ES2244006T3 - Bioconjugados y administracion de agentes bioactivos. - Google Patents
Bioconjugados y administracion de agentes bioactivos.Info
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Abstract
Un bioconjugado de un agente bioactivo y un complejo de organocobalto, en el que el complejo de organocobalto es un complejo orgánico que contiene un átomo de cobalto con 4-5 nitrógenos y/o calcógenos unidos al mismo, tales como oxígeno y el azufre, como parte de un sistema anular heterocíclico insaturado múltiple, en el que el agente bioactivo está conjugado covalentemente al átomo de cobalto a través de un átomo no reactivo del agente bioactivo, y en el que el bioconjugado tiene la propiedad de ser capaz de una liberación dirigida y selectiva del agente bioactivo desde el bioconjugado.
Description
Bioconjugados y administración de agentes
bioactivos.
Esta invención se realizó en parte con el apoyo
del Gobierno con la subvención Nº ES05728 concedida por el National
Institutes of Health, Bethesda, Maryland. El Gobierno de los Estados
Unidos tiene ciertos derechos sobre la invención.
La presente invención trata de bioconjugados y de
la administración de agentes bioactivos, que son dirigidos
preferiblemente para una liberación zonal específica en células,
tejidos u órganos. Más particularmente, esta invención trata de
bioconjugados que comprenden un agente bioactivo y un complejo de
organocobalto. El agente bioactivo está unido covalentemente directa
o indirectamente al átomo de cobalto del complejo de organocobalto.
El agente bioactivo es liberado desde el bioconjugado mediante la
escisión del enlace covalente entre el agente bioactivo y el átomo
de cobalto del complejo de organocobalto. La escisión puede
producirse como resultado de un desplazamiento normal de los
nucleófilos celulares o por una acción enzimática, pero
preferiblemente es provocado para que se produzca selectivamente en
una zona de liberación predeterminada mediante la aplicación de una
señal externa. La señal externa puede ser luz o fotoexcitación, es
decir, fotolisis, o puede ser ultrasonidos, es decir, sonolisis.
Además, si la fotolisis tiene lugar en presencia de un campo
magnético que rodea a la zona de liberación, se minimiza la
liberación del agente bioactivo en el tejido sano circundante.
Las publicaciones y otros materiales usados en
ésta invención para aclarar los antecedentes de la invención, y en
particular, los casos que proporcionan detalles adicionales con
respecto a la práctica, se incorporan como referencia, y por
conveniencia se relacionan en el texto que sigue por autor y fecha,
y están enumerados alfabéticamente por autor en la bibliografía
anexa.
El foco del conjunto sustancial de la
investigación ha sido el desarrollo de un sistema mediante el cual
se pueda administrar selectivamente un agente farmacéutico en una
localización anatómica deseada; a saber, la zona con necesidad de
tratamiento. A pesar del gran progreso que se ha conseguido a este
respecto, muchos sistemas de administración farmacéuticos para el
tratamiento de diversas enfermedades o riesgos sanitarios, por
ejemplo, el tratamiento del cáncer, trasmiten un riesgo sustancial
al paciente. Con respecto al tratamiento del cáncer, los fármacos
que son eficaces atacando a células malignas para destruirlas, o al
menos limitando su proliferación, tienen tendencia a atacar también
a las células benignas. Por lo tanto, es altamente deseable limitar
la localización de su acción a la del cáncer, y asegurarse de que en
cualquier momento se usan cantidades de dichos fármacos eficaces,
pero no excesivas.
Aunque se desea concentrar un agente citotóxico
en una zona diana, los actuales protocolos de tratamiento del cáncer
para administrar estos agentes citotóxicos requieren típicamente una
dosificación intravenosa repetida, con un cuidadoso seguimiento del
paciente. Los fármacos se usan a menudo en combinación para ejercer
un ataque por varios flancos sobre las células neoplásicas. La dosis
se elige para que esté justo por debajo de la cantidad que producirá
una toxicidad aguda (y a veces crónica) que puede dar lugar a
cardiomiopatías, mielotoxicidad, toxicidad hepática o toxicidad
renal potencialmente mortales. La alopecia (pérdida del cabello),
mucositis, estomatitis y náuseas son otros efectos secundarios
comunes, pero generalmente no potencialmente mortales, a estas
dosis. Dado que muchos de estos compuestos son potentes vesicantes,
se producirá una necrosis tisular si se produce una extravasación
localizada (pérdida del fármaco desde la sangre hacia el tejido
circundante). Estos efectos se producen porque en la sangre se
alcanza generalmente una concentración específica de ese fármaco
antes de que sea eficaz. Dado que la sangre se transporta por todo
el cuerpo del hospedador que se está tratando, también lo hace el
agente farmacéutico. El seguimiento de esta técnica proporciona una
distribución uniforme del fármaco por todo el cuerpo, en lugar de
concentrarlo en la zona de tratamiento. Adicionalmente, dichos
procedimientos de tratamiento sistémicos exponen a las células sanas
al agente citotóxico simultáneamente con el tratamiento de las
células no sanas o enfermas, además de limitar la concentración del
fármaco en la zona donde más se necesita.
Los intentos previos de administrar dichos
fármacos mediante inyección indirecta en el lugar del órgano con
cáncer son sólo parcialmente eficaces, debido a la migración del
fármaco desde ese lugar y como resultado de una extensa necrosis
tisular por extravasación. Dicha dispersión no puede ser totalmente
evitada, con el resultado de que tienen que administrarse cantidades
excesivas del fármaco para alcanzar el resultado deseado. Aunque una
monitorización clínica cuidadosa puede evitar un daño extenso o una
pérdida de tejido viable, el suministro de un sistema
vehículo-agente farmacéutico que sea transportado
activamente a través de sistemas biológicos estándar hacia la zona
de tratamiento antes de la activación del agente farmacéutico sería
altamente deseable no sólo para optimizar la utilización del fármaco
sino también para reducir los efectos secundarios y/o minimizar la
destrucción de las células sanas. La inyección directa de agentes
citotóxicos en tumores sólidos de mama, vejiga, próstata y pulmón
usando agentes quimioterapéuticos citotóxicos convencionales como
coadyuvantes a la cirugía y/o radioterapia ha tenido un éxito
limitado para prolongar las vidas de los pacientes. Esto se debe
parcialmente a las limitaciones de las dosis impuestas por la
toxicidad aguda y crónica a sistemas de tejidos u órganos más allá
de los que son objetivos.
Dado que se refiere a la administración de
fármacos citotóxicos o antineoplásicos, la eficaz resolución de las
cuestiones relacionadas con las formas de administración, con la
limitación del tamaño de la dosis y la frecuencia de administración,
y con los efectos secundarios sería ciertamente beneficiosa en el
tratamiento del cáncer.
Los oligonucleótidos que interfieren
específicamente con la expresión génica a nivel de la transcripción
o la traducción tienen el potencial de ser usados como agentes
terapéuticos para controlar la síntesis de proteínas nocivas
relacionadas con enfermedades víricas, neoplásicas u otras
enfermedades. Es posible elegir oligonucleótidos monocatenarios que
reconozcan y se unan al surco mayor de un ADN bicatenario desplegado
de una forma específica con la secuencia para formar un hélice
triple (Le Doan y col., 1987; Moser y Dervan, 1987). Se han usado
oligonucleótidos formadores de triple hélice dirigidos a la región
promotora de ciertos genes para bloquear físicamente la síntesis de
ARN en ensayos de transcripción sin células (Cooney y col., 1988;
Postel y col., 1992; Skoog y col., 1993; Rando y col., 1994). De
forma similar, se han usado ensayos de traducción in vitro
para demostrar que los oligonucleótidos antisentido pueden unirse a
ARNm dianas y evitar la síntesis proteica (Uhlmann y Peyman, 1990;
Cohen y Hogan, 1994).
Aunque los oligonucleótidos antisentido han
mostrado una gran eficacia en la inhibición selectiva de la
expresión génica (Stein y Cohen, 1988; Szczylik y col., 1991; Gray y
col., 1993), las aplicaciones terapéuticas de dichos
oligonucleótidos antisentido están actualmente limitadas por su baja
estabilidad fisiológica, su lenta captación celular y la ausencia de
especificidad celular. Los impedimentos de inestabilidad han sido
ampliamente superados mediante el uso de oligonucleótidos con
estructura molecular modificada que son más resistentes a las
nucleasas. Los metilfosfonatos, los conjugados proteína-ácido
nucleico y los fosforotioatos parecen resistir todos a la digestión
enzimática mejor que los correspondientes oligonucleótidos naturales
(Chang y Miller, 1991; Wickstrom y col., 1992; Letsinger, 1993; Zon,
1993).
Los problemas con la captación celular de los
oligonucleótidos antisentido han sido más difíciles de resolver. Las
rutas de captación endógenas que se basan en la pinocitosis y los
procesos relacionados tienen generalmente una capacidad insuficiente
para administrar las cantidades de oligonucleótidos antisentido
requeridas para suprimir la expresión génica (Vlassov y col., 1994).
También se han emprendido modificaciones hidrófobas para mejorar la
permeabilidad de la membrana, pero dichas estrategias de
derivatización son más útiles únicamente en oligonucleótidos cortos
(Vlassov y col., 1994). Aunque los complejos de construcciones
antisentido con liposomas o inmunoliposomas catiónicos (Gao y Huang,
1991; Bennett y col., 1992, Ma y Wei, 1996) y polilisina (Trubetskoy
y col., 1992; Bunnell y col., 1992) han mejorado significativamente
la administración intercelular, simultáneamente han introducido
nuevos inconvenientes propios. Por lo tanto, ambos procedimientos
muestran cierta citotoxicidad vehicular, y como en otros protocolos,
ninguna estrategia permite acceder a ningún tejido o célula. En
resumen, la administración intracelular y la especificidad tisular
permanecen como los obstáculos principales ante la implementación de
fármacos antisentido en el tratamiento de trastornos en humanos.
Otras técnicas para la administración de
oligonucleótidos en las células incluyen el uso de: (a)
construcciones de
folato-PEG-liposoma para la
administración de ADN antisentido contra el receptor del factor de
crecimiento (Wang y col., 1995); (b) construcciones de ácido
fólico-polilisina para la administración de ADN
c-myc antisentido (Ginobbi y col., (1997); (c)
tris(glucósido de
N-acetilgalactosamina-aminohexilo)
amida de glutamato de tirosil(glutamilo)
(YEE(GalNAcAH)_{3}) unido a polilisina para la
administración de ADN a las células a través del receptor de la
asialoglucoproteína (Merwin y col., 1994); y (d) policationes en
bloque solubles en agua (Kabanov y col., 1995).
Durante algún tiempo se ha sabido que puede
unirse un agente farmacéuticamente activo a una molécula o vehículo.
El término "profármaco" se relaciona a menudo con dichos
sistemas en los que el agente activo está unido a otra molécula con
el propósito de su administración. El fármaco es habitualmente
inactivo en su estado de profármaco y el enlace se escinde
posteriormente liberando el fármaco en la zona en la que puede ser
eficaz. Sin embargo, estos sistemas no son tan útiles como deberían
por diversas razones, siendo una de ellas la especificidad zonal.
También, la liberación del fármaco desde su vehículo requiere la
presencia de algún agente o un suceso que separe el fármaco activo
de su vehículo o molécula, y como tal, puede depender de varios
factores tales como la presencia de una enzima específica, las
condiciones de pH, el tiempo de liberación y similares, que pueden
ser variables de un hospedador a otro y que no pueden llevarse a
cabo eficazmente.
Por ejemplo, el transporte transmembranal de
moléculas de nutriente es una función celular crítica. Dado que los
médicos han reconocido la importancia del transporte transmembranal
en muchas áreas de la ciencia médica y biológica, incluyendo el
tratamiento con fármacos, el tratamiento con péptidos y la
transferencia génica, se han dirigido unos significativos esfuerzos
de investigación hacia la comprensión y la aplicación de dichos
procesos. Así, por ejemplo, la administración transmembranal de
ácidos nucleicos ha sido impulsada mediante el uso de vehículos
proteicos, vehículos anticorpales, sistemas de administración
liposomales, electroporación, inyección directa, fusión celular,
vehículos vivos, choque osmótico y transformación mediada por
calcio-fosfato. Sin embargo, muchas de estas
técnicas están limitadas tanto por los tipos de células en los que
se permite el transporte transmembranal como por las condiciones de
uso para un transporte transmembranal con éxito de especies
moleculares exógenas. Además, muchas de estas técnicas conocidas
están limitadas por el tipo y el tamaño de la molécula exógena que
puede ser transportada a través de la membrana sin pérdida de la
bioactividad.
Un procedimiento para la administración
transmembranal de moléculas exógenas con una amplia aplicabilidad se
basa en el mecanismo de la actividad endocitótica mediada por
receptor. Al contrario que en otros muchos procedimientos, la
actividad endocitótica mediada por receptor puede usarse con éxito
tanto in vivo como in vitro. La endocitosis mediada
por receptor implica el movimiento de ligandos unidos a receptores
de membrana hacia el interior de un área definida por la membrana
mediante invaginación de la membrana. El procedimiento se inicia o
se activa por la unión al receptor de un ligando específico del
receptor. Se han caracterizado muchos sistemas endocitóticos
mediados por receptor, incluyendo los que reconocen galactosa,
manosa, manosa-6-fosfato,
transferrina, asialoglucoproteína, transcobalamina (Vitamina
B_{12}),
\alpha-2-macroglobulinas, insulina
y otros factores de crecimiento de tipo peptídico, tales como el
factor de crecimiento epidérmico (EGF).
La actividad endocitótica mediada por receptor se
ha utilizado para administrar moléculas exógenas tales como
proteínas y ácidos nucleicos a células. Generalmente, se conjuga
químicamente un ligando específico mediante un enlace covalente,
iónico o de hidrógeno con una molécula exógena de interés (es decir,
el compuesto exógeno), formando una molécula conjugada con un resto
(la porción del ligando) que sigue reconociéndose en el conjugado
por un receptor diana. Usando esta técnica se ha conjugado el agente
fototóxico psoraleno con insulina, y se ha internalizado mediante la
vía endocítica del receptor de la insulina (Gasparro, 1986); el
receptor específico de hepatocitos para asialoglucoproteínas
galactosa terminales se ha utilizado para la administración
transmembranal específica de hepatocitos de
asialoorosomucoid-poli-L-lisina
complejada no covalentemente con un plásmido de ADN (Wu, 1987); el
receptor celular del factor de crecimiento epidérmico se ha
utilizado para administrar polinucleótidos unidos covalentemente al
EGF al interior celular (Myers, 1988); el receptor celular situado
en el intestino para el complejo organometálico Vitamina
B_{12}-factor intrínseco se ha usado para mediar
en la administración al sistema circulatorio de un hospedador
vertebrado de un fármaco, hormona, péptido bioactivo o inmunógeno
complejado con Vitamina B_{12} y administrado en el intestino
mediante su administración oral (Russell-Jones y
col., 1995); el receptor de manosa-6- fosfato se ha
usado para administrar lipoproteínas de baja densidad a células
(Murray y Neville, 1980); el receptor de la subunidad de unión de la
toxina colérica se ha usado para administrar insulina a células que
carecen de receptores para insulina (Roth y Maddox, 1983); el
receptor de la gonadotropina coriónica humana se ha empleado para
administrar una cadena a de ricina acoplada a la HCG a células con
el receptor apropiado para HCG con objeto de destruir las células
(Oeltmann y Heath, 1979); el receptor de la transferrina se ha usado
para administrar mitomicina C a células de sarcoma (Tanaka y col.,
1996) o para administrar doxorrubicina a células resistentes a
múltiples fármacos (Fritzer y col., 1996); el receptor de la biotina
se ha empleado para administrar hipoxantina-guanina
fosforibosil transferasa (HGPRT) biotinilando la HGPRT para
restablecer el crecimiento de células deficientes en HGPRT (Low y
col., 1995); y el receptor del ácido fólico se ha usado para
administrar ADN antisentido a células de fibroblastos transformadas
con src (Low y col., 1995).
Russell-Jones y col. (1995)
describen un sistema que implica la formación de un enlace covalente
entre el agente farmacéutico que se desea administrar y una Vitamina
B_{12} modificada para formar una molécula conjugada. El conjugado
se administra por vía oral y después es transportado desde la luz
intestinal hasta la circulación. En gran medida, el agente
farmacéutico y la vitamina están unidos mediante una unión amida que
es propensa a una hidrólisis ácida. Russell-Jones y
col. averiguaron que muchos agentes farmacéuticos biológicamente
activos pueden unirse a la B_{12} para facilitar la introducción
del fármaco en el torrente sanguíneo mediante su administración
oral. De forma destacada, no se proporcionó ningún procedimiento
mediante el cual el enlace fármaco-B_{12} pudiera
ser escindido de forma selectiva, ni la localización del agente
farmacéutico activo pudiera ser controlada una vez activado. En
cambio, Russell-Jones y col. se basaron en la
degradación bioquímica del enlace fármaco-B_{12}
para liberar el fármaco en su forma activa. De forma destacada, con
este procedimiento, el fármaco podía ser liberado en su forma activa
en cualquier zona del sistema circulatorio, disminuyendo la
importancia del transporte activo de la B_{12} hacia tejido
canceroso. Adicionalmente, los conjugados formados con este
procedimiento requieren la modificación de la estructura del anillo
de corrina de la molécula B_{12}, modificación que puede tener
efectos graves sobre las interacciones del receptor.
Pathare, P. M. y col. (Bioconjugate Chemistry,
American Chemical Society, Washington, EE.UU., vol. 7, Nº 2, 1 de
marzo de 1996, págs. 217 a 232) muestran la conjugación de la cadena
lateral de la e-propionamida del anillo de corrina
de la cobalamina, y el documento WO9427613 muestra complejos entre
análogos de la VB_{12} y tanto GCSF como EPO usando un compuesto
separador; sin embargo, ningún documento muestra un bioconjugado
según se establece en la reivindicación 1 abajo mencionada.
Por tanto, existe una necesidad de un sistema de
administración de fármacos que pueda ser utilizado para la
administración de agentes bioactivos, incluyendo productos
farmacéuticos, péptidos y oligonucleótidos. También hay una
necesidad de un sistema de administración de fármacos que pueda
usarse para la liberación zonal específica del agente bioactivo en
las células, tejidos u órganos en los que se desea efectuar un
efecto terapéutico.
Según un primer aspecto de la invención se prevé
según la reivindicación 1.
El agente bioactivo es liberado del bioconjugado
mediante la escisión del enlace covalente entre el agente bioactivo
y el átomo de cobalto del complejo de organocobalto, según se
describe en esta invención.
El agente bioactivo es cualquier agente que se
desee administrar a células, tejidos u órganos con efectos
nutrientes o terapéuticos. Según la presente invención, algunos
agentes bioactivos incluyen, pero no se limitan a, nutrientes,
productos farmacéuticos, fármacos, péptidos y oligonucleótidos.
El complejo de organocobalto es cualquier
complejo orgánico que contiene un átomo de cobalto con
4-5 nitrógenos y/o calcógenos tales como oxígeno,
azufre, etc., unidos al mismo, como parte de un sistema anular
heterocíclico insaturado múltiple. Según la presente invención,
algunos complejos de organocobalto adecuados incluyen, pero no se
limitan a, cobalamina, Co[SALEN],
organo(piridina)bis(dimetilglioximato)cobalto,
corrinoides y derivados de los mismos y análogos de los mismos. Los
complejos de organocobalto pueden ser no sustituidos o estar
sustituidos con grupos funcionales orgánicos convencionales que no
alterarán la naturaleza básica del complejo de organocobalto. La
naturaleza básica del complejo de organocobalto es unirse directa o
indirectamente al agente bioactivo covalentemente en el cobalto, de
forma que el enlace cobalto-agente bioactivo es
fácilmente escindible según se describe en esta invención. El
complejo de organocobalto también puede unirse de forma covalente
directa o indirectamente a una molécula marcadora. La molécula
marcadora es una molécula para la que las células, el tejido u
órgano deseado tienen un requerimiento o un receptor, según se
describe en esta invención.
Según un aspecto adicional de la invención se
prevé una composición farmacéutica que contiene un bioconjugado
según se definió anteriormente, y opcionalmente, un vehículo o
diluyente farmacéuticamente aceptable.
El bioconjugado según la presente invención se
administra a un sujeto con necesidad de tratamiento terapéutico. El
bioconjugado se concentra en una zona de una célula, tejido u órgano
diana como resultado del complejo de organocobalto. Como ejemplo, se
administra un bioconjugado que contiene un agente quimioterapéutico
a un paciente, y el bioconjugado se concentra en células
neoplásicas, en las que el agente quimioterapéutico activo es
liberado del bioconjugado mediante escisión. Igualmente, se
administran otros productos farmacéuticos, fármacos, péptidos u
oligonucleótidos a un sujeto como parte del bioconjugado, que se
concentran en las células, tejidos u órganos deseados. Los productos
farmacéuticos, fármacos péptidos u oligonucleótidos son liberados
mediante escisión. En una forma de realización, la escisión puede
producirse como resultado de un desplazamiento normal de los
nucleófilos celulares o por acción enzimática. En una segunda forma
de realización, la escisión es provocada para que se produzca
selectivamente en la zona de liberación predeterminada mediante una
señal externa. La señal externa puede ser luz o fotoexcitación, es
decir, fotolisis, o puede ser ultrasonidos, es decir, sonolisis.
Además, si la fotolisis tiene lugar en presencia de un campo
magnético que rodea a la zona de liberación, puede minimizarse la
liberación del fármaco, tal como un agente citotóxico, en el tejido
sano circundante.
La Figura 1 muestra la estructura y el espectro
de absorción de metilcobalamina (B_{12}).
La Figura 2 muestra la estructura y el espectro
de absorción de etil-Co[SALEN]
(cobalto-bis-salicilideno)-etilenodiamina.
La Figura 3A muestra un espectro de absorción
secuencial de CH_{3}-Cbl^{III} acuosa como
función de una sonolisis anaeróbica (pH 7,38, HEPES 100 mM, Ar
saturante).
La Figura 3B muestra el cambio en el espectro de
absorbancia tras una sonolisis aeróbica en ausencia de tampón
orgánico.
La Figura 4A muestra un espectro de absorción
secuencial del compuesto 3 acuosa (Ejemplo 6) como función de una
sonolisis anaeróbica a pH 7,4, HEPES 100 mM, Ar saturante.
La Figura 4B muestra el cambio en el espectro de
absorción del compuesto 3 (Ejemplo 6) en una disolución que contiene
tampón fosfato.
La Figura 5 muestra el efecto de un bioconjugado
de clorambucil sobre la viabilidad celular en la línea celular
HCT-116. Los resultados se muestran para el
clorambucil (\blacksquare), el bioconjugado de clorambucil con
fotolisis (\medcirc), el bioconjugado de clorambucil sin fotolisis
(\blacktriangle) y el bioconjugado de clorambucil más 10
equivalentes de hidroxicobalamina con fotolisis (\nabla).
La Figura 6 muestra el efecto de un bioconjugado
de clorambucil sobre la viabilidad celular en la línea celular
HL-60. Los resultados se muestran para el
clorambucil (\blacksquare), el bioconjugado de clorambucil sin
fotolisis (\blacktriangle) y el bioconjugado de clorambucil más
10 equivalentes de hidroxicobalamina sin fotolisis (\nabla).
La Figura 7 muestra el efecto de un bioconjugado
de clorambucil sobre la viabilidad celular en la línea celular
B-16. Los resultados se muestran para el clorambucil
(\blacksquare), el bioconjugado de clorambucil con fotolisis
(\medcirc), el bioconjugado de clorambucil sin fotolisis
(\blacktriangle) y el bioconjugado de clorambucil más 10
equivalentes de hidroxicobalamina con fotolisis (\nabla).
La Figura 8 muestra el efecto de un bioconjugado
de clorambucil sobre la viabilidad celular en la línea celular
Meth-A. Los resultados se muestran para el
clorambucil (\blacksquare), el bioconjugado de clorambucil con
fotolisis (\medcirc), el bioconjugado de clorambucil sin fotolisis
(\blacktriangle) y el bioconjugado de clorambucil más 10
equivalentes de hidroxicobalamina con fotolisis (\nabla).
La Figura 9 muestra el efecto de un bioconjugado
de clorambucil sobre la viabilidad celular en la línea celular
RD-995. Los resultados se muestran para el
clorambucil (\blacksquare), el bioconjugado de clorambucil con
fotolisis (\medcirc), el bioconjugado de clorambucil sin fotolisis
(\blacktriangle) y el bioconjugado de clorambucil más 10
equivalentes de hidroxicobalamina con fotolisis (\nabla).
La presente invención se refiere a bioconjugados
y de la administración de agentes bioactivos, que son dirigidos
preferiblemente para una liberación zonal específica en células,
tejidos u órganos. Más particularmente, esta invención se refiere a
bioconjugados que comprenden un agente bioactivo y un complejo de
organocobalto. El agente bioactivo está unido covalentemente directa
o indirectamente al átomo de cobalto del complejo de organocobalto.
El agente bioactivo es liberado desde el bioconjugado mediante la
escisión del enlace covalente entre el agente bioactivo y el átomo
de cobalto del complejo de organocobalto. La escisión puede
producirse como resultado de un desplazamiento normal de los
nucleófilos celulares o por una acción enzimática, pero
preferiblemente es provocada para que se produzca selectivamente en
una zona de liberación predeterminada mediante la aplicación de una
señal externa. La señal externa puede ser luz o fotoexcitación, es
decir, fotolisis, o puede ser ultrasonidos, es decir, sonolisis.
Además, si la fotolisis tiene lugar en presencia de un campo
magnético que rodea a la zona de liberación, se minimizad la
liberación del agente bioactivo en el tejido sano circundante
El bioconjugado según la presente invención se
administra a un sujeto con necesidad de tratamiento terapéutico. El
bioconjugado se concentra en una zona de una célula, tejido u órgano
objetivo como resultado del complejo de organocobalto. El agente
bioactivo es liberado del bioconjugado mediante escisión. En una
forma de realización, la escisión puede producirse como resultado de
un desplazamiento normal de los nucleófilos celulares o por acción
enzimática. En una segunda forma de realización, la escisión es
provocada para que se produzca selectivamente en la zona de
liberación mediante una señal externa. La señal externa puede ser
luz o fotoexcitación, es decir, fotolisis, o puede ser ultrasonidos,
es decir, sonolisis. Además, si la fotolisis tiene lugar en
presencia de un campo magnético que rodea a la zona de liberación,
se minimiza la liberación del fármaco, tal como un agente
citotóxico, en el tejido sano circundante.
Como ejemplo, el bioconjugado contiene un agente
quimioterapéutico y se administra a un paciente con cáncer. En este
ejemplo, se administra por vía intravenosa una cantidad
terapéuticamente eficaz del bioconjugado a un paciente, de forma que
el bioconjugado se concentra en las células neoplásicas. El agente
quimioterapéutico es liberado del bioconjugado por medios naturales
(por ejemplo, nucleófilos celulares o acción enzimática) o
preferiblemente por medio de una señal externa (por ejemplo, luz o
ultrasonidos).
Como segundo ejemplo, el bioconjugado contiene un
agente citotóxico y se administra a un paciente con psoriasis. En
este ejemplo, se administra una cantidad terapéuticamente eficaz del
bioconjugado a una zona afectada de la piel. El agente citotóxico es
liberado por medios naturales o, preferiblemente, por medio de una
señal externa.
Como tercer ejemplo, el bioconjugado contiene el
dominio enzimático de la toxina diftérica (Nichols y col., 1997) y
se administra a un paciente con cáncer. En este ejemplo, se
administra por vía intravenosa una cantidad terapéuticamente eficaz
del bioconjugado a un paciente, de forma que el bioconjugado se
concentra en las células neoplásicas. El dominio enzimático de la
toxina diftérica es liberado del bioconjugado por medios naturales
(por ejemplo, nucleófilos celulares o acción enzimática) o
preferiblemente por medio de una señal externa (por ejemplo, luz o
ultrasonidos), y procede a destruir las células cancerosas.
Como cuarto ejemplo, el bioconjugado contiene un
oligonucleótido antisentido contra el virus de la hepatitis B (Yao y
col., 1996; Madon y Blum, 1996) y se administra a un sujeto con
hepatitis B. En este ejemplo, se administra por vía intravenosa una
cantidad terapéuticamente eficaz del bioconjugado a un paciente, de
forma que el bioconjugado se concentra en el hígado. El
oligonucleótido antisentido es liberado del bioconjugado por medios
naturales (por ejemplo, nucleófilos celulares o acción enzimática) o
preferiblemente por medio de una señal externa (por ejemplo, luz o
ultrasonidos), y procede a inhibir la expresión génica y la
replicación del virus de la hepatitis B.
La presente invención emplea las siguientes
definiciones:
Agente bioactivo: cualquier agente que se
desee administrar a células, tejidos u órganos para modular o
modificar de otro modo la función celular, incluyendo para efectos
terapéuticos. Según la presente invención, algunos agentes
bioactivos incluyen, pero no se limitan a, compuestos
farmacéuticamente activos o compuestos de diagnóstico. Algunos
agentes bioactivos incluyen, pero no se limitan a, péptidos,
oligopéptidos, proteínas, apoproteínas, glucoproteínas, antígenos y
anticuerpos o fragmentos del mismo anticuerpo, receptores y otras
proteínas de membrana, oligopéptidos retro-inverso,
análogos de proteínas en los que al menos una unión no peptídica
reemplaza a una unión peptídica, enzimas, coenzimas, inhibidores
enzimáticos, aminoácidos y sus derivados, hormonas, lípidos,
fosfolípidos, liposomas, ricina o fragmentos de ricina; toxinas
tales como aflatoxina, digoxina, xantotoxina, rubratoxina;
antibióticos tales como cefalosporinas, penicilina y eritromicina;
analgésicos tales como aspirina, ibuprofeno y acetaminofeno,
broncodilatadores tales como teofilina y albuterol;
beta-bloqueantes tales como propranolol, metoproloI,
atenolol, labetolol, timolol, penbutolol y pindolol; agentes
antimicrobianos tales como los descritos anteriormente y
ciprofloxacina, cinoxacina y norfloxacina; agentes antihipertensivos
tales como clonidina, metildopa, prazosina, verapamil, nifedipina,
aptopril y enalapril; agentes cardiovasculares incluyendo
antiarrítmicos, glucósidos cardiacos, antianginosos y
vasodilatadores, agentes del sistema nervioso central incluyendo
estimulantes, psicotropos, antimaniacos y depresores; agentes
antivíricos; antihistamínicos tales como clorfeniramina y
bromfeniramina; fármacos anticancerígenos incluyendo agentes
quimioterapéuticos, tales como clorambuciI, carboplatino, derivados
de busulfan, doxorrubicina, etopósido, topotecán (TPT);
tranquilizantes tales como diazepam, clordiacepóxido, oxazepam,
alprazolam y triazolam, antidepresivos tales como fluoxetina,
amitriptilina, nortriptiline e imipramine; antagonistas
H-2 tales como nizatidina, cimetidina, famotidina y
ranitidina, anticonvulsivos ; antieméticos; prostaglandinas;
relajantes musculares; sustancias antiinflamatorias; estimulantes;
descongestivos; antieméticos; diuréticos; antiespasmódicos;
antiasmáticos; agentes antiparkinsonianos; expectorantes;
antitusivos, mucolíticos; vitaminas; y aditivos minerales y
nutricionales. Otras moléculas incluyen nucleótidos;
oligonucleótidos; polinucleótidos; y sus análogos y derivados
reconocidos en la técnica y biológicamente funcionales, incluyendo,
por ejemplo, polinucleótidos metilados y análogos de nucleótidos con
uniones fosforotioato; plásmidos, cósmidos, cromosomas artificiales,
otros vectores de ácidos nucleicos; polinucleótidos antisentido
incluyendo los sustancialmente complementarios a al menos un ácido
nucleico endógeno o los que tienen secuencias con un sentido opuesto
a al menos porciones de genomas víricos o retrovíricos elegidos;
promotores; potenciadores; inhibidores; otros ligandos para la
regulación de la transcripción y la traducción génica. Además, el
agente bioactivo puede ser cualquier otra molécula biológicamente
activa que pueda formar un conjugado con un complejo de
organocobalto. El agente bioactivo puede contener además un
separador que proporcione un enlace covalente con el átomo de
cobalto del complejo de organocobalto, pero que no afecte
negativamente a la actividad biológica del agente bioactivo.
Bioconjugado: un conjugado que contiene un
agente bioactivo y un complejo de organocobalto, en el que el agente
bioactivo está unido de forma covalente directamente al átomo de
cobalto o está unido de forma covalente indirectamente al átomo de
cobalto a través de un separador.
Átomo no reactivo: un átomo del agente
bioactivo que no dará lugar a un reordenamiento o a una destrucción
del agente bioactivo en condiciones de intercambio del ligando
durante una endocitosis mediada por receptor, sino que más bien
reproducirá la forma original del agente bioactivo (o del agente
bioactivo y el separador), y que por lo tanto desenmascare un agente
bioactivo activo. El átomo no reactivo puede ser un átomo de
carbono, un átomo de nitrógeno, un átomo de oxígeno, un átomo de
azufre, un átomo de selenio o un átomo de silicio. Es
particularmente preferible un átomo de carbono (por ejemplo, de un
grupo alquilo, acilo o arilo). Dichos átomos no reactivos también se
usan para formar el enlace covalente entre el cobalto y el
separador.
Complejo de organocobalto: un complejo
orgánico que contiene un átomo de cobalto con 4-5
calcógenos unidos al mismo como parte de un sistema anular
heterocíclico insaturado múltiple. Según la presente invención,
algunos complejos de organocobalto adecuados incluyen, pero no se
limitan a, cobalamina (coenzima B_{12}), Co[SALEN] (que es
un análogo de la cobalamina),
organo(piridina)bis(dimetilglioximato)cobalto,
corrinoides (tales como los descritos por Brown y col., 1996) y
derivados o análogos de cualquiera de los precedentes, así como sus
sales farmacéuticamente aceptables. Los complejos de organocobalto
pueden ser no sustituidos o estar sustituidos con grupos funcionales
orgánicos convencionales que no alterarán la naturaleza básica del
complejo de organocobalto. La naturaleza básica del complejo de
organocobalto es unir covalentemente el agente bioactivo al átomo de
cobalto, de forma que el enlace cobalto-agente
bioactivo es fácilmente escindible según se describe en esta
invención. Algunos ejemplos de sustituyentes que pueden encontrase
en el complejo de organocobalto incluyen, amino, nitro, halógeno
(bromo, cloro), sulfito, alqueno C_{2-6} y alquino
C_{2-6}. Por ejemplo, el complejo de
organocobalto puede formarse con un derivado nitro y/o haluro (por
ejemplo, bromo) del anillo de corrina, o tener una conjugación
extendida con una olefina exocíclica o grupos alquileno. Otros
derivados incluyen lactona de cobalamina, lactama de cobalamina y
aquellos en los que el anillo bencimidazólico (por ejemplo,
cobalamina, corrinoide verde y similares) están sustituido con, por
ejemplo, uno o más halógenos (bromo, cloro), hidroxi o alquilo
C_{1-6}. Estos sustituyentes son útiles para
aumentar la \lambda_{max} que se va a usar para escindir el
bioconjugado según se describe en esta invención. Algunos derivados
adicionales incluyen anilida, etilamida, derivados de ácidos mono,
di o tricarboxílicos o de propionamida de cobalamina de Vitamina
B_{12}. En una forma de realización, el complejo de organocobalto
es cualquier complejo orgánico que contiene cobalto que está unido
por transcobalamina y es transportado hasta una célula mediante un
proceso mediado por receptor que implica a la transcobalamina. En
una segunda forma de realización, el complejo de organocobalto
también puede estar unido covalentemente directa o indirectamente
(mediante un separador) a una molécula marcadora, en el que dicha
molécula marcadora está unida por su receptor, y el complejo es
transportado hasta una célula mediante un proceso mediado por
receptor. El Co[SALEN] y sus derivados o análogos pueden
representarse mediante la fórmula general
en la que los sustituyentes pueden
ser incluidos u omitidos para modular las propiedades físicas de la
molécula, por ejemplo, su solubilidad en agua, su estabilidad o la
\lambda_{máx} -longitud de onda a la cual absorbe el complejo.
Por tanto, los sustituyentes son como sigue: R es H, un grupo que
aumenta la solubilidad en agua y/o la estabilidad, o un grupo para
la fijación de una molécula marcadora, y W, W', X, X', Y, Y', Z y Z'
son independientemente H, un grupo que aumenta la solubilidad en
agua y/o la estabilidad, un grupo para la fijación de una molécula
marcadora o un grupo para una absorbancia de energía modificada, o W
y X juntos y W' y X' juntos son un anillo cíclico o heterocíclico de
4-6 miembros, o Y y Z juntos e Y' y Z' juntos forman
un anillo aromático cíclico o heterocíclico de 4-6
miembros. Algunos ejemplos de grupos para mejorar la solubilidad en
agua incluyen amino, alcohol C_{1-6}, carboxilo
C_{1-6} para cualquier sustituyente, o también
SO_{3-} para los sustituyentes distintos a R. Algunos ejemplos de
grupos para la fijación de una molécula marcadora incluyen amino,
alcohol C_{1-6} y carboxilo
C_{1-6} para cualquier sustituyente. Algunos
ejemplos de grupos para modificar la absorbancia incluyen
CH_{2}OH, CO_{2}H, SO_{3-}, amino y nitro para los
sustituyentes distintos a R. Dichos grupos son útiles para aumentar
la longitud de onda de la luz que se va a usar para la escisión del
bioconjugado según se describe en esta invención, mientras que las
moléculas marcadoras son útiles para dirigir selectivamente el
bioconjugado hacia el tejido deseado. Por lo tanto, cuando se usa en
el contexto de la presente solicitud, el término complejo de
organocobalto, salvo que se identifique específicamente, debe
incluir la B_{12} en todas sus formas de realización, incluyendo
la coenzima B_{12}, Co[SALEN] y otras moléculas de B_{12}
o similares a B_{12}, los complejos de organocobalto definidos en
esta invención, así como cualesquiera derivados y análogos del
mismo.
Separador: un átomo o molécula que une
covalentemente dos componentes entre si. En la presente invención,
un separador pretende incluir átomos y moléculas que pueden usarse
para unir covalentemente un agente bioactivo al átomo de cobalto de
un complejo de organocobalto, o unir covalentemente una molécula
marcadora a un complejo de organocobalto. El separador no debe
impedir la unión del complejo de organocobalto o de la molécula
marcadora con su receptor apropiado. Algunos ejemplos de separadores
adecuados incluyen, pero no se limitan a, polimetileno
[-(CH_{2})_{n}, en el que n es 1-10],
éster [agente bioactivo unido a O, y Co a C=O], carbonato, éter,
acetal o cualquier combinación de dos o más de estas unidades. Un
experto reconocerá fácilmente otros separadores que pueden usarse
según la presente invención.
Muchos de estos separadores son útiles como un
grupo conector "autodestructivo". Esto es, algunas o todas las
uniones se consumirían en una reacción de fragmentación. Esto
significa que, tras la escisión del enlace C-Co
mediante fotolisis o sonolisis, tendrá lugar una escisión adicional
en un enlace lejano, dando lugar a la formación de una pequeña
molécula insaturada (y típicamente volátil) compuesta por átomos del
anterior conector. Esto se muestra esquemáticamente a
continuación:
El escenario más típico es la subsiguiente
escisión de un segundo enlace, dos enlaces eliminados del primero.
Por tanto, los conectores más autodestructivos contendrían una
unidad de dos átomos cuya expulsión en forma de una pequeña molécula
gaseosa es favorable. Otra característica del diseño es tener las
nuevas especies radicales que se generan después de la segunda etapa
de escisión como un tipo de radical especialmente estable. A
continuación se muestran algunos ejemplos de conectores
autodestructivos:
Molécula marcadora: una molécula que está
unida por un receptor y es transportada hasta una célula mediante un
proceso mediado por receptor. Algunos ejemplos de moléculas
marcadoras adecuadas incluyen, pero no se limitan a, glucosa,
galactosa, manosa, manosa-6-fosfato,
transferrina, asialoglucoproteína,
\alpha-2-macroglobulinas,
insulina, un factor de crecimiento peptídico, cobalamina, ácido
fólico o sus derivados, biotina o sus derivados, YEE
(GalNAcAH)_{3} o sus derivados, albúmina, texafirina,
metalotexafirina, porfirina, cualquier vitamina, cualquier
coenzima, un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo (por ejemplo,
Fab) y una región variable de cadena única de un anticuerpo (scFv).
Un experto reconocerá rápidamente otras moléculas marcadora
(ligandos) que se unen a receptores celulares y que son
transportadas hasta una célula mediante un proceso mediado por
receptor. La presente invención pretende incluir todas estas
moléculas marcadoras.
La presente invención aprovecha las propiedades
celulares de la cobalamina y de los análogos o derivados de la
cobalamina, así como las propiedades celulares de otras moléculas
marcadoras. Por ejemplo, algunos estudios han demostrado que la
absorción de cantidades fisiológicas de vitamina B_{12} en el
intestino requiere que sea complejada con una proteína
transportadora de origen natural conocida como factor intrínseco
(IF). (Castle, 1953; Fox y Castle, Allen y Majerus. 1972b). Esta
proteína es liberada en la luz del estómago por las células
parietales del fondo. Una vez unida al factor intrínseco, el
complejo B_{12}-IF interactúa con un receptor
unido a membrana del IF localizado en el íleo terminal del
intestino delgado. El complejo
receptor-IF-B_{12} es entonces
internalizado mediante un proceso de endocitosis mediada por
receptor (RME). Allen y Majerus demostraron que es posible modificar
químicamente la B_{12}, unirla a una resina y usar la
B_{12}-resina para purificar por afinidad el IF
(Allen y Majerus, 1972a). Este hallazgo sugiere la posibilidad de
unir una gran macromolécula (tal como la resina usada por Allen y
Majerus, 1972a) a la B_{12} conservando a la vez su capacidad para
interactuar específicamente con el factor intrínseco y ser por tanto
parte del sistema de transporte activo. Uniendo moléculas a la
B_{12} de una forma tal que la B_{12} conserve su capacidad
para interactuar con el factor intrínseco, se averiguó que el
mecanismo natural de captación para la B_{12} administrada por vía
oral podía usarse para administrar diversas proteínas, fármacos y
otras moléculas farmacéuticamente activas desde la luz intestinal
hacia la circulación. Se ha averiguado que la B_{12} se concentra
de forma natural en el tejido canceroso mediante un mecanismo de
transporte similar.
En los mamíferos, la B_{12} es transportada en
la sangre por proteínas de transcobalamina TC-I,
TC-II y TC-III. La forma principal
de la B_{12} en la sangre es metilcobalamina, y el mayor
almacenamiento de B_{12} es adenosilcobalamina, en el hígado. Las
células que se dividen rápidamente, incluyendo las células
cancerosas, requieren la coenzima B_{12} para la producción de
timidina durante la síntesis de ADN. Carmel (1975) ha informado de
que en algunos pacientes con tumores se han observado aumentos de
hasta 50 veces en las principales proteínas de transporte de
cobalamina, TC-I y TC-II. Waxman y
col. (1972) informan del hallazgo de proteínas de unión a B_{12}
específicas tumorales que circulan en la sangre. En cada caso, estos
aumentos en las proteínas de transporte TC y el correspondiente
agotamiento sistémico de B_{12} no fueron el resultado de una
megaloblastosis, proliferación de granulocitos o cualquier otra
deficiencia patogénica de B_{12}.
En un segundo ejemplo de endocitosis mediada por
receptor, se han identificado previamente receptores de folato que
median en la actividad endocítica en células bacterianas (Kumar y
col., 1987) y se han usado para administrar materiales
biológicamente activos (Low y col., 1995). Según la presente
invención, son útiles como moléculas marcadoras el ácido fólico, el
ácido folínico, el ácido pteropoliglutámico y las pteridinas de
unión al receptor de folato, tales como tetrahidropterinas,
dihidrofolatos, tetrahidrofolatos y sus análogos desaza y didesaza.
Los términos análogos de "desaza" y "didesaza" se refieren
a análogos reconocidos en la técnica con un átomo de carbono
sustituido por uno o dos átomos de nitrógeno en la estructura del
ácido fólico natural. Por ejemplo, los análogos desaza incluyen los
análogos 1-desaza, 3-desaza,
5-desaza, 8-desaza y
10-desaza. Los análogos didesaza incluyen, por
ejemplo, los análogos 1,5-didesaza,
5,10-didesaza, 8,10-didesaza y
5,8-didesaza. Los anteriores derivados del ácido
fólico se denominan convencionalmente "folatos", lo que refleja
su capacidad de unirse a receptores de folato, y dichos ligados,
cuando se complejan con moléculas exógenas, son eficaces para
mejorar el transporte transmembranal. Otros folatos útiles como
ligandos formadores de complejos para esta invención son los
análogos de unión al receptor de folato aminopterina, ametopterina
(metotrexato), N^{10}-metilfolato,
2-desamino-hidroxifolato, análogos
desaza tales como 1-desazametopterina o
3-desazametopterina, y ácido
3',5'-dicloro-4-amino-4-desoxi-N^{10}-metilpteroilglutámico
(diclorometotrexato). Otros ligandos adecuados capaces de unirse a
los receptores de folato para iniciar el transporte endocitótico
mediado por receptor del complejo incluyen anticuerpos antiidiotípo
del receptor de folato. Se usa una molécula exógena en complejo con
un anticuerpo antiidiotípico de un receptor de folato para
desencadenar el transporte transmembranal del complejo. Dichas
moléculas se usan según la presente invención como una molécula
marcadora.
En un ejemplo adicional de endocitosis mediada
por receptor se han usado los receptores de biotina para mediar la
actividad endocítica (Low y col., 1995). Los análogos de biotina
tales como biocitina, sulfóxido de biotina, oxibiotina y otros
compuestos de unión al receptor de la biotina son ligandos que
también pueden usarse como moléculas marcadoras adecuadas para
promover el transporte transmembranal de moléculas exógenas según
esta invención. También se contemplan otros compuestos capaces de
unirse a los receptores de biotina para iniciar el transporte
endocitótico mediado por receptor del complejo. Estos pueden incluir
otros ligandos de unión al receptor tales como, por ejemplo,
anticuerpos antiidiotipo del receptor de biotina. Podría usarse una
molécula exógena complejada con un anticuerpo antiidiotípico de un
receptor de biotina para desencadenar el transporte transmembranal
del complejo. Dichas moléculas se usan según la presente invención
como una molécula marcadora.
Otros ejemplos de moléculas marcadoras incluyen
glucosa, galactosa, manosa,
manosa-6-fosfato, hormonas (por
ejemplo, insulina, hormona de crecimiento y similares), factores de
crecimiento o citocinas (por ejemplo, TGF-\beta,
EGF, factor de crecimiento insulinoide y similares), YEE
(GalNAcAH)_{3} o sus derivados, cobalamina,
\alpha-2-macroglobulinas,
asialoglucoproteína, albúmina, texafirina, metalotexafirina,
anticuerpos, fragmentos de anticuerpos (por ejemplo, Fab), una
región variable de cadena única de un anticuerpo (scFv),
transferrina, cualquier vitamina y cualquier coenzima.
Según se describió previamente, un bioconjugado
de la presente invención comprende un agente bioactivo conjugado
directa o indirectamente a través de un enlace covalente al átomo de
cobalto de un complejo de organocobalto. El agente bioactivo se
conjuga directamente con el átomo de cobalto mediante un átomo no
reactivo del agente bioactivo, o se conjuga indirectamente con el
átomo de cobalto mediante el uso de un separador. Por lo tanto, al
contrario que los conjugados formados en la patente de EE.UU.
5.428.023, la fijación del agente bioactivo al átomo de cobalto en
la posición axial no interfiere con la endocitosis mediada por
receptor desde la sangre hacia las células.
El enlace inusualmente débil cobalto-átomo no
reactivo (por ejemplo, un enlace C-Co) del
bioconjugado proporciona un desencadenamiento fácilmente dirigible
para la liberación controlada in vivo del agente bioactivo
desde el complejo de organocobalto. La energía de disociación de
enlace (BDE) del enlace Co-átomo no reactivo en el bioconjugado está
en el intervalo de 30 a 50 kcal/mol (por ejemplo, un intervalo de
30-40 kcal/mol para un enlace Co-C),
que les coloca entre los enlaces covalentes más débiles conocidos,
siendo el enlace, no obstante, relativamente estable en disolución
acuosa.
Una estrategia común empleará la modificación del
fármaco anticancerígeno de forma que posea una zona electrófila que
pueda reaccionar con el intermedio altamente nucleófilo Co(I)
producido tras el tratamiento de la hidroxicobalamina con
NaBH_{4}. Esta modificación estructural será eliminada lo
suficientemente lejos de la zona activa (farmacóforo) para evitar
cualquier interferencia con la actividad biológica deseada. Las
metodologías usadas en el caso del clorambucil son típicas: el grupo
ácido carboxílico del clorambucil se convierte bien en un cloruro de
ácido o bien en un éster de bromoetilo, cualquiera de los cuales
puede ser acoplado eficazmente con la
cob(I)alamina.
Por ejemplo, se prepara Cbl^{I} reducida
mediante reducción con NaBH_{4} o polvo de cinc de, por ejemplo,
hidroxocob(III)alamina. En el esquema anterior, el
fármaco puede ser un agente citotóxico, otro fármaco u otro agente
bioactivo según se describe en esta invención. En otros esquemas se
introduce un separador que contiene un átomo de carbono u otro
átomo, tal como el especificado para el átomo no reactivo, para unir
el átomo de cobalto, y que también contiene un agrupamiento
reactivo, por ejemplo, -OH o -CN, que se hace reaccionar además con
el agente bioactivo. También pueden utilizarse otros grupos
reactivos, por ejemplo, -NH_{2}, -SH, -COOH, etc., para acoplarse
con el agente bioactivo. Es importante mencionar que en algunos
casos (por ejemplo, clorambucil, doxorrubicina), la pequeña molécula
orgánica liberada no es el fármaco parental, sino que conserva
alguna modificación instalada para permitir el acoplamiento. En
otros casos (por ejemplo, topotecán), la estructura del fármaco
liberado puede corresponderse con la molécula parental.
Algunos detalles más específicos de la síntesis
de los bioconjugados representativos según la presente invención son
como sigue, usando un "fármaco" que puede ser reemplazado por
cualquier agente bioactivo adecuado y una cobalamina que puede ser
reemplazada por cualquier complejo de organocobalto adecuado. En
esta síntesis, todos los procedimientos son con argón. Se disuelve
la hidroxocob(III)alamina en CH_{3}OH acuoso (1:1,
v/v) a 25ºC. Se añade un exceso de 2-10 veces de
NaBH_{4}. La disolución cambia lentamente de color desde el rojo
al marrón y gradualmente verde (Cbl^{I}). Después de
aproximadamente 15 min se añade el ligando de fármaco electrófilo
(disuelto en el mismo disolvente desoxigenado) como, por ejemplo, un
cloruro de alquilo, acilo o arilo. Se mantienen unas condiciones
estrictamente anaeróbicas y la mezcla de reacción se agita
suavemente a 25ºC. El color cambia gradualmente de nuevo al rojo
según se convierte la Cbl^{I} en alquil, acil o
aril-Cbl^{III}. Después de aproximadamente 1,5 h
la disolución se acidifica hasta un pH de 3,0 con HCl diluido. El
metanol se elimina en presión reducida mediante evaporación rotativa
a menos de 40ºC. La disolución acuosa resultante se diluye con un
volumen igual de H_{2}O y se carga en una columna de intercambio
catiónico Dowex AG-50-X2 (luz de
malla de 200-400). La columna se lava
secuencialmente con H_{2}O y con NaOAc 0,1 M, pH 6,4. Las
fracciones que contienen
fármaco-cob(III)alaminas aparecen
rojas y se recogen adecuadamente. La
hidroxocob(III)alamina sin reaccionar es retenida en
la columna. Las fracciones combinadas de
fármaco-cob(III)alamina se extraen con
fenol y se concentran mediante evaporación rotativa. Las
fármaco-cob(III)alaminas pueden
cristalizarse a menudo mediante la adición de acetona a una
disolución acuosa concentrada. La caracterización de los conjugados
de alquil, acil o aril-cobalamina es mediante RMN,
espectrometría de masas (FAB, Cl o electroatomización), y métodos
por IR.
Puede sintetizarse un bioconjugado que contenga
metotrexato mediante los siguientes procedimientos. En el
procedimiento uno, que utiliza el procedimiento anterior, el
metotrexato (MTX) se convierte en su correspondiente cloruro de
acilo y se hace reaccionar con cobalamina y/o Co(III)[SALEN]
y/u otros complejos de organocobalto descritos, para rendir
metotrexato-cobalamina y
metotrexato-Co(III)[SALEN] según el siguiente
esquema de reacción I. En el procedimiento alternativo dos, se forma
primero el enlace C-Co a partir de un cloruro de
acilo con un grupo amino protegido. Entonces el grupo amino es
desprotegido, seguido de la formación de un enlace amida con una
aminobenzoilpterina según el siguiente esquema de reacción II.
\newpage
\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
\cr}
\newpage
Puede sintetizarse un bioconjugado que contenga
aminopterina mediante el siguiente procedimiento. El derivado
desmetilado del metotrexato (la aminopterina) es acoplado al cobalto
según se muestra en la siguiente fórmula de reacción, en la que el
ión iminio se hace reaccionar bien directamente con Co(I), o
el ión iminio es convertido en el aminonitrilo y después
desenmascarado lentamente para revelar el catión iminio.
\vskip1.000000\baselineskip
Puede sintetizarse un bioconjugado que contenga
topotecán mediante el siguiente procedimiento. La actividad
citotóxica del topotecán (TPT) o de la camptotecina (CPT) surge de
su capacidad para congelar los "complejos escindibles" de la
topoisomerasa I del ADN (Pommier y col., 1995). Dado que algunos
tipos de tumores muestran unos niveles altamente elevados de topo I
(Giovanella y col., 1989), los venenos de topoisomerasa de este
tipo, parecen tener un alto índice terapéutico en el tratamiento de
estos cánceres. Sin embargo, podría generalizarse el tratamiento con
derivados de la camptotecina si se usara junto con la metodología de
administración dirigida.
El topotecán es conjugado con cobalamina,
Co(III)[SALEN] y otros complejos de organocobalto según los
siguientes esquemas de reacción. La camptotecina se conjuga de una
forma similar. La preparación de 10a y 10b implica una química
similar a la discutida anteriormente para 8a,b. La producción
selectiva de cloroformiato de fenilo (25) de topotecán (5) y la
acilación de Co(I) da 10a. La exposición de 25 a 18 o el
tratamiento de 5 con el cloroformiato 19 discutido previamente,
proporcionan 10b. Los conjugados 10c,d requerirán rutas un tanto más
largas, dado que no pueden prepararse directamente a partir de 5.
Sin embargo, la ruta sintética establecida para la conversión del
producto natural camptotecina en 5 puede modificarse en el punto
adecuado para permitir la fijación del complejo de cobalto. Las tres
primeras etapas para preparar el intermedio fenólico 26 son
conocidas (Mulliez y col., 1994). La sustitución de tipo Mannich con
formaldehído/dimetilamina da entonces 5. El uso de metilamina da la
correspondiente amina secundaria 27. En este punto, la unión al Co a
través de un metileno para dar 10c es posible a través del
atrapamiento del Co(I) de una segunda sal de iminio generada
in situ. Alternativamente, la N-alquilación
con 23 da 10d. La escisión de 10a y 10b proporciona 5 directamente
a través de una vía fragmentativa, o indirectamente a través de
otros productos. La escisión de 10c con extracción de hidrógeno
rinde 5. La escisión de 10d rinde el producto 5 con un grupo
etilmetilamino en lugar del grupo dimetilamino.
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\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
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Puede sintetizarse un bioconjugado que contenga
busulfano mediante el siguiente procedimiento. El busulfano es un
agente alquilante usado terapéuticamente contra la leucemia mieloide
crónica (CML). El punto preferible para fijar el busulfan al
complejo de organocobalto es en una de las unidades de
alcanosulfonato. Un ligero cambio en la estructura de la porción
sulfonato del éster no provocará un gran efecto sobre la capacidad
del fármaco liberado para entrecruzar el ADN. La escisión de 7a,
seguida de la abstracción del hidrógeno proporciona el
etanosulfonato/metanosulfonato mixto 2b. El atrapamiento del radical
de carbono en condiciones oxidativas produce el
bis(sulfonato) mixto 2c, que también es un competente agente
de entrecruzamiento. La escisión de 7b da como resultado la
liberación del fármaco parental 2a tras la abstracción del
hidrógeno.
El bis-metilsulfonato de
busulfano se conjuga con cobalamina, Co[SALEN] y otros
complejos de organocobalto según los siguientes esquemas de
reacción. Para la preparación de 7a, la sal sódica disponible en el
marcado del ácido bromoetanosulfónico (11) sirve como punto de
partida. El calentamiento con pentacloruro de fósforo proporciona el
correspondiente cloruro de sulfonilo 12 como un líquido destilable.
El tratamiento con Co(I) da lugar a un desplazamiento
preferente del bromuro para proporcionar 13, que se convierte en 7a
mediante el tratamiento secuencial con
1,4-butanodiol y cloruro de mesilo. El orden de las
tres etapas finales puede cambiarse; por ejemplo, el tratamiento de
12 con un exceso de butanodiol, seguido por el cloruro de mesilo da
el bis(sulfonato) mixto 14. El desplazamiento selectivo del
bromuro primario por el Co(I) da entonces 7a. En el caso del
conjugado 7b, el tratamiento de
2-bromobutano-1,4-diol
(que es fácilmente obtenible a partir del diéster del ácido málico)
con Co(I) da el aducto 15. La bis(mesilación) da 7b.
Alternativamente, 7b se prepara a partir de 16 (X = Br o I) con el
desplazamiento selectivo del haluro.
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(Esquema pasa a página
siguiente)
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Puede sintetizarse un bioconjugado que contenga
clorambucil mediante los siguientes procedimientos. El clorambucil
es una mostaza nitrogenada relativamente estable con una capacidad
alquilante atenuada, posiblemente como consecuencia del nitrógeno
menos básico de la anilina.
Procedimiento uno: en este procedimiento se
convierte el clorambucil en el cloruro de ácido, seguido de reacción
con cob(I)alamina o con Co(I)[SALEN], según la
secuencia de reacción I. En situaciones en las que la unión acilo
del complejo de organocobalto es demasiado lábil frente a
nucleófilos séricos, pueden utilizarse dos procedimientos
alternativos de bioconjugación.
Procedimiento dos: el procedimiento implica la
bromación de un átomo de carbono adyacente al grupo carboxilo en
condiciones estándar de
Hell-Volhardt-Zelinski para permitir
la fijación del complejo de Co en la posición \alpha, según la
secuencia de reacción II. En el esquema II, el reemplazamiento de
C-Co por C-H proporciona el
clorambucil. La estequiometría de la reacción, la temperatura y las
condiciones de dilución pueden manipularse para evitar el
desplazamiento competitivo de uno de los grupos cloroetilo o del C1
por un ataque S_{N}2.
Procedimiento tres: el
p-aminofenilacetaldehido protegido con BOC puede
conjugarse con el resto de Co, seguido de la formación del producto
de mostaza nitrogenada activa según la siguiente secuencia de
reacción III.
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(Esquema pasa a página
siguiente)
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Puede sintetizarse un bioconjugado que contenga
un éster etílico de clorambucil mediante los siguientes
procedimientos. Cuando se conjuga un fármaco a través de un grupo
carboxilo, como en el caso del clorambucil, puede ser deseable la
conexión del fármaco a la cobalamina a través de un éter
hidroxietílico. Esto puede conseguirse mediante una de dos rutas
convenientes, estando ambas ilustradas esquemáticamente a
continuación. En primer lugar, la
2-hidroxietil-cob(III)alamina
puede prepararse fácilmente a partir de cob(I)alamina
y bromoetanol. La esterificación se lleva a cabo en condiciones
estándar, es decir, mediante reacción de un ácido carboxílico
(clorambucil) con un alcohol
(2-hidroxietil-cob(III)alamina)
en presencia de diciclohexilcarbodiimida (DCC) (o sus derivados
solubles en agua, tales como EDCI) y una cantidad catalítica de
4-N,N-dimetilaminopiridina (DMAP) y
su sal de clorhidrato (DMAP-HCl) en diclorometano o
tolueno. Alternativamente, el conjugado conectado por éster puede
prepararse formando en primer lugar el éster de
2-bromoetilo de clorambucil, y haciendo reaccionar
después el éster con cob(I)alamina para proporcionar
el mismo producto. A continuación se muestran los esquemas de
reacción (I, II). Con esta forma de fijación, la escisión del
bioconjugado da lugar a liberación del éster de etilo de
clorambucil, según el esquema de reacción III.
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Puede sintetizarse un bioconjugado que contenga
etopósido mediante el siguiente procedimiento. El etopósido es un
derivado semisintético del producto natural epipodofilotoxina, que
es ampliamente usado contra una variedad de tumores, especialmente
el carcinoma pulmonar microcítico y tumores de las células
reproductoras (De Jong y col., 1995). También se ha demostrado una
considerable promesa en el tratamiento de los casos resistentes de
cáncer de ovario y de mama. El etopósido parece funcionar como un
veneno de la topoisomerasa II.
El etopósido se conjuga con cobalamina,
Co[SALEN] y otros complejos de organocobalto según los
siguientes esquemas de reacción. Los bioconjugados 8a y 8b requieren
la conversión del fenol libre del etopósido (3) al correspondiente
cloroformiato 17. La acilación directa con Co(I) da el
derivado de acilCo(III) 8a, mientras que el tratamiento con
el derivado hidroxietilCo(III) 18 descrito previamente
proporciona el carbonato 8b. Este derivado también está disponible a
través de la acilación de 3 con el cloroformiato 19 derivado de 18.
La preparación del conjugado modificado con acetal 8c puede ser más
desafiante. El acetal de etileno de 3 puede hidrolizarse, y después
volverse a formar el acetal usando el aldehído 20a o el acetal de
dimetilo 20b (Keller-Jusl y col., 1971). También
puede accederse al compuesto 20a a través de una cuidadosa oxidación
selectiva de 18, mientras que 20b debería estar disponible a través
de la alquilación del derivado de Co(I) con un acetal de
dimetilo de bromoacetaldehído disponible en el marcado. Además,
puede formarse el acetal de glucosa, y después glucosilarse el
alcohol secundario de 21. La escisión de 8a u 8b da 3 directamente a
través de vías fragmentativas, o proporciona productos que pueden
sufrir una eventual hidrólisis a 3. El atrapamiento con H\bullet
seguido de la homolisis de 8c proporcionaría entonces 3.
Puede sintetizarse un bioconjugado que contenga
doxorrubicina mediante el siguiente procedimiento. La doxorrubicina
(4) es el antibiótico antraciclínico más ampliamente usado, y es
clínicamente útil frente a un amplio espectro de tumores sólidos y
hematológicos. Al igual que el etopósido, la doxorrubicina parece
dirigirse a la topoisomerasa II, dando lugar finalmente a una
detención del crecimiento y a la muerte de la célula no apoptótica
(Fornari y col., 1996; Ling y col., 1996). La utilidad clínica de la
doxorrubicina está limitada debido a su toxicidad no específica,
especialmente cardiotoxicidad. Por tanto, parecería ser un candidato
particularmente bueno para su administración selectiva. Esto se
confirma por su frecuente uso en procedimientos basados en liposomas
(Hu y col., 1996; Longman y col., 1995; Hosada y col., 1995), como
parte de inmunoconjugados (Jonson y col., 1995; Sivam y col., 1995)
o en metodologías con profármacos (Svensson y col., 1995).
La doxorrubicina se conjugó con cobalamina,
Co[SALEN] y otros complejos de organocobalto según los
siguientes esquemas de reacción. Para la síntesis del bioconjugado
9a, se realiza la condensación del grupo amino daunosamino con el
complejo acil-Co(III) 22. Esta reacción forma
el anillo de 2-pirrolina en analogía con las rutas
publicadas usando 4-yodobutiraldehído y
5-yodo-2-pentanona
(9b). El derivado acíclico de amina terciaria 9b está disponible a
partir de 4 a través de una aminación reductora inicial con
acetaldehído, y después la alquilación de la amina secundaria
resultante con el mesilato 23 derivado de 18. Alternativamente, el
tratamiento de 4 con el cloroformiato 19 proporciona el carbamato
9c. Si se desean puntos de fijación alternativos, pueden usarse los
derivados conectados por hidrazona, tales como 9d, usando
alquilhidrazidas de cobalamina simple, tales como 24, obtenibles a
partir de 23. En el esquema de reacción, a continuación, se muestra
la escisión de estos bioconjugados.
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(Esquema pasa a página
siguiente)
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Puede sintetizarse un bioconjugado que contenga
carboplatino según se muestra en el siguiente esquema de
reacción.
Puede sintetizarse un bioconjugado que contenga
un péptido mediante los siguientes procedimientos: (1) el grupo
carboxilo C terminal del péptido puede activarse y usarse para
acilar el Co(I), en analogía con la acilación del Co con
cloruro ácido de clorambucil. (2) el grupo carboxilo C terminal
puede esterificarse con bromoetanol, en analogía con la otra ruta
del clorambucil, y el bromuro queda desplazado por el Co(I).
(3) el grupo amino N terminal del péptido puede tratarse con
CH_{2}=O y Co(I) para formar un enlace
Co(III)-CH_{2}-NH-péptido,
en analogía con la síntesis del bioconjugado de topotecán. (4)
puede prepararse un complejo Co(III)- aminoácido, y usarse en
una etapa de acoplamiento con el remanente del péptido. Estos
procedimientos pueden implicar la fijación del Co al N o al C
terminal, o a través de una cadena lateral. Puede emplearse un
conector más largo en cualquiera de estas rutas, si se desea
mantener el complejo de cobalto eliminado adicionalmente de la
cadena peptídica.
Puede sintetizarse un bioconjugado que contenga
un oligonucleótido o un ácido nucleico mediante los siguientes
procedimientos. En ambos procedimientos se usa un éster fosfato para
conectar el extremo del nucleótido y un grupo
hidroxietil-Co. Este enlace puede lograrse bien
uniendo directamente
Co-CH_{2}CH_{2}-OH y
Nucl-OPO_{3}^{2-}, o bien esterificando
Nucl-OPO_{3}^{2-} con
Br-CH_{2}CH_{2}-OH y desplazando
después el Br con Co(I), como anteriormente.
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Puede prepararse un complejo Co[SALEN]
sustituido asimétricamente a partir de
5-amino-salicilaldehído y el éter
glicolato de 2,5-dihidroxibenzaldehído. El grupo
amino, que se prepara a partir de
5-nitrosalicilaldehído disponible comercialmente,
funciona como la fijación para la molécula marcadora (dominio de
unión, BD) mediante la formación de una amida catalizada por EDCI.
La otra molécula tiene una unidad de ácido carboxílico fijada para
mejorar la solubilidad. El acoplamiento de estas dos moléculas con
etilenodiamina y acetato de Co(II) proporciona una mezcla de
tres complejos: los dos complejos simétricos y el complejo mixto.
Todos estos son útiles, aunque el que carece de una unidad de BD
fijada a cualquier lado del SALEN es menos preferible.
Con respecto a los dominios de unión, se muestran
dos posibilidades: un derivado de cobalamina y un péptido. En el
primer caso se usa el ácido carboxílico conocido para fijar la
cobalamina al grupo amino del SALEN. Este bioconjugado todavía usa
una endocitosis mediada por receptor basada en la cobalamina para
introducirse en la célula, pero el fármaco está fijado mediante el
SALEN en lugar de la cobalamina. El segundo caso usa un péptido
conocido para unirse a los receptores de la superficie celular de
células tumorales (por ejemplo, un fragmento del factor de
crecimiento epidérmico), con el carboxilo terminal fijado al grupo
amino del SALEN. Alternativamente, se usa uno de los grupos
carboxilo del glutamato del folato para obtener un bioconjugado
basado en folato. Además de unir el dominio de unión a través de un
enlace amida, se podría usar una aminación reductora si la molécula
marcadora contuviera un aldehído (BD-CHO +
SALEN-NH_{2} + NaBH_{4}), o podría usarse el
grupo carboxilo del otro fragmento para formar un enlace amida o
éster. También son posibles otras muchas metodologías (por ejemplo,
formación de un éter, olefinación mediante la reacción de Wittig,
fijación a través de un conector diéster o diamida, etc.
A continuación se muestran sistemas bencenoides
extendidos de los ligandos SALEN.
Como punto de partida de su síntesis puede usarse
cualquiera de los naftalenodioles disponibles en el mercado. Los
dioles sufren reacciones de formilación para proporcionar las
moléculas mostradas a continuación. Entonces estas moléculas pueden
acoplarse con el acetato de Co(II) y varias diaminas para dar
los complejos extendidos de Co[SALEN]. Los grupos OH del
segundo anillo pueden dejarse intactos, usarse para fijar el dominio
de unión o modificarse para mejorar la solubilidad en agua mediante
la fijación de un grupo polar, tal como una poliamina, un ácido
policarboxílico o una fracción de carbohidrato.
También se llevan a cabo modificaciones de
quinolinas e isoquinolinas, para dar SALEN condensados con
piridina.
A lo largo de líneas similares, se elaboran SALEN
derivados de hidroxialdehídos monocíclicos o heterocíclicos,
ejemplos de los cuales se muestran a continuación.
Puede sintetizarse un bioconjugado que contenga
el "corrinoide verde" (Brown y col., 1996) como sigue. El
"corrinoide verde" puede ser reducido en analogía con la
cobalamina, y ese corrinoide reducido reaccionará con yodometano
para formar el corrinoide metilCo(III). Dado que el
corrinoide metilCo(III) muestra un comportamiento similar al
de la cobalamina natural, pueden llevarse a cabo unos procedimientos
de conjugación similares a los derivados electrófilos del fármaco
descritos anteriormente.
Los bioconjugados de la presente invención tienen
la propiedad mejorada de ser capaces de una liberación selectiva y
dirigida del agente bioactivo desde el bioconjugado. El agente
bioactivo es liberado desde el bioconjugado mediante escisión. En
una forma de realización, la escisión puede producirse como
resultado de un desplazamiento normal de los nucleófilos celulares o
por una acción enzimática. En una segunda forma de realización, la
escisión es provocada para que se produzca selectivamente en la zona
de liberación mediante una señal externa. La señal externa puede ser
luz o fotoexcitación, es decir, fotolisis, o puede ser ultrasonidos,
es decir, sonolisis. Además, si la fotolisis tiene lugar en
presencia de un campo magnético que rodea a la zona de liberación,
puede minimizarse la liberación del fármaco, tal como un agente
citotóxico, en el tejido sano circundante.
Aunque se desea provocar que el agente bioactivo
sea liberado en las células, tejidos u órganos deseados, por
ejemplo, en la zona del tumor o de otras células cancerosas, también
es deseable proteger a los tejidos adyacentes de los efectos
secundarios negativos de dichos potentes agentes. El agente
bioactivo es liberado desde el bioconjugado en la zona objetivo
preferiblemente mediante la aplicación de una señal externa, tal
como luz o ultrasonidos. La fotolisis de los bioconjugados de la
presente invención se produce mediante la escisión del enlace
Co-C para producir un par de radicales en una jaula
de disolvente formado por Co(II) y el radical del agente
bioactivo (R\cdot). Lott y col. (1995) demostraron que la
fotolisis de la alquilcob(III)alamina puede sufrir
una recombinación dependiente de un campo magnético. Puede usarse la
aplicación de un campo magnético de 100-3000 gauss
para mejorar la recombinación del par de radicales en el tejido
circundante cuando no se desee la liberación del fármaco desde el
conjugado, dando lugar a una disminución de hasta 2 veces en la
liberación del fármaco desencadenada fotoquímicamente en dicho
tejido sano circundante.
La sonolisis de los bioconjugados de la presente
invención se produce mediante la escisión del enlace Co-átomo no
reactivo en disolución acuosa, para producir el agente bioactivo y
un Co(II) (por ejemplo, cob(II)alamina
(Cbl^{II})) en condiciones anaeróbicas, o el agente bioactivo y
acuoCo(III) (por ejemplo, acuocob(III)alamina
(H_{2}O-Cbl^{III})) en condiciones aeróbicas. En
cualquier caso, la sonolisis debida a la aplicación dirigida de
ultrasonidos da como resultado la escisión del enlace Co-átomo no
reactivo y la liberación irreversible del agente bioactivo desde el
complejo de organocobalto.
Los bioconjugados de la presente invención pueden
sufrir una escisión natural como sigue. Los bioconjugados pueden ser
escindidos por medios naturales tales como los nucleófilos séricos.
Una vez dentro de la célula, los bioconjugados de
cobalamina-fármaco (utilizado aquí únicamente como
un ejemplo que no pretende limitar la invención) pueden sufrir una
escisión mediante varios mecanismos. Los mecanismos de intercambio
de ligando B_{12} estándares permiten el desplazamiento del
fármaco. Alternativamente, los nucleófilos celulares pueden atacar
al átomo de carbono o de cobalto del enlace Co-C. El
cianuro es el ejemplo más común de un nucleófilo que ataca en el
cobalto, dando lugar a cianocob(III)alamina y un
fármaco libre en el que el anterior enlace C-Co se
ha reemplazado por un enlace C-H. Los tioles (tales
como los encontrados en la cisteína o el glutatión) pueden atacar en
el carbono, dando lugar a una cob(I)alamina reducida y
un fármaco libre que incorpora el anterior grupo tiol (por ejemplo,
R-Co[III] + R'-SH + base
=> R-S-R' + Co[I] +
base-H). Los hidróxidos y otros agentes básicos
también pueden escindir ligandos orgánicos de los complejos de
Co[III], aunque esto se produce típicamente a través de un
proceso de eliminación que altera la estructura de ligando mediante
la incorporación de un nuevo doble enlace. Además, las enzimas
metabólicas de B_{12} presentes en las células pueden dar como
resultado la escisión del agente bioactivo del átomo de Co.
Los bioconjugados de la presente invención pueden
sufrir una escisión mediante fotoactivación o fotolisis, como sigue.
La liberación fotoquímica del agente bioactivo desde el complejo de
organocobalto puede ser desencadenada mediante la aplicación de luz
visible a 400-800 nm. Es preferible el uso de
complejos de organocobalto que requieran longitudes de onda de luz
visible más largas (600-800 nm), más preferiblemente
de luz roja (de 600 a 750 nm). Cuando se utiliza la fotolisis para
la liberación del agente bioactivo desde el bioconjugado, es
particularmente preferible que el átomo no reactivo del agente
bioactivo o que el átomo del separador unido al átomo de cobalto,
sea un átomo de carbono.
El cofactor de la vitamina B_{12} existe en dos
formas naturales: adenosilcob(III)alamina
(AdoCbl^{III}), también conocido como coenzima B_{12}, y
metilcob(III)alamina (CH_{3}Cbl^{III}). El
notablemente débil enlace C-Co entre el anillo de
corrina y el ligando 5'-desoxiadenosilo o metilo
imparte una química muy inusual a las cobalaminas. Se estima que la
energía de enlace C-Co en AdoCbl^{III} y
CH_{3}Cbl^{III} es tan baja como 31 y 37 kcal/mol,
respectivamente. Esto hace al enlace C-Co uno de los
enlaces covalentes más débiles conocidos, y permite la fotoescisión
del enlace mediante luz visible. El producto inicial de la
fotoescisión de AdoCbl^{III} es el par de radicales geminado
{CH_{2}-Ado : Cbl^{II}}. Las llaves { : }
indican que el par de radicales es geminado (nacido de la
misma molécula parental) y se mantiene en una estrecha proximidad
mediante interacciones con el disolvente. Los experimentos de
fotolisis con destellos láser de picosegundos de AdoCbl^{III} han
demostrado que este es un procedimiento reversible con una tasa de
recombinación geminada constante de k_{rec} \approx 1 x 10^{9}
s^{-1}, tras la fotolisis. Estudios recientes de fotolisis con
destellos láser de nanosegundos han indagado en una recombinación
del par de radicales más lenta que se produce en el disolvente y que
está limitada por difusión.
La transición electrónica
\pi-\pi* del anillo de corrina de la cobalamina
produce un máximo de absorción largo de longitud de onda a 525 nm,
según se muestra en la Figura 1. La radiación de alquilcobalaminas
con esta longitud de onda da lugar a la escisión del enlace
C-Co, con un rendimiento cuántico de la fotolisis de
0,1-0,3. La fotolisis in vivo de los
bioconjugados según la presente invención se consigue
preferiblemente suministrando la luz con una sonda de fibra óptica,
debido a la fuerte absorción de la hemoglobina cerca de esta
longitud de onda. Para evitar problemas potenciales con el espectro
de absorción de la cobalamina y mantener a la vez un enlace
C-Co fotolábil, puede usarse Co[SALEN], que
es un análogo pentacoordinado de la coenzima B_{12}. Los complejos
de alquil-Co[SALEN] tienen un máximo de
absorción cerca de los 650 nm, con una absorción significativa más
allá de los 700 nm, según se muestra en la Figura 2. Esto es una
clara ventaja para la liberación fotoactivable del fármaco, dado que
el tejido humano se vuelve cada vez más transparente por encima de
los 610 nm. Otros derivados sintéticos o de origen natural de la
B_{12} que tienen un máximo de absorción por encima de 600 nm
están, o pueden volverse, disponibles. Por ejemplo, Brown y col.
(1996) informan de un corrinoide verde de cobalto con un máximo de
absorción a aproximadamente 624 nm. El tejido humano se vuelve
transparente a unas profundidades de hasta 5,7 cm a unas longitudes
de onda de entre aproximadamente 600 y 800 nm. El uso de longitudes
de onda más largas permite una radiación más selectiva de porciones
limitadas del cuerpo de un sujeto, con la consiguiente liberación en
una región diana pequeña.
Los bioconjugados de la presente invención pueden
sufrir una escisión mediante fotoactivación o fotolisis en presencia
de un campo magnético, como sigue. El uso del campo magnético limita
adicionalmente la liberación del agente bioactivo en la zona
deseada. Por ejemplo, debido a la toxicidad de los agentes
antineoplásicos hacia los tejidos sanos, es preceptivo que cualquier
sistema de administración específico zonal, limite el daño a otras
células diferentes a las de la zona de actividad. En la reacción de
escisión por fotohomolisis, los electrones del enlace covalente roto
salen con sus espines apareados \uparrow \downarrow (estado de
singlete) por haber participado en el enlace covalente. Durante el
inicio de la vida del par de radicales, los espines conservan su
orientación original R\uparrow + \downarrowR' hasta que los
espines electrónicos se vuelven aleatorios con el tiempo. Durante el
tiempo en el que los espines están apareados los radicales pueden
recombinarse y revertir hacia el material de partida. Si cualquiera
de estos espines de radicales apareados se cruzan entre sistemas
(ISC) al estado de espín en triplete (R\uparrow + \uparrowR'),
ya no se podrán recombinar hasta que sus espines estén de nuevo
apareados. Esta situación es preferible para la liberación del
agente bioactivo desde el bioconjugado. Sin embargo, en el tejido
sano, es deseable evitar, o al menos minimizar, la escisión del
conjugado. En ese caso, es deseable alterar la tasa de ISC
introduciendo un campo magnético externo que aumente el hueco entre
los niveles energéticos del estado de triplete, favoreciendo así la
recombinación del bioconjugado original en los tejidos sanos.
La tasa de recombinación puede aumentarse
mediante la aplicación de un campo magnético en el intervalo de
100-3000 gauss en los tejidos sanos, dando lugar a
una disminución neta del rendimiento cuántico fotoquímico y a una
disminución en la liberación de fármaco en los tejidos sanos en un
factor de al menos 2. La aplicación de aproximadamente 300 a 1000
gauss se considera óptima. Véase Grissom (1995).
Los bioconjugados de la presente invención pueden
sufrir una escisión mediante ultrasonido o sonolisis, como sigue.
Aunque puede unirse cualquier átomo no reactivo al átomo de cobalto
del bioconjugado y escindirse mediante sonolisis, es preferible que
el átomo sea un átomo de carbono. El cofactor de la vitamina
B_{12} existe en dos formas naturales:
adenosilcob(III)alamina (AdoCbl^{III}), también
conocido como coenzima B_{12}, y
metilcob(III)alamina (CH_{3}Cbl^{III}). El
notablemente débil enlace C-Co entre el anillo de
corrina y el ligando 5'-desoxiadenosilo o metilo
imparte una química muy inusual a las cobalaminas. Se estima que la
energía de enlace C-Co en AdoCbl^{III} y
CH_{3}Cbl^{III} es tan baja como 31 y 37 kcal/mol,
respectivamente. Esto hace al enlace C-Co uno de los
enlaces covalentes más débiles conocidos, y permite la sonolisis del
enlace mediante la aplicación de ultrasonidos en el intervalo de
aproximadamente 20 kHz - 500 MHz, preferiblemente de 20 kHz - 100
MHz, más preferiblemente de 20 kHz a 10 MHz.
La sonolisis de disoluciones acuosas produce una
alta concentración de radicales hidroxilo y de átomos de hidrógeno
según la ecuación:
H-OH
\longrightarrow H\bullet + \bullet
OH
Estas especies reactivas oxidantes y reductoras
son responsables de la iniciación de la mayoría de las reacciones en
disolventes acuosos. La radiación con ultrasonidos y la sonoquímica
no se describen a menudo como procesos de alta energía, pero durante
la sonolisis, el desarrollo, crecimiento e implosión de burbujas en
un líquido crean un entorno de reacción extremo a escala
microscópica. El colapso de las cavidades de las burbujas produce
presiones > 50,7 MPa y temperaturas > 5000ºC. Los radicales
formados sobreviven al colapso de las burbujas. La formación de
radicales hidroxilo in vivo ha sido el foco de numerosas
investigaciones debido a los potenciales efectos perjudiciales de
los radicales libres oxidantes en el tejido humano. Sin embargo,
dichos radicales no representan un riesgo para la salud inaceptable,
ya que la experiencia química ha demostrado que el diagnóstico por
ultrasonidos es un procedimiento benigno. La capacidad para formar
estos radicales mediante sonolisis in vivo proporciona un
mecanismo para la liberación desencadenada de agentes neoplásicos
activos y otros agentes a partir de la conjugación con B_{12},
Co[SALEN] u otros sustratos de cobalamina o similares a la
cobalamina adecuados.
En la sonolisis de los conjugados
fármaco-B_{12} (utilizado aquí únicamente como un
ejemplo que no pretende limitar la invención), el enlace
C-Co es escindido en disolución acuosa para producir
el fármaco y una cob(II)alamina (Cbl^{II}) en
condiciones anaeróbicas, o el fármaco y
acuocob(III)alamina
(H_{2}O-Cbl^{III})) en condiciones aeróbicas. La
escisión no es una ruptura directa del enlace C-Co.
Más bien, en condiciones anaeróbicas la vía predominante para la
escisión del enlace C-Co mediante sonolisis es
mediante la reducción del fármaco-Cbl^{III} al
lábil fármaco-Cbl^{II} mediante H\bullet,
seguida de la disociación a fármaco en cubierta cerrada y
Cbl^{II}. La reacción de HO\bullet con el
fármaco-Cbl^{II} da lugar a
H_{2}O-Cbl^{III}, así como la degradación del
anillo de corrina. En condiciones aeróbicas, la vía de escisión del
enlace C-Co mediante sonolisis es mediante reducción
del fármaco-Cbl^{III} para producir fármaco y
Cbl^{II}, pero el O_{2} oxida a la Cbl^{II} a
H_{2}O-Cbl^{III}. En cualquier caso, la
sonolisis producida por la aplicación localizada de ultrasonidos da
como resultado la escisión del enlace C-Co y una
liberación irreversible del fármaco desde la cobalamina. Por lo
tanto, la liberación desencadenada por sonolisis puede producirse en
condiciones aeróbicas, e igualmente en condiciones hipóxicas.
La presente invención es útil en el tratamiento
de (incluyendo, pero no limitándose a) cáncer, hepatitis, psoriasis
y otras enfermedades localizadas, así como para la terapia génica y
la terapia peptídica. Los bioconjugados según la presente invención
pueden administrarse por cualquier vía, incluyendo la vía
intravenosa, parenteral, oral, intramuscular, intratecal o como un
aerosol. El modo de administración dependerá ampliamente del efecto
biológico deseado que se va a conseguir. Un experto conocerá
fácilmente la mejor vía de administración para un tratamiento en
particular según la presente invención. Las dosis apropiadas
dependerán de la vía de administración y del tratamiento indicado, y
el experto puede determinarlas fácilmente, tal como mediante la
extrapolación a partir de los protocolos de tratamiento actuales. Si
el complejo de organocobalto del bioconjugado es cobalamina o un
derivado o análogo, es preferible administrar por vía oral un bolo
de vitamina B_{12} antes de la administración del bioconjugado,
para reducir o eliminar la potencial hepatotoxicidad que de otro
modo podría producirse tras la administración del bioconjugado. La
dosis oral de B_{12} saturará el sistema de lanzadera
enterohepático y cargará a los hepatocitos con cobalamina. Es
preferible que se administren de 0,1 mg a 100 mg, más
preferiblemente de 1,0 mg a 10 mg de vitamina B_{12} antes de la
administración del bioconjugado que contiene cobalamina. Además, la
vitamina B_{12} puede administrarse, preferiblemente por vía
intravenosa, seguida de la escisión selectiva del bioconjugado para
eliminar todo el bioconjugado que no haya sido escindido, y por
tanto reducir adicionalmente los potenciales efectos sistémicos. Es
preferible que se administren por vía intravenosa de 0,1 mg a 100
mg, más preferiblemente de 10 mg a 100 mg de vitamina B_{12} en
disolución salina durante 4-5 horas. Finalmente,
antes de la administración de un bioconjugado basado en cobalamina
puede administrarse óxido nitroso al sujeto con objeto de disminuir
los almacenes corporales de cobalamina en sus diversas formas, tales
como metilcobalamina. La administración de óxido nitroso tiene el
efecto de crear una gran carencia corporal de cobalamina antes de la
administración del bioconjugado a base de cobalamina.
Las composiciones farmacéuticas que contienen un
compuesto de la presente invención como principio activo pueden
prepararse según las técnicas sintéticas farmacéuticas
convencionales. Véase, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical
Sciences, 17ª edición (1985, Mack Publishing Co., Easton, PA).
Típicamente, se mezclará una cantidad antagonista del principio
activo con un vehículo farmacéuticamente aceptable. El vehículo
puede tener una amplia variedad de formas dependiendo de la forma de
preparación deseada para su administración, por ejemplo, por vía
intravenosa, oral, parenteral, intratecal, transdérmica o mediante
un aerosol.
Para su administración por vía oral, los
compuestos pueden formularse en preparaciones sólidas o líquidas,
tales como cápsulas, píldoras, comprimidos, grageas, pastillas,
polvos, suspensiones o emulsiones. Para preparar las composiciones
en una forma de dosificación oral puede emplearse cualquier medio
farmacéutico usual, tal como, por ejemplo, agua, glicoles, aceites,
alcoholes, agentes edulcorantes, conservantes, agentes colorantes,
agentes suspensores y similares, en el caso de preparaciones orales
líquidas (tales como, por ejemplo, suspensiones, elixires y
disoluciones); o vehículos tales como almidones, azúcares,
diluyentes, agentes de granulación, lubricantes, aglutinantes,
agentes disgregantes y similares, en el caso de preparaciones orales
sólidas (tales como, por ejemplo, polvos, cápsulas y comprimidos).
Debido a su facilidad de administración, los comprimidos y las
cápsulas representan la forma unitaria de dosificación oral más
ventajosa, en cuyo caso se emplean obviamente vehículos
farmacéuticos sólidos. Si se desea, los comprimidos pueden ser
recubiertos con azúcar o con cubiertas entéricas mediante técnicas
estándar. El agente activo debe ser estable a su paso por el tracto
gastrointestinal. Si fuera necesario pueden usarse agentes adecuados
para un paso estable, y pueden incluir fosfolípidos o derivados de
lecitina descritos en la bibliografía, así como liposomas,
micropartículas (incluyendo microesferas y macroesferas).
Para su administración por vía parenteral, el
compuesto puede disolverse en un vehículo farmacéutico y
administrarse como una disolución o como una suspensión. Algunos
vehículos adecuados ilustrativos son agua, disolución salina,
disoluciones de dextrosa, disoluciones de fructosa, etanol o aceites
de origen animal, vegetal o sintético. El vehículo también puede
contener otros ingredientes, por ejemplo, conservantes, agentes
suspensores, agentes solubilizantes, tampones y similares. Cuando
los compuestos se van a administrar por vía intracerebroventricular
o intratecal, también pueden disolverse en líquido
cefalorraquídeo.
En el tratamiento del cáncer (sarcomas,
carcinomas o leucemias) puede hacerse una distinción entre los tipos
de quimioterapias coadyuvantes sistémicas que se usan típicamente en
combinación con los procedimientos más extremos de escisión
quirúrgica y terapia por radiación. Hay dos amplias clases de
coadyuvantes quimioterapéuticos: (1) agentes terapéuticos endocrinos
y antivasógenos, que pretenden alterar la fisiología corporal; y (2)
agentes quimioterapéuticos citotóxicos que se administran
típicamente por vía sistémica para destruir o inhibir el crecimiento
de las células transformadas.
Los agentes citotóxicos o antineoplásicos están
representados por varias clases de fármacos. Los agentes alquilantes
sufren reacciones químicas que producen iones carbonato electrófilos
altamente reactivos que forman fácilmente enlaces covalentes
(alquilados) con varias fracciones nucleófilas biológicamente
importantes, tales como bases de ácidos nucleicos y grupos fosfato,
amino, sulfhidrilo, hidroxilo, carboxilo e imidazol. Estos agentes,
entre otras funciones, tienen acciones citotóxicas que alteran los
mecanismos fundamentales relacionados con el crecimiento, la
actividad mitótica, la diferenciación y la función celulares. El
clorambucil, el busulfan modificado, la ciclofosfamida, la
ifosfamida y el cisplatino y sus análogos estructurales son agentes
alquilantes representativos.
Los antimetabolitos tales como los análogos del
ácido fólico (por ejemplo, metotrexato) y los análogos de pirimidina
(por ejemplo, fluorouracilo y fluorodesoxiuridina) ejercen su
actividad citotóxica bloqueando o impidiendo las vías metabólicas
que dan lugar a la destrucción de la célula neoplásica. También se
sabe que el metotrexato es útil en el tratamiento de las psoriasis
mediante la inhibición de la proliferación de las células
epidérmicas.
Otra clase citotóxica potente son los inhibidores
de la mitosis, tales como el paclitaxel o los alcaloides
camptotecina, vincristina y vinblastina.
También, ciertos antibióticos, tales como
doxorrubicina y daunorubicina (glucósidos aglicones tetracíclicos),
se intercalan con el ADN e inhiben la síntesis de ácidos
nucleicos.
Según la presente invención, los bioconjugados
para el tratamiento del cáncer se forman usando preferiblemente
agentes quimioterapéuticos seleccionados entre grupo que consiste en
agentes alquilantes, antimetabolitos e inhibidores de la mitosis.
Por ejemplo, el metotrexato es un antimetabolito; el clorambucil,
el cisplatino y el busulfano modificado son agentes alquilantes, y
la camptotecina y sus derivados son alcaloides. Los bioconjugados
formados a partir de estos agentes citotóxicos pueden administrarse
por vía intravenosa para el tratamiento de clases específicas de
cáncer para las que se sabe que son eficaces, por ejemplo, cáncer de
colon, pulmón, riñón, mama, próstata, melanoma, nasofaríngeo,
leucemia de linfocitos T, leucemia mieloide, leucemia linfocítica y
similares. Cuando se administra por vía intravenosa en el torrente
sanguíneo y el bioconjugado contiene cobalamina, la afinidad natural
de las células cancerosas por la B_{12} dirigirá al bioconjugado
hacia estos tejidos o zonas celulares. Alternativamente, los
bioconjugados pueden ser modificados genéticamente para que sean
selectivos para la administración del agente quimioterapéutico a la
célula cancerosa deseada mediante la incorporación de una molécula
marcadora adecuada (tal como las establecidas anteriormente) en el
complejo de organocobalto.
Los tumores sólidos se tratan como sigue,
mediante el uso de un bioconjugado fármaco-B_{12}
como ejemplo. Este ejemplo no pretende limitar la presente invención
en modo alguno, y un experto podrá determinar fácilmente otros
bioconjugados de la presente invención que podrían utilizarse para
el tratamiento de tumores sólidos. El bioconjugado
fármaco-B_{12} se administra, preferiblemente por
vía intravenosa, a un paciente con cáncer para dirigirse a un cáncer
metastásico cuando la célula cancerosa tiene unos requerimientos
significativos de cobalamina. Esta propensión de las cobalaminas a
migrar hacia las células cancerosas reduce significativamente la
cardiotoxicidad, la mielotoxicidad, la hepatotoxicidad y los efectos
secundarios similares que limitan el tamaño y la frecuencia de la
dosis eficaz de los agentes antineoplásicos. Adicionalmente, se
minimizan los problemas relacionados con la toxicidad en las células
que no son diana. La administración se mejora adicionalmente
desencadenando la liberación del agente antineoplásico desde el
bioconjugado mediante el mecanismo de fotolisis o sonolisis, que
aportan un alto grado de control espacial y temporal sobre la
liberación del fármaco en una zona localizada durante un tiempo
corto. La aplicación de un campo magnético con la fotolisis sirve
además para proteger las células sanas mediante la recombinación del
bioconjugado, y limita la liberación del agente activo a
la(s) zona(s) específica(s) que
contiene(n) célula(s) cancerosa(s).
Aunque la quimioterapia se reserva generalmente
para marcar células metastatizadas tras la extirpación quirúrgica de
la masa tumoral principal, la liberación desencadenada del agente
bioactivo atraído hacia la zona tumoral permite el tratamiento del
tumor principal, así como de los neoplasmas metastásicos que se han
diseminado por una zona limitada y conocida. La dosis de
bioconjugado, la duración del tratamiento, el grado de
fotoactivación y otros parámetros del tratamiento pueden ser
determinados por el experto en la materia según el tipo de cáncer,
el agente antineoplásico administrado, la cobalamina específica
usada, el estado del paciente y otros factores que son variables y
que se determinan mejor según cada caso.
La leucemia se trata como sigue, mediante el uso
de un bioconjugado fármaco-B_{12} como ejemplo.
Este ejemplo no pretende limitar la presente invención en modo
alguno, y un experto podría determinar fácilmente otros
bioconjugados de la presente invención que podrían utilizarse para
el tratamiento de la leucemia. Al menos dos formas de la leucemia,
la leucemia mieloide crónica (CML) y la leucemia promielocítica
aguda (APL) producen altos niveles de proteínas de unión a la
B_{12} que dan como resultado un aumento de 3 a 36 veces en la
capacidad de unión a B_{12} insaturada en la sangre. El aumento en
la concentración de las proteínas de unión a B_{12} es coherente
con el rápido recambio de las células sanguíneas inmaduras, y
proporciona una oportunidad para dirigir la administración de
fármacos antileucémicos, tales como agentes bisalquilantes derivados
del busulfano, hacia las células hematopoyéticas transformadas
responsables del estado leucémico. Los bioconjugados de esta
invención proporcionan un medio para la administración eficaz de
dichos agentes alquilantes en zonas celulares en las que el agente
activo puede ser liberado desde el conjugado. Esta administración y
liberación dirigidas proporcionan un avance significativo en el
tratamiento de la CML y la APL, para las cuales los actuales
procedimientos de quimioterapia proporcionan a veces una remisión
incompleta.
La presente invención también es útil para el
tratamiento de la psoriasis. La psoriasis es un objetivo principal
para la administración controlada por vía transdérmica u oral de
antimetabolitos activados mediante una escisión inducida
fotolíticamente. Aunque no es potencialmente mortal, la psoriasis
puede disminuir significativamente la calidad de vida de los
pacientes que experimentan una exfoliación grave relacionada con la
artritis psoriática y reumatoide. Los antimetabolitos, tales como el
metotrexato y 5-fluorouracilo, son eficaces para
controlar casos graves de proliferación cutánea. Una terapia oral
eficaz está limitada por la hepatotoxicidad a pesar de las bajas
dosis, y el riesgo de un daño hepático acumulativo requiere que
dicha terapia se reserve únicamente para los episodios más graves
durante la vida del paciente. La administración de dichos agentes en
la piel mejora el aspecto y la calidad de vida psicológica de los
pacientes cuyas vidas han estado dominadas por una psoriasis
grave.
La presente invención es además útil para la
terapia con péptidos. Un ejemplo de terapia con péptidos es como
agente citotóxico, por ejemplo, como un agente antineoplásico. En
este ejemplo se administra un bioconjugado que contiene el dominio
enzimático de la toxina diftérica (DT) a un sujeto según se
describió anteriormente para tratar tumores sólidos o leucemia. La
liberación dirigida del péptido de la DT da como resultado la
inhibición de la síntesis proteica y una eventual muerte
celular.
La presente invención también es útil para la
terapia génica. Un ejemplo de terapia génica es la administración de
un oligonucleótido antisentido para inhibir la expresión génica
vírica y la replicación vírica. En este ejemplo, se administra un
bioconjugado que contiene un oligonucleótido antisentido contra el
virus de la hepatitis B a un paciente con una infección por
hepatitis B. La acumulación del bioconjugado y la liberación del
oligonucleótido antisentido en el hígado inhiben la expresión génica
y la replicación del virus de la hepatitis B.
La presente invención se describe adicionalmente
con referencia a los siguientes Ejemplos, que se ofrecen a modo de
ilustración y no pretenden limitar la invención en modo alguno. Se
utilizaron técnicas estándar bien conocidas en la materia o las
técnicas descritas específicamente a continuación.
Un protocolo para una fotolisis de onda continua
anaeróbica típica de la metilcob(III)alamina o
CH_{3}Cbl^{III} es como sigue. Se colocaba una disolución
acuosa de CH_{3}Cbl^{III} 200 \muM y K^{+} HEPES 50 mM, pH
7,3, en una cubeta de cuarzo de 1 cm. Las muestras que se van a
fotolizar en condiciones anaeróbicas se someten a ciclos repetidos
de
congelación-estimulación-descongelación
o se purgan con Ar durante 40 minutos inmediatamente antes de la
fotolisis y se precintan. La radiación con luz visible de onda
continua se consigue en la longitud de onda deseada con un láser
coloreado estimulado con Ar^{+}. La luz incidente en la cara de la
cubeta se reduce a 12 mW\cdotcm^{-2} con filtros de densidad
neutra. El flujo de luz se determina mediante actinometría con
ferrioxalato potásico y mediante una termopila lectora de superficie
Scientech. La cubeta se colocaba en un soporte de celda
termostatizado a 25-37ºC. Para medir el rendimiento
cuántico como función del campo magnético, la cubeta se coloca en el
hueco de un electroimán de GMW Associates con polos cilíndricos de
7,5 cm de diámetro. El campo magnético dentro del área de la cubeta
es homogéneo en un 2%, y la estabilidad a largo plazo es mejor del
0,5%, según se monitoriza mediante una sonda Hall transversal y un
teslámetro digital.
Se registran los espectros de absorción en un
segundo entre 300-600 nm con un espectrofotómetro de
diodos en serie a intervalos de tiempo variables desde 10 segundos
hasta 2 minutos (dependiendo de la fluencia de la fuente de luz
fotolizante) durante un total de 3 \tau_{1/2}. La exposición a
la luz durante el análisis se mantiene al mínimo. La concentración
de CH_{3}Cbl^{III} se determina usando la absorbancia medida a
350 o a 520 nm mediante el procedimiento de Chen y Chance (1993). La
representación gráfica de la [CH_{3}Cbl^{III}] frente al tiempo
(t) aparece como de orden cero en todos los casos.
Selección de la longitud de onda de la
fotolisis: Los espectros de absorción de la
metilcob(III)alamina CH_{3}Cbl^{III} y del
etil-Co[SALEN] se muestran en las Figuras 1 y
2. Para la CH_{3}Cbl^{III}, las transiciones electrónicas
\pi-\pi* que dan lugar a la escisión del enlace
C-Co son máximas a 377 y 528 nm. Se ha llevado a
cabo mucho trabajo preliminar con la fotolisis de la B_{12} con
luz de 514 nm de un láser de ión Argón (Ar^{*}). Esta es cercana
al máximo de absorbancia de longitud de onda larga, y da un
rendimiento cuántico de aproximadamente 0,3 para la
CH_{3}Cbl^{III}.
La absorbancia de la sangre y del tejido es
significativa en esta longitud de onda óptima para la excitación de
la cob(III)alamina. La sangre tiene una ventana de
transmitancia baja (parcial) cercana a los 514 nm. Esta absorbancia
es suficiente para pirolizar rápidamente sangre bovina completa
colocaba en la trayectoria de la luz de un haz de luz de 20
W/cm^{2} de 514 nm.
Por lo tanto, sería beneficioso proporcionar una
cobalamina para conjugación en la que las transiciones electrónicas
\pi-\pi* que dan lugar a la escisión del enlace
C-Co sean máximas a la longitud de onda en la que
las interferencias son mínimas o no hay. Por encima de
aproximadamente 610 nm la sangre se vuelve parcialmente transparente
y pierde más del 50% de la transmitancia, debido sobre todo a la
dispersión de la luz por los eritrocitos. La sangre bovina
heparinizada colocada en la trayectoria de la luz de un haz de luz
de 20 W/cm^{2} de 630 nm muestra sólo un calentamiento menor
durante tiempos de exposición largos. También se muestra una alta
transmitancia del tejido a 610-800 nm.
Esto sugiere el uso de un complejo de
organocobalto para conjugación con una longitud de onda de absorción
en la que el tejido y la sangre sean relativamente transparentes. La
Figura 2 muestra que los complejos de
etil-Co[SALEN] tienen máximas de absorción
próximos a los 650 nm, con una absorción significativa más allá de
los 700 nm. Un láser coloreado estimulado con Ar^{+} o un láser de
ión Criptón (Kr^{+}), puede ser una fuente de fotones de alta
intensidad adecuadas en la región de 610^{+} nm. Los láseres
coloreados estimulados con Ar^{+} se usan a menudo en tratamientos
fotodinámicos con hematoporfirinas. También podría usarse un láser
económico de He-Ne, con una línea principal a 633
nm. Sin embargo, dichos láseres están limitados típicamente a una
producción máxima de 50 mW.
Existen láseres coloreados en la región de
600-700 nm que puedan alcanzar eficacias de
conversión energética de hasta el 45%. Esto significa que un láser
estimulado con Ar^{+} de 6 W puede rendir cerca de 3 W de luz
monocromática espacialmente coherente en la región de
610-750 nm. La longitud de onda exacta puede
elegirse para optimizar el rendimiento cuántico de onda continua y
conservar un grado de penetración en el tejido razonable. En pruebas
con complejos de alquil-Co[SALEN] se ha
averiguado que la luz de 690 nm de un láser coloreado estimulado con
Ar^{+} que opera con el colorante rodamina 6-G es
satisfactoria. La optimización puede determinarse dependiendo de la
cobalamina específica elegida para ensayos con animales y/o clínicos
de los bioconjugados. Además, hay disponibles en el mercado láseres
de diodos de gran potencia que emiten luz roja en la longitud de
onda deseable. Estos láseres de diodos tienen la ventaja de
proporcionar hasta 100 vatios de potencia óptica en una estrecha
región del espectro óptico que es útil para desencadenar la escisión
de los bioconjugados.
La sonolisis se llevó a cabo con un baño
ultrasónico Branson (modelo 3200) que opera a 47 kHz. La correcta
colocación del recipiente de reacción en un punto focal del
ultrasonido de alta intensidad se determinó mediante la oxidación de
yoduro a yodo en presencia de almidón (Mason, 1991), y la
temperatura del baño se mantuvo a 21ºC mediante un recirculador de
temperatura constante. La sonolisis aeróbica se llevó a cabo
típicamente en un tubo o un matraz Erlenmeyer, mientras que la
sonolisis anaeróbica se llevó a cabo en un recipiente de reacción
cerrado ajustado con un brazo lateral y una cubeta de cuarzo. Las
condiciones anaeróbicas se produjeron rociando con Ar durante 30 min
antes de la sonolisis. En algunos experimentos el pH se tamponó
mediante el uso de fosfato 100 mM (experimentos aeróbicos) o de
N-(2-hidroxietil)piperacina-N-2-etanosulfonato
(HEPES) 100 mM (experimentos anaeróbicos), según se especifica.
Todos los procedimientos se llevaron a cabo en ausencia de luz para
evitar la escisión fotolítica del enlace Co-C. Los
espectros de absorción se registraron con un espectrofotómetro de
diodos en serie (HP 8452A). Las disoluciones se transfirieron a una
cubeta de cuarzo con una trayectoria de luz de 1 cm para todas las
medidas ópticas, y se tuvo cuidado de asegurar que se producía una
fotolisis insignificante durante el tiempo de medición de 1 s.
Sonolisis de
metilcob(III)alamina: En la Figura 3A se muestran
los espectros de absorción secuenciales de la CH_{3}Cbl^{III}
acuosa en función de la sonolisis anaeróbica (pH 7,38, HEPES 100 mM,
Ar saturante). La absorbancia a 340, 374 y 520 nm disminuye
linealmente en función del tiempo de sonolisis, y la absorbancia a
316 y 420 aumenta linealmente, indicando así que la reacción es de
orden cero en la concentración de sustrato. Los puntos isosbésticos
a 336, 390 y 585 nm están de acuerdo con los obtenidos mediante
fotolisis anaeróbica de la CH_{3}Cbl^{III}. En las condiciones
de la sonolisis se produce un punto isosbéstico adicional a 476 nm,
en lugar de a 486 nm, según se observa típicamente en el transcurso
de la fotolisis. Este leve desplazamiento del punto isosbéstico está
provocado por un producto menor que tiene un máximo de absorbancia
cerca de los 490 nm. Este puede ser cob(I)alamina con
una vida suficiente (t_{1/2} = 22 min a pH 6) para ser observada
espectrofotométricamente. La banda de absorción a 374 nm es
característica de un enlace C-Co, y su desaparición
indica con claridad el desplazamiento del ligando del carbono
axial.
En condiciones aeróbicas, el oxígeno molecular
captura los H\bullet y evita la reducción de la
CH_{3}Cbl^{III} a través de la ecuación
O_{2} +
H\bullet \longrightarrow \bullet
OOH
En ausencia de un tampón orgánico con átomos de
hidrógeno separables, la reacción a través del HO\bullet permanece
como un proceso viable.
La Figura 3B muestra el cambio en los espectros
de absorbancia tras la sonolisis aeróbica en ausencia de un tampón
orgánico. La disminución en la absorbancia a 340 y 374 nm es lineal
con el aumento del tiempo de sonolisis, lo que indica que la
reacción es de orden cero en la concentración de sustrato, pero el
inesperado aumento de la absorbancia a 520 nm indica que el producto
estable de la sonolisis de la cobalamina no es la
hidroxocob(III)alamina, como podría esperarse si el
oxígeno molecular volviera a oxidar a la
cob(II)alamina a cob(III)alamina. La
fotolisis aeróbica en las mismas condiciones muestra la esperada
disminución en la absorbancia a 374 nm, pero ningún cambio a 520 nm.
Esta diferencia sugiere que el HO\bullet es capaz de desplazar al
ligando alquilo del Co^{III}, pero también se producen otras
reacciones del HO\bullet (quizás a través de los productos
secundarios HOO\bullet y \bulletO_{2}^{-}) para oxidar el
anillo de corrina. Se obtuvieron unos espectros de absorbancia
similares a partir de la sonolisis de una disolución acuosa aireada
que contenía tampón fosfato 100 mM.
Se observa un resultado similar en la reacción de
la CH_{3}Cbl^{III} con H\bullet y HO\bullet cuando estas
especies radicales son generadas mediante radiolisis de pulsos
(Blackburn y col., 1972). Las especies reductoras H\bullet
reaccionan para producir los mismos cambios espectrales, según se
muestra en la Figura 3A. Múltiples especies oxidantes (HOO\bullet
y \bulletO_{2}) pueden reaccionar con la CH_{3}Cbl^{III}
para escindir el enlace Co-C, pero estas especies
también dan lugar a la degradación irreversible del anillo de
corrina, según se evidencia por los cambios espectrales, similares a
los observados en la Figura 3B. Existe un precedente para la
oxidación irreversible del anillo de corrina en la fotooxigenolisis
de alquilcobalaminas mediante oxígeno singlete (Krautler y Stepanek,
1985).
La sonolisis aeróbica de disoluciones que
contienen HEPES 100 mM o alcohol t-butílico 100 mM no produce
ningún cambio en los espectros de absorción durante un tiempo
comparable. Esto es debido a que el oxígeno molecular desactiva la
vía de reacción del H\bullet, y el alcohol t-butílico
desactiva la vía de reacción del HO\bullet. Aunque no se ha
informado previamente de que el HEPES sea un capturador de
HO\bullet, muchos informes indican que las moléculas de solutos
orgánicos, tales como formiato, pueden inhibir la reacción del
HO\bullet (Weissler, 1962). La ausencia de cambios espectrales en
estas condiciones sugiere que la sonolisis directa del enlace
Co-C no es una vía de reacción importante.
Se comprueba la eficacia de los bioconjugados
frente a líneas celulares tumorales usando los protocolos existentes
para evaluar la eficacia de los bioconjugados que contienen un
agente antineoplásico marcado con coenzima B_{12}. Algunas de las
líneas celulares representativas ensayadas incluyen HCT 116 (tumor
de colon humano), A549 (pulmón humano), ACHN (riñón humano), MCF7
(mamá humana), próstata humana, SK5-mel (melanoma
humano), KB (nasofaringe humana), CCRF-CEM (leucemia
de linfocitos T humana), HL-60 (leucemia
promielocítica humana), RD-995 (fibrosarcoma de
ratón), B-16 (melanoma de ratón) y
Meth-A (carcinoma de ratón). La detección del
fármaco se lleva a cabo con un ensayo colorimétrico de viabilidad
celular en una placa de 96 pocillos.
Adicionalmente, los bioconjugados elegidos se
marcan radiactivamente con ^{14}C o ^{3}H para evaluar el nivel
de captación por parte de las células tumorales humanas. Según se
mencionó anteriormente, la técnica anterior refiere que algunas
células tumorales y leucémicas producen altos niveles de proteínas
de unión a B_{12} en el suero, y secuestran la B_{12} en altas
concentraciones de hasta 50 veces.
Protocolo de prueba de la línea celular
tumoral: Los bioconjugados del fármaco, sintetizados bajo los
procedimientos descritos en esta invención o adaptaciones de los
mismos, se diluyen en 5 órdenes de magnitud (aproximadamente de
0,005 a 50 \mug/ml). Cuatro horas después de la siembra de las
células en la placa, las células se tratan con el fármaco apropiado
disuelto en disolución tamponada isotónica. En experimentos de
control, sin liberación de fármaco desencadenada por fotolisis, el
fármaco se deja en las células durante tres días, al igual que en el
análisis básico normal en cáncer. En los pocillos para la liberación
desencadenada del fármaco, la salida del láser se dirige a los
pocillos elegidos durante tiempos variables y con intensidad
variable. Alternativamente se usa una matriz de diodos emisores de
luz (LED). Las células se incuban en condiciones estándar para el
cultivo de tejido de mamífero, bajo la adecuada atmósfera de
CO_{2} equilibrada. Después de tres días, las células son
realimentadas y se añade el pigmento colorimétrico bromuro de
3-[4,5-dimetiltiazol-2-il]-2,5-difeniltetrazolio
(MTT). La reducción del MTT a un producto formazán púrpura se
cuantifica en un lector de placas de 96 pocillos. La concentración
del pigmento formazán púrpura se correlaciona con el número de
células viables. La reducción en la supervivencia celular a una tasa
de dosis y a una exposición a la fotolisis dada da una estimación
cuantitativa de la muerte celular y de la eficacia de la
administración de fármaco. Se tiene cuidado de no exponer porciones
de la placa a condiciones de fotolisis a través de excedentes de
radiación accidentales. Esto se consigue usando para la fotolisis
placas de 96 pocillos con una cubierta opaca (Nº cat. de Fisher
07-200-565).
Captación de los bioconjugados
fármaco-B_{12} y
fármaco-Co[SALEN]: La captación de los
bioconjugados fármaco-B_{12} y
fármaco-Co[SALEN] por parte de las células
tumorales cultivadas es seguida mediante el marcaje radiactivo del
fármaco o de la cobalamina durante su síntesis. El
5-fluorouracilo, el metotrexato y el clorambucil
marcados con ^{3}H se adquieren de DuPont/NEN (New England
Nuclear). Estos bioconjugados del fármaco, así como la
metilcob(III)alamina marcada con ^{14}C (sintetizada
a partir de cob(I)alamina y ^{14}CH_{3}I)
proporcionan una indicación de la captación mediada por receptor por
parte de diversas líneas celulares tumorales. En este estudio las
células se expusieron al fármaco marcado radiactivamente según se
describe en la sección precedente, excepto porque no se añade nada
de MTT al final del periodo de incubación de tres días. Dado que
todas las líneas celulares excepto las células leucémicas crecen
fijadas al fondo del pocillo de la placa de microvaloración, el
medio de crecimiento se aspira para eliminar el fármaco marcado
radiactivamente no incorporado, seguido de diversos lavados con
medio nuevo. Las células marcadas se desprenden del fondo de los
pocillos y la radiactividad se cuantifica mediante un recuento por
centelleo. El crecimiento de las células leucémicas no fijadas al
fondo tiene lugar en placas de microvaloración de fondo redondo, de
forma que una centrifugación sedimenta las células y permite el
lavado con medio de crecimiento nuevo antes de solubilizar las
células y cuantificar el fármaco marcado radiactivamente incorporado
mediante un recuento por cente-
lleo.
lleo.
A una disolución agitada de salicilaldehído
(12,21 g/10,62 ml) en etanol a 70ºC (100 ml) se añadió
etilenodiamina (3,01 g/3,33 ml). Inmediatamente se formó un material
cristalino amarillo, y la mezcla de reacción se dejó enfriar hasta
temperatura ambiente con agitación. La disolución se filtró y los
cristales se lavaron con etanol frío. Las capas de etanol se
combinaron y se redujeron hasta aproximadamente 20 ml, y se dejaron
reposar a 0ºC hasta el día siguiente. Los cristales resultantes se
recogieron mediante filtración a vacío y se lavaron con agua. Los
sólidos recogidos se secaron a vacío para tener 13,15 g (98%) de
N,N'-bis(saliciliden)etilenodiamina en
forma de placas amarillas con un punto de fusión de 126ºC (valor en
la bibliografía (24) 127-128ºC).
RMN-^{1}H : (DMSO-d_{6})
\delta 8,57 (s 2H, HC=N), 7,42 (d, 2H aromático, J=7,3 Hz), 7,31
(t, 2H, aromático, J=9,0 Hz), 6,88 (t, 4H, aromático, J=8,3, 16,1
Hz), 3,89 (s, 4H, CH_{2}). RMN-^{13}C:
(DMSO-d_{6}) \delta 166,94 (2C, CO), 160,57
(2C, HC+N), 132,38 (2C, aromático), 131,69 (4C, aromático), 118,59
(2C, aromático), 116,51 (2C, aromático), 58,88 (2C, CH_{2}).
A una disolución desoxigenada caliente (100ºC)
del producto anterior (2,68 g) en dimetilformamida (25 ml) se añadió
a través de la aguja de una cánula una disolución acuosa (10 ml)
acetato de cobalto (II) tetrahidratado (2,49 g). El precipitado rojo
que se formó se recogió mediante filtración a vacío, se lavó con
dimetilformamida fría, y se secó a vacío para obtener 2,6 g (80%) de
N,N'-bis(saliciliden)etilenodiaminacobalto(II)
en forma de cristales rojos.
Se preparó el éter diglicolato de
Co[SALEN] según se describió en el Ejemplo 4, usando el éter
glicolato de 2,5-dihidroxibenzaldehído en lugar del
salicilaldehído. Se preparó un complejo sustituido asimétricamente
(éter glicolato/amida) según se describió en el Ejemplo 4 usando una
mezcla del éter glicolato de
2,5-dihidroxibenzaldehído y
5-aminosalicilaldehído en lugar del
salicilaldehído.
Se añadieron veinticinco ml de CH_{2}Cl_{2}
recién destilado, 0,343 g de diciclohexilcarbodiimida (1,66 mmol),
0,305 g de 4-dimetilaminopiridina (2,5 mmol) y 0,263
g de cloruro de
4-dimetilamino-piridinio (1,66 mmol)
a un matraz de fondo redondo de 50 ml secado al fuego equipado con
una barra agitadora, un condensador a reflujo y una entrada de Ar
(Boden y Keck, 1985). La disolución se purgó con argón y se llevó a
reflujo. Durante el reflujo se transfirió una disolución de 0,304 g
de clorambucil (1,0 mmol) y 0,125 g de
2-bromoetanol (1,0 mmol) en 5 ml de
CH_{2}Cl_{2} (purgado en argón durante 30 min) a través de una
cánula hasta la disolución a reflujo durante un periodo de 30 min.
Una vez completada la adición, la mezcla de reacción se agitó
durante 2 h a temperatura ambiente. La diciclohexilurea precipitada
se retiró por filtración y la disolución se concentró mediante
evaporación rotatoria. El residuo resultante se recogió en
CH_{2}Cl_{2}, se filtró y se purificó mediante cromatografía
rápida en columna de sílice. El producto deseado se eluyó usando
acetato de etilo:hexanos 1:9 (v/v) para dar 0,374 g de un aceite
amarillo con un rendimiento del 91% (éster 2).
RMN-^{1}H : (CDCl_{3}, 300 MHz) d 7,06 (d, 2H,
J=8,4 Hz), 6,60 (d, 2H, J=8,7 Hz), 4,35 (t, 2H, J=6,15 Hz),
3,56-3,72 (m, 8H), 3,48 (t, 2H, J=6,15 Hz), 2,56
(t, 2H, J=7,65 Hz), 2,35 (t, 2H, J=7,35 Hz), 1,91 (quintete, 2H,
J=7,58 Hz), RMN-^{13}C (CDCI_{3}, 75 MHz ^{1}H
desacoplado) d 173,05, 144,35, 130,37, 129,75 (2), 112,12 (2),
63,68, 53,55 (2), 40,60 (2), 33,94, 33,41, 29,05, 26,72.
Doscientos mg de
hidroxocob(III)alamina (0,15 mmol) se disolvieron en
10 ml de agua y se purgaron con argón con agitación (Brown y Peck,
1988). El gas saliente se dirigió secuencialmente a través de: (1)
un matraz que contenía 0,025 g de NaBH_{4} (0,66 mmol); (2) un
matraz que contenía 5 ml de H_{2}O; y (3) un matraz que contenía
0,226 g del éster 2 (0,55 mmol) en 5 ml de CH_{3}OH. Después de
desgasificar durante 1 h, el agua del matraz (2) se transfirió al
matraz (1), que contenía NaBH_{4}, a través de una cánula y se
arremolinó para promover la disolución. Esta disolución se
transfirió a través de la cánula a la disolución acuosa de
cobalamina. Se dejó proceder la reducción durante 20 min, tras lo
cual se añadió el éster de bromoetilo de clorambucil a la
disolución. La mezcla de reacción se dejó agitar durante 5 min
adicionales y después añadieron 0,2 ml de acetona para destruir el
exceso de borhidruro. La disolución se concentró hasta
aproximadamente 2 ml mediante evaporación rotatoria, y la disolución
resultante se aplicó a una columna de 2,5 X 30 cm
XAD-2 de resina de Amberlite. La columna se lavó con
1 l de H_{2}O para desalinizarla, y la cobalamina se eluyó con
acetonitrilo acuoso al 50% (v/v). El eluyente se redujo hasta
aproximadamente 2 ml mediante evaporación rotatoria, y la disolución
se aplicó a una columna de 1 X 40 cm de SP-Sephadex
C25 (forma Na+). La elución con agua eliminó la banda roja
principal, que se redujo a un volumen mínimo. Se añadió acetona
hasta que la débil turbidez persistió tras el arremolinamiento. La
disolución se dejó reposar durante 1 h a 0ºC y se añadió un exceso
de acetona para promover una cristalización adicional. Los cristales
se recogieron mediante filtración a vacío y se secaron a vacío. Se
obtuvo 3 en forma de cristales rojos (122,5 mg) con un rendimiento
del 53%. EM (FAB+) calculado para
C_{68}H_{112}N_{14}0_{16}CoPCl_{2}, 1541; encontrado
1541.
Se sintetizó
4-[4'-(bis-[2-cloroetil]amino)fenil]butiroilcob(III)alamina
(4) de una forma similar, partiendo del cloruro de ácido de
clorambucil y haciéndolo reaccionar con
hidroxocob(III)alamina, como anteriormente.
Síntesis de
2-[4-(4'-[bis-(2-cloroetil)amino]fenil)butiroxi]etil-Co[SALEN]
y
4-[4'-(bis-[2-cloroetil]amino)fenil]butiroil-Co[SALEN],
se sintetizan de una forma similar usando Co[SALEN] en lugar
de hidroxocob(III)alamina.
Síntesis de
2-[4-(4'-[bis-(2-cloroetil)amino]fenil)butiroxi)etil-(Co[SALEN]-folato)
y
4-[4'-(bis-[2-cloroetil]amino)fenil]butiroil-(Co[SALEN]-folato),
se sintetizan de una forma similar usando
Co[SALEN]-folato en lugar de
hidroxocob(III)alamina.
Síntesis de
2-[4-(4'-[bis-(2-cloroetil)amino]fenil)butiroxi]etilo-(corrinoide
verde) y
4-[4'-(bis-[2-cloroetil]amino)feni]butiroilo-(corrinoide
verde), se sintetizan de una forma similar usando corrinoide de
CH_{3}-Co(III) (preparado mediante reacción
de yoduro de metilo con el corrinoide verde de Brown y col. (1996)
después de haberlo reducido con NaBH_{4}) en lugar de
hidroxocob(III)alamina.
Los productos liberados mediante una sonolisis
exhaustiva, según se describe en el Ejemplo 2, del compuesto 3
(preparado en el Ejemplo 6) se aislaron mediante HPLC en fase
inversa (Rainin Microsorb C-18). La elución y la
separación de los productos de la sonolisis se llevaron a cabo con
un gradiente creciente de acetonitrilo (A) y ácido fosfórico 0,05 M
(B): condición inicial 5% de A: 95% de B, aumentado linealmente
durante 10 min hasta un 30% A y un 70% de B, mantenido durante 2
min; seguido de un aumento lineal hasta un 70% de A y un 30% de B
durante 10 min (Rinchik y col., 1993). El disolvente se evaporó de
cada fracción, y los productos se extrajeron con CH_{2}Cl_{2} y
se caracterizaron mediante RMN-^{1}H y
^{13}C.
En la Figura 4A se muestran los espectros de
absorción secuenciales de 3 acuoso en función de la sonolisis
anaeróbica a pH 7,4, con HEPES 100 mM y Ar saturante. La absorbancia
a 374 y 520 nm disminuye linealmente en función del tiempo de
sonolisis, y la absorbancia a 316 y 420 nm aumenta linealmente,
indicando así que la reacción es de orden cero en la concentración
de sustrato. Los puntos isosbésticos a 336, 390, 486 y 585 nm
concuerdan con los obtenidos mediante fotolisis anaeróbica de la
CH_{3}-Cbl^{III} . La banda de absorción a 374
nm es característica de un enlace Co-C, y su
desaparición indica con claridad el desplazamiento del ligando del
carbono axial.
La Figura 4B muestra el cambio en los espectros
de absorción tras la sonolisis aeróbica de una disolución de 3 que
contiene tampón fosfato. Se obtienen diferentes productos estables
en condiciones aeróbicas. Debido a la presencia de oxígeno
molecular, se demostró mediante RMN que el producto liberado era
2-[4-(4'-[bis-(2-cloroetil)amino]fenil)butiroxi]etan-1-al.
RMN-^{1}H (CDCI_{3}, 300 MHz) 9,59 (s, 1H),
7,08 (d, 2H, J=2,9 Hz), 6,62 (d, 2H, J=2,9 Hz), 4,67 (s, 2H),
3,73-3,59 (m, 8H), 2,60 (t, 2H, J=7,5 Hz), 2,45 (t,
2H, J=7,4 Hz), 1,95 (quintete, 2H, J=7,4);
RMN-^{13}C (CDCl_{3}, 75 MHz ^{1}H
desacoplado) 195,85, 173,09, 144,54, 130,43, 129,92 (2), 112,29 (2),
68,73, 53,74 (2), 40,69 (2), 33,99, 33,13, 26,79. La disminución en
la absorbancia a 374 nm es lineal con el aumento del tiempo de
sonolisis, indicando que la reacción es de orden cero en la
concentración de sustrato.
El enlace del Co-C de la
CH_{3}-Cbl^{III} puede escindirse mediante
sonolisis en disoluciones acuosas para producir el alcano y
cob(II)alamina en condiciones anaeróbicas, o para
producir el aldehído e hidroxocob(III)alamina en
condiciones aeróbicas. Al contrario que la fotolisis y la
termolisis, que dan lugar a la escisión directa del enlace
Co-C, la vía predominante de escisión del enlace
Co-C mediante sonolisis es a través de una reducción
mediada por H\bullet de la CH_{3}-Cbl^{III} a
especies lábiles de CH_{3}-Cb^{II-} de 19
e^{-}, seguida por la disociación al alcano en cubierta cerrada y
Cb^{II}, o mediante la reacción de HO\bullet con
CH_{3}-Cbl^{III} que da lugar a la formación de
hidroxocob(III)alamina, así como la degradación del
anillo de corrina.
Existe un paralelismo entre las reacciones de la
alquilcob(III)alamina en condiciones de sonolisis y
radiolisis de pulsos, (Blackburn y col., 1972), pero sin la
necesidad de un equipo caro. Aunque la violenta cavitación durante
la sonolisis tiene una energía suficiente para romper el enlace
Co-C para producir el par de radicales {R\bullet
\bulletCbl^{II}} mediante una vía disociativa análoga a la
fotolisis de la CH_{3}-Cbl^{III}, (Endicott y
Netzel, 1979; Chagovetz y Grissom, 1993; Natarajan y Grissom,
1996), las alquilcob(III)alaminas no son lo
suficientemente volátiles como para ser encontradas en el entorno
extremo de las burbujas en colapso. Por lo tanto, la escisión
directa del enlace C-Co mediante sonolisis
no es
posible a pesar de las más de 80 kcal/mol de diferencia en la energía de disociación de enlace entre Co-C y H-OH.
posible a pesar de las más de 80 kcal/mol de diferencia en la energía de disociación de enlace entre Co-C y H-OH.
La sonolisis anaeróbica del enlace
Co-C es irreversible debido que se forma un alcano
en cubierta cerrada. En condiciones aeróbicas, la tasa de reacción
del H\bullet con O_{2} es del mismo orden de magnitud que la
reacción del H\bullet con CH_{3}, sugiriendo por tanto que el
alcano en cubierta cerrada, CH_{4}, debería ser uno de los
productos finales de las sonolisis de la
CH_{3}-Cbl^{III} (Buxton y col., 1988; Baulch y
col., 1992). Por el contrario, la escisión del enlace
Co-C de la CH_{3}-Cbl^{III} a
través de fotolisis anaeróbica es reversible a partir del par de
radicales {CH_{3}\bullet \bulletCbl^{II}}.
En resumen, la capacidad para formar
cob(II)alamina y el alcano en cubierta cerrada sin el
uso de reductores químicos y sin el uso de un equipo electroquímico,
fotoquímico o de radiolisis de pulsos puede ser un procedimiento
útil para promover la activación de los complejos
fármaco-cobalamina in vivo.
Todos los medios se adquirieron en Sigma, y los
materiales usados para complementar los medios se adquirieron en
Atlanta Biologicals. El cultivo de células HL-60 se
hizo crecer en medios \alpha-MEM. Los medios se
completaron antes de la inoculación mediante la adición de
reactivos, para llevar la concentración final del medio al 7,5% p/v
de bicarbonato sódico, 10% de suero bovino fetal, 100 \mug/ml de
penicilina y de estreptomicina, y 50 unidades/ml de mistatina. Se
usó medio de McCoy con tampón bicarbonato sódico para el cultivo de
las células HCT-116. Se completó del mismo modo con
un 8% de suero bovino neonatal y un 2% de suero bovino fetal. El
medio completado pudo alma-
cenarse a 4ºC durante varias semanas. El medio de cultivo se calentó a 37ºC antes de su inoculación a las células.
cenarse a 4ºC durante varias semanas. El medio de cultivo se calentó a 37ºC antes de su inoculación a las células.
Los cultivos celulares patrones se iniciaron a
partir de las líneas celulares de la ATCC. La línea celular
original de la ATCC se dispuso en alícuotas con DMSO al 10% y se
almacenó en nitrógeno líquido. Los cultivos patrones de 40 ml se
hicieron crecer y se mantuvieron en botellas de cultivo estériles de
75 ml tratados con colágeno adquiridas de Corning. Los cultivos se
incubaron a 37ºC en un entorno de CO_{2} al 5% para mantener un pH
de 7,1. La humedad dentro del incubador se mantuvo, para evitar la
hipertonicidad en los medios, colocando una bandeja con agua en el
fondo del incubador.
Se controló la concentración de las células en
los cultivos patrones, y las concentraciones celulares se estimaron
de varias formas. Los medios se volvieron más violeta y
subsiguientemente naranja como resultado del metabolismo celular y
de los subproductos metabólicos que se acumulaban en los medios. Las
células también se observaron visualmente bajo un microscopio con un
aumento de 40X y 100X. Las células HCT-116 normales
aparecían redondas, planas y fuertemente adheridas a las paredes de
la botella de cultivo. Cuando las células cubrían prácticamente el
fondo de la botella, se redujo la concentración celular. Las células
HL-60 normales aparecían redondas, pero bien
diferenciadas y fácilmente suspendidas en el medio. Los cambios en
la morfología celular eran indicativos a menudo de una contaminación
bacteriana o fúngica. Para la determinación precisa de las
concentraciones celulares se empleó un Coulter Cell Counter^{TM}.
Los cultivos patrones no se dejaron crecer por encima de 100.000
células/ml. Se observó que ambas líneas celulares tenían un tiempo
de duplicación de aproximadamente 24 horas.
Los ensayos se realizaron en placas estériles de
96 pocillos tratadas con colágeno que se adquirieron de Corning. Las
células HL-60 se hicieron crecer en pocillos de
fondo redondo (Nº de catálogo de Corning 25850) y las células
HCT-116 se hicieron crecer en pocillos de fondo
plano (Nº de catálogo de Corning 25860). Las concentraciones
celulares se midieron con un Coulter Cell Counter^{TM}. Las
células se diluyeron en masa y se cargaron en las placas con 200
\mul en cada pocillo. Los ensayos se realizaron usando
aproximadamente 25.000 células HL-60/pocillo y
40.000 células HCT-116/pocillo.
Dado que las células HL-60 crecer
en suspensión, se midió la concentración celular y se diluyeron
directamente. Sin embargo, las células HCT-116 se
adhieren a las paredes de la botella y deben ser suspendidas
mediante un tratamiento con tripsina. Se descongeló una disolución
de tripsina de 0,025 mg/ml inmediatamente antes de su uso. El medio
de cultivo en masa se extrajo mediante aspiración, y se añadieron a
la botella 2 ml de la disolución de tripsina fría. La botella se
agitó periódicamente para promover la suspensión de las células. Se
tuvo cuidado de limitar la exposición de las células a la disolución
de tripsina a menos de cinco minutos, dado que una exposición
prolongada dañará la membrana celular. Cuando las células estaban
suspendidas, según se observó mediante un microscopio, se añadieron
8 ml de medio para inactivar la tripsina. Se midió la concentración
celular en la suspensión resultante, la suspensión se diluyó
apropiadamente y se cargó en las placas de 96 pocillos. Una vez en
las placas, se dejó que las células se adhirieran durante 3 horas
antes del tratamiento con SFU o uno de sus derivados.
Las células HL-60 se trataron y
se colocaron en el incubador durante 24 horas. Las placas se
centrifugaron, y el sobrenadante se aspiró cuidadosamente sin
alterar el sedimento celular. Inmediatamente se añadió una alícuota
de 200 \mul de medio. Las células se dejaron crecer durante 48
horas. Las células HCT-116 se trataron y se dejaron
crecer inalteradas durante 72 horas. El medio de cultivo se extrajo
mediante aspiración (tras una centrifugación en el caso de las
células HL-60). Se añadieron 100 ml de medio de
McCoy y 11 \mul de colorante MTT. Las células se incubaron a 37ºC
durante 3 horas. Durante este tiempo, las células viables redujeron
el colorante MTT a formazán púrpura por acción de la alcohol
deshidrogenasa. Las células se lisaron mediante la adición de 100
\mul de una disolución de HCl 1,2 M en etanol al 60%, liberando
así el colorante reducido en la disolución. Se midió la absorbancia
de cada pocillo a 405 nm usando un BIO-RAD
Microplate Reader (Modelo 450)^{TM}.
Se mencionó que los bioconjugados de clorambucil
3 y 4 (preparados en el Ejemplo 6) tenían labilidad térmica. Por
tanto, se espera que se descompongan térmicamente durante el ensayo,
quizás antes de entrar en las células o antes de la liberación
mediante fotolisis. La descomposición térmica de ambos bioconjugados
se siguió mediante un espectrofotómetro de diodos en serie
UV-vis (HP8452) a 37ºC en agua, medios sin células
y medios filtrados en los que se habían hecho crecer células
HCT-116 hasta una concentración de aproximadamente
100.000 células/ml. Los espectros se tomaron cada hora durante un
total de ocho horas. La presencia de bioconjugado intacto se
determinó entonces mediante fotolisis, 20 min, con una lámpara de
mercurio de alta presión. Si la fotolisis no tenía efecto alguno
sobre el espectro, se daba por hecho que todo el bioconjugado se
había descompuesto.
Se ensayaron ambos bioconjugados frente a las
líneas celulares HCT-116, HL-60,
B-16, Meth-A y
RD-995. Los ensayos se realizaron del mismo modo al
descrito en el Ejemplo 8, según se modifica en esta invención. Las
líneas celulares B-16, RD-995 y
Meth-A son todas líneas de carcinoma derivadas de
Balb/c que fueron proporcionadas por el Dr. R. Raynes de la
Universidad de Utah. Estas líneas celulares se hicieron crecer en
medio RPMI complementado con suero bovino fetal al 5% y otros
componentes de medio, según se describió previamente. Ambas líneas
celulares B-16 y RD-995 se
suspendieron en tripsina, como en el caso de las células
HCT-116. Las células Meth-A se
adhieren débilmente a las paredes de la botella y crecen tanto
fijadas a la botella, como suspendidas en la disolución. Estas
células podrían suspenderse completamente mediante lavados sucesivos
de las paredes de la botella con
medio.
medio.
Los ensayos se realizaron a unas concentraciones
celulares de aproximadamente 40.000 células por pocillo, con la
excepción del ensayo de las HL-60, que se realizó a
25.000 células por pocillo. Las células HCT-116,
B-16, y RD-995 se ensayaron en
placas de fondo plano de 96 pocillos, mientras que las células
HL-60 y Meth-A se ensayaron en
placas de fondo redondo. El clorambucil, sin conjugar, se ensayó
antes que los bioconjugados. Las células se trataron con los
bioconjugados en condiciones tanto no fotolíticas como fotolíticas.
Las células se incubaron durante tres días (los medios se aspiraron
y se reemplazaron después de 24 h en el caso de las células
HL-60) y la viabilidad resultante se midió mediante
un ensayo con MTT.
El un ensayo con MTT se modificó un poco para
este experimento. El medio de cultivo se aspiró después de 72 horas.
Las células Meth-A y HL-60 se
centrifugaron antes de la aspiración. Después se añadieron, como
antes, 100 \mul de medio de McCoy y 11 \mul de la disolución de
MTT. Después de 4 horas, el medio de cultivo se aspiro por segunda
vez (después de una centrifugación en el caso de las células
HL-60 y Meth-A) y se añadieron 100
\mul de DMSO. El DMSO lisó las células liberando el colorante MTT
en la disolución. Como antes, se midió la absorbancia de cada
pocillo a 450 nm. La disolución de HCl/etanol usada previamente
tiene tendencia a precipitar las proteínas de la disolución
resultante, lo que daría medidas de absorbancia falsamente
aumentadas. Su sustitución por DMSO evita este problema.
La concentración de clorambucil y de
bioconjugados se varió desde 0,04 \muM hasta 400 \muM durante el
ensayo. Las células se trataron con los bioconjugados con luces
rojas atenuadas, para evitar la fotolisis. Las condiciones no
fotolíticas se mantuvieron envolviendo las placas de 96 pocillos con
papel de aluminio durante los períodos de incubación. La fotolisis
se realizó en placas negras con pocillos de fondo redondo
transparente y plano (número de catálogo de Costar: 3603). Estas
placas son estériles, están tratadas con colágeno y están hechas de
un plástico ópticamente transparente. El crecimiento de las células
en estas placas no mostró ninguna diferencia con las crecidas en
placas de plástico transparente normales. La fotolisis se consiguió
mediante una serie de LED verdes de alta intensidad (número de
catálogo de Hewlett Packard: 782-6124). La serie se
construyó a partir de una de las placas negras en la que se colocó
un LED en cada pocillo. Los LED podrían encenderse y apagarse como
filas verticales. En cada ensayo se dejaron sin tratar dos filas de
células como controles del crecimiento. Una de estas filas no fue
fotolizada por los LED para mostrar cualquier efecto inesperado de
la fotolisis; la radiación no mostró ningún efecto sobre las células
de control no tratadas. Se colocó una placa vacía entre la serie y
la placa de ensayo para evitar el calentamiento de las células. Diez
minutos de radiación produjeron una fotolisis completa del
bioconjugado en medio sin células. Las células se radiaron 10 min
durante el ensayo. El tiempo de radiación, después del tratamiento
con el fármaco, se determinó mediante un ensayo de transcurso de
tiempo. Toda la placa se trató con uno de los bioconjugados con una
concentración igual a la CI_{50} del clorambucil para esas líneas
celulares. Las filas se radiaron por separado media hora antes del
tratamiento, y después cada hora.
La radiación después de 1 h de tratamiento
demostró la mayor actividad del bioconjugado en todas las líneas
celulares. Se realizaron ensayos adicionales con radiación una hora
después del tratamiento. En el caso de la línea celular
Meth-A, las células se transfirieron desde una placa
de fondo redondo a una placa negra para su fotolisis, y después se
devolvieron a las placas de fondo redondo. La línea celular
HL-60 no pudo ensayarse en estas condiciones
fotolíticas.
Ambos bioconjugados muestran una descomposición
térmica significativa tanto en agua como en medio sin células a
37ºC. Después de 8 horas, la fotolisis no tuvo ningún efecto sobre
el espectro, indicando que todo el bioconjugado se había
descompuesto. En el medio con células HCT-116 ambos
bioconjugados mostraron una rápida descomposición inicial, y se
estabilizaron significativamente al momento siguiente. Se sabe que
la haptocorrina, una proteína de unión a la cobalamina, estabiliza
las alquilcobalaminas en varios órdenes de magnitud. Esta proteína
está presente en el medio sin células procedente de suero bovino
añadido. Sin embargo, la mayor parte de esta proteína en suero está
saturada con cobalamina, por lo que la unión a los bioconjugados
puede estar inhibida. Se sabe que varios tipos de células tumorales
secretan altas cantidades de proteínas de unión a la cobalamina,
especialmente haptocorrina. Por lo tanto, el medio en el que han
crecido las células tiene una mayor concentración de
apo-haptocorrina. La rápida descomposición inicial
de los bioconjugados representa la cantidad remanente tras la
saturación de la haptocorrina en el medio. Los bioconjugados unidos
están significativamente estabilizados por la haptocorrina, y el
complejo con la haptocorrina se asocia y se disocia en disolución de
una forma dinámica, especialmente en presencia de concentraciones
significativas de otras cobalaminas en el medio. Por lo tanto, los
bioconjugados todavía son susceptibles de descomponerse cuando no
están unidos a la haptocorrina. Aunque la haptocorrina estabiliza
los bioconjugados en varios órdenes de magnitud, todavía se observa
una lenta descomposición durante el ensayo. Sin embargo, este ensayo
indica que los bioconjugados están estabilizados de una forma tal
que una cantidad significativa todavía está intacta durante el
tiempo de captación y de fotolisis.
Los datos del transcurso de tiempo de fotolisis y
los ensayos de actividad se resumen en las Figuras
5-9 para el compuesto 3 en cada una de las líneas
celulares ensayadas. Se observaron unos resultados similares para el
compuesto 4. En general, ambos bioconjugados mostraron un
comportamiento de captación y fotolisis similar en el ensayo de
transcurso de tiempo de la fotolisis. La máxima toxicidad inducida
fotolíticamente se observa una hora después del tratamiento con
cualquiera de los bioconjugados. En todos los casos, la fotolisis
del bioconjugado mostró una toxicidad aumentada con respecto a la
del clorambucil no conjugado. La Figura 5 muestra que el fármaco
quimioterapéutico, el clorambucil, tiene una DL_{50} de
aproximadamente 2 \muM con respecto a la línea celular
HCT-116, mientras que el bioconjugado no muestra
ninguna toxicidad sustancial a unas concentraciones próximas a 100
\muM. Si las células tratadas con el bioconjugado se someten a una
breve radiación con luz roja 12 horas después de la dosificación, la
DL_{50} disminuye en un factor de 25 hasta 0,08 \muM. Si se
añade un exceso de 10 veces de vitamina B_{12} para saturar los
receptores celulares de superficie, el bioconjugado no es captado
por las células y la fotolisis desencadena la liberación del
clorambucil activo en el medio de cultivo celular. El clorambucil
liberado entra ahora en la célula mediante difusión pasiva, y se
observa una DL_{50} de 2 \muM, en completo acuerdo con el valor
estándar para el clorambucil.
La Figura 6 muestra que, en la línea celular
HL-60, el clorambucil no conjugado estándar muestra
una DL_{50} de 0,5 \muM, pero el bioconjugado es al menos dos
veces mejor con una DL_{50} de 0,2 \muM. La citotoxicidad de
MC-121 frente a la línea celular leucémica todavía
es un resultado dramático cuando se compara con la ausencia de
toxicidad cuando la captación celular del conjugado está anulada por
la adición de 10 equivalentes de vitamina B_{12}. Se obtuvieron
unos resultados similares para las células Meth-A.
Las células HL-60 y Meth-A tienen
una mayor tasa de recambio, y en el caso de Meth-A,
se dividen más rápidamente que las otras líneas celulares. De hecho,
estas células pueden metabolizar la cobalamina a una tasa más rápida
que las otras líneas celulares, y liberar por tanto el clorambucil
en concentraciones significativas sin fotolisis. Para que esto sea
práctico, sin embargo, el metabolismo de la cobalamina debe
producirse antes de una hidrólisis significativa de la fracción de
clorambucil. Se refiere que las células HL-60 son
capaces de convertir eficazmente la vitamina B_{12} en otras
formas de cobalamina (más rápidamente que los linfocitos normales)
(Quadros y Jacobsen, 1995) y por tanto, serían capaces de liberar
eficazmente el clorambucil conjugado. Sin embargo, en las otras
líneas celulares los bioconjugados son esencialmente no tóxicos en
condiciones no fotolíticas, lo que es una prometedora indicación de
que estos bioconjugados pueden no ser tóxicos para las células
somáticas normales o para las células hematopoyéticas sanas. Los
valores de la CI_{50} de los bioconjugados en ambas condiciones no
fotolíticas y fotolíticas se resumen en la Tabla 1.
| Línea celular | HCT-116 | HL-60 | B-16 | Meth -A | Rd-995 |
| Clorambucil | 20,8 | 5,8 | 1,4 | 1,8 | 1,1 |
| Fotolisis | |||||
| 3 | 1,7 | - - - | 0,6 | 0,2 | 0,2 |
| 4 | 1,1 | - - - | 0,3 | 0,3 | 0,3 |
| Sin fotolisis | |||||
| 3 | - - - | 3,2 | - - - | 210,1 | - - - |
| 4 | - - - | 8,9 | - - - | 84,2 | - - - |
Se apreciará que los procedimientos y las
composiciones de la presente invención pueden incorporarse en forma
de varias de formas de realización, y sólo unas pocas de las cuales
se describen en esta invención.
Por lo tanto, las formas de realización descritas
son ilustrativas, y no deberían interpretarse como restrictivas.
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Claims (14)
1. Un bioconjugado de un agente bioactivo y un
complejo de organocobalto, en el que el complejo de organocobalto es
un complejo orgánico que contiene un átomo de cobalto con
4-5 nitrógenos y/o calcógenos unidos al mismo, tales
como oxígeno y el azufre, como parte de un sistema anular
heterocíclico insaturado múltiple, en el que el agente bioactivo
está conjugado covalentemente al átomo de cobalto a través de un
átomo no reactivo del agente bioactivo, y en el que el bioconjugado
tiene la propiedad de ser capaz de una liberación dirigida y
selectiva del agente bioactivo desde el bioconjugado.
2. Un bioconjugado según la reivindicación 1, en
el que el átomo no reactivo se selecciona entre átomos de carbono,
nitrógeno, oxígeno, azufre, selenio y silicio.
3. Un bioconjugado según la reivindicación 2, en
el que el átomo no reactivo es un átomo de carbono de un grupo
alquilo, acilo o arilo que no da lugar a un reordenamiento o a una
destrucción del agente bioactivo en condiciones de intercambio del
ligando durante una endocitosis mediada por receptor.
4. Un bioconjugado según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, en el que el agente bioactivo está unido de
forma covalente directamente al átomo de cobalto del complejo de
organocobalto.
5. Un bioconjugado según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, en el que el agente bioactivo está unido de
forma covalente indirectamente al átomo de cobalto del complejo de
organocobalto a través de un separador.
6. Un bioconjugado según la reivindicación 5, en
el que el separador es un conector autodestructivo.
7. Un bioconjugado según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6, en el que el agente bioactivo es un
compuesto de diagnóstico, un compuesto farmacéuticamente activo, un
péptido o un análogo de un péptido, una proteína o un análogo de una
proteína o un ácido nucleico o un análogo de un ácido nucleico.
8. Un bioconjugado según la reivindicación 7, en
el que el compuesto farmacéuticamente activo es un agente
anticancerígeno.
9. Un bioconjugado según la reivindicación 7, en
el que el ácido nucleico o el análogo de ácido nucleico es un
polinucleótido, un oligonucleótido o ADN o ARN antisentido.
10. Un bioconjugado según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 9, en el que el complejo de organocobalto es
cobalamina, un derivado de cobalamina, un análogo de cobalamina o un
compuesto con la fórmula:
en la que R es H, amino, alcohol
C_{1-6} o carboxilo C_{1-6}, W,
W', X, X', Y, Y', Z y Z' son independientemente H, amino, alcohol
C_{1-6}, carboxilo C_{1-6},
SO_{3}^{-}, CH_{2}OH, CO_{2}H o nitro, o W y X juntos forman
un anillo cíclico o heterocíclico de 4-6 miembros, o
W' y X' juntos forman un anillo cíclico o heterocíclico de
4-6 miembros, o Y y Z juntos forman un anillo
aromático cíclico o heterocíclico de 4-6 miembros, o
Y' y Z' juntos forman un anillo aromático cíclico o heterocíclico de
4-6
miembros.
11. Un bioconjugado según la reivindicación 10,
que comprende además una molécula marcadora unida covalentemente a
uno de dichos R, W, W', X, X', Y, Y', Z o Z', en el que la molécula
marcadora se selecciona entre glucosa, galactosa, manosa,
manosa-6-fosfato, transferrina,
cobalamina, asialoglucoproteína,
\alpha-2-macroglobulinas,
insulina, un factor de crecimiento peptídico, ácido fólico o sus
derivados, biotina o sus derivados, YEE
(GalNAcAH)_{3}
o sus derivados, albúmina, texafirina, metalotexafirina, una vitamina, una coenzima, un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo y una región variable de cadena única de un anticuerpo (scFv).
o sus derivados, albúmina, texafirina, metalotexafirina, una vitamina, una coenzima, un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo y una región variable de cadena única de un anticuerpo (scFv).
12. Un bioconjugado según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 9, en el que el complejo de organocobalto se
selecciona entre
organo(piridina)bis(dimetilglioximato)cobalto,
un corrinoide o derivados del mismo, en el que dicho derivado es (a)
un corrinoide en el que el anillo bencimidazólico está sustituido
con un halógeno, hidroxi o un alquilo C_{1-6}, (b)
un corrionide sustituido con un amino, un nitro, un halógeno, un
sulfito, un alqueno C_{2-6} o un alquino
C_{2-6}, o (c)
organo(piridina)bis(dimetilglioximato)cobalto
sustituido con un amino, un nitro, un halógeno, un sulfito, un
alqueno C_{2-6} o un alquino
C_{2-6}.
13. El bioconjugado de la reivindicación 1 a 9,
en el que dicho complejo de organocobalto es cobalamina, lactona de
cobalamina, lactama de cobalamina o un derivado de cobalamina, en el
que dicho derivado de cobalamina es (a) cobalamina en la que el
anillo bencimidazólico está sustituido con un halógeno, hidroxi o un
alquilo C_{1-6}, (b) un derivado anilida,
etilamida, ácido monocarboxílico, ácido dicarboxílico, ácido
tricarboxílico o propionamida de la cobalamina o (c) cobalamina
sustituida con un amino, un nitro, un halógeno, un sulfito, un
alqueno C_{2-6} o un alquino
C_{2-6}.
14. Una composición farmacéutica que contiene un
bioconjugado según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, y,
opcionalmente, un vehículo o diluyente farmacéuticamente
aceptable.
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