DE69733618T2

DE69733618T2 - Biokonjugate und verabreichung von bioaktiven substanzen

Info

Publication number: DE69733618T2
Application number: DE69733618T
Authority: DE
Inventors: B. Charles GRISSOM; G. Frederick WEST; Allen W. HOWARD
Original assignee: University of Utah Research Foundation UURF
Current assignee: University of Utah Research Foundation UURF
Priority date: 1996-08-27
Filing date: 1997-08-22
Publication date: 2006-05-11
Anticipated expiration: 2017-08-23
Also published as: AU738431B2; CA2264592C; CA2264592A1; US6790827B2; PT1007533E; EP1007533A1; WO1998008859A1; US20020111294A1; US6777237B2; US6776976B2; US6315978B1; ATE298344T1; EP1007533A4; US20020049154A1; AU4148297A; DE69733618D1; ES2244006T3; EP1007533B1; JP2001501596A; NZ334870A

Description

Diese Erfindung wurde teilweise mit Unterstützung der Regierung im Rahmen des Förderprojektes Nr. ES05728 der National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, ermöglicht. Die Regierung der Vereinigten Staaten von Amerika hat bestimmte Rechte an der Erfindung.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft Biokonjugate und die Abgabe bioaktiver Stoffe, welche vorzugsweise für die ortspezifische Freisetzung in Zellen, Geweben oder Organen bestimmt sind. Insbesondere betrifft diese Erfindung Biokonjugate, welche einen bioaktiven Stoff und einen organischen Kobaltkomplex umfassen. Der bioaktive Stoff ist direkt oder indirekt kovalent an das Kobaltatom des organischen Kobaltkomplexes gebunden. Der bioaktive Stoff wird durch Spaltung der kovalenten Bindung zwischen dem bioaktiven Stoff und dem Kobaltatom in dem organischen Kobaltkomplex aus dem Biokonjugat freigesetzt. Die Spaltung kann als Ergebnis einer normalen Verdrängung durch zelluläre Nukleophile oder enzymatische Wirkung eintreten, wird aber bevorzugt veranlasst, an einer vorbestimmten Freisetzungsstelle durch Anwendung eines externen Signals selektiv einzutreten. Das externe Signal kann Licht oder Lichtanregung, d. h. Photolyse, oder Ultraschall, d. h. Sonolyse, sein. Wenn die Photolyse darüber hinaus in Gegenwart eines die Freisetzungsstelle umgebenden Magnetfelds stattfindet, wird die Freisetzung des bioaktiven Stoffes in das umliegende gesunde Gewebe minimiert.
Die Veröffentlichungen und anderes hierin zur Veranschaulichung des Hintergrunds der Erfindung verwendetes Material und insbesondere Fälle, die zusätzliche Einzelheiten über die Praxis liefern, sind durch Bezugnahme enthalten, und es wird im folgenden Text aus praktischen Gründen nach Autor und Datum darauf Bezug genommen, und sie sind in der beiliegenden Biografie alphabetisch nach Autor aufgeführt.
Der Schwerpunkt von Forschung in beträchtlichem Umfang war die Entwicklung eines Systems, mit dem ein pharmazeutischer Stoff selektiv zu einem gewünschten anatomischen Ort, nämlich der Stelle, die eine Behandlung benötigt, transportiert werden kann. Trotz des großen Erfolgs, der diesbezüglich erreicht wurden ist, setzen viele pharmazeutische Transportsysteme zur Behandlung verschiedener Krankheiten oder Gesundheitsrisiken, z. B. die Behandlung von Krebs, den Patienten einem wesentlichen Risiko aus. Was die Behandlung von Krebs angeht, so haben Arzneistoffe, die bösartige Zellen wirksam angreifen, um sie zu zerstören oder zumindest ihre Proliferation einzuschränken, eine Tendenz, auch gutartige Zellen anzugreifen. Es ist demnach äußerst wünschenswert, den Ort ihrer Aktion auf den der Malignität zu beschränken und sicherzustellen, dass zu jedem bestimmten Zeitpunkt wirksame, aber nicht zu hohe Mengen solcher Arzneistoffe verwendet werden.
Obgleich es wünschenswert ist, einen zytotoxischen Stoff an einem Zielort zu konzentrieren, verlangen derzeitige Krebsbehandlungsprotokolle zum Verabreichen dieser zytotoxischen Mittel typischerweise eine wiederholte intravenöse Dosierung unter sorgfältiger Überwachung des Patienten. Die Arzneistoffe werden häufig in Kombination verwendet, um einen facettenreichen Angriff auf neoplastische Zellen auszuüben. Die Dosis wird so gewählt, dass sie knapp unter der Menge liegt, die eine akute (und manchmal chronische) Toxizität hervorruft, die zu lebensbedrohlicher Kardiomyopathie, Myelotoxizität, hepatischer Toxizität oder renaler Toxizität führen kann. Alopezie (Haarausfall), Mukositis, Stomatitis und Übelkeit sind andere häufige, aber im Allgemeinen nicht lebensbedrohliche Nebenwirkungen dieser Dosen. Da viele dieser Verbindungen wirksame Zugpflaster sind, kommt es bei Auftreten einer lokalisierten Extravasation (Austritt des Arzneistoffs aus dem Blut in das umliegende Gewebe) zu einer Gewebenekrose. Diese Effekte treten auf, da das Blut im Allgemeinen eine spezifische Konzentration dieses Arzneistoffs erreicht, bevor dieser wirksam wird. Da das Blut durch den Körper des behandelten Wirtes transportiert wird, geschieht dies auch mit dem pharmazeutischen Stoff. Das Befolgen dieser Technik bietet eine gleichmäßige Verteilung des Arzneistoffs durch den Körper, weniger dessen Konzentrierung an der Behandlungsstelle. Solche systemischen Behandlungsverfahren setzen darüber hinaus die gesunden Zellen dem zytotoxischen Stoff aus gleichzeitig zur Behandlung der ungesunden oder erkrankten Zellen, abgesehen von der Beschränkung der Konzentration des Arzneistoffs an der Stelle, an dem er am meisten gebraucht wird.
Frühere Versuche, solche Arzneistoffe durch direkte Injektion in den Ort des Organs mit der Malignität zu verabreichen, sind aufgrund der Migration des Arzneistoffs von diesem Ort und als Ergebnis umfangreicher Gewebenekrose infolge Extravasation nur teilweise wirksam. Eine solche Verteilung kann nicht vollständig verhindert werden, was dazu führt, dass exzessive Mengen von Arzneistoff verabreicht werden müssen, um ein gewünschtes Ergebnis zu erhalten. Obgleich eine sorgfältige klinische Überwachung extensive Schäden oder den Verlust von lebensfähigem Gewebe verhindert könnten, wäre die Bereitstellung eines pharmazeutischen Wirkstoff-Trägerstoff-Systems, das vor der Aktivierung des pharmazeutischen Stoffes durch biologische Standardsysteme aktiv zum Behandlungsort transportiert wird, äußerst wünschenswert, nicht nur, um die Nutzung des Arzneistoffs zu optimieren, sondern auch, um Nebenwirkungen zu verringern und/oder die Zerstörung gesunder Zellen zu minimieren. Die direkte Injektion zytotoxischer Stoffe in solide Tumore der Brust, der Blase, der Prostata und der Lunge durch konventionelle zytotoxische Chemotherapeutika als Adjuvanzien zu einer Operation und/oder Strahlentherapie war von eingeschränktem Erfolg beim Verlängern des Lebens von Patienten. Dies ist teilweise auf die durch die akute und chronische Toxizität auf Gewebe oder Organsystemen, bei denen es sich nicht um die Zielgewebe oder Zielorgansysteme, handelt bedingten Dosisbeschränkungen zurückzuführen.
Da es um die Verabreichung zytotoxischer oder antineoplastischer Arzneistoffe geht, wäre die effektive Auflösung von Bedenken hinsichtlich der Verabreichungsarten, der Begrenzung der Dosisgröße und der Häufigkeit der Verabreichung und der Nebenwirkungen für die Behandlung von Krebs sicher vorteilhaft.
Oligonukleotide, die mit Genexpression auf transkriptioneller oder translationeller Ebene spezifisch wechselwirken, haben das Potenzial, als therapeutische Stoffe eingesetzt zu werden, um die Synthese schädlicher Proteine in Verbindung mit viralen, neoplastischen oder anderen Krankheiten zu kontrollieren. Es ist möglich, einzelsträngige Oligonukleotide auszuwählen, welche die große Furche eines Abschnitts doppelsträngiger DNA in sequenzspezifischer Weise erkennen und daran binden, um eine Dreifach-Helix zu bilden (Le Doan et al., 1987; Moser and Dervan, 1987). Dreifachhelix-bildende Oligonukleotide gegen die Promotorregion bestimmter Gene sind verwendet worden, um RNA-Synthese in zellfreien Transkriptionsassays physikalisch zu blockieren (Cooney et al., 1988; Postel et al., 1992; Skoog et al., 1993; Rando et al., 1994). In ähnlicher Weise wurden in vitro-Translationsassays verwendet um zu zeigen, dass Antisense-Oligonukleotide mRNA-Ziele binden und Proteinsynthese verhindern können (Uhlmann and Peyman, 1990; Cohen and Hogan, 1994).
Obwohl Antisense-Oligonukleotide große Wirksamkeit bei der selektiven Hemmung der Genexpression gezeigt haben (Stein and Cohen, 1988; Szczylik et al., 1991; Gray et al., 1993), sind die therapeutischen Anwendungen solcher Antisense-Oligonukleotide derzeit durch ihre geringe physiologische Stabilität, langsame zelluläre Aufnahme und Mangel an Gewebespezifität begrenzt. Die Instabilitätshürden wurden durch Verwendung von Oligonukleotiden mit verändertem Grundgerüst, die gegenüber Nukleasen resistenter sind, weitgehend überwunden. Methylphosphonate, Protein-Nukleinsäure-Konjugate und Phosphorothioate scheinen alle einem enzymatischen Verdau besser zu widerstehen als ihre entsprechenden natürlichen Oligonukleotide (Chang and Miller, 1991; Wickstrom et al., 1992; Letsinger, 1993; Zon, 1993).
Probleme mit der zellulären Aufnahme von Antisense-Oligonukleotiden waren schwieriger zu lösen. Die endogenen Aufnahmewege, die auf Pinozytose und verwandten Prozessen beruhen, haben im Allgemeinen unzureichende Kapazität, um die Mengen an Antisense-Sequenzen von Oligonukleotiden zu liefern die erforderlich sind, um Genexpression zu unterdrücken (Vlassov et al., 1994). Obgleich Komplexe von Antisense-Konstrukten mit kationischen Liposomen oder Immunliposomen (Gao and Huang, 1991; Bennett et al., 1992, Ma and Wei, 1996) und Polylysin (Trubetskoy et al., 1992; Bunnell et al., 1992) signifikant verstärkten intrazellulären Transport aufweisen, sind ihnen gleichzeitig eingeführte, neue Nachteile eigen. Beide Verfahren weisen daher eine gewisse Zytotoxizität des Trägerstoffs auf, und wie andere Protokolle erlauben sie weder ein Targeting eines Gewebes noch einer Zelle. Kurz gesagt, bleiben der intrazelluläre Transport und die Gewebespezifität große Hürden bei der Implementierung von Antisense-Arzneistoffen bei der Behandlung menschlicher Krankheiten.
Andere Techniken für die Abgabe von Oligonukleotiden an Zellen umfassen die Verwendung von: (a) Folat-PEG-Liposom-Konstrukten für den Transport von Antisense-DNA gegen Wachstumsfaktorrezeptor (Wang et al., 1995); (b) Folsäure-Polylysin-Konstrukte für den Transport von c-myc-Antisense-DNA (Ginobbi et al., 1997), (c) Tris(N-acetylgalactosaminaminohexylglycosid)amid von Tyrosyl(glutamyl)-glutamat (YEE(GalNAcAH)₂ verknüpft mit Polylysin zur Abgabe von DNA an Zellen über den Asialoglycoproteinrezeptor (Merwin et al., 1994) und (d) wasserlösliche Blockierungs-Polykationen (Kabanov et al., 1995).
Seit einiger Zeit ist bekannt, dass ein pharmazeutisch aktives Mittel an einen Trägerstoff oder ein Molekül angebracht werden kann. Häufig wird mit solchen Systemen der Begriff „Pro-Pharmakon" in Verbindung gebracht, wobei der aktive Stoff zum Zweck der Verabreichung an ein anderes Molekül gebunden wird. Der Arzneistoff ist im Pro-Pharmakon-Stadium in der Regel inaktiv, und die Bindung wird später gespalten, um den Arzneistoff an einem Ort freizusetzen, an dem er wirksam sein kann. Solche Systeme sind jedoch häufig nicht so nützlich, wie es aus verschiedenen Gründen gewünscht ist, wobei die Ortsspezifität einer davon ist. Außerdem erfordert die Freisetzung des Arzneistoffs aus seinem Trägerstoff das Vorhandensein eines Stoffes oder das Eintreten eines Ereignisses, um den aktiven Arzneistoff von seinem Trägerstoff oder Molekül zu trennen und könnte als solches von Faktoren, wie dem Vorhandensein eines spezifischen Enzyms, pH-Bedingungen, zeitlicher Freisetzung und dergleichen abhängen, welche von Wirt zu Wirt verschieden sein können und gegebenenfalls nicht wirksam implementiert sind.
Der transmembranäre Transport von Nährstoffmolekülen ist beispielsweise eine wichtige zelluläre Funktion. Da in der Praxis die Bedeutung des transmembranären Transports für viele Bereiche der medizinischen und biologischen Forschung, einschließlich der Arzneistofftherapie, Peptidtherapie und dem Gentransfer, anerkannt worden ist, gab es wesentliche Forschungsbemühungen hinsichtlich des Verständnisses und der Anwendung solcher Prozesse. So wurde beispielsweise der transmembranäre Transport von Nukleinsäuren durch Verwendung von Proteinträgerstoffen, Antikörper-Trägerstoffen, liposomalen Transportsystemen, Elektroporation, direkte Injektion, Zellfusion, vitale Trägerstoffe, osmotischen Schock und Kalziumphosphatvermittelte Transformation unterstützt. Viele dieser Techniken sind jedoch sowohl durch die Art von Zellen, bei denen ein transmembranärer Transport möglich ist, als auch durch die Anwendungsbedingungen für einen erfolgreichen transmembranären Transport exogener molekularer Arten eingeschränkt. Darüber hinaus sind viele dieser bekannten Techniken hinsichtlich der Art und Größer exogener Moleküle, die ohne Verlust an Bioaktivität durch eine Membran hindurch transportiert werden können, eingeschränkt.
Ein Verfahren für den transmembranären Transport exogener Moleküle mit einer breiten Anwendbarkeit beruht auf dem Mechanismus einer rezeptorvermittelten endozytotischen Aktivität. Im Gegensatz zu vielen anderen Verfahren lässt sich eine rezeptorvermittelte endozytotische Aktivität sowohl in vivo als auch in vitro erfolgreich anwenden. Rezeptorvermittelte Endozytose umfasst die Bewegung von Liganden, die an Membranrezeptoren gebunden sind, in das Innere eines von der Membran begrenzten Bereichs durch Einstülpung der Membran. Der Prozess wird durch die Bindung eines rezeptorspezifischen Liganden an den Rezeptor ausgelöst oder aktiviert. Es sind viele Systeme einer rezeptorvermittelten Endozytose charakterisiert worden, darunter solche, die Galaktose, Mannose, Mannose-6-Phosphat, Transferrin, Asialoglykoprotein, Transcobalamin (Vitamin B₁₂), ☐-2-Makroglobuline, Insulin und andere Peptidwachstumsfaktoren wie beispielsweise epidermalen Wachstumsfaktor (EGF) erkennen.
Rezeptorvermittelte endozytotische Aktivität wurde zum Transport exogener Moleküle wie Proteine und Nukleinsäuren in Zellen verwendet. Im Allgemeinen wird ein spezifischer Ligand über eine kovalente oder ionische Bindung oder eine Wasserstoffbrücke chemisch an ein exogenes Molekül von Interesse (d. h. die exogene Verbindung) konjugiert, wobei ein Konjugatmolekül mit einer Einheit (dem Ligandenabschnitt) gebildet wird, die vom Zielrezeptor in dem Konjugat noch erkannt wird. Durch Verwendung dieser Technik wurde der phototoxische Stoff Psoralen an Insulin konjugiert und über den endozytotischen Insulinrezeptor-Weg internalisiert (Gasparro, 1986); der hepatozytenspezifische Rezeptor für Galaktose-terminale Asialoglykoproteine wurde für den hepatozytenspezifischen transmembranären Transport von Asialoorosomucoid-Poly-L-Lysin als nicht kovalent gebundener Komplex mit DNA-Plasmid verwendet (Wu, 1987); der Zellrezeptor für den epidermalen Wachstumsfaktor wurde verwendet, um Polynukleotide, die kovalent mit EGF verknüpft waren, in das Zellinnere zu transportieren (Myers, 1988); der sich im Darm befindende zelluläre Rezeptor für den organometallischen Komplex aus Vitamin B₁₂ und intrinsischem Faktor wurde verwendet, um einen Arzneistoff, ein Hormon, ein bioaktives Peptid oder ein Immunogen, die mit Vitamin B₁₂ zum Komplex zusammengeschlossen und durch orale Verabreichung in den Darm transportiert wurden, in die Blutbahn eines Wirbeltieres zu bringen (Russell-Jones et al., 1995); der Mannose-6-Phosphat-Rezeptor wurde verwendet, um Low-Density-Lipoproteine in Zellen zu transportieren (Murray and Neville, 1980); der Rezeptor mit Choleratoxin bindender Untereinheit wurde verwendet, um Insulin in Zellen zu transportieren, die keine Insulinrezeptoren aufwiesen (Roth and Maddox, 1983); der humane chorionische Gonadotropinrezeptor wurde verwendet, um eine an HCG gekoppelte Rizin-a-Kette in Zellen mit dem entsprechenden HCG-Rezeptor zu transportieren, um die Zellen abzutöten (Oeltmann and Heath, 1979); der Transferrinrezeptor wurde verwendet, um Mitomycin C in Sarkomzellen zu transportieren (Tanaka et al., 1996) oder um Doxorubicin in Zellen mit mehrfacher Arzneistoffresistenz zu transportieren (Fritzer et al., 1996); der Biotinrezeptor wurde verwendet, um Hypoxanthin-Guanin-Phosphoribosyltransferase (HGPRT) zu transportieren, indem das HGPRT biotinyliert wurde, um das Wachstum HGPRT-defizienter Zellen wiederherzustellen (Low et al., 1995); und der Folsäurerezeptor wurde verwendet, um Antisense-DNA in src-transformierte Fibroblastenzellen zu transportieren (Low et al., 1995).
Russel-Jones et al. (1995) beschreiben ein System, das die Bildung einer kovalenten Bindung zwischen dem pharmazeutischen Stoff, der transportiert werden soll, und einem modifizierten Vitamin B₁₂ umfasst, um ein Konjugatmolekül zu bilden. Das Konjugat wird oral verabreicht und dann aus dem Darmlumen in die Blutbahn transportiert. Wichtigerweise werden der pharmazeutische Stoff und das Vitamin über eine Amidbindung gebunden, welche gegenüber einer Säurehydrolyse anfällig ist. Russell-Jones et al. fanden heraus, dass viele biologisch aktive pharmazeutische Stoffe an B₁₂ gebunden werden können, um die Einführung des Arzneistoffes in die Blutbahn durch orale Verabreichung zu erleichtern. Es wurde weder ein Verfahren bereitgestellt, wodurch die Bindung zwischen Arzneistoff und B₁₂ selektiv gespalten werden könnte, noch kann die Stelle des aktiven pharmazeutischen Stoffes kontrolliert werden, nachdem eine Aktivierung erfolgt ist. Stattdessen verließen sich Russell-Jones et al. auf den biochemischen Abbau der Bindung zwischen Arzneistoff und B₁₂, um den Arzneistoff in seiner aktiven Form freizusetzen. Diesem Verfahren zufolge könnte der Arzneistoff überall in der Blutbahn in seiner aktiven Form freigesetzt werden, was die Bedeutung des aktiven Transportes von B₁₂ in Krebsgewebe verringert. Darüber hinaus erfordern die mit diesem Verfahren gebildeten Konjugate die Modifikation der Struktur des Corrin-Ringes des B₁₂-Moleküls, welche auf Rezeptorwechselwirkungen starke Auswirkungen haben kann.
Pathare P. M. et al. (Bioconjugate Chemistry, American Chemical Society, Washington US, Band 7, Nr. 2, 1. März 1996, S. 217 bis 232) lehrt die Konjugation an die e-Propionamid-Seitenkette des Corrin-Rings von Cobalamin und WO 9427613 lehrt Komplexe zwischen VB₁₂-Analogen und entweder GCSF oder EOP mittels einer Abstandshalterverbindung, wobei keines der beiden Dokumente jedoch ein Biokonjugat wie in Anspruch 1 hiernach ausgeführt lehrt.
Es besteht daher ein Bedarf für ein Arzneistofftransportsystem, das für den Transport bioaktiver Stoffe, einschließlich Pharmazeutika, Peptiden und Oligonukleotiden, verwendet werden kann. Es besteht außerdem ein Bedarf für ein Arzneistofftransportsystem, das für die ortsspezifische Freisetzung des bioaktiven Stoffes in die Zellen, Gewebe oder Organe verwendet werden kann, in denen ein therapeutischer Effekt ausgeübt werden soll.
Gemäß einem ersten Aspekt der Erfindung ist ein Biokonjugat eines bioaktiven Stoffes und eines organischen Kobaltkomplexes bereit gestellt, wobei der organische Kobaltkomplex ein organischer Komplex ist, der ein Kobaltatom enthält, an das 4–5 Stickstoffe und/oder Chalkogene wie Sauerstoff und Schwefel als Teil eines mehrfachen, ungesättigten heterozyklischen Ringsystems gebunden sind, wobei der bioaktive Stoff durch ein nicht-reaktives Atom in dem bioaktiven Stoff kovalent an das Kobaltatom konjugiert ist und wobei das Biokonjugat die Eigenschaft für eine gezielte, selektive Abgabe des bioaktiven Stoffes aus dem Biokonjugat besitzt.
Der bioaktive Stoff wird durch die Spaltung der kovalenten Bindung zwischen dem bioaktiven Stoff und dem Kobaltatom in dem organischen Kobaltkomplex wie hierin beschrieben aus dem Biokonjugat freigesetzt.
Der bioaktive Stoff ist jeder Stoff, der als Nährstoff oder aufgrund eines therapeutischen Effekts zu Zellen, Geweben oder Organen transportiert werden soll. In Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung umfassen bioaktive Stoffe Nährstoffe, Pharmazeutika, Arzneistoffe, Peptide und Oligonukleotide, sind aber nicht darauf beschränkt.
Der organische Kobaltkomplex ist jeder organische Komplex, der ein Kobaltatom enthält, an welches 4–5 Stickstoffe und/oder Chalkogene wie beispielsweise Sauerstoff, Schwefel, etc. als Teil eines mehrfachen, ungesättigten heterozyklischen Ringsystems gebunden sind. In Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung umfassen geeignete organische Kobaltkomplexe Cobalamin, Co[SALEN], organisches (Pyridin)bis(dimethylglyoximato)cobalt, Corrinoide, Derivate davon und Analoga davon, sind jedoch nicht darauf beschränkt. Die organischen Kobaltkomplexe können unsubstituiert oder mit herkömmlichen organischen funktionellen Gruppen substituiert sein, was die grundsätzliche Natur des organischen Kobaltkomplexes nicht verändert. Die grundsätzliche Natur des organischen Kobaltkomplexes ist es, den bioaktiven Stoff direkt oder indirekt kovalent derart an das Kobalt zu binden, dass der Kobalt-bioaktive Stoff wie hierin beschrieben schnell gespalten werden kann. Der organische Kobaltkomplex kann auch direkt oder indirekt kovalent an ein Targeting-Molekül gebunden sein. Das Targeting-Molekül ist ein Molekül, das für die gewünschte Zelle oder das gewünschte Gewebe oder Organ notwendig ist, oder ein Rezeptor, wie hierin beschrieben ist.
In Übereinstimmung mit einem weiteren Aspekt der Erfindung ist eine pharmazeutische Zusammensetzung bereit gestellt, die ein Biokonjugat wie oben definiert und wahlweise einen pharmazeutisch annehmbaren Trägerstoff oder ein pharmazeutisch annehmbares Verdünnungsmittel enthält.
Das Biokonjugat gemäß der vorliegenden Erfindung wird einem Individuum verabreicht, das eine therapeutische Behandlung benötigt. Als ein Ergebnis des organischen Kobaltkomplexes sammelt sich das Biokonjugat in einer Zielzelle, einer Zielgewebe- oder Zielorganstelle an. Zum Beispiel wird ein Biokonjugat, das ein Chemotherapeutikum enthält, einem Patienten verabreicht und das Biokonjugat sammelt sich in neoplastischen Zellen an, wo das aktive Chemotherapeutikum durch Spaltung von dem Biokonjugat freigesetzt wird. In Ähnlicherweise werden einem Individuum andere Pharmazeutika, Arzneistoffe, Peptide oder Oligonukleotide als Teil des Biokonjugats verabreicht, das sich in den gewünschten Zellen, Geweben oder Organen ansammelt. Die Pharmazeutika, Arzneistoffe, Peptide oder Oligonukleotide werden durch Spaltung freigesetzt. In einer Ausführungsform kann die Spaltung als Ergebnis einer normalen Verdrängung durch zelluläre Nukleophile oder enzymatische Einwirkung eintreten. In einer zweiten Ausführungsform verursacht ein externes Signal die selektive Spaltung an der Freisetzungsstelle. Das externe Signal kann Licht oder Lichtanregung sein, d. h. Photolyse, oder es kann Ultraschall sein, d. h. Sonolyse. Wenn die Photolyse in Gegenwart eines magnetischen Felds stattfindet, das die Freisetzungsstelle umgibt, kann darüber hinaus die Freisetzung des Arzneistoffs, beispielsweise eines zytotoxischen Stoffes in das umliegende gesunde Gewebe minimiert werden.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 zeigt die Struktur und das Absorptionsspektrum von Methylcobalamin (B₁₂).
2 zeigt die Struktur und das Absorptionsspektrum von Ethyl-Co[SALEN] (Cobalt-bis-[salicyliden]-ethylendiamin).
3A zeigt ein sequenzielles Absorptionsspektrum von wässrigem CH₃-Cbl^III als eine Funktion anaerober Sonolyse (pH 7,38; 100 mM Hepes, Ar-Sättigung).
3B zeigt die Veränderung der Absorptionsspektren nach aerober Sonolyse in Abwesenheit von organischem Puffer.
4A zeigt ein sequenzielles Absorptionsspektrum der wässrigen Verbindung 3 (Beispiel 6) als eine Funktion anaerober Sonolyse bei pH 7,4, 100 mM Hepes, Ar-Sättigung.
4B zeigt die Veränderung der Absorptionsspektren nach aerober Sonolyse einer Phosphatpuffer enthaltenden Lösung von Verbindung 3 (Beispiel 6).
5 zeigt den Effekt eines Chlorambucilbiokonjugats auf die Lebensfähigkeit von Zellen der Zelllinie HCT-116. Die Ergebnisse sind gezeigt für Chlorambucil (¦), das Chlorambucilbiokonjugat mit Photolyse (o), das Chlorambucilbiokonjugat ohne Photolyse (
) und das Chlorambucilbiokonjugat plus 10 Äquivalente von Hydroxycobalamin mit Photolyse (∇).
6 zeigt den Effekt eines Chlorambucilbiokonjugats auf die Lebensfähigkeit von Zellen der Zelllinie HL-60. Die Ergebnisse sind gezeigt für Chlorambucil (¦), das Chlorambucilbiokonjugat ohne Photolyse (
) und das Chlorambucilbiokonjugat plus 10 Äquivalente von Hydroxycobalamin ohne Photolyse (∇).
7 zeigt den Effekt eines Chlorambucilbiokonjugats auf die Lebensfähigkeit von Zellen der Zelllinie B-16. Die Ergebnisse sind gezeigt für Chlorambucil (¦), das Chlorambucilbiokonjugat mit Photolyse (o), das Chlorambucilbiokonjugat ohne Photolyse (Δ) und das Chlorambucilbiokonjugat plus 10 Äquivalente von Hydroxycobalamin mit Photolyse (∇).
8 zeigt den Effekt eines Chlorambucilbiokonjugats auf die Lebensfähigkeit von Zellen der Zelllinie Meth-A. Die Ergebnisse sind gezeigt für Chlorambucil (¦), das Chlorambucilbiokonjugat mit Photolyse (o), das Chlorambucilbiokonjugat ohne Photolyse (
) und das Chlorambucilbiokonjugat plus 10 Äquivalente von Hydroxycobalamin mit Photolyse (∇).
9 zeigt den Effekt eines Chlorambucilbiokonjugats auf die Lebensfähigkeit von Zellen der Zelllinie RD-995. Die Ergebnisse sind gezeigt für Chlorambucil (¦), das Chlorambucilbiokonjugat mit Photolyse (o), das Chlorambucilbiokonjugat ohne Photolyse (
) und das Chlorambucilbiokonjugat plus 10 Äquivalente von Hydroxycobalamin mit Photolyse (∇).
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft Biokonjugate und den Transport bioaktiver Stoffe, die vorzugsweise für eine ortsspezifische Freisetzung in Zellen, Geweben oder Organen bestimmt sind. Insbesondere betrifft diese Erfindung Biokonjugate, die einen bioaktiven Stoff und einen organischen Kobaltkomplex aufweisen. Der bioaktive Stoff ist direkt oder indirekt kovalent an das Kobaltatom des organischen Kobaltkomplexes gebunden. Der bioaktive Stoff wird durch Spaltung der kovalenten Bindung zwischen dem bioaktiven Stoff und dem Kobaltatom des organischen Kobaltkomplexes aus dem Biokonjugat freigesetzt. Die Spaltung kann als Ergebnis einer normalen Verdrängung durch zelluläre Nukleophile oder enzymatische Einwirkung stattfinden, wird aber vorzugsweise durch Anwendung eines externen Signals dazu veranlasst, selektiv an einer vorbestimmten Freisetzungsstelle stattzufinden. Das externe Signal kann Licht oder Lichtanregung, d. h. Photolyse, oder Ultraschall, d. h. Sonolyse, sein. Wenn die Photolyse in Gegenwart eines magnetischen Felds stattfindet, das die Freisetzungsstelle umgibt, ist darüber hinaus die Freisetzung des bioaktiven Stoffes in das umliegende gesunde Gewebe minimiert.
Das Biokonjugat gemäß der vorliegenden Erfindung wird einem Individuum verabreicht, das eine therapeutische Behandlung benötigt. Als ein Ergebnis des organischen Kobaltkomplexes sammelt sich das Biokonjugat in einer Zielzelle, einer Zielgewebe- oder Zielorganstelle an. Der bioaktive Stoff wird durch Spaltung aus dem Biokonjugat freigesetzt. In einer Ausführungsform kann die Spaltung als Ergebnis einer normalen Verdrängung durch zelluläre Nukleophile oder enzymatische Einwirkung eintreten. In einer zweiten Ausführungsform veranlasst ein externes Signal, das die Spaltung selektiv an der Freisetzungsstelle stattfindet. Das externe Signal kann Licht oder Lichtanregung, d. h. Photolyse, oder Ultraschall, d. h. Sonolyse, sein. Wenn die Photolyse in Gegenwart eines magnetischen Felds stattfindet, das die Freisetzungsstelle umgibt, ist darüber hinaus die Freisetzung des bioaktiven Stoffes in das umliegende gesunde Gewebe minimiert.
Beispielsweise enthält das Biokonjugat ein Chemotherapeutikum und wird einem Patienten mit Krebs verabreicht. In diesem Beispiel wird einem Patienten eine therapeutisch wirksame Menge des Biokonjugats derart intravenös verabreicht, dass sich das Biokonjugat in den neoplastischen Zellen ansammelt. Der chemotherapeutische Stoff wird durch natürliche Mittel (z. B. zelluläre Nukleophile oder enzymatische Einwirkung) oder vorzugsweise mittels eines externen Signals (z. B. Licht oder Ultraschall) aus dem Biokonjugat freigesetzt.
Als ein zweites Beispiel enthält das Biokonjugat einen zytotoxischen Stoff und wird einem Patienten mit Psoriasis verabreicht. In diesem Beispiel wird eine therapeutisch wirksame Menge des Biokonjugats einer betroffenen Hautstelle verabreicht. Der zytotoxische Stoff wird auf natürliche Weise oder vorzugsweise mittels eines externen Signals freigesetzt.
Als ein drittes Beispiel enthält das Biokonjugat die enzymatische Domäne von Diphtherietoxin (Nichols et al., 1997) und wird einem Patienten mit Krebs verabreicht. In diesem Beispiel wird eine therapeutisch wirksame Menge des Biokonjugats einem Patienten derart intravenös verabreicht, dass sich das Biokonjugat in neoplastischen Zellen ansammelt. Die enzymatische Domäne von Diphtherietoxin wird auf natürliche Weise (z. B. zelluläre Nukleophile oder enzymatische Wirkung) oder vorzugsweise mittels eines externen Signals (z. B. Licht oder Ultraschall) aus dem Biokonjugat freigesetzt und tötet daraufhin die Krebszellen ab.
Als ein viertes Beispiel enthält das Biokonjugat ein Antisense-Oligonukleotid gegen Hepatitis-B-Virus (Yao et al., 1996; Madon and Blum, 1996) und wird einem Individuum mit Hepatitis B verabreicht. In diesem Beispiel wird eine therapeutisch wirksame Menge des Biokonjugats einem Patienten derart intravenös verabreicht, dass sich das Biokonjugat in der Leber ansammelt. Das Antisense-Oligonukleotid wird auf natürliche Weise (z. B. zelluläre Nukleophile oder enzymatische Wirkung) oder vorzugsweise mittels eines externen Signals (z. B. Licht oder Ultraschall) aus dem Biokonjugat freigesetzt und hemmt daraufhin die Genexpression und die Replikation von Hepatitis-B-Virus.
Die vorliegende Erfindung verwendet folgende Definitionen:
Bioaktiver Stoff: Jeder Stoff, der zu Zellen, Geweben oder Organen transportiert oder an Zellen, Gewebe oder Organ abgegeben werden soll, um die Zellfunktion zu modulieren oder anderweitig zu verändern, einschließlich zum Zweck einer therapeutischen Wirkung. Gemäß der vorliegenden Erfindung umfassen bioaktive Stoffe, jedoch nicht ausschließlich, pharmazeutisch aktive Verbindungen oder diagnostische Verbindungen. Bioaktive Stoffe umfassen, jedoch nicht ausschließlich, Peptide, Oligopeptide, Proteine, Apoproteine, Glykoproteine, Antigene und Antikörper oder Antikörperfragmente dagegen, Rezeptoren und andere Membranproteine, Retro-Inverso-Oligopeptide, Proteinanaloga, bei denen mindestens eine Nicht-Peptid-Bindung eine Peptidbindung ersetzt, Enzyme, Coenzyme, Enzyminhibitoren, Aminosäuren und ihre Derivate, Hormone, Lipide, Phospholipide, Liposomen, Ricin oder Ricinfragmente, Toxine wie Aflatoxin, Digoxin, Xanthoxin, Rubratoxin, Antibiotika wie Cephalosporine, Penicillin und Erythromycin, Analgetika wie Aspirin, Ibuprofen und Acetaminophen, Bronchodilatoren wie Theophyllin und Albuterol, Betablocker wie Pronanolol, Metoprolol, Atenolol, Labetolol, Timolol, Penbutolol und Pindolol, antimikrobielle Stoffe wie die oben Beschriebenen und Ciprofloxacin, Cinoxacin und Norfloxacin, Antihypertensiva wie Clonidin, Methyldopa, Prazosin, Verapamil, Nifedipin, Apropril und Enalapril, kardiovaskuläre Stoffe einschließlich Antiarrhythmika, Herzglykoside, antianginale Stoffe und Vasodilatoren, Stoffe mit Wirkung auf das Zentralnervensystem einschließlich Stimulanzien, Psychotropika, antimanische Stoffe und Antidepressiva, antivirale Stoffe, Antihistaminika wie Chlorphenimin und Brompheniramin, Krebsmittel einschließlich Chemotherapeutika wie Chlorambucil, Carboplatin, Derivate von Busulfan, Doxorubicin, Etoposid, Topotecan (TPT), Beruhigungsmittel wie Diazepam, Chlordazepoxid, Oxazepam, Alprazolam und Triazolam, Antidepressiva wie Fluoxetin, Amitriptylin, Nortryptilin und Imipramin, H2-Antagonisten wie Nizatidin, Cimetidin, Famotidin und Ranitidin, Antiepileptika, Übelkeit hemmende Stoffe, Prostaglandine, Muskelrelaxanzien, entzündungshemmende Substanzen, Stimulanzien, abschwellende Mittel, Antiemetika, Diuretika, Antispasmodika, Antiasthmatika, Mittel gegen die Parkinson-Krankheit, Schleim lösende Mittel, Husten unterdrückende Mittel, Mukolytika, Vitamine und Mineralstoffe und Nahrungsergänzungsmittel. Andere Moleküle umfassen Nukleotide, Oligonukleotide, Polynukleotide und deren im Stand der Technik anerkannte und biologisch funktionelle Analoga und Derivate, einschließlich beispielsweise methylierte Polynukleotide und Nukleotidanaloga mit Phosphorothioatbindungen, Plasmide, Cosmide, artifizielle Chromosomen, andere Nukleinsäurevektoren, Antisense-Polynukleotide, einschließlich denen, die sequenziell zu mindestens einer endogenen Nukleinsäure komplementär sind, oder solche, deren Sequenz eine andere Leserichtung (Sense) aufweisen, als mindestens Abschnitte ausgewählter viraler oder retroviraler Genome, Promotoren, Enhancer, Inhibitoren, andere Liganden zur Regulierung von Gentranskription und Translation. Darüber hinaus kann ein bioaktiver Stoff jedes andere biologisch aktive Molekül sein, das mit einem organischen Kobaltkomplex ein Konjugat bilden kann. Der bioaktive Stoff kann des Weiteren einen Abstandshalter enthalten, der eine kovalente Bindung mit dem Kobaltatom des organischen Kobaltkomplexes bereitstellt, der aber die biologische Aktivität des bioaktiven Stoffes nicht negativ beeinflusst.
Biokonjugat: Ein Konjugat, das einen bioaktiven Stoff und einen organischen Kobaltkomplex enthält, in dem der bioaktive Stoff kovalent direkt an das Kobaltatom gebunden ist oder über einen Abstandshalter indirekt an das Kobaltatom gebunden ist.
Nicht-reaktives Atom: Ein Atom in dem bioaktiven Stoff, das unter Bedingungen des Ligandenaustausches während der rezeptorvermittelten Endozytose nicht zu einer Neuanordnung oder Zerstörung des bioaktiven Stoffes führt, sondern stattdessen die ursprüngliche Form des bioaktiven Stoffes (oder des bioaktiven Stoffes und des Abstandshalters) wiederherstellt und damit einen aktiven bioaktiven Stoff demaskiert. Das nicht reaktive Atom kann ein Kohlenstoffatom, ein Stickstoffatom, ein Sauerstoffatom, ein Schwefelatom, ein Selenatom oder ein Siliziumatom sein. Ein Kohlenstoffatom (z. B. von einer Alkyl-, Acyl- oder Arylgruppe) ist besonders bevorzugt. Solche nicht reaktiven Atome werden auch verwendet, um die kovalente Bindung zwischen dem Kobalt und dem Abstandshalter zu bilden.
Organischer Kobaltkomplex: Ein organischer Komplex, der ein Kobaltatom enthält, an das 4–5 Chalkogene als Teil eines mehrfachen ungesättigten heterozyklischen Ringsystems gebunden sind. Gemäß der vorliegenden Erfindung umfassen geeignete organische Kobaltkomplexe, jedoch nicht ausschließlich, Cobalamin (Coenzym B₁₂), Co[SALEN] (bei dem es sich um ein Cobalaminanalog handelt), Organo(pyridin)bis(dimethylglyoximato)cobalt, Corrinoide (wie beispielsweise offenbart von Brown et al., 1996) und Derivate oder Analoga eines der vorherigen, sowie pharmazeutisch annehmbare Salze. Die organischen Kobaltkomplexe können unsubstituiert oder mit herkömmlichen organischen funktionellen Gruppen substituiert sein, welche die grundsätzliche Natur des organischen Kobaltkomplexes nicht verändern. Die grundsätzliche Natur des organischen Kobaltkomplexes ist es, den bioaktiven Stoff derart kovalent an das Kobalt zu binden, dass die Bindung zwischen dem Kobalt und dem bioaktiven Stoff wie hierin beschrieben einfach gespalten werden kann. Beispiele von Substituenten, die in einem organischen Kobaltkomplex vorkommen können, umfassen Amino, Nitro, Halogen (Brom, Chlor), Sulfito, C_2-6-Alken und C_2-6-Alkyn. Beispielsweise kann der organische Kobaltkomplex derart gebildet sein, dass er ein Nitro- und/oder Halo- (z. B. Brom) Derivat des Corrinrings aufweist oder eine erweiterte Konjugation mit exozyklischen Olefin- oder Alkylengruppen aufweist. Andere Derivate umfassen Cobalaminlacton, Cobalaminlactam und solche, in denen der Benzimidazolring (z. B. von Cobalamin, grünem Corrinoid und dergleichen) mit z. B. einem oder mehr Halogenen (Brom, Chlor), Hydroxy oder C_1-6-Alkyl substituiert ist. Solche Substituenten eignen sich zum Erhöhen der ☐_max, die zur Spaltung des Biokonjugats wie hierin beschrieben verwendet werden soll. Weitere Derivate umfassen Anilid, Ethylamin, Mono-, Di- oder Tricarboxylsäure oder Proprionamidderivate von Cobalamin oder Vitamin B₁₂. In einer Ausführungsform ist der organische Kobaltkomplex jeder organische Komplex, der Kobalt enthält, das durch Transcobalamin gebunden ist und durch einen rezeptorvermittelten Prozess, an dem Transcobalamin beteiligt ist, in eine Zelle transportiert wird. In einer zweiten Ausführungsform kann der organische Kobaltkomplex auch direkt oder indirekt (durch einen Abstandshalter) kovalent an ein Targeting-Molekül gebunden sein, wobei das Targeting-Molekül durch seinen Rezeptor gebunden ist und der Komplex durch einen rezeptorvermittelten Prozess in eine Zelle transportiert wird. Co[SALEN] und seine Derivate oder Analoga können durch die allgemeine Formel
wiedergegeben werden, wobei Substituenten enthalten oder nicht enthalten sein können, um physikalische Eigenschaften des Moleküls zu modulieren, z. B. Wasserlöslichkeit, Stabilität oder λ_max, die Wellenlänge, bei welcher der Komplex absorbiert. Die Substituenten sind demnach wie folgt: R ist H, eine Gruppe, welche die Wasserlöslichkeit und/oder Stabilität erhöht, oder eine Gruppe zum Anbringen eines Targeting-Moleküls, und W, W', X, X', Y, Y', Z und Z' sind unabhängig H, eine Gruppe, welche die Wasserlöslichkeit und/oder Stabilität erhöht, eine Gruppe zum Anbringen eines Targeting-Moleküls oder eine Gruppe für modifizierte Absorption von Energie, oder W und X zusammen oder W' und X' zusammen sind ein 4-6-gliedriger, zyklischer oder heterozyklischer Ring oder Y und Z sind zusammen ein 4-6-gliedriger, zyklischer oder heterozyklischer aromatischer Ring oder Y' und Z' sind zusammen ein 4-6-gliedriger, zyklischer oder heterozyklischer aromatischer Ring. Beispiele von Gruppen zum Verstärken der Wasserlöslichkeit umfassen Amino, C_1-6-Alkohol, C_1-6-Carboxyl für einen beliebigen Substituenten oder auch SO_3- für die Substituenten außer R. Beispiele von Gruppen zur Anbringung eines Targeting-Moleküls umfassen Amino, C_1-6-Alkohol und C_1-6-Carboxyl für einen beliebigen Substituenten. Beispiele für Gruppen zum Modifizieren der Absorption umfassen CH₂OH, CO₂H, SO_3-, Amino und Nitro für die Substituenten außer R. Solche Gruppen sind geeignet, um die Wellenlänge von Licht zu erhöhen, das zur Spaltung des hierin beschriebenen Biokonjugats verwendet werden soll, während Targeting-Moleküle geeignet sind, um das Biokonjugat selektiv zu dem gewünschten Gewebe zu leiten. Bei Gebrauch in Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung umfasst der Begriff organischer Kobaltkomplex daher, sofern nicht anderweitig angegeben, B₁₂ in allen seinen Ausführungsformen, einschließlich Coenzym B₁₂, Co[SALEN] und andere B₁₂- oder B₁₂-ähnliche Moleküle, die hierin definierten organischen Kobaltkomplexe sowie alle Derivate und Analoga davon.
Abstandshalter: Ein Atom oder Molekül, das zwei Bestandteile kovalent aneinander bindet. In der vorliegenden Erfindung soll ein Abstandshalter Atome und Moleküle umfassen, welche verwendet werden können, um einen bioaktiven Stoff an das Kobaltatom eines organischen Kobaltkomplexes kovalent zu binden oder um ein Targeting-Molekül kovalent an einen organischen Kobaltkomplexes zu binden. Der Abstandshalter darf die Bindung des organischen Kobaltkomplexes oder des Targeting-Moleküls an seinen entsprechenden Rezeptor nicht verhindern. Beispiele geeigneter Abstandshalter umfassen, jedoch nicht ausschließlich, Polymethylen [·(CH₂)_n, wobei n 1–10], Ester [bioaktiver Stoff an O und CO an C = O angebracht], Carbonat, Ether, Acetat oder eine beliebige Kombination von zwei oder mehr dieser Einheiten ist. Ein Fachmann erkennt leicht andere Abstandshalter, die gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden können.
Mehrere dieser Abstandshalter sind als eine „selbst zerstörende" Linkergruppe geeignet. Das bedeutet, dass ein Teil oder die gesamte Verknüpfung in einer Fragmentierungsreaktion verbraucht würde. Dies bedeutet, dass nach der Spaltung der C-C-Bindung durch Photolyse oder Sonolyse einige Bindungen davon entfernt eine weitere Spaltung stattfindet, was zur Bildung eines kleinen, ungesättigten (und typischerweise flüchtigen) Moleküls führt, das aus Atomen des früheren Linkers besteht. Die ist schematisch im Folgenden gezeigt:
Das typischste Szenario ist die anschließende Spaltung einer zweiten Bindung, zwei Bindungen von der Ersten entfernt. Die meisten selbst zerstörenden Linker würden daher eine Zwei-Atom-Einheit enthalten, deren Extrusion als ein kleines, gasförmiges Molekül bevorzugt ist. Ein weiteres Designmerkmal ist, dass es sich bei der neuen Radikalart, die nach dem zweiten Spaltungsschritt erzeugt wird, um eine stabile Art von Radikal handelt. Beispiele für selbst zerstörende Linker sind im Folgenden gezeigt.
Targeting-Molekül: Ein Molekül, das von einem Rezeptor gebunden wird und durch einen rezeptorvermittelten Prozess in eine Zelle transportiert wird. Beispiele geeigneter Targeting-Moleküle umfassen, jedoch nicht ausschließlich Glukose, Galaktose, Mannose, Mannose-6-phosphat, Transferrin, Asialoglycoprotein, ☐☐2-Makroglobuline, Insulin, einen Peptidwachstumsfaktor, Cobalamin, Folsäure oder Derivate, Biotin oder Derivate, YEE(GalNAcAH)₃ oder Derivate, Albumin, Texaphyrin, Metallotexaphyrin, Porphyrin, ein beliebiges Vitamin, ein beliebiges Coenzym, ein Antikörper, ein Antikörperfragment (z. B. Fab) und eine einzelkettige variable Region eines Antikörpers (scF☐). Ein Fachmann erkennt leicht andere Targeting-Moleküle (Liganden), die an Zellrezeptoren binden und die durch einen rezeptorvermittelten Prozess in eine Zelle transportiert werden. Die vorliegende Erfindung soll alle derartigen Targeting-Moleküle einschließen.
Die vorliegende Erfindung nutzt die zellulären Eigenschaften von Cobalamin und Cobalaminanaloga oder -derivaten sowie die zellulären Eigenschaften anderer Targeting-Moleküle. Beispielsweise haben Studien gezeigt, dass die Absorption physiologischer Mengen von Vitamin B₁₂ vom Darm erfordert, dass es mit einem natürlich vorkommenden Transportprotein, dem so genannten Intrinsic Factor (IF) Komplexe bildet (Castle 1953; Fox and Castle, Allen and Majerus, 1972b). Dieses Protein wird von Parietalzellen im Fundus in die Magenhöhle abgegeben. Nach der Bindung an den Intrinsic Factor interagiert der B₁₂-IF-Komplex mit einem membrangebundenen Rezeptor für IF, der sich auf dem terminalen Ileum des Dünndarms befindet. Der Rezeptor-B₁₂-IF-Komplex wird dann durch einen Prozess der rezeptorvermittelten Endozytose (RME) in die Zelle transportiert. Allen und Majerus haben gezeigt, dass es möglich ist, B₁₂ chemisch zu modifizieren, es an ein Harz zu binden und das B₁₂-Harz zur Affinitätsreinigung von IF zu verwenden (Allen and Majerus 1972a). Dieser Befund lässt den Schluss zu, dass es möglich ist, ein großes Makromolekül (wie das von Allen and Majerus 1972a, verwendete Harz) an B₁₂ zu koppeln, während es dennoch seine Fähigkeit zur spezifischen Wechselwirkung mit dem Intrinsic Factor beibehält und so Teil des aktiven Transportsystems ist. Durch Koppeln von Molekülen an B₁₂ derart, dass die Fähigkeit von B₁₂ zur Wechselwirkung mit dem Intrinsic Factor erhalten bleibt, wurde gefunden, dass der natürliche Aufnahmemechanismus für oral verabreichtes B₁₂ verwendet werden könnte, um verschiedene Proteine, Arzneistoffe oder andere pharmazeutisch aktive Moleküle aus dem Darmlumen in die Blutbahn zu transportieren. Man fand heraus, dass B₁₂ durch einen ähnlichen Transportmechanismus in Krebsgewebe natürlich konzentriert wird.
Bei Säugetieren wird B₁₂ im Blut von Transcobalaminproteinen TC-I, TC-II und TC-III transportiert. Die Hauptform von B₁₂ im Blut ist Methylcobalamin, und der größte B₁₂-Speicher ist Adenosylcobalamin in der Leber. Schnell teilende Zellen, einschließlich Krebszellen, brauchen Coenzym B₁₂ zur Produktion von Thymidin während der DNA-Synthese. Von Carmel (1975) wurde berichtet, dass bei manchen Patienten mit Tumoren ein Anstieg der wichtigsten Cobalamintransportproteine TC-I und TC-II um das bis zu 50-Fache beobachtet worden ist. Waxman et al. (1972) fanden tumorspezifische B12-Bindungsproteine, die im Blut zirkulieren. In jedem Fall waren diese Erhöhungen der TC-Transportproteine und die korrespondierende systemische Depletion von B₁₂ nicht das Ergebnis einer Megaloblastose, Granulozytenproliferation oder einem anderen pathogenen B₁₂-Mangel.
In einem zweiten Beispiel für rezeptorvermittelte Endozytose wurden bereits früher in bakteriellen Zellen Folatrezeptoren identifiziert, die endozytotische Aktivität vermitteln (Kumar et al., 1987) und für den Transport biologisch aktiver Materialien verwendet werden (Low et al., 1995). Folsäure, Folinsäure, Pteropolyglutaminsäure und Folatrezeptor-bindende Pteridine wie Tetrahydropterine, Dihydrofolate, Tetrahydrofolate und deren Deaza- und Dideaza-Analoga sind gemäß der vorliegenden Erfindung als Targeting-Moleküle geeignet. Die Begriffe "Deaza-„ und „Dideaza-" Analoga beziehen sich auf die im Stand der Technik anerkannten Analoga, bei denen ein Kohlenstoffatom in der natürlich vorkommenden Folsäurestruktur für ein oder zwei Stickstoffatome substituiert ist. Beispielsweise umfassen die Deaza-Analoga die 1-Deaza-, 3-Deaza-, 5-Deaza-8-Deaza- und 10-Deaza-Analoga. Die Dideaza-Analoga umfassen beispielsweise 1,5-Dideaza-, 5,10-Dideaza, 8,10-Dideaza und 5,8-Dideaza-Analoga. Die davor stehenden Folsäurederivate werden der Konvention entsprechend als „Folate" bezeichnet, was ihre Fähigkeit zur Bindung an Folatrezeptoren wiedergibt, und Liganden sind bei Komplexbildung mit exogenen Molekülen wirksam, um den transmembranären Transport zu verstärken. Andere Folate, die sich als Komplex bildende Liganden für diese Erfindung eignen, sind die Folatrezeptorbindungsanaloga Aminopterin, Amethopterin (Methotrexat), N¹⁰-Methylfolat, 2-Deaminohydroxyfolat, Deaza-Analoga wie 1-Deazamethopterin oder 3-Deazamethopterin und 3'5'-Dichlor-4-amino-4-desoxy-N¹⁰-methylpteroylglutaminsäure (Dichlormethotrexat). Andere geeignete Liganden, die an Folatrezeptoren binden können, um einen rezeptorvermittelten endozytotischen Transport des Komplexes einzuleiten, umfassen anti-idiotypische Antikörper gegen den Folatrezeptor. Ein exogenes Molekül, das sich in einem Komplex mit einem anti-idiotypischen Antikörper gegen einen Folatrezeptor befindet, wird verwendet, um einen transmembranären Transport des Komplexes auszulösen. Solche Moleküle werden gemäß der vorliegenden Erfindung als Targeting-Molekül verwendet.
In einem weiteren Beispiel für rezeptorvermittelte Endozytose wurden Biotinrezeptoren verwendet, um endozytotische Aktivität zu vermitteln (Low et al., 1995). Biotinanaloga wie Biocytin, Biotinsulfoxid, Oxybiotin und andere Biotinrezeptor-bindende Verbindungen sind Liganden, die auch als geeignete Targeting-Moleküle verwendet werden könnten, um erfindungsgemäß den transmembranären Transport von exogenen Molekülen zu fördern. Es werden auch andere Verbindungen, die an Biotinrezeptoren binden können, um rezeptorvermittelten endozytotischen Transport des Komplexes auszulösen, in Betracht gezogen. Dazu können andere rezeptorbindende Liganden gehören, wie beispielsweise anti-idiotypische Antikörper gegen den Biotinrezeptor. Ein exogenes Molekül, das sich in einem Komplex mit einem anti-idiotypischen Antikörper gegen den Biotinrezeptor befindet, könnte verwendet werden, um den transmembranären Transport des Komplexes auszulösen. Solche Moleküle werden gemäß der vorliegenden Erfindung als Targeting-Molekül verwendet.
Andere Beispiele von Targeting-Molekülen umfassen Glukose, Galaktose, Mannose, Mannose-6-phosphat, Hormone (z. B. Insulin, Wachstumsfaktor und dergleichen), Wachstumsfaktoren oder Zytokine (z. B. TGF-☐, EGF, der insulinähnliche Wachstumsfaktor und dergleichen), YEE(GalNAcAH)₃ oder Derivate, Cobalamin, ☐☐2-Makroglobuline, Asialoglycoprotein, Albumin, Texaphyrin, Metallotexaphyrin, Antikörper, Antikörperfragmente (z. B. Fab), die einzelkettige variable Region eines Antikörpers (scF☐), Transferrin, beliebige Vitamine und Coenzyme.
Wie zuvor beschrieben, umfasst ein Biokonjugat der vorliegenden Erfindung einen bioaktiven Stoff, der direkt oder indirekt über eine kovalente Bindung an das Kobaltatom eines organischen Kobaltkomplexes gebunden ist. Der bioaktive Stoff ist durch ein nicht-reaktives Atom in dem bioaktiven Stoff direkt an das Kobaltatom gebunden oder durch Verwendung eines Abstandshalters indirekt an das Kobaltatom konjugiert. Im Gegensatz zu den nach US-Patent 5,428,023 gebildeten Konjugaten beeinträchtigt die Anbringung eines bioaktiven Stoffes an das Kobaltatom in der axialen Position nicht die rezeptorvermittelte Endozytose aus dem Blut in Zellen.
Die in der Regel schwache Bindung zwischen einem Kobaltatom und einem nicht-reaktiven Atom (z. B. C-Co-Bindung) des Biokonjugats stellt einen einfach ansprechbaren Auslöser für die kontrollierte in-vitro-Freisetzung des bioaktiven Stoffes aus dem organischen Kobaltkomplex bereit. Die Bindungsdissoziationsenergie (BDE) einer Bindung zwischen einem Kobaltatom und einem nicht-reaktiven Atom in dem Biokonjugat liegt im Bereich von 30 bis 50 kcal/mol (z. B. 30–40 kcal/mol für eine Co-C-Bindung), was sie zu einer der schwächsten bekannten kovalenten Bindungen macht, obwohl die Bindung in wässriger Lösung relativ stabil ist.
Eine gängige Strategie modifiziert das Antikrebsmittel derart, dass es eine elektrophile Stelle aufweist, die mit den hoch nukleophilen Co(I)-Zwischenstufen reagieren kann, die nach Behandlung von Hydroxycobalamin mit NaBH₄ erzeugt werden. Diese strukturelle Modifizierung ist ausreichend weit von der aktiven Stelle (dem Pharmakophor) entfernt, um jegliche Störung der gewünschten biologischen Aktivität auszuschließen. Die im Fall von Chlorambucil verwendeten Ansätze sind typisch: die Carboxylsäuregruppe von Chlorambucil wird entweder in ein Säurechlorid oder einen Bromethylester umgewandelt, die beide effektiv mit Cob(I)-Amin gekoppelt werden können.
Allgemeine Strategie:
Beispielsweise wird reduziertes Cbl^I durch NaBH₄- oder Zinkstaub-Reduktion hergestellt, z. B. aus Hydroxycob(III)alamin. Im obigen Schema kann der Arzneistoff ein zytotoxischer Stoff, ein anderer Arzneistoff oder ein anderer bioaktiver Stoff wie hierin beschrieben sein. In andere Schemata wird ein Abstandshalter eingeführt, der ein Kohlenstoffatom oder ein anderes Atom der Art enthält, wie für das nicht-reaktive Atom zum Binden des Kobaltatoms spezifiziert, und welches auch eine reaktive Gruppe enthält, z. B. -OH oder -CN, welche weiter mit dem bioaktiven Stoff umgesetzt wird. Andere reaktive Gruppen, z. B. -NH2, -SH, -COOH, etc. können ebenfalls zum Koppeln eines bioaktiven Stoffes verwendet werden. Es muss darauf hingewiesen werden, dass in manchen Fällen (z. B. Chlorambucil, Doxorubicin) das kleine freigesetzte organische Molekül nicht der Ausgangsarzneistoff ist, sondern vielmehr einige der Modifikationen bewahrt, die eingebaut worden sind, um die Kopplung zu ermöglichen. In anderen Fällen (z. B. Topotecan) kann die Struktur des freigesetzten Arzneistoffes dem Ausgangsmolekül entsprechen.
Spezifischere Einzelheiten der Synthese stellvertretender Biokonjugate gemäß der vorliegenden Erfindung sind wie folgt, wobei ein „Arzneistoff", der durch jeden geeigneten bioaktiven Stoff ersetzt werden kann, und Cobalamin, das durch jeden geeigneten organischen Kobaltkomplex ersetzt werden kann, verwendet werden. Bei dieser Synthese laufen alle Prozesse unter Argon ab. Hydroxycob(III)alamin wird in wässrigem CH3OH (1:1 Vol./Vol.) bei 25°C gelöst. Es wird NaBH4 in zweifachem Überschuss zugegeben. Die Lösung verändert langsam die Farbe von rot nach braun und allmählich zu grün (Cbl^I). Nach etwa 15 Minuten wird der elektrophile Arzneistoffligand (im selben entoxygenierten Lösungsmittel gelöst) zugegeben, z. B. als ein Alkyl-, Acyl- oder Arylchlorid. Es werden strikt anaerobe Bedingungen aufrechterhalten, und die Reaktionsmischung wird vorsichtig bei 25°C gerührt. Die Farbe wechselt allmählich zurück zu rot, während Cb^I zu Alkyl-, Acyl- oder Aryl-Cb^III umgewandelt wird. Nach etwa 1,5 Stunden wird die Lösung mit verdünntem HCl auf pH 3,0 angesäuert. Unter verringertem Druck wird durch Rotationsverdunstung bei unter 40°C Methanol entfernt. Die resultierende wässrige Lösung wird mit einem gleichen Volumen an H₂O verdünnt und auf eine Dowex AG-50-X2 (200–400 Mesh)-Kationenaustauschersäule geladen. Die Säule wird nacheinander mit H₂O und 0,1 M NaOAc, pH 4,6 gewaschen. Fraktionen, die Arzneistoff-Cob(III)alamin enthalten, erscheinen rot und werden entsprechend aufgefangen. Nicht umgesetztes Hydroxycob(III)alamin bleibt in der Säule. Kombinierte Fraktionen von Arzneistoff-Cob(III)alamin werden mit Phenol extrahiert und durch Rotationsverdunstung konzentriert. Arzneistoff-Cob(III)alamin kann häufig durch Zugabe von Aceton zu einer konzentrierten wässrigen Lösung kristallisiert werden. Die Alkyl-, Acyl- oder Aryl-Cobalaminkonjugate werden durch NMR, Massenspektrometrie (FAB, Cl oder Elektrospray) und IR-Verfahren charakterisiert.
Ein methotrexathaltiges Biokonjugat kann nach den folgenden Verfahren synthetisiert werden.
In Verfahren eins, indem obiger Prozess verwendet wird, wird Methotrexat (MTX) in sein entsprechendes Acylchlorid umgewandelt und mit Cobalamin und/oder Co(III)[SALEN] und/oder anderen offenbarten organischen Kobaltkomplexen umgesetzt, um Methotrexat-Cobalamin und Methotrexat-Co(III)[SALEN] gemäß folgendem Reaktionsschema I zu erhalten. In Alternativverfahren zwei wird aus einem Acylchlorid mit einer geschützten Aminogruppe zunächst die C-Co-Bindung gebildet. Der Schutz der Aminogruppe wird dann entfernt, gefolgt von der Bildung der Amidbindung an ein Aminobenzoylpterin gemäß folgendem Reaktionsschema II.
Ein aminopterinhaltiges Biokonjugat kann nach folgendem Verfahren synthetisiert werden. Das Des-Methyl-Derivat von Methotrexat (Aminopterin) wird wie gezeigt nach folgender Reaktionsformel an Kobalt gekoppelt, wobei das Iminiumion entweder direkt mit Co(I) umgesetzt wird oder das Iminiumion zu dem Aminonitril umgewandelt und dann langsam demaskiert wird, um das Iminiumkation aufzudecken.
Ein topotecanhaltiges Biokonjugat kann nach folgendem Verfahren synthetisiert werden. Die zytotoxische Aktivität von Topotecan (TPT) oder Camptothecin (CPT) beruht auf deren Fähigkeit, „spaltbare Komplexe" aus Topoisomerase I und DNA zu fixieren (Pommier et al., 1989). Da manche Tumorarten stark erhöhte Spiegel von Topo I aufweisen (Giovanella et al., 1989), haben Topoisomerasegifte dieser Art wahrscheinlich einen höheren therapeutischen Index bei der Behandlung solcher Krebsarten. Eine Behandlung mit Camptothecinderivaten könnte jedoch allgemeiner gestaltet werden, wenn sie in Verbindung mit dem Ansatz des zielorientierten Transports kombiniert wird.
Topotecan ist mit Cobalamin, Co[SALEN] und anderen organischen Kobaltkomplexen nach folgenden Reaktionsschema konjugiert. Camptothecin ist auf eine ähnliche Weise konjugiert. Die Herstellung von 10a und 10b umfasst eine ähnliche Chemie wie die oben für 8a, b diskutierte. Die selektive Erzeugung des Phenylchloroformats (25) von Topotecan (5) und Acylierung von Co(I) ergibt 10a. Aussetzen von 25 zu 18 oder Behandlung von 5 mit dem vorher diskutierten Chloroformat 19 ergibt 10b. Konjugate 10c, d erfordert etwas längere Reaktionswege, da sie nicht direkt aus 5 hergestellt werden können. Die etablierten Synthesewege zur Umwandlung des natürlichen Produktes Camptothecin zu 5 können jedoch am entsprechenden Punkt modifiziert werden, um die Anbringung des Kobaltkomplexes zu ermöglichen. Die ersten drei Schritte zur Herstellung der phenolischen Zwischenstufe 26 sind bekannt (Mulliez et al., 1994). Eine Substitution vom Mannich-Typ mit Formaldehyd/Dimethylamin ergibt dann 5. Die Verwendung von Methylamin ergibt das entsprechende sekundäre Amin 27. An diesem Punkt ist durch Co(I)-Trapping eines zweiten in situ erzeugten Imminiumsalzes eine Verknüpfung an das Co über ein Methyl zum Erhalt von 10c möglich. Alternativ ergibt eine N-Alkylierung mit 23 10d. Die Spaltung von 10a und 10b ergibt 5 direkt über einen fragmentarischen Weg oder indirekt über andere Produkte. Die Spaltung von 10c mit Wasserstoffextraktion ergibt 5. Die Spaltung von 10d ergibt das Produkt 5, das eine Ethylmethylaminogruppe anstelle der Dimethylaminogruppe aufweist.
Ein busulfanhaltiges Biokonjugat kann nach folgendem Verfahren synthetisiert werden. Busulfan ist ein Alkylierungsmittel, das therapeutisch gegen chronische myeloische Leukämie (CML) eingesetzt wird. Der bevorzugte Punkt der Anbringung von Busulfan an den organischen Kobaltkomplex ist eine der Alkansulfonateinheiten. Eine leichte Veränderung der Struktur des Sulfonatanteils des Esters hat keinen großen Effekt auf die Fähigkeit des freigesetzten Arzneistoffes zur Vernetzung von DNA. Die Spaltung von 7a, gefolgt von Wasserstoffabstraktion ergibt das gemischte Ethansulfonat/Methansulfonat 2b. Das Trapping des Kohlenstoffradikals unter Oxidationsbedingungen ergibt gemischtes Bis(sulfonat) 2c, welches ebenfalls ein kompetentes Vernetzungsmittel ist. Die Spaltung von 7b bewirkt die Freisetzung des Ausgangsarzneistoffes 2a nach Wasserstoffabstraktion.
Bis-Methalsulfonatbusulfan wird nach den folgenden Reaktionsschemata an Cobalamin, Co[SALEN] und andere organische Kobaltkomplexe konjugiert. Für die Herstellung von 7a dient das kommerziell erhältliche Natriumsalz von Bromethansulfonsäure (11) als Ausgangspunkt. Erhitzung mit Phosphor-Pentachlorid ergibt das entsprechende Sulfonylchlorid 12 als eine destillierbare Flüssigkeit. Behandlung mit Co(I) führt zu einer bevorzugten Verdrängung des Bromids und ergibt 13, welches durch aufeinander folgende Behandlung mit 1,3-Butandiol und Mesylchlorid zu 7a umgewandelt wird. Die Reihenfolge der letzten drei Schritte kann verändert werden; beispielsweise ergibt die Behandlung von 12 mit Butandiol im Überschuss, gefolgt von Mesylchlorid, das gemischte Bis(sulfonat) 14. Selektive Verdrängung von 2-Brombutan-1,4-diol (das einfach aus Apfelsäurediester erhältlich ist) durch Co(I) ergibt Addukt 15. Bis(methylierung) ergibt 7b. Alternativ wird 7b aus 16 (X = Br oder I) mit selektiver Verdrängung des Halids hergestellt.
Ein chlorambucilhaltiges Biokonjugat kann nach den folgenden Verfahren synthetisiert werden. Chlorambucil ist ein relativ stabiler Stickstoffsenf mit abgeschwächter Alkylierungsaktivität, vermutlich als Folge des weniger basischen Anilinstickstoffs.
Verfahren Eins: Bei diesem Prozess wird Chlorambucil in das Säurechlorid umgewandelt, gefolgt von der Reaktion mit Cob(I)alamin oder Co(I)[SALEN] nach Reaktionssequenz I. In Situationen, in denen die Acylverknüpfung an den organischen Kobaltkomplex gegenüber Serumnukleophilen zu labil ist, können zwei alternative Biokonjugationsprozesse verwendet werden.
Verfahren Zwei: Der Prozess umfasst die Bromierung eines Kohlenstoffatoms neben der Carboxylgruppe unter Hell-Vollhardt-Zelinski-Standardbedingungen, um eine Anbringung des Co-Komplexes in der ☐-Position nach Reaktionssequenz II zu ermöglichen. In Schema II ergibt der Austausch von C-Co durch C-H Chlorambucil. Die Reaktanden-Stöchiometrie, Temperatur- und Verdünnungsbedingungen können verändert werden, um eine konkurrierende Verdrängung einer der Chlorethylgruppen oder des C1 durch S_N2-Angriff zu vermeiden.
Verfahren Drei: Das BOC-geschützte p-Aminophenylacetaldehyd kann an die Co-Einheit konjugiert werden, gefolgt von der Bildung des aktiven Stickstoffsenfproduktes nach folgender Reaktionssequenz III.
Ein Chlorambucilethylester-haltiges Biokonjugat kann nach folgenden Verfahren synthetisiert werden. wenn ein Arzneistoff über eine Carboxylgruppe konjugiert wird, wie im Fall von Chlorambucil, könnte eine Verknüpfung des Arzneistoffes mit dem Cobalamin über eine Hydroxyethylbindung wünschenswert sein. Dies kann durch zwei bequeme Wege erreicht werden, die beiden unten schematisch veranschaulicht sind. Erstens kann 2-Hydroxyethyl-cob(III)alamin aus Cob(I)alamin und Bromethanol einfach hergestellt werden. Die Veresterung wird unter Standardbedingungen durchgeführt, d. h. durch Reaktion einer Carboxylsäure (Chlorambucil) mit einem Alkohol (2-Hydroxyethylcob(III)alamin) in Gegenwart von Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) (oder wasserlöslichen Derivaten wie beispielsweise EDCI) und einer katalytischen Menge von 4-N,N-Dimethylaminopyridin (DMAP) und seinem Hydrochloridsalz (DMAP-HCl) in Dichlormethan oder Toluol. Alternativ kann das esterverknüpfte Konjugat hergestellt werden, indem zuerst der 2-Bromethylester von Chlorambucil hergestellt und dann der Ester mit Cob(I)alamin umgesetzt wird, um dasselbe Produkt bereit zu stellen. Die Reaktionsschemata (I, II) sind unten gezeigt. Mit dieser Art der Anbringung führt die Spaltung von dem Biokonjugat zur Freisetzung des Ethylesters von Chlorambucil nach Reaktionsschema III.
Ein etoposidhaltiges Biokonjugat kann nach folgendem Verfahren synthetisiert werden. Etoposid ist ein halbsynthetisches Derivat des natürlichen Produktes Epipodophyllotoxin, das häufig gegen verschiedene Tumoren eingesetzt wird, vor allem gegen kleinzelliges Bronchialkarzinom und Keimzelltumoren (De Jong et al., 1995). Auch bei der Behandlung von resistenten Fällen von Ovarial- und Brustkrebs hat es sich viel versprechend gezeigt. Etoposid scheint als ein Topoisomerease-II-Gift zu wirken.
Etoposid wird nach folgenden Reaktionsschemata an Cobalamin, Co[SALEN] und andere organische Kobaltkomplexe konjugiert. Biokonjugat 8a und 8b erfordert die Umwandlung des freien Phenols von Etoposid (3) in das entsprechende Chlorformat 17. Direkte Acylierung mit Co(I) ergibt das AcylCo(III)-Derivat 8a, während die Behandlung mit dem vorher erwähnten HydroxyethylCo(III)-Derivat 18 Carbonat 8b ergibt. Dieses Derivat ist auch über Acylierung von 3 mit dem aus 18 abgeleiteten Chlorformat 19 erhältlich. Die Herstellung von acetalmodifiziertem Konjugat 8c könnte schwieriger sein. Das Ethylenacetal von 3 kann hydrolysiert werden und dann das Acetyl neu gebildet werden, indem Aldehyd 20a oder Dimethylacetal 20b verwendet werden (Keller-Jusl et al., 1971). Verbindung 20a kann auch über sorgfältige, selektive Oxidation von 18 erhältlich sein, während 20b über Alkylierung des Co(I)-Derivats mit kommerziell erhältlichen Bromacetaldehyd-dimethylacetal erhältlich sein dürfte. Darüber hinaus kann das Acetyl von Glukose gebildet werden, und anschließend kann der sekundäre Alkohol von 21 glucosyliert werden. Spaltung von 8a oder 8b ergibt entweder 3 direkt über fragmentative Wege, oder ergibt Produkte, die schließlich zu 3 hydrolysiert werden können. Trapping mit H+ nach Homolyse von 8c ergibt dann 3.
Ein doxorubicinhaltiges Biokonjugat kann nach folgendem Verfahren synthetisiert werden. Doxorubicin (4) ist das am häufigsten verwendete der Antracyclinantibiotika und wirkt klinisch gegen ein breites Spektrum solider und hämatologischer Tumore. Wie Etoposid scheint Doxorubicin Topoisomerase II anzugreifen, was schließlich zu Wachstumsstillstand und nicht apoptotischem Zelltod führt (Fornari et al., 1996; Ling et al., 1996). Die klinische Nutzbarkeit von Doxorubicin ist aufgrund unspezifischer Toxizität, vor allem Kardiotoxizität, eingeschränkt. Es wäre daher ein besonders guter Kandidat für einen selektiven Transport. Dies wird durch seine häufige Verwendung in liposomenbasierten Verfahren (Johnson et al., 1995; Sivam et al., 1995) oder in Propharmakon-Ansätzen (Svensson et al., 1995) bestätigt.
Doxorubicin wird nach folgenden Reaktionsschemata an Cobalamin, Co[SALEN] und andere organische Kobaltkomplexe konjugiert. Für die Synthese von Biokonjugat 9a wird die Kondensation der Daunosaminaminogruppe mit Acyl-Co(III)-Komplex 22 durchgeführt. Diese Reaktion bildet den 2-Pyrrolinring in Analogie zu veröffentlichten Wegen unter Verwendung von 4-Iodbutyraldehyd und 5-Iod-2-pentanon (9b). Das azyklische tertiäre Aminderivat 9b ist aus 4 über initiale reduktive Aminierung mit Acetaldehyd, dann Alkylierung des resultierenden sekundären Amins mit dem aus 18 abgeleiteten Mesylat 23 erhältlich. Alternativ ergibt die Behandlung von 4 mit Chlorformat 19 Carbamat 9c. Wenn alternative Punkte der Anbringung gewünscht sind, können Hydrazon-verknüpfte Derivate wie 9d verwendet werden, indem einfache Cobalaminalkylhydrazide wie 24 verwendet werden, die aus 23 erhältlich sind. Die Spaltung dieser Biokonjugate ist in dem Reaktionsschema unten gezeigt.
Ein carboplatinhaltiges Biokonjugat kann wie gezeigt nach folgendem Reaktionsschema synthetisiert werden.
Ein peptidhaltiges Biokonjugat kann nach folgenden Verfahren synthetisiert werden: (I) Die C-terminale Carboxylgruppe des Peptids kann aktiviert und verwendet werden, um Co(I) in Analogie zu der Acylierung von Co mit Chlorambucilsäurechlorid zu acylieren. (2) Die C-terminale Carboxylgruppe kann mit Bromethanol in Analogie zu dem anderen Chlorambucilsyntheseweg verestert werden, und das Bromid kann durch Co(I) verdrängt werden. (3) Die N-terminale Aminogruppe des Peptids kann mit CH₂=O und Co(I) behandelt werden, um in Analogie zu der Synthese des Topotecanbiokonjugats eine Co(III)-CH₂-NH-Peptidverknüpfung zu bilden. (4) Es kann ein Co(III)-Aminosäurekomplex hergestellt und in einem Kopplungsschritt mit dem Rest des Peptids verwendet werden. Diese Verfahren können die Anbringung des Co entweder am N- oder am C-Terminus oder über eine Seitenkette beinhalten. Bei jedem dieser Synthesewege kann ein längerer Linker verwendet werden, wenn es wünschenswert ist, den Kobaltkomplex von der Peptidkette weiter entfernt zu halten.
Ein oligonukleotid- oder nukleinsäurehaltiges Biokonjugat kann nach folgenden Verfahren synthetisiert werden. In beiden Verfahren wird ein Phosphatester verwendet, um das Ende des Nukleotids und eine Hydroxyethyl-Co-Gruppe zu verknüpfen. Diese Verknüpfung kann entweder durch direkte Kopplung von Co-CH₂CH₂-OH und Nukl-OPO₃ ^2- erreicht werden oder indem Nukl-OPO₃ ^2- mit Br-CH₂CH₂-OH verestert wird, dann das Br durch Co(I) wie oben verdrängt wird.
Ein unsymmetrisch substituierter Co[SALEN]-Komplex kann aus 5-Aminosalicylaldehyd und dem Glycolatether von 2,5-Dihydroxybenzaldehyd hergestellt werden. Die Aminogruppe, die aus kommerziell verfügbarem 5-Nitrosalicylaldehyd hergestellt wird, dient als Anbringung für das Targeting-Molekül (Bindungsdomäne, BD) über EDCI-katalysierte Amidbildung. An dem anderen Molekül ist eine Carboxylsäure zur Verstärkung der Löslichkeit angebracht. Durch Kopplung dieser zwei Moleküle mit Ethylendiamin und Co(II)acetat erhält man eine Mischung von drei Komplexen: die beiden symmetrischen Komplexe und der Gemischte. Alle sind geeignet, obgleich derjenige, der an keiner Seite des SALENs eine BD-Einheit aufweist, am wenigsten bevorzugt ist.
Was die Bindungsdomänen anbelangt, sind zwei Möglichkeiten gezeigt: ein Cobalaminderivat und ein Peptid. Im ersten Fall wird die bekannte Carboxylsäure verwendet, um Cobalamin an die Aminogruppe von SALEN anzubringen. Dieses Biokonjugat verwendet dennoch cobalaminbasierte rezeptorvermittelte Endozytose, um in die Zelle zu gelangen, aber der Arzneistoff ist über das SALEN angebracht anstatt über Cobalamin. Im zweiten Fall wird ein Peptid verwendet, von dem bekannt ist, dass es an Zelloberflächenrezeptoren von Tumorzellen bindet (z. B. ein Fragment des epidermalen Wachstumsfaktors), wobei der Carboxylterminus an die Aminogruppe an dem SALEN angebracht ist. Alternativ wird eine der Glutamatcarboxylgruppen von Folat verwendet, um ein folatbasiertes Biokonjugat zu erhalten. Außer der Verbindung der Bindungsdomäne über eine Amidverknüpfung könnte man reduktive Aminierung verwenden, wenn das Targeting-Molekül ein Aldehyd enthält (BD-CHO+SALEN-NH₂ + NaBH₄), oder man könnte die Carboxylgruppe an dem anderen Stück könnte verwenden, um eine Amid- oder Esterverknüpfung zu bilden. Es sind auch noch viele andere Ansätze möglich (z. B. Etherbildung, Olefinierung durch die Wittig-Reaktion, Anbringung über einen Diester- oder Diamidlinker, etc.)
Erweitere Benzenoidsysteme der SALEN-Liganden sind unten gezeigt.
Als Ausgangspunkt in deren Synthese können alle beliebigen kommerziell verfügbaren Naphthalendiole verwenden werden. Die Diole unterlaufen Formylierungsreaktionen, um die unten gezeigten Moleküle zu erhalten. Diese Moleküle werden dann mit Co(II)acetat und verschiedenen Diaminen gekoppelt, um die erweiterten Co[SALEN]-Komplexe zu ergeben. Die OH-Gruppen an dem zweiten Ring können intakt bleiben, zur Anbringung der Bindungsdomäne verwendet werden, oder modifiziert werden, um die Wasserlöslichkeit durch Anbringung einer polaren Gruppe wie Polyamin, Polycarboxylsäure oder einer Kohlenhydrateinheit zu verstärken.
Um mit Pyridin fusionierte SALENe zu erhalten, wird auch eine Modifikation von Chinolinen und Isochinolinen durchgeführt.
Entlang ähnlicher Reaktionswege werden SALENE aus monozyklischen heterozyklischen Hydroxyaldehyden hergestellt, wovon Beispiele unten gezeigt sind.
Ein Biokonjugat, welches das „grüne Corrinoid" (Brown et al., 1996) enthält, kann wie folgt synthetisiert werden. Das „grüne Corrinoid" kann analog zu Kobalt reduziert werden und dass reduzierte Corrinoid reagiert mit Iodmethan, um das Methyl-Co(II)-Corrinoid zu bilden. Da das Methyl-Co(II)-Corrinoid ein ähnliches Verhalten aufweist wie natürliches Cobalamin, können ähnliche Konjugationsprozesse mit den elektrophilen Arzneistoffderivaten wie oben beschrieben durchgeführt werden.
"Grünes Corrinoid"
Die Biokonjugate der vorliegenden Erfindung haben die verbesserte Eigenschaft einer gezielten, selektiven Freisetzung des bioaktiven Stoffes aus dem Biokonjugat. Der bioaktive Stoff wird durch Spaltung aus dem Biokonjugat freigesetzt. In einer Ausführungsform kann die Spaltung als ein Ergebnis normaler Verdrängung durch zelluläre Nukleophile oder enzymatische Wirkung stattfinden. In einer zweiten Ausführungsform kann durch ein externes Signal bewirkt werden, dass die Spaltung selektiv an der Freisetzungsstelle stattfindet. Das externe Signal kann Licht oder Lichtanregung, d. h. Photolyse, oder Ultraschall, d. h. Sonolyse, sein. Wenn die Photolyse in Gegenwart eines die Freisetzungsstelle umgebenden Magnetfelds stattfindet, kann darüber hinaus die Freisetzung des Arzneistoffes wie beispielsweise eines zytotoxischen Stoffes, in das umliegende gesunde Gewebe minimiert werden.
Obgleich es wünschenswert ist zu veranlassen, dass der bioaktive Stoff bei den gewünschten Zellen, Geweben oder Organen, z. B. an der Stelle des Tumors oder anderer Krebszellen, freigesetzt wird, ist es ebenfalls wünschenswert, benachbarte Gewebe von den negativen Nebenwirkungen solcher potenter Stoffe zu schützen. Der bioaktive Stoff wird von dem Biokonjugat vorzugsweise durch Anwendung eines externen Signals wie Licht oder Ultraschall an der Zielstelle freigesetzt. Die Photolyse der Biokonjugate der vorliegenden Erfindung findet durch Spaltung der Co-C-Bindung statt, um ein Radikalpaar in einem Lösungsmittelkäfig herzustellen, das aus Co(II) und dem Radikal des bioaktiven Stoffes (R·) besteht. Lott et al. (1995) zeigten, dass Alkylcob(III)alaminphotolyse eine magnetfeldabhängige Rekombination durchlaufen kann. Ein angelegtes Magnetfeld von 100–3000 Gauss kann verwendet werden, um die Rekombination von Radikalpaaren im umliegenden Gewebe, wo keine Arzneistofffreisetzung aus dem Konjugat wünschenswert ist, zu verstärken, was zu einer mindestens 2-fachen Verringerung der photochemisch ausgelösten Arzneistofffreisetzung in solchem umliegenden gesunden Gewebe führt.
Die Sonolyse der Biokonjugate der vorliegenden Erfindung findet durch Spaltung der Bindung zwischen dem Kobalt und dem nicht reaktiven Atom in wässriger Lösung statt, um unter anaeroben Bedingungen den bioaktiven Stoff und ein Co(II) (z. B. Cob(II)alamin (Cbl^II)) oder unter aeroben Bedingungen den bioaktiven Stoff und Aquo-Co(III) (z. B. Aquo-Cob(III)alamin (H₂O-Cbl^III)) herzustellen. In jedem Fall bewirkt die Sonolyse durch die fokussierte Anwendung von Ultraschall die Spaltung der Bindung zwischen dem Kobalt und dem nicht reaktiven Atom und die irreversible Freisetzung des bioaktiven Stoffes aus dem organischen Kobaltkomplex.
Die Biokonjugate der vorliegenden Erfindung können wie folgt eine natürliche Spaltung durchlaufen. Biokonjugate können durch natürliche Mittel wie beispielsweise durch Serumnukleophile gespalten werden. Sind Cobalamin-Arzneistoff-Biokonjugate (hier nur als Beispiel verwendet und nicht als Einschränkung der Erfindung) in der Zelle, können sie durch verschiedene Mechanismen gespalten werden. B₁₂-Ligandenaustausch-Standardmechanismen erlauben die Verdrängung des Arzneistoffes. Alternativ können zelluläre Nukleophile entweder das Kohlenstoff- oder das Kobaltatom der Co-C-Bindung angreifen. Cyanid ist das häufigste Beispiel eines Nukleophils, das am Kobalt angreift, was Cyanocob(III)alamin und einen freien Arzneistoff ergibt, in dem die frühere C-Co-Bindung durch eine C-H-Bindung ersetzt ist. Thiole (wie die in Cystein oder Glutathion vorhandenen) können am Kohlenstoff angreifen, was zu einem reduzierten Cob(I)alamin und einem freien Arzneistoff führt, in dem die vorherige Thiolgruppe eingebaut ist (z. B. R-Co[III] + R'-SH + Base --> R-S-R' + Co[I] + Base-H). Auch Hydroxid und andere basische Stoffe können organische Liganden aus Co[III]-Komplexen spalten, obwohl dies typischerweise über einen Eliminierungsvorgang abläuft, welcher die Struktur des Liganden durch Einbau einer neuen Doppelbindung verändert. Darüber hinaus können in Zellen vorhandene B₁₂-metabolische Enzyme zur Spaltung des bioaktiven Stoffes aus dem Co-Atom führen.
Das Biokonjugat der vorliegenden Erfindung kann durch Lichtaktivierung oder Photolyse wie folgt gespalten werden. Die photochemische Freisetzung des bioaktiven Stoffes aus dem organischen Kobaltkomplex kann durch Anwendung von sichtbarem Licht bei 400–800 nm ausgelöst werden. Es ist bevorzugt, organische Kobaltkomplexe zu verwenden, die längere Wellenlängen sichtbaren Lichts (600–800 nm), mehr bevorzugt roten Lichts (600 bis 750 nm), erfordern. Wenn für die Freisetzung des bioaktiven Stoffes aus dem Biokonjugat Photolyse verwendet wird, ist es besonders bevorzugt, dass das nicht-reaktive Atom des bioaktiven Stoffes oder das Atom des an das Kobaltatom gebundenen Abstandshalters ein Kohlenstoffatom ist.
Der Vitamin-B₁₂-Cofaktor kommt natürlicherweise in zwei Formen vor: Adenosylcob(III)alamin (AdoCbl^III), auch Coenzym-B12 genannt, und Methylcob(III)alamin (CH₃Cbl^III). Die bemerkenswert schwache C-Co-Bindung aus dem Corrinring an den 5'-Desoxyadenosyl- oder Methylliganden verleiht Cobalaminen eine sehr ungewöhnliche Chemie. Die C-Co-Bindungsenergie in AdoCbl^III und CH₃Cbl^III wird auf nur 31 bzw. 37 kcal/mol geschätzt. Dies macht die C-Co-Bindung zu einer der schwächsten bekannten kovalenten Bindungen und erlaubt eine Lichtspaltung der Bindung durch sichtbares Licht. Das anfängliche Produkt der Lichtspaltung von AdoCbl^III ist das paarweise Radikalpaar {CH₂-Ado:Cbl^III}. Die Klammern {:} zeigen an, dass das Radikalpaar paarweise vorliegt (vom demselben Stammmolekül abstammt) und durch Lösungsmittelwechselwirkungen eng zusammengehalten wird. Laserblitzphotolyseexperimente im Picosekundenbereich mit AdoCbl^III haben gezeigt, dass es sich dabei um einen reversiblen Prozess mit einer paarweisen Rekombinationsratenkonstante von K_rek ^~ 1 × 10⁹ s^–1 nach der Photolyse handelt. Kürzliche Laserblitzphotolyseexperimente im Nanosekundenbereich haben eine langsamere Radikalpaarkombination untersucht, die in dem Lösungsmittel vorkommt und durch Diffusion eingeschränkt ist.
Der π- π*-Elektronenübergang des Corrinrings von Cobalamin produziert ein langwelliges Absorptionsmaximum bei 525 nm, wie in 1 gezeigt. Bestrahlung von Alkylcobalaminen bei dieser Wellenlänge führt zur Spaltung der C-Co-Bindung mit einer Photolyse-Quantenausbeute von 0,1–0,3. Die in-vivo-Photolyse von Biokonjugaten gemäß der vorliegenden Erfindung wird aufgrund der starken Absorption von Hämoglobin im Bereich dieser Wellenlänge vorzugsweise erreicht, indem das Licht mit einer Glasfasersonde transportiert wird. Um mögliche Probleme mit dem Absorptionsspektrum von Cobalaminen zu vermeiden, während eine photolabile C-Co-Bindung erhalten bleibt, kann Co[SALEN], ein Analog von Coenzym-B₁₂ mit fünf Koordinaten, verwendet werden. Alkyl-Co[SALEN]-Komplexe haben Absorptionsmaxima im Bereich von 650 nm mit einer signifikanten Absorption jenseits von 700 nm wie in 2 gezeigt. Für die lichtaktivierbare Arzneistofffreisetzung ist dies ein deutlicher Vorteil, da menschliches Gewebe über 610 nm zunehmend transparent wird. Es sind andere synthetische oder natürlich vorkommende B₁₂-Derivate verfügbar oder könnten verfügbar werden, die Absorptionsmaxima über 600 nm aufweisen. Beispielsweise wurde von Brown et al. (1996) ein grünes Kobaltcorrinoid mit einem Absorptionsmaximum bei etwa 624 nm berichtet. Menschliches Gewebe wird bei Wellenlängen von etwa 600 bis 800 nm bis zu einer Tiefe von bis zu etwa 5,7 cm transparent. Die Verwendung längerer Wellenlängen ermöglicht die selektivere Bestrahlung eingeschränkter Abschnitte des Körpers eines Individuums mit einer anschließenden Freisetzung in einer kleinen Zielregion.
Die Biokonjugate der vorliegenden Erfindung können durch Lichtaktivierung oder Photolyse in Gegenwart eines Magnetfelds wie folgt gespalten werden. Die Anwendung des Magnetfelds engt die Freisetzung des bioaktiven Stoffes weiter auf die gewünschte Stelle ein. Aufgrund der Toxizität antineoplastischer Mittel für gesundes Gewebe ist es für jedes wirkungsortspezifische Transportsystem obligatorisch, den Schaden von Zellen, die sich nicht am Ort der Aktivität befinden, zu beschränken. Bei der Photohomolyse-Spaltreaktion beginnen die Elektronen in der aufgebrochenen kovalenten Bindung mit einer Spinpaarung von ⇅ (Singulett-Zustand) aufgrund der Beteiligung an der kovalenten Bindung. Zu Beginn der Lebenszeit des Radikalpaars behalten die Spins ihre ursprüngliche Ausrichtung R↑ + R'↓ bei, bis die Elektronenspins mit der Zeit randomisieren. Solange die Spins gepaart sind, können die Radikale rekombinieren und zum Ausgangsmaterial zurückkehren. Wenn eines dieser gepaarten Radikalspins einen Intersystem-Cross (ISC) zum Triplett-Spinzustand (R↑ + R'↑) durchläuft, können sie nicht länger rekombinieren, solange ihre Spins nicht wieder gepaart sind. Diese Situation ist bevorzugt, um den bioaktiven Stoff aus dem Biokonjugat freizusetzen. In gesundem Gewebe ist es jedoch wünschenswert, die Spaltung des Konjugats zu verhindern oder mindestens zu minimieren. In diesem Fall ist es wünschenswert die ISC-Rate zu verändern, indem ein externes Magnetfeld eingeführt wird, das den Abstand zwischen den Energieniveaus des Triplett-Zustands vergrößert, und somit die Rekombination des ursprünglichen Biokonjugats in den gesunden Geweben fördert.
Die Rekombinationsrate kann durch Anlegen eines Magnetfelds im Bereich von 100–300 Gauss an die gesunden Gewebe erhöht werden, was zu einer Nettoverringerung der photochemischen Quantenausbeute und einer Verringerung der Arzneistofffreisetzung in gesunde Gewebe um einen Faktor von mindestens 2 führt. Das Anlegen von etwa 300 bis 1000 Gauss gilt als optimal. Siehe Grissom (1995).
Die Biokonjugate der vorliegenden Erfindung können durch Ultraschall oder Sonolyse wie folgt gespalten werden. Obgleich jedes nicht-reaktive Atom an das Cobaltatom in dem Biokonjugat gebunden sein und durch Sonolyse gespalten werden kann, ist es bevorzugt, dass das Atom ein Kohlenstoffatom ist. Der Vitamin-B₁₂-Cofaktor kommt natürlicherweise in zwei Formen vor: Adenosylcob(III)alamin (AdoCbl^III), auch Coenzym-B12 genannt, und Methylcob(III)alamin (CH₃Cbl^III). Die bemerkenswert schwache C-Co-Bindung aus dem Corrinring an den 5'-Desoxyadenosyl- oder Methylliganden verleiht Cobalaminen eine sehr ungewöhnliche Chemie. Die C-Co-Bindungsenergie in AdoCbl^III und CH₃Cbl^III wird auf nur 31 bzw. 37 kcal/mol geschätzt. Dies macht die C-Co-Bindung zu einer der schwächsten bekannten kovalenten Bindungen und erlaubt eine Sonolyse der Bindung durch die Anwendung von Ultraschall im Bereich von etwa 20 kHz–500 MHz, vorzugsweise 20 kHz–100 MHz, mehr bevorzugt 20 kHz bis 10 MHz.
Sonolyse wässriger Lösungen bewirkt eine hohe Konzentration von Hydroxylradikalen und Wasserstoffatomen nach der Gleichung: H-OH → H· + ·OH
Diese reaktiven oxidierenden und reduzierenden Arten sind für das Auslösen der meisten Reaktion in wässrigen Lösungen verantwortlich. Ultraschallbestrahlung und Sonochemie sind häufig nicht als energiereiche Prozesse beschrieben, aber Entwicklung, Wachstum und Implosion von Bläschen in einer Flüssigkeit während der Sonolyse schaffen extreme Reaktionsumgebungen auf mikroskopischer Skala. Das Zusammenfallen von Kavitationsbläschen erzeugt Drücke > 500 atm und Temperaturen > 5000°C. Die gebildeten Radikale überleben das Zusammenfallen der Bläschen. Aufgrund der potenziell schädlichen Effekte oxidierender freier Radikale in menschlichem Gewebe stand die Bildung von Hydroxylradikalen in vivo im Kern mehrerer Untersuchungen. Solche Radikale stellen jedoch kein unannehmbares Gesundheitsrisiko dar, da klinische Erfahrung gezeigt hat, dass diagnostischer Ultraschall ein nicht schädliches Verfahren ist. Die Möglichkeit zur Bildung dieser Radikale durch Sonolyse in vivo bietet einen Mechanismus für die ausgelöste Freisetzung aktiver neoplastischer und anderer Stoffe durch Konjugation mit B12, Co[SALEN] und andere geeignete Cobalamin- oder cobalaminähnliche Substrate.
Bei der Sonolyse von Arzneistoff-B12-Konjugaten (hier nur als Beispiel genutzt und nicht als Einschränkung der Erfindung bestimmt) wird die C-Co-Bindung in wässriger Lösung gespalten, um unter anaeroben Bedingungen den Arzneistoff und ein Cob(II)alamin (Cbl^II) oder unter aeroben Bedingungen den Arzneistoff und Aquocob(III)alamin (H₂O-Cbl^III) herzustellen. Die Spaltung ist kein direktes Aufbrechen der C-Co-Bindung. Vielmehr findet die Spaltung der C-Co-Bindung durch Sonolyse unter anaeroben Bedingungen hauptsächlich durch Reduktion von Arzneistoff-Cbl^III zu dem labilen Arzneistoff-Cbl^II durch H· statt, gefolgt von einer Dissoziation in den Arzneistoff mit abgeschlossener Elektronenschale (Closed-shell) und Cbl^II. Die Reaktion von HO· mit Arzneistoff-Cbl^II führt zu H₂O-Cbl^III sowie zur Degradation des Corrin-Rings. Unter aeroben Bedingungen findet die Spaltung der C-Co-Bindung durch Sonolyse durch Reduktion von Arzneistoff-Cbl^II statt, um Arzneistoff und Cbl^II zu erhalten, aber O₂ oxidiert Cbl^II zu H₂O-Cbl^III. In jedem Fall führt die Sonolyse durch gezielte Anwendung von Ultraschall zu einer Spaltung der C-Co-Bindung und der irreversiblen Freisetzung des Arzneistoffs aus Cobalamin. Durch Sonolyse ausgelöste Freisetzung kann daher gleichermaßen unter aeroben wie unter anaeroben Bedingungen stattfinden.
Die vorliegende Erfindung eignet sich zu der Behandlung von (einschließlich, jedoch nicht ausschließlich) Krebs, Hepatitis, Psoriasis und andere lokalisierte Erkrankungen sowie für Gentherapie und Peptidtherapie. Die Biokonjugate gemäß der vorliegenden Erfindung können auf jedem Weg verabreicht werden, einschließlich intravenös, parenteral, oral, intramuskulär, intrathekal oder als Aerosol. Die Art des Transports richtet sich weitgehend nach dem biologischen Effekt, der erreicht werden soll. Einem Fachmann ist der beste Verabreichungsweg für eine bestimmte Behandlung gemäß der vorliegenden Erfindung bekannt. Die geeigneten Dosen richten sich nach dem Verabreichungsweg und der angezeigten Behandlung und können von einem Fachmann einfach bestimmt werden, beispielsweise durch Extrapolation derzeit bekannter Behandlungsprotokolle. Wenn der organische Kobaltkomplex des Biokonjugats Cobalamin oder ein Derivat oder ein Analog ist, ist es bevorzugt, vor der Verabreichung des Biokonjugats einen Bolus von Vitamin B₁₂ oral zu geben, um eine mögliche Lebertoxizität zu reduzieren oder zu beseitigen, die sich sonst aus der Gabe des Biokonjugats ergeben könnte. Die orale Dosis an B₁₂ sättigt das enterohepatische Shuttle-System und lädt Hepatozyten mit Cobalamin. Es ist bevorzugt, dass vor der Verabreichung des cobalaminhaltigen Biokonjugats 0,1 mg bis 100 mg, mehr bevorzugt 1,0 mg bis 20 mg Vitamin B₁₂ verabreicht werden. Darüber hinaus kann Vitamin B₁₂ nach der selektiven Spaltung von Biokonjugat verabreicht werden, vorzugsweise intravenös, um das gesamte Biokonjugat auszuwaschen, das nicht gespalten wurde, und so die potenziellen systemischen Effekte weiter zu verringern. Es ist bevorzugt, dass 0,1 mg bis 100 mg, mehr bevorzugt 10 mg bis 100 mg Vitamin B₁₂ in Salzlösung intravenös über 4–5 Std. verabreicht werden. Vor der Verabreichung eines cobalaminbasierten Biokonjugats kann schließlich Dem Individuum Stickstoffoxid verabreicht werden, um die Körperspeicher von Cobalamin in seinen verschiedenen Formen wie beispielsweise Methylcobalamin zu leeren. Die Verabreichung von Stickstoffoxid hat den Effekt, ein größeres Körperdefizit an Cobalamin zu erzeugen, bevor das cobalaminbasierte Biokonjugat verabreicht wird.
Pharmazeutische Zusammensetzungen, die eine Verbindung der vorliegenden Erfindung als den aktiven Inhaltsstoff enthalten, können nach herkömmlichen pharmazeutischen Compounding-Techniken hergestellt werden. Siehe beispielsweise Remington's Pharmaceutical Sciences, 17te Auflage (1985, Mack Publishing Co., Easton, PA, USA). Typischerweise wird eine antagonistische Menge an aktivem Inhaltsstoff mit einem pharmazeutisch annehmbaren Trägerstoff gemischt. Der Trägerstoff kann je nach der Form der für die Verabreichung, z.B. intravenös, oral, parenteral, intrathekal, transdermal oder als Aerosol, gewünschten Zubereitung sehr unterschiedliche Formen haben.
Für die orale Verabreichung können die Verbindungen in festen oder flüssigen Zubereitungen wie Kapseln, Pillen, Tabletten, Lutschtabletten, Schmelzpräparaten, Pulvern, Suspensionen oder Emulsionen formuliert sein. Bei der Herstellung der Zusammensetzungen in oraler Dosisform können beliebige der üblichen pharmazeutischen Medien verwendet werden, wie beispielsweise, im Fall oraler flüssiger Zubereitungen (wie beispielsweise Suspensionen, Elixire und Lösungen), Wasser, Glykole, Öle, Alkohole, Aromastoffe, Konservierungsmittel, Farbstoffe, Suspensionsmittel und dergleichen; oder im Fall von oralen festen Zubereitungen (wie beispielsweise Pulvern, Kapseln oder Tabletten) Trägerstoffe wie Stärken, Zucker, Verdünnungsmittel, Granulationsmittel, Befeuchtungsmittel, Bindemittel, Zerfallsmittel und dergleichen. Aufgrund der Einfachheit ihrer Verabreichung stellen Tabletten und Kapseln die vorteilhaftesten oralen Dosiseinheit-Formen dar, wobei in diesem Fall natürlich feste pharmazeutische Trägerstoffe verwendet werden. Falls gewünscht, können Tabletten nach Standardtechniken mit Zucker beschichtet oder dünndarmlöslich sein. Der aktive Stoff muss so stabil sein, dass er den Magendarmtrakt passieren kann. Falls erforderlich können geeignete Mittel für einen stabilen Durchgang verwendet werden und können in der Literatur beschriebene Phospholipide oder Lecithinderivate sowie Liposomen, Mikropartikel (einschließlich Mikrokügelchen und Makrokügelchen) umfassen.
Für die parenterale Verabreichung kann die Verbindung in einem pharmazeutischen Trägerstoff gelöst werden und entweder als eine Lösung oder eine Suspension verabreicht werden. Veranschaulichend für solche geeigneten Trägerstoffe sind Wasser, Salzlösung, Dextroselösungen, Fruktoselösungen, Ethanol oder Öle tierischen, pflanzlichen oder synthetischen Ursprungs. Der Trägerstoff kann auch andere Inhaltsstoffe enthalten, beispielsweise Konservierungsmittel, Suspensionsmittel, Solubilisierungsmittel, Puffer und dergleichen. Wenn die Verbindungen intrazerebroventrikulär oder intrathekal verabreicht werden, können sie auch in Gehirn-Rückenmarks-Flüssigkeit gelöst werden.
Bei der Behandlung von Krebs (Sarkome, Karzinome oder Leukämien) kann eine Unterscheidung zwischen den Arten systemischer adjuvanter Chemotherapien getroffen werden, die typischerweise zusammen mit den extremeren Verfahren chirurgischen Exzision und Bestrahlungstherapie verwendet werden. Es gibt zwei allgemeine Klassen chemotherapeutischer Adjuvanzien: (1) endokrine und antivasogene therapeutische Mittel, die darauf abzielen, die Physiologie des Körpers zu verändern, und (2) zytotoxische chemotherapeutische Mittel, die typischerweise systemisch verabreicht werden, um transformierte Zellen abzutöten oder ihr Wachstum zu hemmen.
Zytotoxische oder antineoplastische Mittel werden durch eine Anzahl von Arzneistoffklassen wiedergegeben. Alkylierende Mittel durchlaufen chemische Reaktionen, die hoch reaktive elektrophile "carborationsnium"-Ionen erzeugen, die leicht kovalente Verknüpfungen (Alkylat) mit verschiedenen nukleophilen biologisch wichtigen Einheiten wie Nukleinsäurebasen und Phosphaten, Amin-, Sulfhydryl-, Hydroxyl-, Carboxyl- und Imidazolgruppen formen. Diese Mittel haben, neben anderen Funktionen, zytotoxische Wirkungen, welche die fundamentalen Mechanismen beim Zellwachstum, der mitotischen Aktivität, der Differenzierung und der Funktion der Zelle stören. Chlorambucil, modifiziertes Busulfan, Cyclophosphamid, Ifosfamid und Cisplatin und seine strukturellen Analoga sind Beispiele alkylierender Mittel.
Antimetabolite wie Folsäureanaloga (z. B. Methotrexat) und Pyrimidinanaloga (z. B. Fluoruracil und Fluordesoxyuridin) üben zytotoxische Aktivität aus, indem sie Stoffwechselwege blockieren oder verhindern, was zur Zerstörung neoplastischer Zellen führt. Methotrexat ist bekannterweise auch zur Behandlung von Psoriasis geeignet, indem es die Proliferation epidermaler Zellen hemmt.
Eine andere wirksame zytotoxische Klasse sind Mitose-Inhibitoren wie Paclitaxel oder die Alkaloide Camptothecin, Vincristin und Vinblastin.
Bestimmte Antibiotika wie Doxorubicin und Daunorubicin (tetrazyklische Aglykonglykoside) interkalieren ferner mit DNA und hemmen die Nukleinsäuresynthese.
Gemäß der vorliegenden Erfindung werden Biokonjugate für die Behandlung von Krebs vorzugsweise durch Verwendung von Chemotherapeutika gebildet, die aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus alkylierenden Mitteln, Antimetaboliten und Mitoseinhibitoren besteht. Beispielsweise ist Methotrexat ein Antimetabolit; Chlorambucil, Cisplatin und modifiziertes Busulfan sind alkylierende Mittel und Camptothecin und seine Derivate sind Alkaloide. Die aus diesen zytotoxischen Mitteln gebildeten Biokonjugate können intravenös zur Behandlung der spezifischen Klassen von Krebs verabreicht werden, gegen die sie bekannterweise wirksam sind, z. B. Dickdarm-, Lungen-, Nieren-, Brust-, Prostatakrebs, Melanom, Nasopharyngealkarzinom, T-Zellleukämie, myelogene Leukämie, lymphozytäre Leukämie und dergleichen. Bei intravenöser Abgabe in den Blutstrom und wenn das Biokonjugat Cobalamin enthält, leitet die natürliche Affinität von Krebszellen von B₁₂ das Biokonjugat direkt zum Ort diese Gewebe oder Zellen. Alternativ können die Biokonjugate so konstruiert werden, dass sie das chemotherapeutische Mittel selektiv zu der gewünschten Krebszelle transportieren, indem in dem organischen Kobaltkomplex ein geeignetes Targeting-Molekül (wie beispielsweise die oben ausgeführten) eingebaut wird.
Solide Tumore werden wie folgt behandelt, wobei die Verwendung eines Arzneistoff-B₁₂-Biokonjugats als Beispiel dient. Dieses Beispiel soll die vorliegende Erfindung keinesfalls einschränken und ein Fachmann könnte leicht andere Biokonjugate der vorliegenden Erfindung bestimmen, die für die Behandlung solider Tumore genutzt werden können. Das Arzneistoff-B₁₂-Biokonjugat wird einem Krebspatienten vorzugsweise intravenös verabreicht, um metastatischen Krebs gezielt anzugreifen, wenn die Krebszelle einen signifikanten Bedarf an Cobalamin aufweist. Diese Neigung von Cobalamin, zu den Krebszellen zu wandern, verringert die Kardiotoxizität, Myelotoxizität, Hepatotoxizität und ähnliche Nebenwirkungen, welche die Größe und Häufigkeit einer wirksamen Dosierung antineoplastischer Mittel begrenzt, wesentlich. Außerdem werden Probleme mit Verbindung mit Toxizität gegenüber Nicht-Zielzellen minimiert. Der zielgerichtete Transport wird des Weiteren durch das Auslösen der Freisetzung des antineoplastischen Mittels aus dem Biokonjugat durch den Mechanismus der Photolyse oder Sonolyse verstärkt, was ein hohes Maß an räumlicher und zeitlicher Kontrolle der Arzneistofffreisetzung in einem lokalisierten Bereich über einen kurzen Zeitraum bietet. Die Anwendung eines Magnetfelds mit Photolyse dient außerdem dem Schutz gesunder Zellen durch Rekombination des Biokonjugats und schränkt die Freisetzungen des aktiven Stoffes auf die spezifische(n) Krebszellen aufweisende(n) Stelle(n) ein.
Obgleich Chemotherapie in der Regel dem Angriff metastasierter Zellen nach der chirurgischen Exzision der primären Tumormasse vorbehalten ist, erlaubt die ausgelöste Freisetzung eines bioaktiven Stoffes, der an die Stelle des Tumors geleitet wird, die Behandlung des primären Tumors sowie der metastatierten Neoplasmen, die sich auf einen begrenzen und bekannten Bereich ausgebreitet haben. Die Dosis des Biokonjugats, die Behandlungsdauer, der Grad der Lichtaktivierung und andere Behandlungsparameter können von einem Fachmann je nach Art des Krebses, des verabreichten antineoplastischen Mittels, des spezifischen verwendeten Cobalamins, dem Zustand des Patienten und anderen Faktoren, die variabel sind und am besten von Fall zu Fall bestimmt werden, festgelegt werden.
Leukämie wird wie folgt behandelt, wobei die Verwendung eines Arzneistoff-B₁₂-Biokonjugats als Beispiel dient. Dieses Beispiel soll die vorliegende Erfindung keinesfalls einschränken und ein Fachmann könnte leicht andere Biokonjugate der vorliegenden Erfindung bestimmen, die für die Behandlung von Leukämien genutzt werden können.
Mindestens zwei Formen von Leukämie, chronische myeloische Leukämie (CML) und akute promyelozytäre Leukämie (APL) produzieren hohe Mengen an B₁₂-bindenden Proteinen, die zu einer 3- bis 36-fachen Erhöhung der ungesättigten B₁₂-Bindungskapazität im Blut führt. Die erhöhte Konzentration von B₁₂-Bindungskapazität geht mit dem schnellen Umsatz unreifer Blutzellen einher und bietet eine Möglichkeit, den Transport antileukämischer Arzneistoffe wie beispielsweise bisalkylierender, aus Busulfan abgeleiteter Mittel spezifisch zu den transformierten hematopoietischen Zellen zu leiten, die für den leukämischen Zustand verantwortlich sind. Die Biokonjugate dieser Erfindung stellen ein Mittel für die effektive Verabreichung solcher alkylierender Mittel an Zellorte bereit, an denen der aktive Stoff aus dem Konjugat freigesetzt werden kann. Dieser zielgerechte Transport und die zielgerechte Freisetzung bieten bei der Behandlung von CML und APL, bei denen aktuelle Chemotherapieverfahren manchmal eine unvollständige Remission liefern, einen wesentlichen Vorteil.
Die vorliegende Erfindung ist auch für die Behandlung von Psoriasis geeignet. Psoriasis ist ein primäres Ziel für den transdermal oder oral kontrollierten Transport von Antimetaboliten, die durch photolytisch induzierte Spaltung aktiviert werden. Psoriasis ist zwar nicht lebensbedrohlich, kann aber die Lebensqualität von Patienten, die an schwerer Exfoliation in Verbindung mit psoriasis-assoziierter und rheumatoider Arthritis leiden, wesentlich vermindern. Antimetabolite wie Methotrexat und 5-Fluoruracil sind geeignet, um schwere Fälle von Hautproliferation zu kontrollieren. Eine effektive orale Therapie ist trotz geringer Dosis aufgrund durch Hepatotoxizität beschränkt, und das Risiko eines kumulativen Leberschadens erfordert, dass eine solche Therapie den schwersten Episoden im Leben eines Patienten vorbehalten ist. Die Abgabe solcher Mittel in die Haut verbessert das Erscheinungsbild und die psychologische Lebensqualität von Patienten, deren Leben von schwerer Psoriasis dominiert wird.
Die vorliegende Erfindung eignet sich außerdem für einen Peptidtherapie. Ein Beispiel einer Peptidtherapie ist als zytotoxisches Mittel, beispielsweise als antineoplastisches Mittel. In diesem Beispiel wird ein Biokonjugat, das die enzymatische Domäne von Diphtherietoxin (DT) enthält, einem Individuum verabreicht, wie oben für solide Tumore oder Leukämie beschrieben wurde. Die gezielte Freisetzung des DT-Peptids bewirkt die Hemmung der Proteinsynthese und schließlich Zelltod.
Die vorliegende Erfindung eignet sich auch für eine Gentherapie. Ein Beispiel einer Gentherapie ist der zielgerichtete Transport eines Antisense-Oligonukleotids, um Genexpression und virale Replikation zu hemmen. In diesem Beispiel wird einem Patienten mit einer Hepatitis-B-Infektion ein Biokonjugat verabreicht, das ein Antisense-Oligonukleotid gegen Hepatitis-B-Virus enthält. Die Ansammlung des Biokonjugats und die Freisetzung des Antisense-Oligonukleotids in der Leber hemmt die Genexpression und Replikation des Hepatitis-B-Virus.
Die vorliegende Erfindung wird weiter unter Bezugnahme auf folgende Beispiele beschrieben, welche der Veranschaulichung dienen und die Erfindung in keiner Weise einschränken sollen. Es wurden Standardtechniken, die aus dem Stand der Technik gut bekannt sind, oder Techniken, die unten spezifisch beschrieben sind, verwendet.
BEISPIEL I
Photolyse von B₁₂ und Co[SALEN]-Biokonjugaten
Ein Protokoll für eine typische anaerobe Photolyse mit kontinuierlicher Welle von Methylcob(III)alamin oder CH₃Cbl^III lautet wie folgt. Eine wässrige Lösung von 200 μM CH₃Cbl^III und 50 mM K⁺-Hepes pH 7,3 wird in eine 1-cm-Quarzküvette gegeben. Proben, die unter anaeroben Bedingungen photolysiert werden sollen, werden entweder wiederholten Einfrier-Pump-Zyklen unterzogen oder unmittelbar vor der Photolyse 40 Minuten lang mit Ar gespült und versiegelt. Bestrahlung mit sichtbaren Licht mit kontinuierlicher Welle wird mit einem gepumpten Farbstoff-Ar⁺-Laser erreicht. Das auf die Küvettenfläche einfallende Licht wird mit Neutraldichtefiltern auf 12 mW cm^–2 reduziert. Der Lichtfluss wird durch Kaliumferrioxalat-Aktinometrie und mit einem Thermopile-Oberflächenleser von Scientech bestimmt. Die Küvette wird in einen Thermostat-Zellhalter bei 25–37°C gegeben. Zur Messung der Quantenausbeute als Funktion des Magnetfelds wird die Küvette in den Spalt eines Elektromagnets von GMW Associates mit zylindrischen Stäben eines Durchmessers von 7,5 cm platziert. Das Magnetfeld in dem Bereich der Küvette ist bis auf 2% homogen, und die langfristige Stabilität ist besser als 0,5%, wie eine Überwachung durch eine schräge Hall-Sonde und ein digitales Teslameter ergab.
Mit einem Diodenarray-Spektrophotometer werden in verschiedenen Zeitintervallen von 10 Sekunden bis 2 Minuten (je nach Fluenz der photolysierenden Lichtquelle) für insgesamt 3 t_1/2 in einer Sekunde Absorptionsspektren von 300–600 nm aufgezeichnet. Anhand der bei 350 oder 520 nm gemessenen Absorption wird nach dem Verfahren von Chen und Chance (1993) die Konzentration von CH₃Cbl^III bestimmt. Die Kurve von [CH₃Cbl^III] gegenüber der Zeit (t) erscheint in allen Fällen nullter Ordnung zu sein.
Auswahl der Photolyse-Wellenlänge: In 1 und 2 sind die Absorptionsspektren von CH₃Cbl^III und Ethyl-Co[SALEN] gezeigt. Bei CH₃Cbl^III finden die π- π*-Elektronenübergänge, die zur Spaltung der C-Co-Bindung führen, bei maximal 388 und 528 nm statt. Es gibt zahlreiche vorläufige Arbeiten über B₁₂-Photolyse mit 514-nm-Licht eines Argon (Ar⁺)- Ionenlasers. Dies ist nahe bei der maximalen Absorption im langwelligen Bereich und ergibt für CH₃Cbl^III eine Quantenausbeute von etwa 0,3.
Die Absorption von Blut und Gewebe ist bei dieser zur Anregung von Cob(III)alamin optimalen Wellenlänge signifikant. Blut hat ein niedriges (partielles) Lichtdurchlässigkeitsfenster in der Nähe von 514 nm. Diese Absorption ist ausreichend, um bovines Vollblut, das in den Lichtweg eines 20-W/cm²-Strahls von Licht der Wellenlänge 514 nm platziert wird, schnell zu pyrolysieren.
Es wäre daher von Vorteil, ein Cobalamin zur Konjugation bereit zu stellen, wobei die π- π*-Elektronenübergänge, die zur Spaltung der C-Co-Bindung führen, bei maximal einer Wellenlänge stattfinden, bei der es minimale oder keine Interferenz gibt. Etwa über 610 nm wird Blut teilweise transparent, und Verluste der Lichtdurchlässigkeit jenseits von 50% sind größtenteils auf Lichtstreuung von den Erythrozyten zurückzuführen. Heparinisiertes Blut, das in den Lichtweg eines 20-W/cm²-Strahls von Licht der Wellenlänge 630 nm platziert wird, zeigt über lange Aussetzungszeiten nur geringe Erhitzung. Für Gewebe wurde auch bei 610–800 nm eine hohe Lichtdurchlässigkeit gezeigt.
Dies deutet auf die Verwendung eines organischen Kobaltkomplexes zur Konjugation mit einer Absorptionswellenlänge hin, bei der Gewebe und Blut relativ transparent sind. 2 zeigt, dass Ethyl-Co[SALEN]-Komplexe Absorptionsmaxima in der Nähe von 650 nm und eine signifikante Absorption jenseits von 700 nm aufweisen. Ein gepumpter Ar⁺-Farbstofflaser oder ein Kryptonionen (Kr⁺)-Laser kann eine geeignete Hochintensitäts-Quelle von Photonen im Bereich von 610⁺ nm sein. Gepumpte Ar⁺-Farbstofflaser werden häufig für die photodynamische Therapie mit Hämatoporphyrinen verwendet. Auch ein kostengünstiger He-Ne-Laser mit einer Hauptlinie ("principal line") bei 633 nm kann verwendet werden. Solche Laser sind jedoch typischerweise auf eine Ausgabe von maximal 50 mW beschränkt.
Es gibt Laserfarbstoffe im Bereich von 600–700 nm, die Energieumwandlungseffizienzen von bis zu 45% erreichen können. Das bedeutet, dass ein gepumpter Ar⁺-Laser mit 6 W nahezu 3 W an räumlich kohärentem monochromatischem Licht im Bereich von 610–750 nm liefern kann. Die genaue Wellenlänge kann ausgewählt werden, um die Quantenausbeute mit kontinuierlicher Welle zu optimieren, und dennoch ein angemessenes Maß an Gewebedurchdringung zu erhalten. In Tests mit Alkyl-Co[SALEN]-Komplexen fand man heraus, dass Licht mit 690 nm von einem gepumpten Ar⁺-Farbstofflaser, der mit Rhodamin-6-G-Farbstoff arbeitet, zufrieden stellen ist. Eine Optimierung kann je nach dem für tierexperimentelle und/oder klinische Tests des Biokonjugats ausgewählten, spezifischen Cobalamin festgelegt werden. Darüber hinaus sind leistungsstarke Diodenlaser kommerziell verfügbar, die rotes Licht der gewünschten Wellenlänge aussenden. Diese Diodenlaser haben den Vorteil, bis zu 10 Watt an optimaler Leistung in einem engen Bereich des optischen Spektrums zu liefern, der zum Auslösen der Spaltung der Biokonjugate geeignet ist.
BEISPIEL 2
Sonolyse von B₁₂ und Co[SALEN]-Biokonjugaten
Die Sonolyse wurde mit einem Ultraschallbad von Branson (Modell 3200) mit einem Betrieb bei 47 kHz durchgeführt. Die korrekte Position des Reaktionsgefäßes an einem fokalen Punkt hoch intensiven Ultraschalls wurde durch Oxidation von Iod zu Iodid in Gegenwart von Stärke bestimmt (Mason, 1991) und die Temperatur des Bads wurde durch Zirkulation bei konstanter Temperatur bei 21°C gehalten. Aerobe Sonolyse wurde typischerweise in einem Teströhrchen oder einer Erlenmayer-Flasche durchgeführt, wohingegen anaerobe Sonolyse in einem geschlossenen Reaktionsgefäß, ausgestattet mit einem Seitenarm und einer Quarzküvette, durchgeführt wurde. Anaerobe Bedingungen wurden durch 30-minütiges Durchperlen von Ar vor der Sonolyse hergestellt. In manchen Experimenten wurde der pH-Wert durch Verwendung von 100 mM Phosphat (aerobe Experimente) oder 100 nM N-(2-Hydroxyethyl)piperazin-N-2-ethansulfonat (Hepes) (anaerobe Experimente) wie angegeben gepuffert. Alle Prozesse wurden in Abwesenheit von Licht durchgeführt, um eine photolytische Spaltung der C-Co-Bindung zu vermeiden. Auf einem Diodenarray-Spektrophotometer (HP 8452A) wurden Absorptionsspektren aufgezeichnet. Die Lösungen wurden für alle optischen Messungen in eine Quarzküvette mit einem Lichtweg von 1 cm überführt, und es wurde sorgfältig sichergestellt, dass die Photolyse während der Messdauer von 1 Sek. nicht signifikant war.
Sonolyse von Methylcob(III)alamin: in 3A sind sequenzielle Absorptionsspektren von wässrigem CH₃-Cbl^III als eine Funktion anaerober Sonolyse (pH 7,38, 100 mM Hepes, sättigendes Ar) gezeigt. Die Absorption bei 340, 374 und 520 nm verringert sich linear als eine Funktion der Sonolysedauer und die Absorption bei 316 und 420 nm steigt linear, was anzeigt, dass es sich bei Substratkonzentration um eine Reaktion nullter Ordnung handelt. Die isosbestischen Punkte bei 336, 390 und 585 nm stimmen mit den durch anaerobe Photolyse von CH₃-Cbl^III Erhaltenen überein. Unter den Bedingungen der Sonolyse tritt ein weiterer isosbestischer Punkt bei 476 nm und nicht bei 486 nm auf, wie es im Verlauf der Photolyse typischerweise beobachtet wird. Diese leichte Verschiebung des isosbestischen Punkts wird durch ein kleines Produkt verursacht, das ein Absorptionsmaximum in der Nähe von 490 nm aufweist. Dies könnte Cob(III)alamin sein, das eine ausreichend lange Lebensdauer (t_1/2 = 22 Min. bei pH 6) aufweist, um spektrophotometrisch beobachtet werden zu können. Die Absorptionsbande bei 374 nm ist charakteristisch für eine C-Co-Bindung und ihr Verschwinden zeigt unmissverständlich die Verdrängung des axialen Kohlenstoffliganden an.
Unter aeroben Bedingungen fängt molekularer Sauerstoff H· ein und verhindert die Reduktion von CH₃-Cbl^III über die Gleichung O₂ + ·H → ·OOH
In Abwesenheit eines organischen Puffers mit abziehbaren Wasserstoffatomen bleibt die Reaktion über HO· ein realisierbarer Prozess.
3B zeigt die Veränderung der Absorptionsspektren nach aerober Sonolyse in Abwesenheit von organischem Puffer. Die Abnahme der Absorption bei 340 und 373 nm ist linear zur steigenden Sonolysedauer, was zeigt, dass die Reaktion bei Substratkonzentration nullter Ordnung ist, aber der unerwartete Anstieg der Absorption bei 520 nm zeigt, dass das stabile Produkt der Cobalaminsonolyse nicht Hydroxycob(III)alamin ist, wie es zu erwarten wäre, wenn molekularer Sauerstoff Cob(II)alamin zu Cob(III)alamin reoxidieren würde. Aerobe Photolyse unter denselben Bedingungen zeigt die erwartete Abnahme der Absorption bei 374 nm, aber keine Veränderung bei 520 nm. Dieser Unterschied lässt vermuten, dass HO· den Alkylliganden von Co^III zu verdrängen kann, dass aber auch andere HO·-Reaktionen stattfinden (möglicherweise durch die sekundären Produkte HOO· und ·O₂), um den Corrinring zu oxidieren. Ähnliche Absorptionsspektren werden durch Sonolyse einer belüfteten wässrigen Lösung mit 100 mM Phosphatpuffer erhalten.
Ein ähnliches Ergebnis erhält man bei der Reaktion von CH₃-Cbl^III mit H· und HO·, wenn diese Radikalarten durch Pulsradiolyse erzeugt werden (Blackburn et al., 1972). Die reduzierende Art H· reagiert, um dieselben spektralen Veränderungen wie in 3A gezeigt zu erzeugen. Mehrere oxidierende Arten (HOO· und ·O₂) können mit CH₃-Cbl^III reagieren, um die C-Co-Bindung zu spalten, aber diese Arten führen auch zur irreversiblen Degradation des Corrinrings, wie sich an den spektralen Veränderungen zeigt, die ähnlich sind wie die in 3B. Ein Beispiel für irreversible Oxidation des Corrinrings stellt die Photooxygenolyse von Alkylcobalaminen durch Singulett-Sauerstoff dar (Krautler and Stepanek, 1985).
Aerobe Sonolyse von Lösungen, die 100 mM Hepes oder 100 mM t-Butylalkohol enthalten, produziert keine Veränderung der Absorptionsspektren über einen vergleichbaren Zeitraum. Dies liegt daran, dass molekularer Sauerstoff den H·-Reaktionsweg und t-Butylalkohol den HO·-Reaktionsweg dämpft. Obgleich es keine früheren Angaben darüber gibt, dass Hepes ein HO·-Fänger ist, deuten viele Berichte an, dass organische lösliche Moleküle wie Format die Reaktion von HO· hemmen können (Weissler, 1962). Die Abwesenheit spektraler Veränderungen unter diesen Bedingungen deutet darauf hin, dass direkte Sonolyse der C-Co-Bindung kein wichtiger Reaktionsweg ist.
BEISPIEL 3
Biologische Testung gegen menschliche NCI-Tumorzelllinien
Die Wirksamkeit der Biokonjugate gegen Tumorzelllinien wird durch bestehende Protokolle zur Beurteilung der Wirksamkeit gezielter Coenzym-B₁₂-Biokonjugate mit antineoplastischen Stoffen getestet. Repräsentative Zelllinien umfassen HCT 116 (menschlicher Kolontumor), A549 (menschliche Lunge), ACHN (menschliche Niere), MCF7 (menschliche Brust), menschliche Prostata, SK5-mel (menschliches Melanom), KB (menschlicher Nasopharynx), CCRF-CEM (menschliche T-Zellleukämie), HL-60 (menschliche promyelozytäre Leukämie), RD-995 (Mausfibrosarkom), B-16 (Maulmelanom) und Meth-A (Mauskarzinom). Die Arzneistofftestung wird mit einem kolorimetrischen Test der Zelllebensfähigkeit in einer Platte mit 96 Vertiefungen durchgeführt.
Darüber hinaus werden ausgewählte Biokonjugate mit ¹⁴C oder ³H radioaktiv markiert, um das Maß der Aufnahme durch menschliche Tumorzellen zu bestimmten. Wie oben erwähnt, ist im Stand der Technik angegeben, dass manche Tumor- und Leukämiezellen hohe Mengen von B₁₂-Bindungsproteinen im Serum produzieren und B₁₂ in hoher Konzentration bis zum 50-Fachen vereinnehmen.
Tumorzelllinien-Testprotokoll: Die Arzneistoff-Biokonjugate, die nach den hierin beschriebenen Prozessen oder deren Adaptionen synthetisiert wurden, werden über 5 Größenordnungen verdünnt (etwa 0,005 bis 50 μg/mL). Vier Stunden nach dem Aussäen der Zellen in die Platte werden die Zellen mit dem entsprechenden, in isotoner Pufferlösung gelösten Arzneistoff behandelt. In Kontrollexperimenten ohne durch Photolyse ausgelöste Arzneistofffreisetzung bleibt der Arzneistoff wie beim normalen Krebsbasistest drei Tage auf den Zellen. In den Vertiefungen für ausgelöste Arzneistofffreisetzung wird die Laserausgabe über unterschiedliche Zeit und mit unterschiedlicher Intensität auf ausgewählte Zellen fokussiert. Alternativ wird eine Matrix von Licht emittierenden Dioden (LEDs) verwendet. Die Zellen werden unter Standardbedingungen für Säugetierzellkulturen in der geeigneten Atmosphäre mit ausgewogenem CO₂-Gehalt inkubiert. Nach drei Tagen werden die Zellen erneut gefüttert und der kolorimetrische Farbstoff 3-[4,5-Dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT) wird zugegeben. Die Reduktion des MTT zu violettem Formazanprodukt wird in einem Lesegerät für Platten mit 96 Vertiefungen quantifiziert. Die Konzentration des violetten Formazanfarbstoffes wird zur Anzahl lebensfähiger Zellen in Bezug gesetzt. Die Reduktion des Zellüberlebens bei einer bestimmten Dosisrate und Photolyseaussetzung ergibt eine quantitative Schätzung von Zelltod und Effektivität des Arzneistofftransports. Es wird darauf geachtet, Abschnitte der Platte nicht durch hinzukommende externe Bestrahlung Photolysebedingungen auszusetzen. Dies wird erreicht, indem für die Photolyse Platten mit 96 Vertiefungen mit einer lichtundurchlässigen Maske verwendet werden (Fisher, Katalog-Nr. 07-200-565).
Aufnahme von Arzneistoff-B₁₂- und Arzneistoff-Co[SALEN]-Biokonjugaten: Die Aufnahme von Arzneistoff-B₁₂- und Arzneistoff-Co[SALEN]-Biokonjugaten durch kultivierte Tumorzellen wird überwacht, indem der Arzneistoff oder das Cobalamin während der Synthese radioaktiv markiert werden. ³H-markiertes 5-Fluoruracil, Methotrexat und Chlorambucil wurden von DuPont/NEN (New England Nuclear) erworben. Diese Arzneistoff-Biokonjugate sowie ¹⁴C-markiertes Methylcob(III)alamin (synthetisiert aus Cob(I)alamin und ¹⁴CH₃I) liefert eine Anzeige der rezeptorvermittelten Aufnahme durch die verschiedenen Tumorzelllinien. In dieser Studie werden die Zellen wie im vorherigen Abschnitt beschrieben dem radioaktiv markierten Arzneistoff ausgesetzt, außer, dass am Ende des dreitägigen Inkubationszeitraums kein MTT hinzugegeben wird. Da alle Zelllinien außer den Leukämiezellen wachsen, während sie am Boden der Vertiefung der Mikrotiterplatte angeheftet sind, wird das Wachstumsmedium abgesaugt, um nicht eingebauten radioaktiv markierten Arzneistoff zu entfernen, gefolgt von mehreren Waschschritten mit frischem Medium. Die markierten Zellen werden vom Boden der Vertiefungen abgelöst und die Radioaktivität durch Szintillationszählung quantifiziert. Das Wachstum nicht angehefteter Leukämiezellen findet in Mikrotiter-Rundbodenplatten derart statt, dass Zentrifugation die Zellen sedimentiert und das Waschen mit frischem Wachstumsmedium erlaubt, bevor die Zellen gelöst werden und der eingebaute radioaktiv markierte Arzneistoff durch Szintillationszählung quantifiziert wird.
BEISPIEL 4
Synthese von Co[SALEN]
Synthese von N,N'-Bis(salicyliden)ethylendiamin
Zu einer gerührten Lösung von Salicylaldehyd (12,21 g/10,62 ml) in Ethanol bei 70°C (100 ml) wurde Ethylendiamin (3,01 g/3,33 ml) gegeben. Sofort bildete sich ein gelbes kristallines Material und die Reaktionsmischung konnte unter Rühren auf Raumtemperatur abkühlen. Die Lösung wurde filtriert und die Kristalle mit kaltem Ethanol gewaschen. Die Ethanolschichten wurden kombiniert und auf etwa 20 ml eingeengt und konnten über Nacht bei 0°C stehen. Die resultierenden Kristalle wurden durch Vakuumfiltration gewonnen und mit Wasser gewaschen. Die gewonnenen Feststoffe wurden in vacuo getrocknet, um 13,15 g (98%) N,N'-Bis(salicyliden)ethylendiamin als gelbe Plättchen mit einem Schmelzpunkt von 126°C (Literaturwert (24) 127–128°C). ¹H NMR (DMSO-d₆) ☐ 8, 57 (s, 2H, HC=N), 7,42 (d, 2H, aromatisch, J = 7,3 Hz), 7,31 (t, 2H, aromatisch, J = 9,0 Hz), 6,88 (t, 4H, aromatisch, H = 8,3, 16,1 Hz), 3,89 (s, 4H, CH₂). ¹³C NMR (DMSO-d₆) ☐ 166,94 (2C, CO), 160,57 (2C, HC+N), 132,38 (2C, aromatisch), 131,69 (4C, aromatisch), 118,59 (2C, aromatisch), 116,51 (2C, aromatisch), 58,88 (2C, CH₂).
Synthese von N,N'-Bis(salicyliden)ethylendiamincobalt(II) {Co[SALEN]}
Zu einer heißen (10=°C) desoxygenierten Lösung des obigen Produktes (2,69 g) in Dimethylformamid (25 ml) wurde durch eine Kanüle eine wässrige Lösung (10 ml) Cobalt(II)acetat-Tetrahydrat (2,49 g) gegeben. Das sich bildende rote Präzipitat wurde durch Vakuumfiltration gewonnen, mit kaltem Dimethylformamid gewaschen und in vacuo getrocknet, um 2,6 g (80%) N,N'-Bis(salicyliden)ethylendiamincobalt(II) als rote Kristalle zu erhalten.
BEISPIEL 5
Synthese von modifiziertem Co[SALEN]
Der Diglycolatether von Co[SALEN] wird wie in Beispiel 4 beschrieben hergestellt, wobei der Glycolatether von 2,5-Dihydrobenzaldehyd anstelle von Salicylaldehyd verwendet wird. Es wird wie in Beispiel 4 beschrieben ein unsymmetrisch substituierter (Glycolatether/Amid) Komplex hergestellt, indem eine Mischung des Glycolatethers von 2,5-Dihydrobenzaldehyd und 5-Aminosalicylaldehyd anstelle von Salicylaldehyd verwendet werden.
BEISPIEL 6
Synthese von Chlorambucil-Cobalamin-Biokonjugaten
Synthese von 1-Bromo-2-[4-(4'-[bis-(2-chlorethyl)amino]phenyl)butyroxy]ethan.
Fünfundzwanzig ml frisch destilliertes CH₂Cl₂, 0,343 g Dicyclohexylcarbodiimid (1,66 mmol), 0,305 g 4-Dimethylaminopyridin (2,5 mmol) und 0,263 g 4-Dimethylaminopyridiniumchlorid (1,66 mmol) wurden in eine flammengetrocknete 50 ml-Rundbodenflasche gegeben, die mit einem Rührstab, einem Rückflusskondensator und einem Ar-Einlass ausgestattet war (Boden and Keck, 1985). Die Lösung wurde mit Argon gespült und zum Rückfluss gebracht. Während des Rückflusses wurde eine Lösung von 0,304 g Chlorambucil (1,0 mmol) und 0,125 g 2-Bromethanol (1,0 mmol) in 5 ml CH₂Cl₂ (gespült unter Argon für 30 Minuten) über einen Zeitraum von 30 Minuten durch eine Kanüle in die rückfließende Lösung übertragen. Nach Abschluss der Zugabe wurde die Reaktionsmischung 2 Std. bei Raumtemperatur gerührt. Ausgefallener Dicyclohexylharnstoff wurde durch Filtration entfernt und die Lösung durch Rotationsverdampfung eingeengt. Der resultierende Rückstand wurde in CH₂Cl₂ aufgenommen, filtriert und durch Blitzchromatographie auf Kieselsäuresäulen gereinigt. Das gewünschte Produkt wurde mit Ethylacetat:Hexan im Verhältnis 1:9 (Vol./Vol.) eluiert, um 0,374 g eines gelben Öls als Ausbeute von 91% (Ester 2) zu erhalten. ¹H NMR (CDCl₃, 300 MHz) d 7,06 (d, 2H, J = 8,4 Hz), 6,60 (d, 2H, J = 8,7 Hz), 4,35 (t, 2H, J = 6,15 Hz), 3,56–3,72 (m, 8H), 3,48 (t, 2H, J = 6,15 Hz), 2,56 (t, 2H, J = 7,65 Hz), 2,35 (t, 2H, J = 7,35 Hz), 1,91 (Quintett, 2H, J = 7,58 Hz). ¹³C NMR (CDCl₃, 75 MHz ¹H entkoppelt) d 173,05, 144,35, 130,37, 129,75 (2), 112,12 (2), 63,68, 53,55 (2), 40,60 (2), 33,94, 33,41, 29,05, 26,72.
Synthese von 2-[4-(4'-[bis-(2-chlorethyl)amino]phenyl)butyroxy]ethylcob(III)alamin (3)
Zweihundert mg Hydroxycob(III)alamin (0,15 mmol) wurden in 10 ml Wasser gelöst und während des Rührens mit Ar gespült (Brown and Peck, 1988). Das austretende Gas wurde nacheinander durch Folgende geführt: (1) eine Flasche, die 0,025 g NaBH₄ (0,66 mmol) enthält; (2) eine Flasche, die 5 ml H₂O enthält, und (3) eine Flasche, die 0,226 g Ester 2 (0,55 mmol) in 5 ml CH₃OH enthält. Nach 1-stündiger Entlüftung wurde das Wasser aus Flasche (2) durch eine Kanüle in Flasche (1), die NaBH₄ enthält, überführt und geschwenkt, um das Lösen zu fördern. Diese Lösung wurde mit einer Kanüle in die wässrige Cobalaminlösung überführt. Die Reduktion konnte 20 Minuten lang stattfinden, danach wurde der Lösung der Chlorambucilbromethylester zugegeben. Die Reaktionsmischung konnte für weitere 5 Min. rühren, und anschließend wurde 0,2 ml Aceton zugegeben, um das überschüssige Borhydrid zu zerstören. Die Lösung wurde durch Rotationsverdampfung auf etwa 2 ml eingeengt, und die resultierende Lösung wurde auf eine 2,5 × 30-cm-Säule von Amberlite XAD-2-Harz gegeben. Die Säule wurde zum Entsalzen mit 1 l H₂O gewaschen und das Cobalamin wurde mit 50% wässrigem Acetonitril (Vol./Vol.) eluiert. Das Eluat wurde durch Rotationsverdampfung auf etwas 2 ml eingeengt, und die Lösung wurde auf eine 1 × 40 cm-Säule von SP-Sephadex C25 (Na⁺-Form) aufgetragen. Elution mit Wasser entfernte die rote Hauptbande, die auf ein minimales Volumen eingeengt wurde. Es wurde Aceton zugegeben, bis nach Schwenken eine schwache Trübung dauerhaft beobachtet wurde. Die Lösung konnte 1 Std. bei 0°C stehen, und es wurde Aceton im Überschuss zugegeben, um weitere Kristallisation zu fördern. Die Kristalle wurden durch Vakuumfiltration gewonnen und in vacuo getrocknet. Mit einer Ausbeute von 53% wurde 3 als rote Kristalle (122,5 mg) erhalten. MS (FAB+) berechnet für C₆₈H₁₁₂N₁₄O₁₆COPCl₂, 1541; gefunden 1541.
4-(4'-[bis-(2-chlorethyl)amino]phenyl)butyroylcob(III)alamin (4) wurde in ähnlicher Weise synthetisiert, wobei dem Säurechlorid von Chlorambucil begonnen wurde und dieses wie oben mit Hydroxycob(III)alamin umgesetzt wurde.
Die Synthese von 2-[4-(4'-[bis-(2-chlorethyl)amino]phenyl)butyroxy]ethyl-Co[SALEN] und 4-(4'-[bis-(2-chlorethyl)amino]phenyl)butyroyl-Co[SALEN] erfolgte in ähnlicher Weise, wobei Co[SALEN] anstelle von Hydroxycob(III)alamin verwendet wurde.
Die Synthese von 2-[4-(4'-[bis-(2-chlorethyl)amino]phenyl)butyroxy]ethyl-(Co[SALEN]-folat) und 4-(4'-[bis-(2-chlorethyl)amino]phenyl)butyroyl-(Co[SALEN]-folat) erfolgte in ähnlicher Weise, wobei Co[SALEN]-folat anstelle von Hydroxycob(III)alamin verwendet wurde.
Die Synthese von 2-[4-(4'-[bis-(2-chlorethyl)amino]phenyl)butyroxy]ethyl-(grünes Corrinoid) und 4-(4'-[bis-(2-chlorethyl)amino]phenyl)butyroyl-(grünes Corrinoid) erfolgte in ähnlicher Weise, wobei CH₃-Co(III)-Corrinoid (hergestellt durch Umsetzen von Methyliodid mit dem grünen Corrinoid von Brown et al. (1996) nach Reduktion mit NaBH₄) anstelle von Hydroxycob(III)alamin verwendet wurde.
BEISPIEL 7
Sonolyse von 2-[4-(4'-[bis-(2-chlorethyl)amino]phenyl)butyroxy]ethylcob(III)alamin (3)
Die durch erschöpfende Sonolyse freigesetzten Produkte, wie in Beispiel 2 beschrieben, von Verbindung 3 (hergestellt in Beispiel 6) wurde durch Umkehrphasen-HPLC (Rainin Microsorb C-18) isoliert. Elution und Trennung der Sonolyseprodukte wurden mit einem steigenden Gradienten von Acetonitril (A) und 0,05 M Phosphorsäure (B) durchgeführt; initiale Bedingung 5% A, 95% B, linear ansteigend für 10 Min. auf 30% A und 70% B, aufrechterhalten für 2 Min, gefolgt von einem linearen Anstieg auf 70% A und 30% B über 10 Min. (Rinchik et al., 1993). Aus jeder Fraktion wurde das Lösungsmittel verdampft, und die Produkte wurden mit CH₂Cl₂ extrahiert und mittels ¹H- und ¹³C-NMR charakterisiert.
Sequenzielle Absorptionsspektren von wässrigem 3 als eine Funktion anaerober Sonolyse bei pH 7,4, 100 mM Hepes, Ar-Sättigung, sind in 4 gezeigt. Die Absorption bei 374 nm und 520 nm verringert sich linear als eine Funktion der Sonolysedauer und die Absorption bei 316 und 420 nm steigt linear, was eine Reaktion nullter Ordnung bei Substratkonzentration anzeigt. Die isobestischen Punkte bei 336, 390, 486 und 585 nm entsprechen den durch anaerobe Photolyse von CH₃Cbl^III Erhaltenen. Die Absorptionsbande bei 374 nm ist für eine C-Co-Bindung charakteristisch und ihr Verschwinden zeigt unmissverständlich die Verdrängung des axialen Kohlenstoffliganden an.
4B zeigt die Veränderung der Absorptionsspektren nach aerober Sonolyse einer Lösung von 3 mit Phosphatpuffer. Unter aeroben Bedingungen werden verschiedene stabile Produkte erhalten. Aufgrund des Vorhandenseins molekularen Sauerstoffs wurde das freigesetzte Produkt mittels NMR als 2-[4-(4'-[bis-(2-chlorethyl)amino]phenyl)butyroxy]ethan-1-al identifiziert. ¹H NMR (CDCl₃, 300 MHz) 9,59 (s, 1H), 7,08 (d, 2H, J = 2,9 Hz), 6,62 (d, 2H, J = 2,9 Hz), 4,67 (s, 2H), 3,73–3,59 (m, 8H), 2,60 (t, 2H, J = 7,5 Hz), 2,45 (t, 2H, J = 7,4 Hz), 1,96 (Quintett, 2H, J = 7,4); ¹³C NMR (CDCl₃, 75 MHz ¹H entkoppelt) 195,85, 173,09, 144,54, 130,43, 129,92 (2), 112,29 (2), 68,73, 53,74 (2), 40,69 (2), 33,99, 33,13, 26,79. Die Abnahme der Absorption bei 374 nm ist linear mit steigender Sonolysedauer, was eine Reaktion nullter Ordnung bei Substratkonzentration anzeigt.
Die Co-C-Bindung von CH₃Cbl^III kann durch Sonolyse in wässriger Lösung gespalten werden, um unter anaeroben Bedingungen das Alkan und Cob(II)alamin oder unter aeroben Bedingungen das Aldehyd und Hydroxycob(III)alamin zu erhalten. Im Gegensatz zur Photolyse und Thermolyse, die zu einer direkten Spaltung der Co-C-Bindung führen, erfolgt der hauptsächliche Weg zur Spaltung der Co-C-Bindung durch Sonolyse durch H·-vermittelte Reduktion von CH₃Cbl^III zu der labilen 19e^– CH₃-Cbl^II--Art, gefolgt von einer Dissoziation zum Alkan mit abgeschlossener Elektronenschale (closed shell) und Cbl^II oder durch die Reaktion von HO· mit CH₃-Cbl^III, die zur Bildung von Hydroxycob(III)alamin und der Degradation des Corrinrings führt.
Es besteht eine Parallele zwischen den Reaktionen von Hydroxycob(III)alamin unter den Bedingungen der Sonolyse und Pulsradiolyse (Blackburn et al., 1972), aber ohne den Bedarf für teure Ausrüstung. Obgleich die starke Kavitation während der Sonolyse ausreichende Energie aufweist, um die C-Co-Bindung aufzubrechen, um durch einen dissoziativen Weg analog zur Photolyse von CH₃-Cbl^III das Radikalpaar {R· ·Cbl^II} zu produzieren (Endicott and Netzel, 1979; Chagovetz and Grissom, 1993; Natarajan and Grissom, 1996), sind Alkylcob(III)alamine nicht ausreichend flüchtig, um in der extremen Umgebung der zusammenbrechenden Bläschen zu existieren. Trotz der Differenz von mehr als 80 kcal/mol der Bindungsdissoziationsenergie zwischen Co-C und H-OH ist also keine direkte Spaltung der Co-C-Bindung durch Sonolyse möglich.
Anaerobe Sonolyse der Co-C-Bindung ist irreversibel, da ein Alkan mit abgeschlossener Elektronenschale (closed shell) gebildet wird. Unter aeroben Bedingungen hat die Rate der H·-Reaktion mit O₂ dieselbe Größenordnung wie die Reaktion von H· mit CH₃, was andeutet, dass das Alkan mit abgeschlossener Elektronenschale (closed shell), CH₄, eines der Endprodukte der Sonolyse von CH₃-Cbl^III sein dürfte (Buxton et al., 1988; Baulch et al., 1992). Dagegen ist die Spaltung der Co-C-Bindung von CH₃-Cbl^III über anaerobe Photolyse aus dem Radikalpaar {CH₃· ·Cbl^II} reversibel.
Zusammengefasst könnte die Fähigkeit zur Bildung von Cob(II)alamin und des Alkans mit abgeschlossener Elektronenschale (closed shell) ohne Gebrauch chemischer Reduktionsmittel und ohne Gebrauch elektrochemischer oder photochemischer Ausrüstung oder von Pulsradiolyseausrüstung ein geeignetes Verfahren sein, um die Aktivierung von Arzneistoff-Cobalaminkomplexen in vivo zu fördern.
BEISPIEL 8
Materialien und Verfahren für in-vitro-Assays der Biokonjugataktivität
Herstellung von Medien:
Alle Medien wurden von Sigma erworben und Materialien zur Supplementierung der Medien wurden von Atlanta Biologicals erworben. Die HL-60-Zellkultur wurde in einem ☐☐MEM-Medium gezüchtet. Das Medium wurde vor der Inokulierung durch Zugabe von Reagenzien fertig gestellt, um die Medienendkonzentration auf 7,5% Gew./Vol. Natriumbicarbonat, 10% fetales Kälberserum, 100 μg/ml Penicillin und Streptomycin und 50 Einheiten/ml Mystatin zu bringen. Für die HCT-116-Zellkultur wurde McCoys-Medium mit Natriumbicarbonatpuffer verwendet. Es wurde auf die gleiche Weise mit 8% neugeborenem Kälberserum und 2% fetalem Kälberserum fertig gestellt. Fertige Medien konnten mehrere Wochen lang bei 4°C aufbewahrt werden. Das Kulturmedium wurde vor der Inokulierung mit Zellen auf 37°C erwärmt.
Herstellung und Weiterführung von Stammkulturen
Stamm-Zellkulturen wurden aus ATCC-Zelllinien gewonnen. Die ursprüngliche ATCC-Zelllinie wurde in 10% DMSO aliquotiert und in flüssigem Stickstoff aufbewahrt. Es wurden Stammkulturen von 40 ml gezüchtet und in kollagenbehandelten, sterilen 72 ml-Kulturflaschen weitergeführt, die von Corning erworben wurden. Die Kulturen wurden bei 37°C in einer Umgebung mit 5% CO₂ inkubiert, um einen pH von 7,1 aufrecht zu erhalten. Die Feuchtigkeit im Inkubator wurde aufrechterhalten, um einen Hypertonus des Mediums zu vermeiden, indem eine offene Schale mit Wasser auf den Boden des Inkubators gestellt wurde.
Die Konzentration von Zellen in der Stammkultur wurde reguliert und Zellkonzentrationen wurden auf unterschiedliche Weise geschätzt. Das Medium wurde infolge des Zellstoffwechsels und von Stoffwechselnebenprodukten, die sich in dem Medium ansammelten, zunehmend violett und anschließend orange. Die Zellen wurden auch im Mikroskop bei 40- und 100-facher Vergrößerung visuell beobachtet. Normale HCT-116-Zellen erschienen gerundet, flach und hafteten stark an den Wänden der Kulturflasche an. Wenn die Zellen den Boden der Flasche fast bedeckten, wurde die Zellkonzentration reduziert. Normale HL-60-Zellen erschienen rund, waren aber gut differenziert und ließen sich leicht im Medium suspendieren. Veränderungen der Zellmorphologie zeigten häufig eine Verunreinigung durch Bakterien oder Pilze an. Zur genauen Bestimmung von Zellkonzentrationen wurde ein Coulter Cell Counter(TM) verwendet. Die Stammkulturen durften höchsten bis zu einer Zellzahl von 100.000 Zellen/ml wachsen. Bei beiden Zelllinien wurde eine Verdopplungszeit von etwa 24 Std. beobachtet.
Vorbereitung der Assays
Die Assays wurden in kollagenbehandelten, sterilen Platten mit 96 Vertiefungen durchgeführt, die von Corning erworben wurden. HL-60-Zellen wurden in Rundbodenvertiefungen (Corning Katalog-Nr. 25850) und HCT-116-Zellen wurden in Flachbodenvertiefungen (Corning Katalog-Nr. 25860) gezüchtet. Zellkonzentrationen wurden mit einem Coulter Cell Counter(TM) gemessen. Die Zellen wurden im Ganzen verdünnt und mit 200 μl pro Vertiefung in die Platten gegeben. Die Assays wurden mit etwa 25.000 HL-60-Zellen/Vertiefung und 40.000 HCT-116-Zellen/Vertiefung durchgeführt.
Da HL-60-Zellen in Suspension wachsen, wurde die Zellkonzentration gemessen und direkt verdünnt. HCT-116-Zellen haften jedoch an den Wänden der Flasche und müssen durch Behandlung mit Trypsin suspendiert werden. Unmittelbar vor dem Gebrauch wurde eine Lösung mit 0,025 mg/ml Trypsin aufgetaut. Das Kulturmedium wurde im Ganzen abgesaugt und 2 ml der kalten Trypsinlösung wurden in die Flasche gegeben. Die Flasche wurde regelmäßig bewegt, um die Suspension der Zellen zu unterstützen. Es wurde darauf geachtet, die Zellaussetzung gegenüber der Trypsinlösung auf weniger als fünf Minuten zu beschränken, da ein verlängertes Aussetzen die Zellmembran schädigt. Wenn die Zellen suspendiert waren, was im Mikroskop beobachtet wurde, wurden 8 ml Medium zugegeben, um das Trypsin zu inaktivieren. Die Zellkonzentration in der resultierenden Suspension wurde gemessen, die Suspension entsprechend verdünnt und in die Platten mit 96 Vertiefungen gegeben. In den Platten konnten sich die Zellen vor der Behandlung mit SFU oder einem der Derivate 3 Std. lang anheften.
Zellwachstum und MTT-Bestimmung der Lebensfähigkeit von Zellen
HL-60-Zellen wurden behandelt und 24 Std. lang in einen Inkubator gestellt. Die Platten wurden zentrifugiert und der Überstand wurde sorgfältig abgesaugt, ohne das Zellpellet zu zerstören. Sofort wurde ein 200 μl-Aliquot des Mediums zugegeben. Die Zellen konnten 48 Std. lang wachsen. HCT-116-Zellen wurden behandelt und konnten 72 Std. lang ungestört wachsen. Das Kulturmedium wurde abgesaugt (im Falle von HL-60-Zellen nach Zentrifugation). Es wurden 100 ml McCoys-Medium und 11 μl MTT-Farbstoff zugegeben. Die Zellen wurden 3 Std. lang bei 37°C inkubiert. Während dieser Zeit reduzierten lebensfähige Zellen den MTT-Farbstoff durch die Wirkung von Alkoholdehydrogenase zu violettem Formazan. Die Zellen wurden durch Zugabe von 100 μl einer Lösung mit 1,2 M HCl in 60% Ethanol lysiert, wodurch der reduzierte Farbstoff in Lösung gelangte. Für jede Vertiefung wurde die Absorption bei 405 nm anhand eines Microplate Readers^TM von BIORAD (Modell 450) gemessen.
BEISPIEL 9
In-vitro-Aktivität von Chlorambucil-Cobalamin-Biokonjugaten Thermische Stabilität von Biokonjugaten beim Menschen
Es wurde festgestellt, dass die Chlorambucilbiokonjugate 3 und 4 (hergestellt in Beispiel 6) thermisch labil sind. Es wird daher erwartet, dass sie während des Assays thermisch zerfallen, wahrscheinlich bevor die in die Zellen gelangen oder vor der Freisetzung durch Photolyse. Thermischer Zerfall beider Biokonjugate wurde mit einem UV-Vis-Diodenarray-Spektrophotometer (HP8452) bei 37°C in Wasser, zellfreiem Medium und filtriertem Medium überwacht, in dem die HCT-116-Zellen bis zu einer Konzentration von etwa 100.000 Zellen/ml gezüchtet worden waren. Die Spektren wurden stündlich über insgesamt 8 Std. ermittelt. Das Vorhandensein intakten Biokonjugats wurde anschließend durch 20-minütige Photolyse mit einer Hochdruck-Quecksilberlampe bestimmt. Wenn die Photolyse keinen Einfluss auf das Spektrum hatte, wurde davon ausgegangen, dass sämtliches Biokonjugat zerfallen war.
In-vitro-Assays der Aktivität von 3 und 4
Beide Biokonjugate wurden gegen die Zelllinien HCT-116, HL-60, B-16, Meth-A und RD-995 getestet. Die Assays wurde auf dieselbe Weise wie in Beispiel 8 beschrieben wie hierin modifiziert durchgeführt. Bei den Zelllinien B-16, RD-995 und Meth-A handelt es sich sämtlich um von Balb/c abstammende Karzinomzelllinien, die von Dr. R. Daynes von der Universität von Utah zur Verfügung gestellt worden sind. Diese Zelllinien wurden in RPMI-Medium gezüchtet, das mit 5% fetalem Rinderserum und anderen Mediumkomponenten wie zuvor beschrieben fertig gestellt wurde. Sowohl die Zelllinie B-16 als auch die Zelllinie RD-995 wurden wie im Fall von HCT-116-Zellen in Trypsin suspendiert. Die Meth-A-Zellen haften lose an den Wänden der Flasche an und wachsen sowohl an die Flasche angeheftet als auch in Lösung. Diese Zellen konnten durch sukzessives Waschen der Flaschenwand mit Medium komplett suspendiert werden.
Assays wurden bei einer Zellkonzentration von etwa 40.000 Zellen/Vertiefung durchgeführt, mit Ausnahme des HL-60-Assays, der mit 25.000 Zellen/Vertiefung durchgeführt wurde. Die HCT-116-, B-16- und RD-995-Zellen wurden in Flachbodenplatten mit 96 Vertiefungen getestet, während die HL-60- und Meth-A-Zellen in Rundbodenplatten getestet wurden. Vor den Biokonjugaten wurde unkonjugiertes Chlorambucil getestet. Die Zellen wurden unter nicht-photolytischen und photolytischen Bedingungen mit den Biokonjugaten behandelt. Die Zellen wurden drei Tage lang inkubiert (im Fall der HL-60-Zellen wurde das Medium abgesaugt und nach 24 Std. ersetzt) und die resultierende Lebensfähigkeit in einem MTT-Assay gemessen.
Der MTT-Assay wurde für dieses Experiment etwas verändert. Das Kulturmedium wurde nach 72 Std. abgesaugt. Die Meth-A- und HL-60-Zellen wurden vor dem Absaugen zentrifugiert. Anschließend wurden wie zuvor 100 μl McCoys-Medium und 11 μl der MTT-Lösung zugegeben. Nach 4 Stunden wurde das Kulturmedium ein zweites Mal abgesaugt (im Fall der HL-60- und Meth-A-Zellen nach Zentrifugation), und es wurde 100 μl DMSO zugegeben. Das DMSO lysierte die Zellen, wobei der MTT-Farbstoff in Lösung freigesetzt wurde. Wie zuvor wurde die Absorption jeder Vertiefung bei 450 nm gemessen. Die zuvor verwendete HCl/Ethanol-Lösung hat eine Neigung, Proteine aus der resultierenden Lösung auszufällen, was fälschlicherweise erhöhte Absorptionsmessungen ergeben kann. Der Austausch mit DMSO vermeidet dieses Problem.
Die Konzentration von Chlorambucil und den Biokonjugaten wurde in dem Assay von 0,04 M bis 400 μM variiert. Die Zellen wurden unter abgeblendetem Rotlicht mit den Biokonjugaten behandelt, um eine Photolyse zu vermeiden. Nicht-photolytische Bedingungen wurden erhalten, indem die Platten mit 96 Vertiefungen während der Inkubationszeiträume mit Folie eingepackt wurden. Photolyse wurde in schwarzen Platten mit Vertiefungen mit flachem, durchsichtigem Boden (Costar, Katalog-Nr. 3603) durchgeführt. Diese Platten sind steril, kollagenbehandelt und bestehen aus optisch durchsichtigem Kunststoff. Das Wachstum der Zellen in diesen Platten unterschied sich nicht von dem Wachstum von Zellen, die in normalen durchsichtigen Kunststoffplatten gezüchtet werden. Photolyse wurde durch eine Anordnung grüner Hochintensitäts-LEDs (Hewlett Packard Katalog-Nr. 782-6124) erreicht. Die Anordnung bestand aus einer der schwarzen Platten, in deren Vertiefungen jeweils eine LED platziert wurde. Die LEDs konnten als senkrechte Reihen ein- und ausgeschaltet werden. In jedem Assay blieben zwei Reihen von Zellen als Wachstumskontrollen unbehandelt. Eine dieser Reihen wurde von den LEDs nicht photolysiert, um etwaige unerwartete Effekte der Photolyse aufzuzeigen; Bestrahlung zeigte keine Effekte auf unbehandelte Kontrollzellen. Zwischen der Anordnung und den Assay wurde eine leere Platte platziert, um eine Erhitzung der Zellen zu vermeiden. Zehnminütige Bestrahlung produzierte eine vollständige Photolyse des Biokonjugats in zellfreiem Medium. Die Zellen wurden während des Assays 10 Minuten lang bestrahlt. Die Dauer der Bestrahlung nach der Behandlung mit Arzneistoff wurde in einem Zeitverlaufsassay bestimmt. Die gesamte Platte wurde mit einem der Biokonjugate einer Konzentration behandelt, die dem IC₅₀-Wert von Chlorambucil in der jeweiligen Zelllinie entsprach. Die Reihen wurden gesondert eine halbe Stunde nach der Behandlung und anschließend stündlich bestrahlt.
Bestrahlung eine Stunde nach der Behandlung zeigte die größte Biokonjugataktivität in allen Zelllinien. Es wurden weitere Assays durchgeführt, in denen eine Stunde nach der Behandlung bestrahlt wurde. Im Fall der Zelllinie Meth-A wurden die Zellen für die Photolyse aus der Rundbodenplatte in die schwarze Platte überführt und anschließend wieder in die Rundbodenplatte zurückgegeben. Die HL-60-Zelllinie konnte unter diesen photolytischen Bedingungen nicht getestet werden.
Ergebnisse und Diskussion
Beide Biokonjugate zeigten sowohl in Wasser als auch in zellfreiem Medium bei 37°C einen signifikanten thermischen Zerfall. Nach 8 Stunden hatte die Photolyse keinen Effekt auf das Spektrum, was anzeigt, dass das Biokonjugat vollständig zerfallen war. In den HCT-116-Zellen zeigen beide Biokonjugate einen schnellen anfänglichen Zerfall und sind später wesentlich stabilisiert. Haptocorrin, ein Cobalamin bindendes Protein, ist dafür bekannt, dass es Alkylcobalamine um mehrere Größenordnungen stabilisiert. In dem zellfreien Medium stammt dieses Protein aus dem zugegebenen Rinderserum. Der Großteil dieses Proteins im Serum ist allerdings derart mit Cobalamin gesättigt, dass die Bindung an das Biokonjugat gehemmt sein dürfte. Es ist bekannt, dass mehrere Arten von Tumorzellen hohe Mengen Cobalamin bindender Proteine, vor allem Haptocorrin, sezernieren. Medium, in dem Zellen gezüchtet wurden, weist daher eine höhere Konzentration von Apo-Haptocorrin auf. Der anfängliche schnelle Zerfall der Biokonjugate gibt die Menge wieder, die nach der Sättigung von Haptocorrin in dem Medium verbleibt. Die gebundenen Biokonjugate werden von Haptocorring wesentlich stabilisiert, und der Haptocorrinkomplex assoziiert und dissoziiert in Lösung in dynamischer Weise, vor allem in Gegenwart signifikanter Konzentrationen anderer Cobalamine im Medium. Die Biokonjugate sind also einem Zerfall gegenüber noch anfällig, wenn sie nicht an Haptocorrin gebunden sind. Obwohl Haptocorrin die Biokonjugate um mehrere Größenordnungen stabilisiert, wird in dem Assay dennoch ein langsamer Zerfall beobachtet. Dieser Assay zeigt jedoch an, dass die Biokonjugate derart stabilisiert sind, dass während der Dauer der Aufnahme und Photolyse eine wesentliche Menge noch intakt ist.
Die Daten aus dem Zeitverlauf der Photolyse und den Aktivitätsassays ist in 5–9 für Verbindung 3 in allen getesteten Zelllinien zusammengefasst. Ähnliche Ergebnisse wurden für Verbindung 4 erhalten. Im Allgemeinen zeigten beide Biokonjugate in dem Zeitverlaufsassay der Photolyse eine ähnliche Aufnahme und ein ähnliches Photolyseverhalten. Die maximale photolytisch induzierte Toxizität wird eine Stunde nach Behandlung mit einem der Biokonjugate beobachtet. In allen Fällen zeigte die Photolyse des Biokonjugats höhere Toxizität im Vergleich zum unkonjugierten Chlorambucil. 5 zeigt, dass der chemotherapeutische Arzneistoff, Chlorambucil, was die HCT-116-Zelllinie betrifft, einen LD₅₀-Wert von etwa 2 μM aufweist, wohingegen das Biokonjugat bei Konzentrationen um 100 μM keine wesentliche Toxizität zeigt. Wenn Zellen, die mit dem Biokonjugat behandelt wurden, 12 Stunden nach der Dosierung einer kurzen Bestrahlung mit Rotlicht ausgesetzt wurden, verringert sich der LD₅₀-Wert um einen Faktor 25 auf 0,08 μM. Wenn ein 10-facher Überschuss an Vitamin B₁₂ zugegeben wird, um die Zelloberflächenrezeptoren abzusättigen, wird das Biokonjugat nicht in die Zellen aufgenommen, und Photolyse löst die Freisetzung des aktiven Chlorambucils in das Zellkulturmedium aus. Das freigesetzte Chlorambucil gelangt nun durch passive Diffusion in die Zelle, und es wird ein LD₅₀-Wert von 2 μM beobachtet – in enger Übereinstimmung mit dem Wert für den Chlorambucilstandard.
6 zeigt, dass der unkonjugierte Chlorambucilstandard in Zelllinie HL-60 einen LD₅₀-Wert von 0,5 μM aufweist, aber das Biokonjugat um mindestens das 2-Fache besser ist und einen LD₅₀-Wert von 0,2 μM aufweist. Die Zytotoxizität von MC-121 gegen die Leukämiezelllinie ist dennoch ein drastisches Ergebnis, wenn man es mit der Abwesenheit von Toxizität vergleicht, wenn die zelluläre Aufnahme des Konjugats verdrängt wird, indem 10 Äquivalente von Vitamin B₁₂ zugegeben werden. Ähnliche Ergebnisse wurden mit Meth-A-Zellen erhalten. Die HL-60- und Meth-A-Zellen haben eine hohe Umsatzrate und teilen sich im Falle der Meth-A-Zellen schneller als die anderen Zelllinien. Diese Zellen können Cobalamin faktisch schneller verstoffwechseln als die anderen Zelllinien und setzen daher das Chlorambucil in wesentlichen Konzentrationen ohne Photolyse frei. Damit dies möglich ist, muss der Cobalaminstoffwechsel allerdings vor einer signifikanten Hydrolyse der Chlorambucileinheit ablaufen. Es wurde berichtet, dass HL-60-Zellen in der Lage sind, Vitamin B₁₂ effizient in die anderen Cobalaminformen umzuwandeln (schneller als normale Lymphozyten) (Quadros and Jacobsen, 1995) und wären daher in der Lage, das konjugierte Chlorambucil effizient freizusetzen. In den anderen Zelllinien sind die Biokonjugate unter nicht-photolytischen Bedingungen jedoch im Wesentlichen nicht toxisch, was die Hoffnung zulässt, dass diese Biokonjugate auch in normalen somatischen Zellen oder gesunden hämatopoietischen Zellen nicht toxisch sind. Die IC₅₀-Werte der Biokonjugate unter nicht-photolytischen und photolytischen Bedingungen sind in Tabelle 1 zusammengefasst.
TABELLE 1 IC50-Werte (μM)
Die Verfahren und Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung sollten in Form verschiedener Ausführungsformen Eingang finden, von denen hierin nur einige offenbart sind. Die beschriebenen Ausführungsformen sind daher veranschaulichend und sollen nicht einschränkend sein.
LISTE VON BEZUGSQUELLEN

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Claims

Biokonjugat eines bioaktiven Stoffes und eines organischen Kobaltkomplexes, wobei der organische Kobaltkomplex ein organischer Komplex ist, der ein Kobaltatom enthält, an das 4–5 Stickstoffe und/oder Chalkogene wie Sauerstoff und Schwefel als Teil eines mehrfachen, ungesättigten heterozyklischen Ringsystems gebunden sind, wobei der bioaktive Stoff durch ein nicht-reaktives Atom in dem bioaktiven Stoff kovalent an das Kobaltatom konjugiert ist und wobei das Biokonjugat die Eigenschaft für eine gezielte, selektive Abgabe des bioaktiven Stoffes aus dem Biokonjugat besitzt.
Biokonjugat nach Anspruch 1, wobei das nicht-reaktive Atom aus Kohlenstoff, Stickstoff-, Sauerstoff-, Schwefel-, Selen- und Siliziumatomen ausgewählt ist.
Biokonjugat nach Anspruch 2, wobei das nicht-reaktive Atom ein Kohlenstoffatom einer Alkyl-, Acyl- oder Arylgruppe ist, das unter Bedingungen des Ligandenaustausches nicht zu einer Neuanordnung oder Zerstörung des bioaktiven Stoffes während rezeptorvermittelter Endozytose führt.
Biokonjugat nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei der bioaktive Stoff kovalent direkt an das Kobaltatom des organischen Kobaltkomplexes gebunden ist.
Biokonjugat nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei der bioaktive Stoff über einen Abstandshalter kovalent indirekt an das Kobaltatom des organischen Kobaltkomplexes gebunden ist.
Biokonjugat nach Anspruch 5, wobei der Abstandshalter ein sich selbst zerstörender Linker ist.
Biokonjugat nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei der bioaktive Stoff eine diagnostische Verbindung, eine pharmazeutisch aktive Verbindung, ein Peptid- oder Peptidanalog, ein Protein- oder Proteinanalog oder eine Nukleinsäure oder ein Nukleinsäureanalog ist.
Biokonjugat nach Anspruch 7, wobei die pharmazeutisch aktive Verbindung ein krebshemmender Stoff ist.
Biokonjugat nach Anspruch 7, wobei die Nukleinsäure oder das Nukleinsäureanalog ein Polynukleotid, ein Oligonukleotid oder eine Antisense-DNA oder -RNA ist.
Biokonjugat nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei der organische Kobaltkomplex Kobalamin, ein Kobalaminderivat, ein Kobalaminanalog oder eine Verbindung mit der Formel:
ist, wobei R H, Amino, ein C_1-6-Alkohol oder ein C_1-6-Carboxyl ist, W, W', X, X', Y, Y', Z und Z' unabhängig H, Amino, ein C_1-6-Alkohol oder ein C_1-6-Carboxyl, SO_3-, CH₂OH, CO₂H oder Nitro sind, oder W und X zusammen oder W' und X' zusammen einen 4-6-gliedrigen, zyklischen oder heterozyklischen Ring bilden oder Y und Z zusammen einen 4-6-gliedrigen, zyklischen oder heterozyklischen aromatischen Ring bilden oder Y' und Z' zusammen einen 4-6-gliedrigen, zyklischen oder heterozyklischen aromatischen Ring bilden.
Biokonjugat nach Anspruch 10, das des Weiteren ein Targeting-Molekül umfasst, das kovalent mit einem von R, W, W', X, X', Y, Y', Z oder Z' verknüpft ist, wobei das Targeting-Molekül aus Glukose, Galaktose, Mannose, Mannose-6-Phosphat, Transferrin, Kobalamin, Asialoglykoprotein, α-2-Makroglobulinen, Insulin, einem Peptidwachstumsfaktor, Folsäure oder -derivaten, Biotin oder -derivaten, YEE(GalNAcAH)₃ oder Derivaten, Albumin, Texaphyrin, Metallotexaphyrin, einem Vitamin, einem Coenzym, einem Antikörper, einem Antikörperfragment und einer Einzelkette der variablen Region eines Antikörpers (scFν) ausgewählt ist.
Biokonjugat nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei der organische Kobaltkomplex aus Organo(pyridin)bis(dimethylglyoximato)kobalt, einem Corrinoid oder Derivaten davon ausgewählt ist, wobei das Derivat (a) ein Corrinoid ist, in dem der Benzimidiazol-Ring mit einem Halogen, Hydroxy- oder C_1-6-Alkyl substituiert ist, (b) ein Corrinoid ist, das mit einer Amino-, einer Nitro-, einer Halogen-, einer Sulfito-, einer C_2-6-Alken- oder einer C_2-6-Alkyngruppe substituiert ist oder (c) Organo(pyridin)bis(dimethylglyoximato)kobalt ist, das mit einer Amino-, einer Nitro-, einer Halogen-, einer Sulfito-, einer C_2-6-Alken- oder einer C_2-6-Alkyngruppe substituiert ist.
Biokonjugat nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei der organische Kobaltkomplex Kobalamin, Kobalaminlakton, Kobalaminlaktam oder ein Kobalaminderivat ist, wobei das Kobalaminderivat (a) Kobalamin ist, in dem der Benzimidiazol-Ring mit einem Halogen, Hydroxy- oder C_1-6-Alkyl substituiert ist, (b) ein Anilid, Ethylamin, Monocarbonsäure, Dicarbonsäure, Tricarbonsäure oder ein Propionamidderivat von Kobalamin ist oder (c) Kobalamin ist, das mit einer Amino-, einer Nitro-, einer Halogen-, einer Sulfito-, einer C_2-6-Alken- oder einer C_2-6-Alkyngruppe substituiert ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung, enthaltend ein Biokonjugat wie in einem der Ansprüche 1 bis 13 beansprucht und wahlweise einen pharmazeutische annehmbaren Trägerstoff oder ein pharmazeutisch annehmbares Verdünnungsmittel.