sensorischen Regionen im Rückenmark bestehen bleibt.
Wenn die Bindungseigenschaften von [¹²⁵I]Ang IV im achten zervikalen Segment (C8) des Rückenmarks von Schafen beurteilt wurden, haben wir festgestellt, dass die Affinitäten des unterschiedlichen unmarkierten Liganden bei der Kompetition um die Bindung ähnlich jenen waren, die für das Affengehirn beobachtet wurden.
Im Rückenmark von Schafen wurden in der Lamina IX in den ventralen Hörnern von allen untersuchten Segmenten AT₄-Rezeptoren in hohen Dichten gefunden. Auf einem zellulären Niveau wurde festgestellt, dass die Bindung das Cytoplasma der lateralen und medialen motorischen Neuron und ihre Fortsätze überdeckte, aber im Zellkern war keine Bindung vorhanden. Während für die Ang IV-Bindungsstelle noch eine klar definierte Funktion bestimmt werden muss, ist die Assoziation mit der motorischen Aktivität im Lichte seiner reichlich vorhandenen Lokalisation in den Motoneuronen im Vorderhorn des Rückenmarks zusätzlich zu seiner ausgeprägten Anwesenheit in den supraspinalen motorischen Gebieten gefestigt.
Hohe Dichten an AT₄-Rezeptoren wurden auch an der lateralen Spitze der Lamina VII von allen Thoraxsegmenten und den Lumbalsegmenten L1 bis L4 gefunden, welche mit den sympathischen preganglionären Neuronen in der intermedioarterialen Zellsäule übereinstimmten. Die Bindung fehlte jedoch in L5 und L6 und den sakralen Segmenten S1 und S2.
In den Spinalganglien, die mit allen Rückenmarksegmenten assoziiert sind, wurden hohe Dichten an AT₄-Rezeptoren im Cytoplasma von kleinen und großen Zellkörpern der sensorischen Neuronen festgestellt, aber nicht in den Satellitenzellen und auch nicht im endoganglionären Bindegewebe. In den Laminae I und II, den terminalen Bereichen der sensorischen Afferenzen der Spinalganglien, wurde nur eine geringe Häufigkeit des Rezeptors in Lamina II festgestellt. Trotz der niedrigen Mengen an AT₄-Rezeptoren in Lamina II deuten ihre hohe Häufigkeit in den Spinalganglien und ihre einheitlichen, aber niedrigen Mengen in den meisten supraspinalen sensorischen Gebieten darauf hin, dass die AT₄-Rezeptoren in der Verarbeitung der sensorischen Information doch eine wichtige Rolle spielen könnten.
Niedrige Mengen von den AT₄-Rezeptoren wurden auch in den Blutgefäßen, die sich radial zur Piafläche ausbreiten, in den Blutgefäßen der vorderen und hinteren Fissuren und im Ependym des Zentralkanals gefunden. Von Ang IV ist berichtet worden, dass es Endothel-abhängige Erweiterung der Piaarteriolen von Kaninchen induziert und in Ratten kehrt Ang IV die Reduktion der akuten cerebralen Durchblutung nach experimenteller Subarachnoidalblutung um.
Unsere Lokalisationsstudien deuten darauf hin, dass sich AT₄-Rezeptoren von den bekannten Angiotensin Rezeptoren – den AT_1a-, AT_1b- und AT₂-Rezeptoren – in Bezug auf ihre pharmakologische Spezifität und ihr Verteilungsmuster im Gehirn und dem Rückenmark ziemlich unterscheiden. Darüber hinaus deutet das Verteilungsmuster der AT₄-Rezeptoren darauf hin, dass sie an der Funktion von Neuronen, die an motorischen Funktionen, sensorischen Funktionen und cholinergischen Systemen beteiligt sind, einschließlich der Wahrnehmung, beteiligt sein können.
Beispiel 3 Charakterisierung von Ang IV- und Ang II-Bindungsstellen in Hühnerembryonen
Um die Pharmakologie der AT₄- und Ang II-Rezeptoren von Hühnerembryonen zu charakterisieren, wurden Chorioallantoismembranen (CAM) aus Hühnern am Embryotag 13 (E13) verwendet. Die Membranen wurden entfernt und in Isopentan auf –40°C abgekühlt.
a) Charakterisierung der Ang IV-Bindungsstelle von Hühnerembryonen
CAM wurden in 30 ml eines hypotonischen Puffers (50 mM Tris, pH-Wert 7,4, 5 mM EDTA) homogenisiert und dann für 10 Minuten bei 500 g und 4°C zentrifugiert. Die Überstandsfraktion wurde entfernt und für 20 Minuten bei 40.000 g und 4°C zentrifugiert. Das resultierende Pellet wurde in 2 ml eines hypotonischen Puffers nochmals homogenisiert und das endgültige Volumen des Homogenisats wurde eingestellt, um eine Proteinkonzentration von 10 mg/ml zu ergeben, wie durch den Biorad-Proteintest bestimmt wurde. Der Bindungstest enthielt CAM (100 μg Protein), 0,14 μCi an [¹²⁵I]Ang IV (ungefähr 260 pM) und Kompetitions-Liganden in einem Gesamtvolumen von 270 μl in einem 50 mM Tris-Puffer, pH-Wert 7,4, der 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 100 μM Phenylmethylsulfonylfluorid, 20 μM Bestatin und 0,1% (Gew./Vol.) Rinderserumalbumin enthielt. Das Bindungssystem wurde bei 37°C für 2 Stunden inkubiert.
b) Charakterisierung der Ang II-Bindungsstelle von Hühnerembryonen
CAM wurden, wie vorstehend beschrieben, mit den folgenden Ausnahmen hergestellt. Der isotonische Puffer enthielt 50 mM Tris, pH-Wert 7,4 und 6,5 mM MgCl₂ und der hypotonische Puffer enthielt 50 mM Tris, pH-Wert 7,4, 6,5 mM MgCl₂, 125 mM NaCl, und 0,2% (Gew./Vol.) Rinderserumalbumin. Außerdem wurden die Peptidasehemmer Leupeptin, Lisinopril, Phosphoramidon, Plummer-Hemmstoff und Bestatin, jeweils bei einer Konzentration von 1 μM verwendet und 1 mM Benzamidin und 2,5 mM Phenanthrolin wurden zu beiden Puffern hinzugefügt.
In den Bindungs-Kompetitionsstudien bei E13-Hühner-CAM wurde die [¹²⁵I]Ang IV-Bindung stark durch Ang IV und Nle¹-AIV (IC₅₀ von 18 bzw. 43 nM) gehemmt, wohingegen WSU-4042, Nle¹-Y-I-Amid und Ang II schwächere Kompetitoren waren, mit IC₅₀ von 5, 2,2 bzw. 0,65 μM, und Losartan und PD 123319 waren bei Konzentrationen bis zu 10 μM inaktiv. [Sar¹Ile⁸]Ang II und CGP 42112 waren wirksam, wenn sie nur um 50% der Stellen kompetitierten und dann nur bei Konzentrationen von 10 bzw. 0,5 μM. Diese Ergebnisse werden in 2 zusammengefasst.
In den Studien der ¹²⁵I[Sar¹Ile⁸]Ang II-Bindung an CAM kompetierten Ang II, [Sar¹Ile⁸]Ang II und CGP 42112 um die Bindung mit IC₅₀ von 100, 13 bzw. 180 nM, wohingegen Ang IV, Nle¹-AIV und Losartan sehr schwache Kompetitoren waren (IC₅₀ von 50, 8 bzw. 100 μM). PD 123319, WSU-4042 und Nle¹-Y-I-Amid zeigten IC₅₀, die größer als 100 μM war. Diese Ergebnisse werden in 3 gezeigt.
Beispiel 4 Effekte von Ang IV auf Neuriten-Auswuchs
Die weite Verbreitung der AT₄-Rezeptoren in motorischen, sensorischen und cholinergischen Regionen deutet auf wichtige Rollen für dieses Peptid im zentralen Nervensystem hin. Eine physiologische Wirkung von Ang IV in Neuronen muss jedoch noch klar definiert werden. Zahlreiche Neurotransmitter und Neuropeptide sind mit der Regulation der neuronalen Entwicklung in Zusammenhang gebracht worden. Zum Beispiel hemmt Acetylcholin den Neuriten-Auswuchs von embryonalen ziliaren Hühner-Ganglienzellen, den symphatischen Neuronen und Hippocampus-Neuronen von Ratten. Umgekehrt stimuliert das vasoaktive Darmpeptid die Verzweigung des oberen Halsganglions und Somatostatin erhöht die neuronale Sprossung aus den buccalen Helisoma-Ganglionneuronen.
Wir bestimmten, ob Ang IV eine trophische Rolle im zentralen Nervensystem hat, indem wir seine Wirkungen auf den Neuriten-Auswuchs aus gezüchteten embryonalen sympathischen Hühnerneuronen untersuchten.
Sympathische Ganglien aus E11-Hühnern wurden unter Verwendung von Trypsin/Versen dissoziiert und wurden in Platten mit 24 Vertiefungen in DMEM und Ham-F12-Medium gezüchtet, das 1% (Vol./Vol) Insulin-Transferrin-Selenium-X-Wachstumsergänzungsmedium (Gibco BRL, Maryland USA), 100 mM Putrescin, 1,67 mg/ml Prostaglandin F2α, 6,67 ng/ml Progesteron und 5 ng/ml Nervenwachstumsfaktor (Sigma, Missouri USA) enthielt. Den Neuronen wurde gestattet, sich an den Vertiefungen anzulagern (ungefähr 2 Stunden), bevor ihnen eine 24-stündige Behandlung mit Peptiden und/oder ihren Antagonisten verabreicht wurde. Die verwendeten Peptide und Antagonisten wurden zu den Kulturen 0,5 Stunden vor der Ang IV- oder der Ang II-Zugabe hinzugefügt. Ang IV-Dosis-Wirkungskurven wurden über einen Konzentrationsbereich von 10^–11 bis 10^–5 durchgeführt. Die Kulturschalen wurden mit 0,1 mg/ml Polylysin beschichtet und dann erhielten sie drei Waschungen mit phosphatgepufferter Salzlösung (PBS), bevor sie mit 10 μg/ml Laminin beschichtet wurden. Die Vertiefungen wurden mit PBS gewaschen, bevor sie für die Kultur verwendet wurden.
Zum Abschluss des Experiments wurde das Kulturmedium von den Vertiefungen entfernt, die Neuronen wurden mit 2,5% Glutaraldehyd in PBS für 20 Minuten fixiert und unter dem Phasen-Kontrastmikroskop untersucht, das an eine MD30 Plus-Bildanalysesoftware (Adelaide, Australien) angeschlossen war. Die Länge der Neuriten (länger als 50 μm) von jedem untersuchten Neuron wurde gemessen. Ein Minimum von 40 Neuritenmessungen wurde pro Behandlungsgruppe durchgeführt und jede experimentelle Behandlung wurde zumindest in dreifacher Ausführung durchgeführt.
Zum Abschluss des Experiments wurde die Lebensfähigkeit der Zellen durch Ausschluss von 0,1% Anilin-Blau durchgeführt.
In Kulturen von embryonalen (E11) sympathischen Hühnerneuronen hemmte Ang IV den Neuriten-Auswuchs in einer Dosis-abhängigen Weise mit einem Schwellenwert bei 10^–11 M, halb-maximaler Hemmung bei 10^–10 und einem maximalen Effekt bei 10^–9 M. Zwischen 10^–9 bis 10^–5 war der Auswuchs maximal gehemmt (P < 0,05). Diese Ergebnisse werden in 4 gezeigt. Bei 10^–8 M Ang IV wurde die Hemmung des Neuriten-Auswuchses bei 1 μM der Ang IV-Analoge WSU-4042, Nle¹-V-I-Amid und Nle¹-AIV vollständig umgekehrt. Die Wirkungen der Analogen alleine waren statistisch nicht unterschiedlich von den Kontrollwerten. Im Gegensatz zu den Ang IV-Analogen hatten der Ang II-Antagonist [Sar¹Ile⁸] Ang II, die AT₁- und AT₂-Antagonisten Losartan und PD 123319 und der teilweise Ang II-Agonist CGP 42112 keine Wirkung auf die Ang IV-Antwort, wie in 5 gezeigt wird.
Bei 10^–8 M Ang II wurde der Neuriten-Auswuchs um 25% gehemmt, was hoch signifikant war. Die Ang IV-Analoge kehrten diesen Effekt vollständig um, während die Ang II-Antagonisten [Sar¹Ile⁸]Ang II, Losartan, PD 123319 und CGP 42112 nicht effektiv waren. Die wird in 6 dargestellt.
Diese Studien deuten darauf hin, dass die Hemmung des Neuriten-Auswuchses durch beide Peptide durch die AT₄-Rezeptoren vermittelt wird und unterstützen die Rolle für Angiotensin IV in der Neuritmusterbildung.
Beispiel 5 Effekte von Angiotensin IV auf Verletzungen des Rückenmarks
Astrocyten, positiv für gliales fibrilläres saures Protein (glial fibrillary acid Protein, GFAP), sind an der Musterbildung der Neuritbildung nach Verletzung des Rückenmarks beteiligt (Bovolenta et al, 1992). Durch Verletzung verursachte Plastizität stellt eine ähnliche Situation zu jener dar, die im sich entwickelnden Embryo beobachtet wird (Schwartz, 1992). Im Lichte unserer Erkenntnisse über die Fähigkeit von Rückenmarksgewebe, Ang IV zu binden (Beispiel 2), haben wir die Effekte von Rückenmarksverletzungen auf die Ang IV-Bindung getestet. Überraschenderweise haben wir eine deutliche Erhöhung der [¹²⁵I] Ang IV-Bindung in verletzten Rückenmarksabschnitten festgestellt. Das ist in 7 dargestellt.
Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass der AT₄-Rezeptor ein geeignetes Ziel für die Abschwächung der Effekte einer Rückenmarksverletzung sein könnte.
Beispiel 6 Reinigung von einem endogenen Gehirnpeptid, das an den AT₄-Rezeptor bindet
Die Mengen von Ang IV im Gehirn sind sehr niedrig bis nicht nachweisbar (DJ Campbell, persönliche Mitteilung). Die weit verbreitete und charakteristische Verteilung der AT₄-Rezeptoren im zentralen Nervensystem deutet darauf hin, dass es für diesen Rezeptor einen bis jetzt nicht identifizierten Peptidliganden geben könnte. Wir haben daher unter Verwendung von herkömmlichen proteinchemischen Reinigungstechniken gemeinsam mit einem AT₄-Rezeptortestsystem eine Suche nach einem solchen Liganden durchgeführt, um (eine) Substanz(en) in Extrakten von Schafhirn nachzuweisen und aufzuzeichnen, die in diesem System um die [¹²⁵I] Ang IV-Bindung kompetiert (kompetieren).
a) ¹²⁵AT₄-Rezeptorbindungstest
Die Bindung des ¹²⁵I-Ang IV an Nebennieren-Membranen von Rindern wurde als ein Testsystem verwendet, um auf AT₄-Rezeptorbindungsaktivität in cerebralen Cortexfraktionen des Schafs zu durchmustern. Rinder-Nebennieren, die aus dem Schlachthaus erhalten wurden, wurden in 1 mm × 1 mm-Blöcke geschnitten, in 3 ml eines hypotonischen Puffers homogenisiert (50 mM Tris, 5 mM EDTA, pH-Wert 7,4) und dann für 10 Minuten bei 500 g zentrifugiert. Der Überstand wurde entfernt und für 20 Minuten bei 40.000 g zentrifugiert und das daraus resultierende Pellet wurde nochmals in 2 ml eines hypotonischen Puffers homogenisiert. Die Bindungstestproben enthielten Rinder-Nebennieren (56 mg an Protein, wie bestimmt durch den Biorad-Proteintest), 0,14 μCi an [¹²⁵I]Ang IV (ungefähr 260 pM) und 10 μl der Testprobe in einem Gesamtvolumen von 270 μl in 50 mM Tris-Puffer, pH-Wert 7,4, der 150 mM Natriumchlorid, 5 mM EDTA, 100 μM Phenylmethylsulfonylfluorid, 20 μM Bestatin und 0,1% (Gew./Vol) Rinderserumalbumin enthielt. Die relative Potenz der Fraktionen in der Kompetition um die ¹²⁵I-Ang IV-Bindung wurde aus einer Standardkurve bestimmt, bei welcher bekannte Mengen an nicht markiertem Ang IV hinzugefügt wurden (10^–10 bis 10^–6 M). Die Fraktionen aus jedem Reinigungsschritt wurden auf ihre Fähigkeit hin überprüft, um die [¹²⁵I]Ang IV-Bindung zu kompetitieren, wobei jene, welche die höchste Aktivität zeigten, auch den nächsten Reinigungsschritt durchmachten.
b) Reinigungsvorgang
Hirncortex aus Schaf wurde in 2 M Essigsäure homogenisiert (2 ml/g Gewebe), zentrifugiert und der Überstand abgegossen. Eine vorläufigen Reinigung des Extrakts wurde unter Verwendung einer Säule von präparativem C18-Material (55–105 mm, Waters) durchgeführt. Der C18-Ausfluss wurde lyophilisiert, rekonstituiert und einer Reihe von chromatographischen Schritten unterzogen, in welchen die Fraktionen auf Ang IV-Verdrängungsaktivität getestet wurden. Die chromatographischen Schritte waren kurz gesagt: drei aufeinanderfolgende Umkehrphasen-HPLC-Schritte unter Verwendung von Säulen mit verschiedenen Porengrößen (Deltapak-C18, 300°A und Novapak-C18) sowie auch das Wechseln von Ionenpaarungsmitteln, Lösungsmitteln und Gradienten-Elutionsbedingungen; das wurde gefolgt durch einen Anionenaustausch, dann Kationenaustausch mit einer endgültigen Reinigung auf einer Microbor LC C8-Säule. Das gereinigte aktive Peptid wurde unter Verwendung eines Protein-Sequenziergeräts von Applied Biosystem, Model 470A mit einem online Analysiergerät, Modell 120A PTH, sequenziert.
Der Hirncortex des Schafes ergab 1,9 nMol AT₄-Rezeptorbindungsaktivität pro Gramm des Naßgewichts nach der ersten Deltapak-C18-Säule. Im Anschluss an die dritte Poly LC-Säule (55°C) eluierte die Ang IV-Aktivität gleichzeitig mit dem Haupt-UV-Absorptionspeak und die folgende Peptidsequenz wurde aus diesem Peak erhalten:
Eine Suche in den Proteindatenbankaufzeichnungen offenbarte, dass diese Sequenz der Aminosäuresequenz 32–41 der menschlichen β, δ-, γ- und ε-Globinketten entsprach und als LVV-Haemorphin-7 bekannt ist.
LVV-Haemorphin-7 ist ein 10 Aminosäuren langes Peptid, das im Gehirn, in der Hirnanhangdrüse, dem Hypothalamus und dem Knochenmark gefunden wird und das mit hoher Affinität an den Angiotensin-AT₄-Rezeptor bindet. Die Schaf-Peptidsequenz ist identisch zu den Aminosäuren 30–39 der Schaf-β_A-, -β_a-, -β_c- und -ε-Globinvorläufern (Garner und Lingrel, 1989; Saban und King, 1994) und diese Sequenz ist in vielen Arten konserviert, einschließlich des Menschen (siehe zum Beispiel Karelin et al, 1994). In Menschen gibt es 6 β-Globin-ähnliche Gene, ε, γ', γ^G, δ, β und ein Pseudogen ψβ, die eng zusammen auf dem Chromosom 11 liegen und alle die LVV-Haemorphin-7-Sequenz codieren (Karlsson und Nienhuis, 1985). Diese Sequenz ist auf keiner der α-Globin-Genfamilie vorhanden. LVV-Haemorphin-7 und manche kürzere Sequenzen innerhalb dieses Peptids haben Opioidwirkung und es scheint, dass die Sequenz VVYP für diese Aktivität benötigt wird (Karellin et al, 1994).
Beispiel 7 Eigenschaften von synthetischem LVV-Haemorphin-7
Ein Decapeptid mit der Sequenz, die vorstehend isoliert wurde, wurde unter Vertrag durch Chiron Mimotopes synthetisiert und seine biochemischen und pharmakologischen Eigenschaften wurden wie folgt charakterisiert:
a) HPLC
Ein einleitender Hochleistungsflüssigchromatographie(HPLC)-Lauf deutete darauf hin, dass das synthetische Peptid nicht gleichzeitig mit der Fraktion eluierte, die sequenziert wurde. Es schien, dass die Fraktion aufgrund einer längeren Lagerung bei 4°C abgebaut war. Massenspektrometrieanalyse wurde durchgeführt, um zu bestimmen, ob das der Fall war. Die aus der Massenspektrometrieanalyse erhaltenen Daten der beiden aktiven Peaks, die nach einer verlängerten Lagerung des ursprünglichen, gereinigten Materials erzeugt wurden, stimmten tatsächlich mit Abbau überein. Der früh eluierte Peak ergab eine Masse, die genau dem Verlust des Phenylalaninrests vom Carboxyterminus entsprach, wohingegen der zweite aktive Peak eine Masse ergab, die genau dem Verlust des amino-terminalen Leucin-Rests entsprach. Darüber hinaus deuteten diese Daten (vorausgesetzt, dass alle Daten eindeutig waren) stark darauf hin, dass das aktive Peptid nicht post-translationell entweder am Peptidkern oder am Amino- oder Carboxyterminus modifiziert wurde.
b) Liganden-Bindungsstudien
Die pharmakologischen Eigenschaften des Decapeptids LVV-Haemorphin-7 in der Kompetition um die Bindung von ¹²⁵I-Ang IV in Rinder-Nebennierenmembran und cerebellaren cortikalen Membranen aus Schafen wurden bestimmt. Sowohl LVV-Haemorphin-7 als auch Ang IV wurden unter Verwendung von Chloramin T radiojodiert und auf einer C18-Sep-pak-Säule unter Verwendung von 0,5% Trifluoressigsäure in einem 20–80% Methanolgradienten aufgetrennt.
Nebennierenmembranen aus Rindern oder cerebellare cortikale Membranen aus Schafen wurden in 30 ml eines hypotonischen Puffers (50 mM Tris, 5 mM EDTA, pH-Wert 7,4) homogenisiert und dann für 10 Minuten bei 500 g zentrifugiert. Der Überstand wurde entfernt und für 20 Minuten bei 40.000 g zentrifugiert und das daraus resultierende Pellet wurde nochmals in 2 ml hypotonischem Puffer homogenisiert. Die Bindungstests enthielten:
Rinder-Nebennieren (56 μg Protein) oder cerebellare Membranen aus dem Schaf (26 μg Protein), wie bestimmt durch den Biorad-Proteintest (Bradford, 1976); 0,14 μCi von [¹²⁵I]Ang IV (ungefähr 260 pM) oder 0,11 μCi von [¹²⁵I]LVV-Haemorphin-7 (ungefähr 200 pM) und
Kompetitionsligand,
in einem Gesamtvolumen von 270 μl in 50 mM Tris-Puffer, pH-Wert 7,4, der 150 mM Natriumchlorid, 5 mM EDTA, 100 μM Phenylmethylsulfonylfluorid, 20 μM Bestatin und 0,1% (Gew./Vol.) Rinderserumalbumin enthielt.
Der Test wurde bei 37°C für 2 Stunden inkubiert.
In den Nebennierenmembranen aus Rindern wurde eine Auswahl an Konzentrationen von nicht-markiertem LVV-Haemorphin-7 oder Ang IV zu dem Testsystem hinzugefügt, um die relativen Wirksamkeiten der beiden Peptide in diesem Radiorezeptor-Testsystem zu bestimmen. Sowohl Ang IV als auch LVV-Haemorphin-7 zeigten vergleichbare Affinitäten in der Kompetition um die ¹²⁵I-Ang IV-Bindung (ungefähr 1–5 nM), wobei Ang IV eine etwas höhere Affinität zeigte.
Für Kompetitionsstudien in cerebellaren cortikalen Membranen aus dem Schaf wurden Verdünnungen der nicht markierten Liganden LVV-Haemorphin-7, Ang IV, Ang II, Ang III und des nicht-spezifischen opioiden Antagonisten Naloxon, des Ang II-AT₁-Antagonisten Losartan, des Ang II-AT₂-Antagonisten PD 123319 und des sigma-Opioid- und Dopamin D2-Antagonisten Haloperidol bei Konzentrationen verwendet, die von 10^–13 bis 10^–4 M reichten. Die Quantifizierung der Rezeptorbindung wurde als der Mittelwert von zwei Experimenten berechnet.
In diesen Studien wurde um die ¹²⁵I-LVV-Haemorphin-7-Bindung an cerebellare cortikale Membranen von Schafen durch LVV-Haemorphin-7, Ang IV, Ang III und Ang II (IC₅₀ von 5,6 nM, mM, 77 nM bzw. 1,6 μM) kompetiert. PD 123319 war ein schwacher Kompetitor (IC₅₀ von 46 μM), wohingegen Losartan, Naloxon und Haloperidol ineffektiv waren (IC₅₀ größer als 100 mM). Diese Ergebnisse werden in 8 dargestellt. Auf ähnliche Weise wurde um die [¹²⁵I]Ang IV-Bindung an cerebellare Membranen durch Ang IV, LVV-Haemorphin-7, Ang III und Ang II mit IC₅₀ von 1,13 nM, 2 nM, 6,9 nM bzw. 2 μM kompetiert, wohingegen PD 123319, Losartan, Naloxon und Haloperidol bei 10 μM inaktiv waren. Diese Ergebnisse werden in 9 dargestellt.
c) Bindung von ¹²⁵I-LVV-Haemorphin-7 an Schafhirn
Schaf-Rautenhirn-Schnitte wurden verwendet, um die Verteilung von ¹²⁵I-LVV-Haemorphin-7-Bindung und AT₄-Rezeptorstellen zu vergleichen. Schnitte von 10 μm-Dicke wurden bei 22°C (30 Min.) äquilibriert und dann für 30 Minuten in einem isotonischen Puffer, der 50 mM Tris, 150 mM Natriumchlorid, 5 mM EDTA, 100 μM Phenylmethylsulfonylfluorid, 20 μM Bestatin und 0,1% Rinderserumalbumin, pH-Wert 7,4 enthielt, vor einer weiteren 2-stündigen Inkubation im gleichen Puffer, der 2,84 μCi [¹²⁵I]LVV-Haemorphin-7 oder [¹²⁵I]Ang IV (ungefähr 140 pM) enthielt, vorinkubiert. Die Radioliganden wurden durch entweder 1 μM nicht markiertem LVV-Haemorphin-7 oder Ang IV von ihrer Bindung verdrängt. Nach der Inkubation wurden die Schnitte drei 2-minütigen Waschungen in Puffer bei 4°C unterzogen und für 14 bis 28 Tage einem radioaktiven Film exponiert.
[¹²⁵I]LVV-Haemorphin-7 und [¹²⁵I]Ang IV zeigten ein identisches Bindungsmuster im Rautenhirn vom Schaf. Die Bindung wurde in den motorisch assoziierten Gebieten, der granulären Schicht des Cerebellums, dem Olivenhauptkern, dem Hypoglossuskern und lateralen nucleus reticulares, den autonomen Regionen, dem motorischen Nucleus thoracius des Vagus und dem Nucleus ambiguus, und den sensorischen Bereichen, dem externen Nucleus cuneatus und Trigeminusnucleus des Rückenmarks lokalisiert. Die beiden Radioliganden wurde durch eine 1 μM-Konzentration von entweder nicht markiertem Ang IV oder LVV-Haemorphin-7 von ihren Bindungsstellen verdrängt, was darauf hindeutet, dass nicht nur zwei Bindungsstellen in den gleichen Gehirnregionen verteilt sind, sondern dass auch zwei Radioliganden tatsächlich an die gleichen Stellen binden.
Beispiel 8 Isolierung von mutmaßichen LVV-Haemorphin-7-Vorläuferclonen
Es ist nicht bekannt, ob LVV-Haemorphin-7 im Gehirn synthetisiert wird oder ob es aus dem Abbau von Hämoglobin stammt. Die Demonstration der LVV-Haemorphin-7-Vorläufer–mRNA im Gehirn würde einen Beweis für das Erstere liefern. Mögliche Verfahren zur Demonstration, dass LVV-Haemorphin-7-Vorläufer-mRNA im Gehirn vorhanden ist, umfassen:

(a) eine Isolation von spezifischen cDNA-Clonen aus einer Hirn-cDNA-Bank;
(b) Nachweis der mRNA im Gehirn durch RT-PCR;
(c) Nachweis von LVV-Haemorphin-7-Vorläufer-mRNA durch in situ-Hybridisierungs-Histochemie; und
(d) Demonstration der mRNA in Hirn-spezifischen Zellkulturen.

Es wurde früher darüber berichtet, dass α- und β-Globin-mRNAs in Maushirn exprimiert werden, wie durch Northern-Analyse gezeigt wurde (Ohyagi, Y. et al, 1994).
Jeder dieser Ansätze hat bestimmte Vorteile. In situ-Hybridisierungs-Histochemie und Nachweis der mRNA in hirnspezifischen Zellkulturen würden den Beweis für die Synthese im Gehirn erbringen. Die Isolierung von Clonen und der Nachweis von mRNA durch reverse Transkription-Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR) würde die Anwesenheit von mRNA im Gehirn zeigen, aber die Kontamination durch Retikulocyten kann nicht ausgeschlossen werden. Die Isolation von cDNA-Clonen stellt jedoch beachtliche Informationen über die Struktur des Vorläufers bereit. Der Vorläufer von LVV-Haemorphin-7 kann ein Mitglied der β-Globin-Familie sein, z. B. β^A usw., oder ein alternativ gespleißtes Globin, oder er kann ein bis dahin unbekanntes nicht-Globin-Peptid darstellen.
Um potentielle Clone zu isolieren, die für den Vorläufer des LVV-Haemorphin-7-Peptids codieren, haben wir eine Rattenhirn-cDNA-Bank unter Verwendung eines Oligonucleotids durchmustert, das auf der LVV-Haemorphin-7-Sequenz basiert.
Entwurf des Oligonucleotids
Etliche Oligonucleotide sind, wie in 10 gezeigt, entworfen worden. Oligonucleotid H170 (SEQ ID NO: 2) wurde entworfen, um der Region des Schaf-β-Globingens zu entsprechen, das die LVV-Haemorphin-7-Sequenz enthält. Diese Sonde wurde für die Durchmusterung der Genbank und auch als das Sense-Oligonucleotid in der PCR verwendet. Das Oligonucleotid H173 (SEQ ID NO: 5) wurde als der Antisenseprimer für die Verwendung in der PCR entworfen. PCR mit H170/H173 überspannt das Intron 2 und wird ein 255 bp-Fragment mit cDNA und ein 1098 bp-Fragment mit genomischer DNA als Matrize erzeugen. Oligonucleotid H172 (SEQ ID NO: 4) kann als eine interne Sonde für H170/H173-PCR-Produkte verwendet werden. Die Oligonucleotide H172 und H173 (SEQ ID NO: 4, 5) sind die Antisensesonden, die dem Exon 2 und 3 des Schaf-β-Globingens entsprechen und werden für in situ-Hybridiserungs-Histochemie verwendet.
Der Nachweis von β-Globin-ähnlichen Sequenzen im Gehirn durch Polymerase-Kettenreaktion (PCR)
RNA wurde aus cerebellaren und cerebralen Cortizes, Herz und Leber vom Schaf isoliert. Die RNA (20 μg) wurde in einer 25 μl-Reaktion bei 42°C für 1 Stunde revers transkribiert, die 100 mM KCl, 50 mM Tris-HCl (pH-Wert 8,4), 6 mM MgCl₂, 10 mM Dithiothreit, 500 μM dNTPs (erogen), 12 μg/ml zufällige Hexamere (Boehringer Mannheim), 40 Einheiten RNasin (erogen) und reverse AMV-Transkriptase (Boehringer Mannheim, 25 Einheiten) enthielt. Ein Aliquot der reversen Transkriptionsreaktion (10%) wurde in der Polymerase-Kettenreaktion verwendet. Die für die Amplifikation der β-Globin-mRNA verwendeten Primer waren Sense-H170 und Antisense-H173 (siehe 10). Die PCR wurde in einer Reaktion durchgeführt, die 10 mM Tris-HCl (pH-Wert 8,3), 50 mM KCl, 400 μM dNTPs, Taq-Polymerase (Bresatec, 2,5 Einheiten), 3 μM MgCl₂ und jeden Primer zu 400 nM enthielt. Denaturierung, Anlagerung und Verlängerung wurden bei 94°C, 60°C und 72°C für jeweils 1 Minute für 40 Zyklen durchgeführt, gefolgt von einer endgültigen Verlängerung bei 72°C für 10 Minuten.
Die PCR-Produkte wurden auf einem Agarosegel aufgetrennt, auf Hybond N+ übertragen und eine Southern-Analyse wurde unter Verwendung eines internen Oligonucleotids (H172) durchgeführt, um zu bestätigen, dass die Produkte von Globin-Vorläufern stammten. Spezifische Banden der erwarteten Größe von 255 bp, wie gezeigt in 11, wurden in allen vier untersuchten Geweben nachgewiesen.
Durchmusterung der Ratten-cDNA-Bank auf β-Globin-ähnliche Sequenzen
Ein Oligonucleotid, das der Nucleotidsequenz der LVV-Haemorphin-7-Region des Schaf-β-Globins entsprach (H170), wurde verwendet, um eine Rattenhirn-cDNA-Bank (Stratagene Kat. Nr.: 936515, Sprague-Dawley, gesamtes Gehirn) zu durchsuchen. Ungefähr 8 × 10⁵ Clone wurden ausplattiert und Plaqueentnahmen unter Verwendung von Standardmethoden durchgeführt (z. B. Maniatis et al: Molecular Cloning). Die Filter wurden in Rapid-Hyb (Amersham) für 1 Stunde bei 42°C vorhybridisiert und dann wurde das am 5'-Ende markierte H170 für 2 Stunden hinzugefügt. Die Filter wurden dann dreimal bei 42°C in 2 × SSC/0,1% SDS gewaschen. Die Filter wurden für 4 Tage unter Verwendung eines Biomax-Films und eines Verstärkerschirms autoradiographiert. Insgesamt wurden 24 mutmaßliche Positive isoliert. Die Positiven wurden in PBS eluiert.
Die Positiven wurden dann weiter unter Verwendung von einem auf PCR basierenden Verfahren charakterisiert. PCR wurde unter Verwendung von Oligonucleotid H170 als dem 5'-Primer und H173 als dem 3'-Primer durchgeführt. Ein PCR-Produkt, das von H170/H173 stammt, wird ein Intron im Schaf-β-Globingen umspannen und wird ein 1098 bp langes Fragment ergeben.
Ein Aliquot des eluierten λ-Clons wurde für 5 Minuten gekocht und dann auf Eis abgekühlt. Das wurde als Matrizen-DNA in einer PCR-Reaktion verwendet, die 10 mM Tris-HCl (pH-Wert 8,3), 50 mM KCl, 400 μM dNTPs, Taq-Polymerase (Bresatec, 2,5 Einheiten), 3 μM MgCl₂ und jeden Primer bei 400 nM enthielt. Denaturierung, Anlagerung und Verlängerung wurden bei 94°C, 60°C und 72°C für jeweils 1 Minute für 30 Zyklen durchgeführt, gefolgt von einer endgültigen Verlängerung bei 72°C für 10 Minuten. Die PCR-Produkte wurden durch Elektrophorese auf einem 1,4% Agarosegel analysiert.
Die H170 positiven/PCR negativen Clone wurden für die weitere Charakterisierung gelagert. Es wird in Betracht gezogen, dass sie entweder nicht-Globin-Vorläufer, alternativ gespleißte Vorläufer oder Fragmente von Globinclonen darstellen.
Sequenzierung der Ratten-β-Globin-Clone
Die 6 Positiven, die durch PCR ausgewählt wurden, wurden plaquegereinigt und das Plasmid wurde gemäß den Anweisungen des Herstellers herausgeschnitten unterzogen. Die Größen der Insertionen wurden durch getrennte Restriktionskartierung mit den Enzymen EcoRI und PvuII bestimmt. Die Clone EX, FX, LX, RX und TX enthalten Insertionen von ungefähr 500 bp. Der Clon DX war der längste und enthielt eine Insertion von ungefähr 2500 bp. Die Southern-Analyse der Clone unter Verwendung eines internen Oligonucleotids (H172) bestätigte, dass diese Clone von Globin-Vorläufern stammten.
Dieses Plasmid wurden unter Verwendung des Pharmacia -T7-Sequenzierungskits sequenziert. Die Sequenzierung der Clone EX, FX und LX unter Verwendung der universellen Primer zeigte eine Sequenzhomologie zu der nichttranslatierten 3'-Region des β-Globins. Die Clone RX und TX, wenn sie mit dem Universalprimer sequenziert wurden, und Clon DX, wenn er mit dem reversen Primer sequenziert wurde, zeigten eine Sequenzhomologie zum 5'-Ende des β-Globingens einschließlich des Intitiationscodons ATG.
Clon DX wurde einer verschachtelten Deletionsanalyse unterzogen, um mehr Matrizen für die Sequenzierung zu erzeugen. Dieser Clon enthielt die β-Globin-Sequenz und ungefähr 1,8 kb der Sequenz, die nicht homolog zum Globincluster war, und könnte das Ergebnis von zwei Insertionen in dem einen Clon sein.
Die vollständige Sequenzierung des Clons EX zeigte, dass der Clon identisch zum Ratten-β^A-Globin (Genbank-Zugangsnummer: X16417) war, wie es in 12 gezeigt wird. 13 zeigt die Nucleotidsequenz und die davon abgeleitete Aminosäuresequenz des Clons EX, wobei die mutmaßliche LVV-Haemorphin-7-Region angezeigt wird.
Beispiel 9 In situ-Hybridisierungs-Histochemie
Die Verteilung der mRNA, welche das LVV-Haemorphin-7 und sein Vorläuferpeptid codiert, wird unter Verwendung einer Reihe an Oligonucleotiden für die unterschiedlichen Regionen des β-Globingens untersucht, einschließlich des C-Terminus von Exon 2 (H172 von 13) und der N-terminalen Regionen von Exon 3 (H173). Die Antisense (ursprünglich H172, H173)-Oligonucleotide wurden am 3'-Ende mit ³⁵S-dATP unter Verwendung von terminaler d-Transferase markiert und auf einer Nensorbsäule gereinigt. Schnitte vom Schafhirn wurden dann mit 7,5 × 10⁵ ZpM an markierter Sonde in einem Gesamtvolumen von 75 μl von 50% Formamid, 4 × SSC, 1 × Denhardt-Lösung, 2% Sarcosyl, 20 mM Na₂PO₄-Puffer (pH-Wert 7), 10% Dextransulfat, 50 μg/ml Heringssperma-DNA und 0,2 mM Dithiothreit hybridisiert. Nach einer 16-stündigen Hybridisierungsdauer wurden die Schnitte viermal in 1 × SSC gewaschen, in destilliertem Wasser gespült und durch zunehmendes Ethanol dehydratisiert und einem Hyperfilm β-max exponiert. Vorläufige Untersuchungen unter Verwendung der Oligonucleotide H172 und H173 wiesen β-Globin-mRNA im Colliculus inferior und dem Kern des Trigeminus des Rückenmarks nach. Weitere in situ-Hybridisierungs-Histochemiestudien umfassen die Verwendung von zusätzlichen synthetischen Antisense- und Sense-Oligonucleotiden aus unterschiedlichen Regionen der β-Globin-Sequenz, um unseren Befund von β-Globin-mRNA in Hirnkernen zu bestätigen. Die Verteilung der β-Globin-mRNA wird dann mit unserer autoradiographischen Lokalisierung der AT₄-Rezeptoren verglichen, um die Rollen dieses neuen Peptidsystems weiter zu erleuchten.
Beispiel 10 Radioimmuntest und immunhistochemischer Nachweis von LVV-Haemorphin-7
Zwei Schafe wurden mit der LVV-Haemorphin-7-Sequenz immunisiert, die mit dem Diphtherietoxin konjugiert war, und sowohl Antiseren als auch affinitätsgereinigte Antiseren mit angemessenem Titer, um Radioimmuntests für LVV-Haemorphin-7 zu erstellen, wurden erhalten. Der Radioimmuntest, der dem herkömmlichen Typ entspricht, wird verwendet, um die Konzentration des LVV-Haemorphin-7 in unterschiedlichen Geweben oder in spezifischen Regionen innerhalb eines Gewebes zu bestimmen, um weitere Information über andere mögliche physiologische Wirkungen des Dekapeptids für uns bereitzustellen.
Die Antiseren werden auch immunhistochemisch verwendet, um die Gewebeverteilung von LVV-Haemorphin-7 zu bestimmen, insbesondere im Gehirn. Meerschweinchen werden intrakardial mit 4% Paraformaldehyd in Phosphatgepufferter Salzlösung perfundiert, die Gewebe herausseziert und über Nacht in 20% Saccharoselösung gelegt. Die Gewebe werden dann eingefroren, 5–10 Mikron-Schnitte geschnitten und endogene Peroxidase wird durch eine 30-minütige Inkubation in 0,5% Wasserstoffperoxid in Methanol blockiert, bevor über Nacht mit dem primären Antikörper in Phosphat-gepufferter Salzlösung eine Inkubation erfolgt, die 3% normales Ziegenserum enthält. Nach einigen Waschungen in Phosphatgepufferter Salzlösung werden die Schnitte mit dem sekundären anti-Schaf-Antikörper inkubiert und unter Verwendung des Streptavidin-Biotin/Meerrettichperoxidase-Komplexsystem nachgewiesen (Vectastain). Der Nachweis von LVV-Haemorphin-7 in Neuronen stellt einen weiteren Beweis bereit, dass das Decapeptid innerhalb der Neuronen synthetisiert wird und dadurch als ein Neuropeptid wirken kann, nachdem wir schon gezeigt haben, dass sein Rezeptor in Neuronen vorkommt. Immunhistochemie wird auch auf der elektronenmikroskopischen Ebene durchgeführt, um die subzelluläre Verteilung des Peptids zu bestimmen, insbesondere ob es in intrazellulären Speicherkörperchen vorkommt.
Der Radioimmuntest für LVV-Haemorphin-7 wird auch eingesetzt, um die Absonderung des Peptids aus neuralem Gewebe zu untersuchen. Schnitte, die aus Hirnregionen erzeugt wurden, von welchen festgestellt wurde, dass sie viel LVV-Haemorphin-7-Immunreaktivität aufweisen, werden in Krebs-Ringer-Bicarbonatpuffer bei 37°C inkubiert und die Wirkungen der Depolarisierung durch ein Medium mit hohem K⁺-Gehalt und verschiedene die Sekretion induzierende Substanzen werden bewertet, um zu überprüfen, ob das Peptid aus Neuronen ausgeschieden wird. Ähnliche Experimente werden auf gezüchteten neuronalen Zelllinien durchgeführt, von denen festgestellt wurde, dass sie das Peptid enthalten. Radioimmuntests von Körperflüssigkeiten einschließlich Plasma und Rückenmarksflüssigkeit werden verwendet, um die Mengen des Peptids in diesen Flüssigkeiten unter normalen und pathologischen Bedingungen zu bestimmen.
Zusätzlich wird die subzelluläre Verteilung des Peptids durch einen Radioimmuntest von subzellulären Fraktionen aus Nervengeweben, einschließlich Synaptosomen, bewertet, um zu bestimmen, ob das Peptid in subzellulären Körnchen gelagert wird, wie es bei anderen abgesonderten Neuropeptiden vorkommt.
Beispiel 11 Wirkung von LVV-Haemorphin-7 in passiven Vermeidungs-Konditionierungsversuchen
Von Angiotensin IV ist gezeigt worden, dass es den Gedächtniserhalt und Gedächtnisabruf in passiven Vermeidungsaufgaben verbessert (Braszko et al, 1988, Wright et al, 1993), ein Effekt, der durch den AT₄-Rezeptor vermittelt wird. Scopolamin, ein muscarinischer Rezeptorantagonist, ist verwendet worden, um Amnesie zu induzieren. Es wurde berichtet, dass ein stabileres Analog von Angiotensin IV, WSU 2088, die Lernstörung in einer passiven Vermeidungsaufgabe, die durch Scopolamin induziert wird, umkehrte. Die Effekte von LVV-Haemorphin-7 auf die konditionierten passiven Vermeidungsaufgaben in unbehandelten und mit Scopolamin-behandelten Ratten wurden getestet.
Ratten wurden chirurgisch intracerebroventrikuläre Kanülen implantiert und sie wurden jeden Tag behandelt. Am Konditionierungstag wurde jedes Tier an den dunklen Bereich eines passiven Vermeidungs-Konditionierungsapparates für 5 Minuten mit geschlosser Guillotinentüre gewöhnt. Das Tier wurde dann in seinen Heimkäfig für 5 Minuten zurückgeben und dann in den hellen Bereich mit der geöffneten Guillotinentüre gegeben. Die Latenz, den dunklen Bereich mit allen vier Füßen zu betreten, wurde in Sekunden gemessen. Diese Versuche wurden mit 5 Minuten im Heimkäfig zwischen den Versuchen wiederholt, bis die Ratte die dunkle Seite innerhalb von 20 Sekunden betrat. Vor dem letzten Versuch am Konditionierungstag wurden die Ratten wahllos in vier Gruppen aufgeteilt: (a) Salzlösung, gefolgt von Salzlösung, (b) Salzlösung, gefolgt von 1.0 nMol LVV-Haemorphin-7, in (c) 70 nMol Scopolamin, gefolgt von Salzlösung (d) 70 nMol Scopolamin, gefolgt von 1.0 nMol LVV-Haemorphin-7, wobei alles in einem Volumen von 2,5 μl intracerebroventrikulär 30 Minuten bzw. 5 Minuten vor dem endgültigen Versuch verabreicht wurde. Beim letzten Versuch war die Guillotinentüre geschlossen und die Tiere erhielten für 1,5 Sekunden einen Schock auf niedriger Stufe (0,2 mA) über den Gitterboden. Die Tiere wurden dann für 24 Stunden in ihre Heimkäfige zurückgegeben, bevor sie täglich für die nächsten vier Tage getestet wurden, und die Latenzperioden bis zum Wiedereintreten in die dunklen Bereiche wurden gemessen. Die Ergebnisse werden in 14 gezeigt.
In diesem passiven Vermeidungsparadigma zeigten die Kontrolltiere, welche die Konditionierung erfolgreich erhielten, hohe Latenzzeiten beim Eintreten in den dunklen Bereich, wohingegen die Ratten, die mit Scopolamin behandelt waren, Lern- und Gedächtnisdefizite zeigten, wie durch viel geringere Latenzzeiten beim Eintreten in den dunklen Bereich gezeigt wurde. Die durchschnittlichen Latenzzeiten bis zum Eintreten in den dunklen Bereich von Ratten, die LVV-Haemorphin-7 nach Scopolamin erhielten, waren nicht signifikant unterschiedlich von jenen der Kontrollratten, was darauf hindeutet, dass in diesen Ratten LVV-Haemorphin-7 die durch Scopolamin induzierte Amnesie vollständig umkehrte. Die Ratten, die LVV-Haemorphin-7 alleine erhielten, schnitten jedoch schlechter ab als die mit Scopolamin behandelten Ratten.
Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass LVV-Haemorphin-7 der durch die Scopolamin induzierten Gedächtnisstörung erfolgreich entgegenwirkt. Die Verabreichung des Peptids alleine war für das Lernen jedoch schädlich, was auf die Überstimmulierung des neuronalen Systems aufgrund der hohen verwendeten Dosis zurückzuführen sein kann.
Effektive Dosierungen von LVV-Haemorphin-7 werden durch das Durchführen von Dosis-Wirkungsstudien mit LVV-Haemorphin-7 durchgeführt und das Beobachten der Effekte auf das Lernen einer passiven Vermeidungsaufgabe in den Tieren bestimmt, einschließlich jener mit einer durch Scopolamin induzierten Amnesie. Ähnliche Studien werden auch verwendet, um zu bestimmen, ob die durch LVV-Haemorphin-7 verursachte Gedächtnisstörung auf übermäßig hohe Dosierungen des Peptids zurückzuführen ist.
Beispiel 12 Wirkung von LVV-Haemorphin-7 in Wasser-Labyrinth-Lernversuchen
Das runde Wasserlabyrinth (Morris-Wasserlabyrinth) besteht aus einem runden Tank, der Wasser enthält, das trüb gemacht wurde, mit einer unter der Oberfläche des Wassers versteckten Plattform. Scopolamin blockiert die von Versuch zu Versuch abnehmende Latenzzeit dieser Aufgabe und seine Wirkung scheint von der Beeinträchtigung des Kurzzeitgedächtnisses abzuhängen. Die Wirkung von LVV-Haemorphin-7 auf die durch Scopolamin induzierte Amnesie in dieser Aufgabe wurde untersucht.
Den Ratten wurden chirurgisch intracerebroventrikuläre Kanülen eingepflanzt und sie wurden täglich behandelt. Am Tag des Versuchs wurden die Ratten von unterschiedlichen Ausgangspositionen in das Wasserlabyrinth eingeführt, die von der Fluchtplattform gleich weit entfernt waren. Die Zeit, die jede Ratte gebraucht hat, um die Plattform zu erreichen, wurde aufgezeichnet. Es gab vier aufeinanderfolgende Versuche für jedes Tier an einem Tag, mit einer 60 Sekunden-Rastdauer zwischen den Versuchen. Die durchschnittliche Latenzdauer, bevor das Tier die Plattform erreichte, wurde aufgezeichnet und wird in 15 gezeigt. An den Tagen 1 und 2 des Versuches (nicht-räumlich) hat keines der Tiere eine Arzneistoffbehandlung erhalten. Obwohl die Scopolamingruppe eine erhöhte Latenzzeit am 1. Tag zeigte, war die Latenzzeit am 2. Tag auf die Kontrollhöhe abgefallen. Die Ratten wurden dann wahllos in 3 Gruppen aufgeteilt:

(a) Salzlösungskontrolle,
(b) 70 nMol Scopolamin in 2,5 μl, und
(c) 70 nMol Scopolamin, gefolgt von 1,0 nMol LVV-Haemorphin-7, und wurden an

5 Tagen Untersuchungen unterzogen. Nach der intracerebroventriculären Behandlung mit Scopolamin 30 Minuten vor der Untersuchung zeigten die Ratten signifikant erhöhte Latenzzeiten beim Finden der Plattform, was Lerndefizite demonstrierte. In Ratten, die 25 Minuten nach Scopolamin mit LVV-Haemorphin-7 behandelt wurden, wurde die durch Scopolamin induzierte Latenz beim Finden der Plattform vollständig umgekehrt und diese Ratten waren von der Kontrollgruppe nicht zu unterscheiden. Die Absetzung der Behandlung am 8. Tag brachte die Latenz der mit Scopolamin behandelten Gruppe zurück zu Kontrollmengen, was darauf hindeutet, dass die durch Scopolamin induzierte Amnesie reversibel ist.
Beispiel 13 Wirkung von LVV-Haemorphin-7 auf Acetylcholin- Freisetzung im Ratten-Hippocampus
Von Acetylcholin wird angenommen, dass es der Haupttransmitter ist, der an der Verarbeitung der kognitiven Funktion beteiligt ist, da anti-cholinergische Arzneistoffe das Gedächtnisdefizit und die Verwirrung induzieren. Bei der Alzheimer-Erkrankung ist von neuronalem Verlust in cholinergisch reichen Bereichen berichtet worden, insbesondere im septohippocampalen Weg. Angiotensin AT4-Rezeptoren wurden in großer Häufigkeit im basalen Nucleus von Meynert, in den CA2 und im Gyrus dentatus des Hippocampus und in somatischen und autonomen präganglionären motorischen Neuronen des Affenhirns festgestellt. Dieses Muster der Rezeptorverteilung ähnelt dem der cholinergischen Neuronen und deutet darauf hin, dass die AT₄-Rezeptoren mit cholingergischen Wegen zentral verbunden sein können. Darüber hinaus kann LVV-Haemorphin-7, wie in Beispiel 12 gezeigt wird, das Lerndefizit, das durch Scopolamin induziert wurde (einem muscarinischen Rezeptor-Antagonisten), umkehren. Wir postulieren daher, dass LVV-Haemorphin-7 die Freisetzung von Acetylcholin aus den septohippocampalen Neuronen über die AT₄-Rezeptoren freisetzen kann.
Ratten werden mit Natrium-Pentobarbiton anästhetisiert und stereotaxisch mit einer intracerebralen Führungskanüle implantiert, entweder im dorsalen Hippocampus (Koordinaten 3,8 mm caudal bis bregma, 2,5 mm lateral bis zur Mittellinie und 3,0 mm ventral zur Oberfläche des Schädels) oder im ventralen Hippocampus (Koordinaten 5,3 mm caudal bis bregma, 5,4 mm lateral bis zur Mittellinie und 6,5 mm ventral bis zur Oberfläche des Schädels). Die Führungskanülen werden mit Zahnzement fixiert, der an drei Schrauben im Schädel befestigt wird. Plazebosonden werden dann in die Führungskanülen inseriert, um eine Blockade der Kanülen zu verhindern. Die Ratten können sich für 5–7 Tage erholen. Am Tag des Experiments wird eine Mikrodialysesonde mit einer 3 mm-Dialysemembran durch die Führungskanüle inseriert und mit künstlicher Zerebrospinalflüssigkeit (148 mM NaCl, 3 mM KCl, 1,4 mM CaCl, 0,8 mM MgCl, 1,3 mM NaH₂PO₄, 0,2 mM Na₂HPO₄, pH-Wert 7,4) bei einer Durchflussrate von 2,0 μl/min perfundiert. Neostigmin (1,0 μM) wird zur künstlichen Zerebrospinalflüssigkeit hinzugefügt, um die Wiederfindung von Acetylcholin zu erleichtern. Vier 20-Minuten Grundlinienproben wurden 1 Stunde nach dem Einführen der Sonde gesammelt, gefolgt durch vier 20-Minuten-Proben während der Dauer des Experiments, wenn LVV-Haemorphin-7 (1 μMol aufgelöst in künstlicher Zerebrospinalflüssigkeit und 1 μM Neostigmin) durch die Sonde perfundiert wird. Während der Erholungsphase wird die Peptidperfusion abgebrochen und vier 20-Minuten-Proben werden gesammelt.
Acetylcholin wird im Dialysat durch HPLC mit elektrochemischem Nachweis gemessen. Acetylcholin und Cholin werden auf einer auf Polymer basierenden analytischen 10-cm-Säule aufgetrennt und dann in Wasserstoffperoxid und Betain durch einen immobilisierten Enzymreaktor (Acetylcholinesterase und Cholinoxidase) umgewandelt, der an die analytische Säule gekoppelt ist. Die mobile Phase besteht aus 35 mM Natriumphosphat bei pH-Wert 8,5, ergänzt mit dem antibakteriellen Reagens Kathoon CG.
Beispiel 14 Nachweis der β-Globinsequenzen in unterschiedlichen neuronalen Zelllinien durch RT-PCR
Gesamt-RNA wird aus den folgenden Zelllinien isoliert:

(a) NG 108-Ratten-Gliom-Neuroblastom-Hybrid,
(b) menschliches SKNMC-Neuroblastom, und
(c) PC 12W-Ratten-Pheochromcytom. Die gesamte RNA wird wie folgt hergestellt: 10⁷ Zellen werden in 4 ml 4 M Guanidinthiocyanat, 25 mM Natriumcitrat und 0,05% Natriumdodecylsulfat homogenisiert, gefolgt durch schrittweises Hinzufügen von 0,4 ml an 2 M Natriumacetat, pH-Wert 4,0, 4 ml mit Wasser gesättigten Phenol und 0,8 ml Chloroform-Isoamylalkohol. Das Homogenisat wird gemischt und auf Eis für 15 Minuten abgekühlt, gefolgt durch Zentrifugation bei 2000 g für 15 Minuten. Die wässrige Phase wird entfernt und zwei Phenol-Chloroform-Extraktionen unterzogen, bevor die RNA durch das Hinzufügen von Isopropanol ausgefällt wird.

Die mRNAs werden dann einer RT-PCR unterzogen. cDNA wird aus ungefähr 20 μg der Gesamt-RNA unter Verwendung von reverser Transkriptase und wahllosen Hexameren synthetisiert. 10% des cDNA-Produktes wurden mit PCR durch 40 Zyklen amplifiziert, wobei jeder Zyklus aus der Denaturierung bei 94°C für Minute, der Anlagerung der Primer bei 60°C für 1 Minute und der Primerverlängerung bei 72°C für 1 Minute bestand, gefolgt durch eine endgültige 10-minütige Inkubation bei 72°C. Die verwendeten Primer waren
welche mit hoher Homologie den β-, δ-, ε-Globinketten vom Schaf entsprachen und von einem 255-bp-cDNA-Fragment flankiert wurden. Der Sense-Primer umspannt die Nucleotidsequenz, welche für LVV-Haemorphin-7 codiert, und der Antisense-Primer umspannt das zweite Intron des Globingens, um zu ermöglichen, dass die cDNA von der kontaminierenden genomischen DNA unterschieden werden kann. Die PCR-Produkte werden durch das Southern-Blot-Verfahren in 0,4 M NaOH auf eine Hybond N+-Membran übertragen. Die Membran wird bei 42°C in 5 × SSC, 5 × Denhardt-Lösung und 0,5% Natriumdodecylsulfat mit einem ³²P-endmarkierten Oligonucleotid
hybridisiert, das intern zu den für die PCR verwendeten Primern liegt und an die β-, δ-, ε-Globinketten bindet. Nach 12 Stunden der Hybridiserung wird der Filter bei 42°C in einem Puffer mit einer endgültigen Stringenz von 0,5 × SSC und 0,1% Natriumdodecylsulfat gewaschen.
Wir haben die Verteilung der AT₄-Rezeptoren im Gehirn von Macaca fascicularis und im Rückenmark vom Schaf kartiert. Der Rezeptor hat eine markante und einzigartige Verteilung, einschließlich der motorisch- und sensorisch-assoziierten Regionen und Wege und cholinergischen Zellkörper einschließlich aller motorischen Nuclei im Hirnstamm und Rückenmark. Wir haben gezeigt, dass Ang IV Neuriten-Auswuchs in gezüchteten embryonalen Hühnerneuronen hemmt und dass dieses Peptid daher eine Rolle beim Wachstum und der Entwicklung des zentralen und peripheren Nervensystems haben kann.
Wir haben ein endogenes Hirnpeptid gereinigt, das an den AT₄-Rezeptor mit hoher Affinität bindet. Dieses Decapeptid ist 100% identisch mit der internen Aminosäuresequenz 30–39 des β-Globins vom Schaf. Die Anwesenheit von dieser β-Globin-ählichen Sequenz wurde im Schafhirn und in anderen Geweben unter Verwendung von PCR demonstriert. Die Durchmusterung einer Rattenhirn cDNA-Bank führte zur Isolierung eines Clons, dessen Sequenz identisch zu jener des Ratten-β^A-Globins ist.
Wir haben die Anwesenheit der β-Globin-mRNA im Gehirngewebe gezeigt und einen β-Globin-cDNA-Clon aus einer Ratten-Hirnbank isoliert. Diese Daten deuten darauf hin, dass LVV-Haemorphin-7 aus den β-Globin-Vorläufern stammt, die im Gehirn synthetisiert werden, obwohl eine Kontamination durch Retikulocyten nicht ausgeschlossen werden kann. Alle cDNA-Clone, die sequenziert worden sind, entsprechen der Sequenz, die das Ratten-β^A-Globin codiert. Die Ratten-LVV-Haemorphin-7-Peptidsequenz weist eine konservative Substitution an Position 10 auf, wobei ein Tyrosin ein Phenylalanin ersetzt.
Es scheint daher, dass ein Peptid, das der Sequenz des LVV-Haemorphin-7 aus dem Rind entspricht, im Gehirn existiert und als Vorläufer aus dem β-Globin stammt. Das Peptid wird fast sicher ein endogener Ligand für häufig vorkommende Hirn-AT₄-Rezeptoren sein und kann daher ein Reihe von Wirkungen auf definierte motorische, sensorische und cholinergische Neuronen ausüben.
Wir haben gezeigt, dass LVV-Haemorphin-7 die Gedächtnis-störenden Wirkungen von Scopolamin sowohl in passiven Vermeidungs-Konditionierungsversuchen als auch in Wasser-Labyrinth-Lernversuchen umkehrt. Die Verabreichung von hohen Dosierungen des Peptids kann jedoch für das Lernen aufgrund von Überstimulation des neuronalen Systems schädlich sein.
In einem weiteren Kontext deuten unsere Ergebnisse darauf hin, dass β-Globin ein Vorläufer für eine Reihe von neuroaktiven Peptiden sein kann, die im zentralen Nervensystem durch spezifische Spaltungsenzyme erzeugt werden, um mit einer Reihe von Rezeptoren zu interagieren.
Es wird für einen Fachmann offensichtlich sein, dass, obwohl die Erfindung zum Zwecke der Klarheit und des Verständnisses ziemlich im Detail beschrieben wurde, verschiedene Modifikationen und Veränderungen zu den hierin beschriebenen Ausführungsformen und Verfahren durchgeführt werden können, ohne vom Geltungsbereich des erfinderischen Konzepts, das in dieser Erfindung offenbart wird, abzuweichen.
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SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Verwendung eines neuroaktiven Peptids, das mindestens eine biologische Aktivität von Angiotensin IV aufweist, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Modifizierung des Lernens, Verhaltensmodifizierung, vasoaktiven Wirkungen, Dilatation von Gehirnarterien, Erhöhung des renalen Blutflusses, Verstärkung des stereotypen Verhaltens, Förderung von Gedächtnisabruf, Neuritmusterbildung, Minderung der Wirkung von Rückenmarksverletzungen, und die Aminosäuresequenz: Leu-Val-Val-Tyr-Pro-Trp-Thr-Gln-Arg-Phe, (SEQ ID NO: 1), umfasst, oder eines biologisch aktiven Analogs oder Fragments des Peptids für die Herstellung eines Arzneimittels zur Modulierung neuronaler Aktivität bei einem Säuger.
Verwendung eines neuroaktiven Peptids nach Anspruch 1 für die Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung eines Zustands bei einem Säuger ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Demenz, Alzheimer-Krankheit, neurodegenerativen Störungen, die eine oder mehrere cholinergische Bahnen, motorische Bahnen oder sensorische Bahnen betreffen, Motoneuronerkrankung, periphere sensorische Neuropathien, periphere motorische Neuropathien, Gehirnverletzung sowie Rückenmarksverletzung, die von einem oder mehreren von Trauma, Hypoxie und Gefäßkrankheit herrühren.
Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, wobei die neuronale Aktivität ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Motoneuronaktivität, cholinergische Neuronaktivität und neuronale Entwicklung.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei der Säuger ein Mensch ist.
Neuroaktives Peptid, umfassend die Aminosäuresequenz: Leu-Val-Val-Tyr-Pro-Trp-Thr-Gln-Arg-Phe, (SEQ ID NO: 1), oder ein biologisch aktives Analog oder Fragment des Peptids, das mindestens eine biologische Aktivität von Angiotensin IV aufweist, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Modifizierung des Lernens, Verhaltensmodifizierung, vasoaktiven Wirkungen, Dilatation von Gehirnarterien, Erhöhung des renalen Blutflusses, Verstärkung des stereotypen Verhaltens, Förderung von Gedächtnisabruf, Neuritmusterbildung, Minderung der Wirkung von Rückenmarksverletzungen zur Modulierung der neuronalen Aktivität bei einem Säuger.
Neuroaktives Peptid nach Anspruch 1 für die Behandlung eines Zustands bei einem Säuger ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Demenz, Alzheimer-Krankheit, neurodegenerativen Störungen, die eine oder mehrere cholinergische Bahnen, motorische Bahnen oder sensorische Bahnen betreffen, Motoneuronerkrankung, periphere sensorische Neuropathien, periphere motorische Neuropathien, Gehirnverletzung sowie Rückenmarksverletzung, die von einem oder mehreren von Trauma, Hypoxie und Gefäßkrankheit herrühren.
Neuroaktives Peptid nach Anspruch 1 oder 2, wobei die neuronale Aktivität ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Motoneuronaktivität, cholinergische Neuronaktivität und neuronale Entwicklung.