DE69727595T2

DE69727595T2 - Verfahren zur herstellung eines extraktes des plättchenwachstumsfaktors für zubereitungen zur wundheilung

Info

Publication number: DE69727595T2
Application number: DE69727595T
Authority: DE
Inventors: Paul Brazeau; Thierry Abribat; Michel Ibea; Michèle BOUSHIRA
Original assignee: Theratechnologies Inc
Current assignee: Theratechnologies Inc
Priority date: 1996-03-20
Filing date: 1997-03-19
Publication date: 2004-12-16
Anticipated expiration: 2017-03-20
Also published as: AU725091B2; DK1007061T3; WO1997034614A1; EP1007061B1; AU2019597A; US5834418A; ATE259238T1; CA2249534A1; EP1007061A1; DE69727595D1

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
(a) Gebiet der Erfindung
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Plättchenextrakten, die aus Schweinevollblut gewonnen wurden, und deren klinische Verwendungen bei der Wundversorgung.
(b) Beschreibung des Standes der Technik
Die Wundheilung ist eine komplexe Kaskade von zellularen und biochemischen Vorgängen, welche zum Verschluß der Wunde und der Reparatur von Geweben führt. Klassisch werden drei aufeinanderfolgende Phasen im Wundheilungsvorgang unterschieden:

1) die Entzündungsphase, die gesteigerter Gefäßdurchläßigkeit und Wanderung von Leukozyten und Makrophagen entspricht;
2) die proliferative Phase, welche gekennzeichnet ist durch Fibroblastenproliferation und Kollagensynthese, was zur Bildung von Granulationsgewebe führt; und
3) die Remodelierphase, wo Umverteilungen von Kollagen und Granulationsgewebe zu Narbenresorption führt.

Das allererste Ereignis, das gewöhnlich in einer Wunde eintritt, ist Blutaustritt aus dem Gewebe, was zur Plättchenansammlung und Imprägnierung der Wunde mit Plättchen und Serumbestandteilen führt. Unter diesen Bestandteilen sind Polypeptidwachstumsfaktoren, von denen bekannt ist, daß sie eine Hauptrolle in der Geweberegenerierung spielen. Plättchen-α-Granula, die durch zusammengelagerte Plättchen freigesetzt werden, sind eine der reichsten physiologischen Quellen des von Plättchen abgeleiteten Wachstumsfaktors (PDGF = plateletderived growth factor) und des transformierenden Wachstumsfaktors β (TGFβ), während Se rum hohe Mengen an insulinähnlichem Wachstumsfaktor I (IGF-I), IGF-II und deren Bindungsproteine (IGF-BPs) enthält (Strovbant P & Waterfield M D, Endo. J., 1984, 2: 2963–2967; Assoian R K et al., J. Biol. Chem., 1983, 258: 7155–7160; Sara V R et al., Physiol. Rev., 1990, 70: 591–614).
PDGFs umfassen PDGF, von Plättchen abgeleiteten Angiogenesefaktor (PDAF), TGFβ und Plättchenfaktor 4 (PF 4), welcher ein Chemoattraktant für Neurophile ist (Knighton et al., in Growth Factors and Other Aspects of Wound Healing: Biological and Clinical Implications, Alan R. Liss, Inc., Seiten 319–329 (1988)). PDGF ist ein Mitogen und ein Chemoattraktant für Fibroblasten und glatte Muskelzellen und ist ein Stimulator der Proteinsynthese in Zellen von mesenchymalem Ursprung, einschließlich Fibroblasten und glatte Muskelzellen. PDGF ist auch ein nicht mitogenischer Chemoattraktant für endotheliale Zellen.
TGFβ ist ein Chemoattraktant für Makrophagen und Monozyten. Entsprechend der Anwesenheit oder Abwesenheit von anderen Wachstumsfaktoren erhöht TGFβ die Zugfestigkeit von heilenden dermalen Wunden. TGFβ inhibiert auch endotheliale Zellmitosis und stimuliert die Synthese von Kollagen und Glycosaminoglycan durch Fibroblasten.
Andere Wachstumsfaktoren wie EGF, TGFα, die HBGFs und Osteogenin sind auch wichtig in der Wundheilung. EGF, das in gastrischen Sekretionen und Speichel gefunden wird, und TGFα, das sowohl durch normale als auch durch transformierte Zellen hergestellt wird, sind strukturell verwandt und können die gleichen Rezeptoren erkennen, welche Zellproliferation an epithelialen Zellen vermitteln. Beide Faktoren beschleunigen die Re-Epithelialisierung von Hautwunden.
Der in vivo-Aktionsmodus dieser Wachstumsfaktoren geht einher mit Chemoattraktion an der Wundstelle, Zellproliferation und Kollagensynthese. Ein sehr interessantes Merkmal dieser Produkte ist, daß einige von ihnen, nämlich PDGF und IGFs, synergistisch wirken bei der Stimulierung der Wundreparatur (Lynch S E et al., J. Clin. Invest., 1989, 84: 640–646; Greenhalgh D G et al., Wound. Rep. Reg., 1993, 1: 54–62).
Wachstumsfaktoren sind daher potentiell nützlich für die spezifische Förderung der Wundheilung und Gewebereparatur. Es wurde gezeigt, daß der Zusatz von exogenen Wachstumsfaktoren zu einer Wunde zu einer Steigerung der Geschwindigkeit, mit der die Wunde geschlossen wird, der Anzahl von Zellen im Heilungsbereich, des Wachstums der Blutgefäße, der Gesamtgeschwindigkeit der Abscheidung von Kollagen und der Festigkeit der Narbe führt (Carter et al., in Growth Factors and Other Aspects of Wound Healing: Biological and Clinical Implications, Alan R. Liss, Inc., Seiten 303–317 (1988)).
Eine von Plättchen abgeleitete Wundheilungsformulierung (PDWHF), ein Plättchenextrakt in Form einer Salbe oder flüssigen Tinktur für topische Anwendung wurde beschrieben von Knighton et al. (Ann. Surg., 1986, 204: 322–330). Knighton et al. (Ann. Surg., 1986, 204: 322–330 & in Growth Factors and Other Aspects of Wound Healing: Biological and Clinical Implications, Alan R. Liss, Inc., Seiten 319–329 (1988)) beschreibt ein Verfahren zur Herstellung einer von Plättchen gewonnenen Wundheilungszusammensetzung durch Zentrifugieren der Plättchen und Behandlung derselben mit Thrombin, um die Produktion eines Releasats zu stimulieren, das mit Kollagen kombiniert werden kann. Knighton et al. Erhalten ein von Plättchen gewonnenes Releasat mit einer begrenzten Konzentration von Wachstumsfaktoren mit einer hohen Konzentration an Albumin (9,9%), was seine klinischen Verwendungen begrenzt. Auch enthält dieses von Plättchen gewonnene Releasat im wesentlichen unreife Wachstumsfaktoren wegen der Verwendung von Thrombin, um die Plättchen aufzubrechen und ihren Inhalt freizusetzen.
Eine klinische Bewertung von rekombinanten Wachstumsfaktoren ist in Bearbeitung, jedoch bleibt es bisher ungewiß, ob der therapeutische Vorteil dieser Drogen sich angesichts ihrer hohen Herstellungskosten bezahlt macht, besonders wenn sie in Kombination verwendet werden.
Es wurde auch gezeigt, daß eine autologe aus menschlichen Plättchen gewonnene Wundheilungsformulierung hergestellt aus mit Thrombin aktivierten Plättchen α-Granula die Heilung von chronischen Geschwüren induziert, was anzeigt, daß Wachstumsfaktorextrakte eine vorteilhafte Alternative zur Verwendung von rekombinanten Wachstumsfaktoren darstellen können, wenn sie sich als wirtschaftlich extrahierbar erweisen.
Es wäre hoch erwünscht, über ein wirtschaftliches und leicht durchzuführendes Verfahren zur Isolation von kontaminationsfreien aus Blut gewonnenem Plättchenextrakt zur Verwendung in einer Wundversorgungszusammensetzung zu verfügen. Ein solcher aus Blut gewonnener Plättchenextrakt sollte absolut frei von Hepatitis B- und HIV-Kontaminierungen sein.
Es wäre hoch erwünscht, über ein Verfahren zur Isolation von Plättchenextrakt mit einem Gehalt an reifen Wachstumsfaktoren mit minimaler Albuminkonzentration (0,4%) und verbessertem Gehalt an Wundheilungssubstanzen (Wachstumsfaktoren), Fibronektin, Thrombospondin, usw. zu verfügen, welcher aus Schweinevollblut gewonnen würde und zur Verwendung in einer Wundversorgungszusammensetzung geeignet wäre.
Es wäre hoch erwünscht, über ein Verfahren zur Förderung der Wundheilung eines Patienten zu verfügen, welches die topische Anwendung der pharmazeutischen Zusammensetzung auf der Wunde des Patienten umfaßt.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Ein Ziel der Erfindung ist es, ein Verfahren zur Isolierung von Plättchenextrakt zu schaffen, der gereifte Wachstumsfaktoren mit einer solchen Konzentration enthält, daß er möglichst wenig Albumin und optimale Mengen Wachstumsfaktoren, Fibronektin und Thrombospondin enthält.
Ein weiteres Ziel der Erfindung ist es, ein Verfahren bereitzustellen, welches zu einem verbesserten Plättchenextrakt führt, der gereifte Wachstumsfaktoren und nur Spuren von Albumin enthält.
Gemäß einer Ausführungsform der Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung von Schweine-Plättchenextrakt, der gereifte Wachstumsfaktoren enthält, geschaffen, welches folgende Stufen umfaßt:

a) Zentrifugieren von Schweinevollblut bei etwa 1000 g bis etwa 5000 g, um die Plättchen vom plättchenreichen Plasma zu isolieren;
b) Suspendieren der isolierten Plättchen der Stufe a) in Plasma-Lyte A^® und Zentrifugieren, um die Plättchen zu konzentrieren;
c) Waschen der konzentrierten Plättchen der Stufe b);
d) Lyophilisieren der gewaschenen Plättchen der Stufe c), wodurch eine Lysis der Plättchen verursacht wird und der Plättchenextrakt gewonnen wird.

Gemäß einer anderen Ausführungsform der Erfindung weist das Verfahren weiterhin einen Schritt der Re-Suspension in reinem Wasser nach Schritt d) auf, worin die lyophilisierten Plättchen re-suspendiert werden.
Gemäß einer anderen Ausführungsform der Erfindung wird eine pharmazeutischen Zusammensetzung zur Förderung von Wundheilung geschaffen, welche eine wirksame Konzentration eines Plättchenextrakts enthält, der gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellt wurde, worin der Plättchenextrakt gereifte Wachstumsfaktoren, Thrombospondin, Fibronektin und geringste Mengen Albumin enthält, zusammen mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger. Eine solche pharmazeutische Zusammensetzung hat eine Plättchenextraktkonzentration zwischen 10⁷ bis 10¹² Plättchenäquivalent/ml mit nur Spuren an Albuminproteinen.
Gemäß einer anderen Ausführungsform der Erfindung wird die Anwendung der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung zur Förderung der Wundheilung eines Patienten vorgeschlagen.
Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung werden die folgenden Ausdrücke und Abkürzungen hiernach definiert.
„PRP" bedeutet ein plättchenreiches Plasma, vorzugsweise vom Schwein, das durch Zentrifugieren bei geringer Geschwindigkeit hergestellt wurde, um Erythrozyten und Leukozyten in Pelletform zu bringen und zu entfernen.
„PE" bedeutet einen Plättchenextrakt.
„PPP" bedeutet ein plättchenarmes Plasma (platelet-poor-plasma).
FIGURENBESCHREIBUNG
1 erläutert die Gewinnung von Schweineplättchenextrakten gemäß einer Ausführungsform der Erfindung;
2 erläutert die Gewinnung von Plättchenreferenz (PTRF) gemäß dem Verfahren von Knighton;
3 erläutert das Elutionsprofil an der Säule Protein Pak SW^TM (8,0 × 300) von verschiedenen Molekulargewichtindikatoren;
4 erläutert das Elutionsprofil an der Säule Protein Pak SW^TM (8,0 × 300) der Plättchenreferenz (PTRF) gemäß dem Verfahren von Knighton;
5 erläutert das Elutionsprofil an der Säule Protein Pak SW^TM (8,0 × 300) eines Schweineplättchenextrakts (EP-PL-Lyte) gemäß einer Ausführungsform der Erfindung;
6 zeigt das Elutionsprofil an der Säule Protein Pak SW^TM (8,0 × 300) eines Schweineplättchenextrakts (EP-95-11) gemäß einer Ausführungsform der Erfindung;
7 zeigt das Elutionsprofil an YMC-Pak-Säule Diol-120^TM verschiedener Molekulargewichtindikatoren;
8 erläutert das Elutionsprofil an YMC-Pak-Säule Diol-120^TM der Plättchenreferenz (PTRF) gemäß dem Verfahren von Knighton;
9 erläutert das Elutionsprofil an YMC-Pak-Säule Diol-120^TM eines Schweineplättchenextrakts (EP-PL-Lyte) gemäß einer Ausführungsform der Erfindung; und
10 zeigt das Elutionsprofil an YMC-Pak-Säule Diol-120^TM eines Schweineplättchenextrakts (EP-95-11) gemäß einer Ausführungsform der Erfindung.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung von Schweineplättchenextrakten ist neu, einfach und billig. Darüber hinaus garantiert der Ursprung des Bluts vom Schwein erfindungsgemäß: 1) eine völlige Abwesenheit potentieller Übertragung von humanen viralen Agenzien (Hepatitis, HIV, usw.); 2) die Herstellung von Wachstumsfaktoren, die zu nahezu 100% identisch mit ihren menschlichen Gegenstücken sind; und 3) eine zuverlässige weithin verfügbare und hoch reproduzierbare Quelle von Rohmaterial.
Das erfindungsgemäße Verfahren führt zu einem verbesserten Plättchenextrakt, der gereifte Wachstumsfaktoren und nur Spuren von Albumin enthält.
Die bevorzugten Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens werden im folgenden spezifischer beschrieben, um die Erfindung zu erläutern, jedoch nicht zu begrenzen.
1. PRÄPARATION DER BLUTEXTRAKTE
1.1. BLUTGEWINNUNG
Für experimentelle Zwecke wurde Schweinevollblut erfindungsgemäß verwendet, weil es allgemein verfügbar und frei von Kontamination ist. So wurden junge männliche kastrierte zwei Monate alte Ferkel von 25 kg Bruttogewicht der Landrasse Yorkshire von einem örtlichen Züchter gekauft. Sie wurden 2 bis 5 Tage in unseren Anlagen mit freiem Zugang zu Wasser und Nahrung untergebracht. Zur Blutsammlung wurden sie mit Ketaminhydrochlorid (10 mg/kg Bruttogewicht), dann mit Fluothan durch intratracheale Verabreichung anästhesiert. Eine Kanüle wurde aseptisch in eine Carotisarterie eingeführt. Bevor die Tiere ausgeblutet wurden, wurden in das Kanülensystem 2 ml Heparin-Salzlösung injiziert; und das gleiche Volumen wurde abgesaugt. Ungefähr 450 ml steriles Blut wurden in jeden Triple-Beutel (CLX CPDA-1, Vertrieb durch Miles Canada) gesammelt.
1.2. Plättchenreiches Plasma (PRP)
Das gesammelte sterile Schweinevollblut wurde in seinem Auffangbeutel etwa 4,5 Minuten bei 1375 g zentrifugiert (BREMSE = 3; Rotor JS-4,2; Beckman^TM J6-B). Das überstehende plättchenreiche Plasma (PRP) wurde gesammelt durch Entleeren des Inhalts des zentrifugierten Beutels in einen zweiten Beutel, bis die roten Blutzellen auf etwa 1 cm von der Oberkante des entleerten Beutels sind.
1.3. Plättchenkonzentrat (PC)
Das gesammelte plättchenreiche Plasma (PRP) wurde sofort in seinem Lagerbeutel etwa 8 Minuten bei 5000 g zentrifugiert (BREMSE = Maximum; Rotor JS-4,2; Beckman^TM J6-B). Nach dem Zentrifugieren wurde das plättchenarme Plasma (PPP = platelet-poor-plasma) in einen dritten Beutel überführt, bis zum maximalen Abtrennen des PPP oder wenn ein Volumen von etwa 10 ml im zweiten Beutel verbleibt, welcher das Plättchenkonzentrat enthält. Das PPP wurde verworfen.
Der zweite, das Plättchenkonzentrat enthaltende Beutel ruhte auf eine Waagebrücke (Sartorius^TM LC-4800-P). Ein Beutel von Plasma-Lyte A^TM (Baxter) wurde mit einer zweiten Medikationseinrichtung verbunden, gefolgt von einem Septum und einer Nadel von 18G × 1½. Die Nadel wurde durch eine Membran eingeführt, die in einem der Schlote des Beutels angeordnet war. 48 g Plasma-Lyte A^TM wurden in den Beutel injiziert.
Man ließ das Plättchenkonzentrat 2 Stunden ruhen und es wurde dann über Nacht auf einem Horizontalschüttler (New Brunswick Scientific, Modell G20) bei 25 UpM und 22°C bewegt.
1.4. Waschen des Plättchenkonzentrats (PC)
Der Inhalt von sechs (6) Plättchenkonzentratbeuteln wurde in einem Sechs-Lines-Leukotrap^TM-Beutel (Miles Canada) (Beutel mit 6 Anschlüssen/Leitungen) gesammelt und 15 Minuten bei 180 g zentrifugiert (BREMSE = Maximum; Rotor JS-4,2; Beckman^TM J6-B). Der den roten Blutzellenrest enthaltende Anhang des Beutels wurde verschlossen unter Verwendung der Klammer, die gewöhnlich zum Zurückhalten von Leukozyten verwendet wird. Der Beutel wurde von oben nach unten umgedreht, aufgehängt und der Überstand wurde in einen Sechs-Lines-CLX-Beutel (Miles Canada) transferiert, wobei die proximale Line verwendet wurde. Die Reihenfolge der verwendeten Lines ist stets vom proximalen zum distalen Ende.
Es wurde 8 Minuten bei 5000 g (BREMSE = Maximum; Rotor JS-4,2; Beckman^TM J6-B) zentrifugiert. Der Beutel wurde auf eine Plasmapresse (Miles Canada) gelegt, und der größtmögliche Teil des Überstands wurde in einen Becher entfernt. Die Line wurde unter Verwendung eines Aluminiumringes verschlossen.
Der das zentrifugierte Plättchenkonzentrat enthaltende Beutel wurde auf eine Brückenwaage gelegt (Sartorius^TM LC-4800-P) und es wurden unter Verwendung einer Leitung des CLX-Beutels 48 g Plasma-Lyte-A^TM injiziert. Die Beutelöffnung wurde vorübergehend blockiert unter Verwendung einer hämostatischen Klammer oder eines Aluminiumringes, um einen Rückfluß in den Leitungen zu verhindern.
Man ließ das Plättchenkonzentrat eine Stunde ruhen und schüttelte es dann etwa eine Stunde oder bis zur vollständigen Re-Suspension auf einem horizontalen Schüttler (New Brunswick Scientific, Modell G20) bei 25 UpM und 22°C.
Der Beutel wurde auf eine Brückenwaage (Sartorius^TM LC-4800-P) gelegt und es wurden 360 g Plasma-Lyte-A^TM unter Verwendung einer Leitung des CLX-Beutels injiziert, und es wurde gut gemischt.
Der Inhalt des Beutels wurde für die Zellkultur in einen graduierten Zylinder transferiert. Das Volumen wurde gemessen. 1 ml wurde steril in ein 5 ml Polypropylenreagenzrohr gegeben. Die Plättchen, roten Blutzellen und weiße Blutzellen wurden gezählt. Die Gesamtmenge der erhaltenen Plättchen wurde berechnet, ebenso wie ein Mittelwert pro Beutel des gesammelten Blutes. Für fünf Extraktionen wurde ein Mittelwert von 57 ± 13 × 10⁹ Plättchen/Beutel erhalten.
Das Plättchenkonzentrat wurde dann in sterile konische Reagenzgläser von 250 ml transferiert. Diese wurden ohne den Deckel des Rotors 20 Minuten bei 2900 g zentrifugiert (BREMSE = Maximum; Rotor JS-4,2; Beckman^TM J6-B).
1.5. Gewinnung von Plättchenextrakt (PE)
Der Plättchenrest wurde vom Überstand abgetrennt und wurde in picoreinem Wasser bei 4°C wieder suspendiert mit 1 × 10¹⁰ Plättchen/ml. Dieses Präparat wurde in dünnen Schichten unter Verwendung von flüssigem Stickstoff tiefgefroren und dann lyophylisiert.
Die lyophylisierte Plättchen wurden in sterilem picoreinem Wasser bei 4°C resuspendiert.
Diese wurden in Oak Ridge-Reagenzgläsern 30 Minuten bei 40000 g and 4°C zentrifugiert (BREMSE = Maximum; Rotor JA-20; Beckman^TM J2-21).
Es wurden Aliquots von 1, 2 oder 5 ml genommen und bei –80°C aufbewahrt.
2. ANALYTISCHE VERFAHREN
Proteine wurden gemessen mittels einer Lowry-Methode (J. Biol. Chem., 1951, 193: 265–275) unter Verwendung eines handelsüblichen Kits vertrieben von Sigma Chemical (St. Louis, MO).
Von Plättchen gewonnener Wachstumsfaktor (PDGF) wurde gemessen durch Radioimmunoassay unter Verwendung eines handelsüblichen Kits (Amersham International, UK) gemäß dem folgenden Verfahren.
Nach den Herstellerangaben beträgt die Kreuzreaktivität von Schweine-PDGF 38% mit dem Antihuman-PDGF-Antikörper, der im Kit verwendet wird. Die Ergebnisse wurden daher in Schwein-PDGF-Äquivalent konvertiert, indem man sie durch 0,38 teilte.
Die transformierenden Wachstumsfaktoren β1 und β2 wurden gemessen unter Verwendung des im Handel verfügbaren Quantikinetest^TM (R and D Systems, Minnesota, USA). Vor der Messung wurden die Extrakte 1 : 2 entweder in destilliertes Wasser oder in Trifluoressig säure (TFA) 1% eingemischt, eine Stunde bei Raumtemperatur inkubiert, lyophylisiert und mit Wasser auf ihr ursprüngliches Volumen rekonstituiert. Dieses Verfahren wurde durchgeführt, um festzustellen, ob TGFβ in Extrakten als eine aktive oder latente hochmolekulare Form vorlag.
3. IN VITRO-ASSAYS
3.1. Schweineanästhesie
Einem Schwein von 25 kg ± 2 kg wurde intramuskulär Ketamin injiziert (15 mg/kg). Nach 5 bis 10 Minuten wurde das Schwein tracheotomisiert, intubiert und künstlich beatmet unter Verwendung eines mechanischen Respirators. Das Fließvolumen wurde auf 15 cc/kg festgelegt, und die Atmungsfrequenz wurde bei zwischen 10 und 15 pro Minute gehalten, um einen PaCO₂ zwischen 35 und 45 mmHg zu halten. Die Anästhesie wurde mit 1,5 bis 2,0% Fluothane gesichert.
3.2. Hautabnahme
Das Schwein wurde in eine Decubitusstellung gebracht, die Hautabschnitte wurden vom Postero-Anterior-Bereich entnommen. Dieser Bereich war zuvor rasiert, gewaschen mit Kompressen, die mit Cidex imprägniert waren, mit Leitungswasser gespült und dann reichlich mit 70%-igem Ethanol besprüht worden.
Hautstreifen von 15 cm × 2,5 cm wurden unter Verwendung eines sterilen Skalpellblatts abgenommen. Die Streifen wurden nacheinander in sterilen 50 ml Reagenzgläsern, die 40 ml 70%-iges Ethanol enthielten, dann in sterilem PBS (Phosphatpuffer, -Salzlösung) und schließlich in einer sterilen Waschkultur (DMEM, 5% Penicillin-Streptomycin, 125 μg/ml Fongizone) gewaschen.
3.3. Digestiermethode
Unter der Haube wurden die Streifen sofort in eine sterile Petrischale von 145 cm² transferiert, die 100 ml Waschkulturmedium enthielt. Jeder Streifen wurde unter Verwendung eines Skalpellblattes und einer sterilen Gewebezange in Stücke von 2,5 cm × 2,0 cm geschnitten.
Gewebestücke wurden dann in einem Waschmedium 60 Minuten bei Raumtemperatur unter der Haube inkubiert, um die Stücke in dem Antibiotika enthaltenden Kulturmedium zu sterilisieren. Die Stücke wurden dann in drei aufeinanderfolgenden Bädern von 100 ml sterilem PBS in Petrischalen gewaschen.
In einem Digestierkolben von 250 ml mit einem magnetischen Rührer wurden die Gewebestücke unter Rühren in 100 ml Pronase bei einer Konzentration von 1 mg/ml in DMEM, 1% Penicillin-Streptomycin in einem Inkubator unter 5% CO₂-Atmosphäre bei 37°C eine Stunde lang digeriert.
Nach einer Stunde Digerierung wurde das Pronase-Enzym abdekantiert, und die Gewebestücke wurden mit Waschmedium gewaschen. Um das Digerieren zu vervollständigen, wurden die Gewebestücke zurückgebracht in 100 ml Kollagenase IV in einer Konzentration von 300 μg/ml in einem DMEM-Medium, 1% Penicillin-Streptomycin unter Rühren während 18 Stunden.
3.4. Zellkultur
Nach einer 18-Stunden-Inkubation wurde die Zellsuspension in sterilen Reagenzgläsern (50 ml) 5 Minuten bei 800 g in einer Tischzentrifuge zentrifugiert. Der Überstand wurde dekantiert, und der Zellrest wurde in einem DMEM-Medium re-suspendiert. Ein 50 μl Zellaliquot wurde gut gemischt mit 10 ml Isoton II^TM in einer Zählschale. Von dieser Mischung wurde ein 500 μl Volumen unter Verwendung eines Coulter Counter ZM^TM-Geräts (Coulter Electronics of Canada Ltd.) gezählt, wobei die Zählgrenzen zuvor festgelegt waren. Die Zellen wurden dann bis zu einer Dichte von 50 × 10⁶ in 175 cm² Kolben gesät, die 25 ml DMEM, 10% CFS (Kalbsfötalserum), 1% Penicillin-Streptomycin enthielten und in einen Inkubator bei 37°C, 5% CO₂ und 100% Feuchtigkeit gestellt. Wenn die meisten Zellen hafteten, etwa 4 Stunden nach dem Einsäen, wurde das Kulturmedium ersetzt und auch am folgenden Tag. Die Zellhaftung wurde auf etwa 30% geschätzt. Die Zellen wurden dann alle zwei Tage trypsinisiert entsprechend zu einer Verdünnung von ¼ des Zellrestes pro Kolben.
3.5. Biologische Assays an Schweinekulturfibroblasten
Die Wirkung der Proben wurde systematisch verifiziert am Wachstum und Metabolismus von Schweinefibroblasten. Dieser Assay ermöglicht festzustellen, ob Proben auf die Proliferation und den Metabolismus von Zellen einwirken (Inhibierung, Stimulierung oder Abtötung). Der Effekt der Proben wurde jeweils verglichen mit dem Effekt von fötalem Kalbsserum mit einer Konzentration von 10% (positive Kontrolle).
Experimentelles Protokoll des Proliferationsassays
Tag 1: Das Assay wurde durchgeführt mit Fibroblasten bei Passage 4. Dazu wurden die Fibroblasten, welche die Passage 3 erreicht hatten, während 3 bis 4 Minuten mit 10 ml Trypsin-EDTA dispergiert, dem 15 mM einer HEPES-Lösung zugefügt war, um den pH auf 7,4 einzustellen. Wenn die Zellen vollständig abgelöst waren, wurde die Dispersion mit 1 ml CFS abgebrochen und sie wurden dann 5 Minuten bei 800 g in einer Tischzentrifuge zentrifugiert. Der Rest wurde wieder suspendiert in DMEM, ein 50 μl Aliquot der Zellen wurde gut gemischt mit 10 ml Isoton II^TM, die in einer Zählschale enthalten waren. Von dieser Mischung wurde ein 500 μl Volumen unter Verwendung eines Counter Counter ZM^TM-Geräts gezählt, wobei die Zählgrenzen zuvor festgelegt waren. Diese Zellen wurden mit einer Dichte entsprechend 80000 Zellen/ml DMEM, 10% CFS, 1% Penicillin-Streptomycin eingesät.
Unter Rühren unter Verwendung eines in einer sterilen Umhüllung enthaltenen Magnetstabes wurde 1 ml des die Zellen enthaltenden Mediums in jede Vertiefung einer 12-Loch-Platte gegeben, wobei eine Repetitions-Pipette und ein 50 ml steriles konisches Reagenzglas verwendet wurden. Die Platten wurden bei 37°C, 5% CO₂ und 100% Feuchtigkeit während 18 Stunden in einem Inkubator inkubiert.

Tag 0: Nachdem sie Haftung erreicht hatten, wurden die Zellen mit auf 37°C erwärmtem DMEM-Medium gewaschen. Das Medium wurde dann durch Absaugen abgezogen. Dann wurden in jede Vertiefung 1 ml Waschmedium mit einer serologischen Polystyrolpipette von 10 ml zugefügt und wieder durch Absaugen abgezogen. Zu jeder Vertiefung wurden 100 μl experimentelles Medium mit Gehalt an DMEM, 0,5% CFS und 1% Penicillin-Streptomycin genau mit einer automatischen Pipette von 100 μl zugesetzt. Weiterhin wurden 100 μl einer 10 ×-konzentrierten Probe unter Verwendung einer automatischen Pipette von 100 μl zugesetzt. Jede Platte umfaßte drei Proben und eine negative Kontrolle (Basisstufe) je dreifach. Für jede Probe wurde eine serielle Verdünnung im experimentellen Medium in sterilen Reagenzgläsern von 3 ml wie folgt durchgeführt:
Für

80 μl/ml Endstufe:	1) 800 μl Probe + 200 μl experimentelles Medium
40 μl/ml Endstufe:	2) 500 μl Lösung 1) + 500 μl experimentelles Medium
20 μl/ml Endstufe:	3) 500 μl Lösung 2) + 500 μl experimentelles Medium
Kontrolle:	DMEM + 0,5% CFS + 1% Penicillin-Streptomycin

Ferner wurde eine positive Kontrolle von 100 μl CFS zum in den Vertiefungen enthaltenen Medium sowie als Stimulationskontrolle eines Probenstandards zugesetzt, um den Assay zu verifizieren.
Um den Fortschritt der zellularen Proliferation zu erkennen, wurden Vertiefungen von poisitiven und negativen Kontrollen am Tag 0 und Tag 1 durchgeführt. Die zellulare Dispersionsmethode ist für den Tag 2 im folgenden beschrieben.
Tag 2: Die Dispersion von Zellen wurde auch durchgeführt mit zuvor ins Gleichgewicht gesetztem Trypsin-EDTA während 18 Stunden bei 37°C unter 5% CO₂. Das Medium wurde durch Absaugen abgezogen, dann wurden die Zellen mit 1 ml von auf 37°C erwärmtem DMEM-Medium gewaschen. Nach Absaugen des Waschmediums wurde in die Vertiefungen 1 ml von bei 37°C gehaltenem Trypsin zugesetzt. Die Zellablösung wurde mit einem Mikroskop beobachtet. Wenn die Zellen vollständig frei waren, wurde die Dispersion gestoppt durch Zugabe von 100 μl CFS.
Die Zellen wurden durch drei Mal aufeinanderfolgendes Umkehren mit einer serologischen Glaspipette von 5 ml suspendiert. Die Suspension wurde durch sorgfältiges Übernehmen jeder Blase in 7 ml Isoton II^TM transferiert, die in einer Zählschale enthalten waren. Die Vertiefung wurde dann durch drei Mal aufeinanderfolgendes Umkehren mit zwei 2 ml Isoton II^TM gespült und zu den vorigen 7 ml zugesetzt. Vor dem Zählen wurde das die Zellen enthaltende Isoton II^TM in den Schalen 5 Mal gut gemischt mit einer serologischen Polystyrolpipette von 10 ml. Ein 500 μl Volumen der Mischung wurde gezählt unter Verwendung eines Counter Counter^TM-Geräts mit den zuvor festgelegten Zählgrenzen.
Versuchsprotokoll der Messung der metabolischen Aktivität
Tag 1: Der Assay wurde mit Fibroblasten bei Passage 4 durchgeführt. So wurden die zu Passage 3 gelangten Fibroblasten während 3 bis 4 Minuten mit 10 ml Trypsin-EDTA dispergiert, denen 15 mM einer HEPES-Lösung zugefügt waren, um den pH auf 7,4 einzustellen. Wenn die Zellen vollkommen abgelöst waren, wurde das Dispergieren mit 1 ml CFS gestoppt, und sie wurden 5 Minuten bei 800 g in einer Tischzentrifuge zentrifugiert. Der Rest wurde in DMEM wieder suspendiert, ein 50 μl Aliquot der Zellen wurde gut gemischt mit 10 ml Isoton II^TM, die in einer Zählschale enthalten waren. Von dieser Mischung wird ein 500 μl Volumen gezählt unter Verwendung eines Culter Counter ZM^TM-Geräts, wobei die Zählgren zen zuvor festgelegt waren. Die Zellen wurden eingesät mit einer Dichte entsprechend 8500 Zellen/200 ml DMEM, 10% CFS, 1% Penicillin-Sreptomyzin.
Unter Rühren unter Verwendung eines in einem sterilen Kolben enthaltenen Magnetstabes wurde 200 μl des die Zellen enthaltenden Mediums zu jeder Vertiefung einer 96-Loch-Platte unter Verwendung einer Mehrkanalpipette gegeben, wobei die äußeren Vertiefungen leer blieben und die vorletzte Reihe frei blieb für die Reaktionskontrolle. Die Platten wurden bei 37°C, 5% CO₂ und 100% Feuchtigkeit 18 Stunden in einem Inkubator inkubiert.

Tag 0: Nachdem sie angehaftet waren, wurden die Zellen mit auf 37°C erwärmtem DMEM-Medium gewaschen. Das Medium wurde dann durch Absaugen abgezogen. Anschließend wurde 1 ml Waschmedium jeder Vertiefung zugesetzt und wiederum abgesaugt. Zu jeder Vertiefung wurden mit einer Mehrkanalpipette genau 90 μl des Versuchsmediums mit einem Gehalt an DMEM, 0,5% CFS und 1% Penicillin-Streptomycin zugesetzt. Weiterhin wurden unter Verwendung einer automatischen 10 μl-Pipette 10 μl einer 10 ×-konzentrierten Probe zugesetzt. Jede Platte enthielt 5 Proben von 3 Dosierungen, eine negative Kontrolle (Basisniveau) und eine positive Kontrolle (10 μl CFS wurden zu jeden 90 μl Medium in jeder Vertiefung zugesetzt). Alle diese Versuche wurden dreifach vorgenommen. Innerhalb der Proben wurde eine Stimulationskontrolle einer Standardprobe durchgeführt, um die Gültigkeit des Assays zu verifizieren. Für jede Probe wurde eine serielle Verdünnung im Versuchsmedium in sterilen Reagenzgläsern von 3 ml wie folgt durchgeführt:
Für

80 μl/ml Endstufe:	1) 800 μl Probe + 200 μl Versuchsmedium
40 μl/ml Endstufe:	2) 500 μl Lösung 1) + 500 μl Versuchsmedium
20 μl/ml Endstufe:	3) 500 μl Lösung 2) + 500 μl Versuchsmedium
Kontrolle:	DMEM + 0,5% CFS + 1% Penicillin-Streptozmyzin

Um das Fortschreiten der Zellproliferation zu verfolgen, wurden Vertiefungen von positiven und negativen Kontrollen am Tag 0 und Tag 1 vorgenommen. Die Behandlungsmethode für Tag 2 ist im folgenden beschrieben.
Tag 2: Nach einer zweitägigen Inkubation wurden 25 μl MTT-Reagenz (5 mg/ml Konzentration) zu 100 μl Medium in jede Vertiefung zugefügt. Das muß ohne Lichteinfall geschehen. Die Platten wurden dann zurückgeführt, um im Dunkeln bei 37°C wenigstens zwei Stunden zu inkubieren. Dann wurden 100 μl Lyse-Puffer zu jeder Vertiefung zugesetzt und 18 Stunden im Dunkeln beim 37°C inkubiert. Am nächsten Tag wurden die 96-Loch-Platten gelesen unter Verwendung eines ELISA-Spektrophotometers bei einer Wellenlänge von 470 nm, nachdem zuvor das Kontrollreaktionsmuster bestimmt worden war.
Herstellung von MTT-Reagenz
Konzentration: 5 mg/ml (für 100 ml Gewicht 500 mg) 500 mg MTT/100 ml PBS filtriert bei 0,22 mm.
Lagern bei 4°C in einer braunen Flasche unter Lichtabschluß. Kann bis zu einem Monat gelagert werden. Lyse-Puffer

Für 200 ml sind herzustellen: 50% DMF = 105 ml DMF + 105 ml H₂O 20% SDS = 40 g SDS + 180 ml DMF 50%
Der pH wurde mit Essigsäure (80%), 2,5% HCl (5 ml HCl 1 N + 5 ml Essigsäure 80%) auf 4,7 eingestellt, dann wurde mit DMF 50% auf 200 ml aufgefüllt.
Plättchen-α-Granula sind die reichste in vivo-Quelle von TGFβ und PDGF. Schweineplättchen enthalten zwei Isotypen, TGFβ1 und β2. Human- und Schweine-TGFβ1 haben totale Sequenzidentität und TGFβ2 hat etwa 70% Homologie mit TGFβ1. Alle TGFβs werden natürlich gefunden als latente hoch molekulare inaktive Komplexe in Plättchen. In den erfindungsgemäßen Plättchenextrakten lieferte die Messung von nicht-extrahierten und mit Säure extrahierten Plättchenextrakten die gleiche Menge an TGFβ1 und β2, was anzeigt, daß TGFβ1 und β2 in diesen Extrakten in ihrer aktiven Form von etwa 25 KD vorliegen.
PDGF ist ein Dimer mit einer Disulfid-Brücke mit einem Mokulargewicht 30 bis 32 KD. Die Untereinheiten des Dimers sind zwei verwandte Polypeptide, die als A- und B-Kette bezeichnet werden. Obgleich gezeigt wurde, daß Humanplättchen PDGF aus PDGF-AB und PDGF-BB besteht, besteht das Schweineplättchen PDGF in erster Linie aus PDGF-BB-Homodimeren. Wegen seiner höheren Affinität für den Typ B PDGF-Rezeptor ist PDGF-BB potenter als PDGF-AB bei der Stimulierung von Zellproliferation in vitro. Jedoch lassen in vivo-Daten vermuten, daß PDGF-AB und -BB gleiche Potenz als Förderer der Wundheilung haben.
Beide PDGF und TGFβs sind bekannt als Stimulatoren der Wundheilung. Sie induzieren beide extrazelullare Matrixsynthese, Bildung von Granulationsgewebe und Erhöhung der Wundbruchfestigkeit in verschiedenen Tiermodellen. Beide, das rekombinante TGFβ1 und β2 und PDGF-BB, werden gegenwärtig in klinischen Versuchen getestet als therapeutische Mit tel zur Heilung von chronischen Geschwüren, wobei vielversprechende Anfangsergebnisse erhalten wurden.
Es wurde gezeigt, daß Plättchen-α-Granulat zusätzlich zu PDGF und TGFβ eine Anzahl von Agenzien enthält, die möglicherweise eine Rolle im Prozeß der Wundheilung spielen. Unter diesen Substanzen finden sich Plättchenfaktor 4 (PF4), ein von Plättchen abgeleiteter endothelialer Zellwachstumsfaktor (pdECGF), ein epidermis-wachstumsfaktor-ähnliches Protein (EGF) und Spuren von IGF-I, IGF-II und IGFBP3.
So zeigen die analytischen Ergebnisse, daß das erfindungsgemäße Extraktionsverfahren erfolgreich PDGF und TGFβ aus Plättchen gewann.
In Zellkultur stimulierten die erfindungsgemäßen Plättchenextrakte Fibroblast-Proliferation in einer dosisabhängigen Weise. PE induzierte einen dosisabhängigen Anstieg von primär gezüchteten Schweinefibroblasten (porcine primary cultured fibroblasts = PPCF).
Kürzlich berichtete eine randomisierte, doppelblind- und placebo-klinische Studie signifikante Verbesserungen in der Behandlung von diabetischen Geschwüren mit einem homologen Humanplättchenlysat gewonnen aus gepoolten Humanplättchen. Darüber hinaus zeigte eine Kosten/Wirkungs-Analyse, die für diese Studie durchgeführte wurde, daß die Behandlung einherging mit einer 38% Verringerung der medizinischen Kosten im Vergleich mit der üblichen Therapie. Obgleich die Zusammensetzung des PE der Erfindung sich von der des Humanplättchenlysats unterscheidet (thrombinaktivierte Plättchen-Wundheilungsformulierung) entwickelt von Curative Technologies Inc., zeigen die Ergebnisse dieser Untersuchung das therapeutische Potential und die Vorteile von Wachstumsfaktorextrakten gegenüber rekombinanten Wachstumsfaktoren.
Die Erfindung wird weiter erläutert mit Bezug auf die folgenden Beispiele, die jedoch den Umfang der Erfindung nicht begrenzen.
BEISPIEL 1
Schweineplättchenextrakte hergestellt gemäß der Erfindung im Vergleich mit Extrakten des Knighton-Verfahrens
Schweineplättchenextrakte der Erfindung
Die Plättchenextrakte wurden nach dem oben beschriebenen und in 1 erläuterten Verfahren hergestellt, jedoch mit den folgenden Maßgaben.
Extrakte: EP-95-11
Der Plättchenrest wurde vom Überstand abgetrennt und wurde mit 1 × 10¹⁰ Plättchen/ml in picoreinem Wasser bei 4°C re-suspendiert. Dieses wurde in dünnen Schichten unter Verwendung von flüssigem Stickstoff gefroren und dann lyophylisiert.
Extrakt: EP-PL-LYTE
Der Plättchenrückstand wurde vom Überstand getrennt und wurde mit 1 × 10¹⁰ Plättchen/ml im Plasma-Lyte^TM bei 4°C re-suspendiert. Dieses wurde in dünnen Schichten unter Verwendung von flüssigem Stickstoff gefroren und dann lyophylisiert.
Knighton-Schweineplättchenextrakte
Die Plättchenextrakte von Knighton, wie in 2 gezeigt, wurden verwendet als ein Vergleich mit den erfindungsgemäßen Plättchenextrakten. Das Knighton-Verfahren ist ein bekanntes Verfahren veröffentlicht von Knighton et al. (Ann. Surg., 1986, 204: 322–330).
A. Vorbereitung des Schweines
Einem Schwein von 20 bis 28 kg wurden intramuskular in seinem hinteren Bereich 4 bis 5 ml Ketaset^TM injiziert. Nach 5 bis 10 Minuten wurde das Schwein gewogen und mit Fluothan anästhesiert. Das Schwein wurde auf seinen Rücken gelegt mit seinen Beinen am Anästhesietisch festgelegt. Dann wurde die Tracheotomie durchgeführt und das Trachealrohr in die Trachea eingeführt und der Ballon aufgeblasen. Das Schwein wurde mit dem mechanischen Respirator verbunden. Die Karotis wurde freigelegt. Ein Katheter wurde in die Karotis eingelegt, der mit einem Zwei-Weg-Hahn und einem Septum verbunden war. Bevor die Tiere ausgeblutet wurden, wurden etwa 2 ml Heparin salin (Salzlösung) in das Kanülensystem injiziert und das gleiche Volumen abgesaugt.
B. Blutsammlung
Blut wurde gesammelt unter Verwendung einer 60 ml-Spritze, die 12 ml sauren Citrat-Dextrose-Puffer enthielt.
C. Gewinnung von plättchenreichem Plasma
Das gesammelte sterile Schweinevollblut wurde in 450 ml-Kolben etwa 3 Minuten bei 1600 g und 22°C zentrifugiert (BREMSE = Maximum; Beckman^TM J2-21). Der Überstand, plättchenreiches Plasma (PRP) wurde in 450 ml-Flaschen transferiert.
D. Gewinnung des Plättchenkonzentrats
Das gesammelte plättchenreiche Plasma (PRP) wurde sofort etwa 20 Minuten lange bei 1600 g und 22°C zentrifugiert (BREMSE = 6; Beckman^TM J2-21). Das plättchenarme Plasma (platelet-poor-plasma = PPP) wurde verworfen.
E. Waschen des Plättchenkonzentrats
Der rote Blutzellen enthaltende Rest wurde in PBS-Puffer (pH 7,4) re-suspendiert, um eine Plättchenkonzentration von 10⁹ Plättchen/ml zu erhalten. Es wurde in 450 ml-Kolben etwa 20 Minuten bei 1600 g und 22°C zentrifugiert (BREMSE = 6; Beckman^TM J2-21).
Der Rest wurde in PBS-Puffer (pH 7,4) re-suspendiert, um eine Plättchenkonzentration von 1 × 10¹⁰ Plättchen/ml zu erhalten.
F. Methode der Aktivierung der Plättchen
10 μg/ml Thrombin wurden zu den Plättchen zugefügt, und es wurde 30 Minuten zwischen 0°C und 4°C inkubiert. Die Plättchen wurden in 450 ml-Flaschen etwa 5 Minuten bei 950 g und 4°C zentrifugiert (BREMSE = 6; Beckman^TM J2-21).
Der das Granulat enthaltende Überstand wird in Aliquots in 2 ml-Reagenzgläser aufgeteilt und bei –80°C gelagert.
Tabelle 1
Tabelle 1 zeigt, daß der Plättchenextrakt EP-95-11, der nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellt ist, welches darin besteht, in reinem Wasser wieder zu suspendieren, bevor eine Endstufe der Lyophylisierung und weitere erneute Suspensierung in picoreinem Wasser durchgeführt wird, zu einer erhöhten Konzentration an PDGF, TGF-β1, Thrombospondin (Thbs) und Fibronektin (FbN) führt im Vergleich mit dem Knighton-Extrakt (PTRF). Jedoch ist besonders wichtig, daß der Plättchenextrakt EP-95-11 nur Spuren von Albumin im Bezug auf sein Proteingehalt enthält im Vergleich mit dem PTRF von Knighton.
Weiterhin führte der Plättchenextrakt EP-PL-LYTE, der nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellt wurde, welches im Wiedersuspendieren in Plasma-Lyte^TM vor einer Endstufe der Lyophylisierung besteht, um die Integrität der Plättchen weiter zu bewahren, und wieder suspendieren in picoreinem Wasser, zu noch mehr gesteigerter Konzentration an PDGF, TGF-β1, Thrombospondin (Thbs) und Fibronektin (FbN) im Vergleich mit dem Knighton-Extrakt (PTRF). Jedoch ist von höchster Bedeutung, daß der Plättchenextrakt EP-95-11 noch geringere Spuren von Albumin im Bezug auf seinen Proteingehalt enthält, im Vergleich mit dem Plättchenextrakt von Knighton und selbst mit dem Plättchenextrakt EP-95-11.
Tabelle 2
Tabelle 2 zeigt, daß der erfindungsgemäße Plättchenextrakt EP-95-11 zu einer effektiveren Proliferation und einem 3- bis 4-fachen Anstieg an MTT im Vergleich mit dem PTRF-Extrakt von Knighton führte.
Weiterhin führte der Plättchenextrakt EP-PL-LYTE zu noch effektiverer Proliferation und einem mehr als 10-fachen Anstieg an MTT im Vergleich mit dem PTRF-Extrakt von Knighton.
So ermöglicht die Lyophylisierungsstufe die leichte Lagerung des Extraktes und eine längere Haltbarkeit. Das Plasma-Lyte mit der Lyophylisierung gestattet die Erhaltung der aktiven Prinzipien in einer nicht denaturierten Form (gereift) und führen zu einer erhöhten Konzentration der Wachstumsfaktoren in jedem Milliliter des Extrakts.
3 zeigt das Elutionsprofil an der Säule Protein Pak SW^TM (8,0 × 300) verschiedener Molekulargewichtsindikatoren. 4 bis 6 zeigen die Ergebnisse einer vergleichenden Analyse von Elutionsprofilen des PTRF-Extrakts von Knighton im Vergleich mit EP-95-11- und EP-PL-LYTE-Plattchenextrakte der Erfindung. Diese Elutionsprofile wurden an einer Säule Protein Pak SW^TM (8,0 × 300) durchgeführt.
Die 7 bis 10 zeigen eine weitere vergleichende Analyse von Elutionsprofilen, die an einer anderen Säule YMC-Pak Column Diol-120^TM durchgeführt wurden.
Aus diesen vergleichenden Analysen ist ersichtlich, daß die erfindungsgemäßen Extrakte eine höhere Konzentration der Wachstumsfaktoren zeigen, beruhend auf direkten Messungen, was die höhere Aktivität erklären könnte, die in Tabelle 2 gefunden wird. Auch ist in beiden Säulensystemen die Konzentration von Proteinen und Wachstumsfaktoren viel höher als bei dem nach dem Knighton-Verfahren erhaltenen Extrakt.

Claims

Verfahren zur Herstellung eines Schweine-Plättchenextrakts der gereifte Faktoren, Thrombospondin, Fibronektin und geringste Mengen Albumin enthält, welches folgende Stufen aufweist: a) Zentrifugieren von Schweine-Vollblut mit etwa 1000 g bis etwa 5000 g, um die Plättchen vom plättchenreichen Plasma zu isolieren; b) Wiedersuspendieren der isolierten Plättchen der Stufe a) in einer wäßrigen Lösung mit der folgenden Zusammensetzung: Natriumchlorid: 5,26 g/l Kaliumchlorid: 0,37 g/l Natriumgluconat: 5,02 g/l Natriumacetat: 3,58 g/l Magnesiumchlorid: (Plasma-Lyte-A^®) 0,30 g/l

und Zentrifugieren, um die Plättchen zu konzentrieren; c) Waschen der konzentrierten Plättchen der Stufe b); d) Lyophilisieren der gewaschenen Plättchen der Stufe c), wodurch Lyse der Plättchen verursacht und der Plättchenextrakt gewonnen wird.
Verfahren nach Anspruch 1, welches außerdem eine Stufe der erneuten Suspendierung nach der Stufe d) aufweist, worin die lyophilisierten Plättchen wieder suspendiert werden.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei das erneute Suspendieren in reinem Wasser vorgenommen wird.
Verfahren nach Anspruch 1, worin das Waschen in Stufe c) in reinem Wasser oder in einer wäßrigen Lösung mit der folgenden Zusammensetzung vorgenommen wird: Natriumchlorid: 5,26 g/l Kaliumchlorid: 0,37 g/l Natriumgluconat: 5,02 g/l Natriumacetat: 3,58 g/l Magnesiumchlorid: 0,30 g/l
Pharmazeutische Zusammensetzung zur Förderung der Wundheilung, welche eine wirksame Konzentration eines nach dem Verfahren des Anspruchs 1 hergestellten Plättchenextrakts aufweist, worin der Plättchenextrakt gereifte Wachstumsfaktoren, Thrombospondin, Fibronektin und geringste Mengen Albumin zusammen mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger enthält.