DE69717065T2

DE69717065T2 - Verwendung von thermochromen Flüssigkristallen in Diagnosemethoden mit Reflektrometrie

Info

Publication number: DE69717065T2
Application number: DE69717065T
Authority: DE
Inventors: Michael Celentano; Chris T. Zimmerle
Original assignee: Bayer AG; Bayer Corp
Current assignee: Siemens Healthcare Diagnostics Inc
Priority date: 1996-12-23
Filing date: 1997-12-10
Publication date: 2003-10-09
Anticipated expiration: 2017-12-11
Also published as: AU4855197A; US5972715A; AU718044B2; JPH10206411A; CA2218008A1; EP0851229B1; ES2186836T3; DE69717065D1; CA2218008C; EP0851229A1

Description

Hintergrund der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft Diagnose-Teststreifen sowie ein verbessertes Verfahren zu deren Ablesung mittels eines Reflexionsspektrometers.
Teststreifen zur Analyse von Komponenten in einer Flüssigkeit wie von Körperflüssigkeiten des Menschen sind gut bekannt. In typischer Weise sind derartige Streifen aus einem absorbierenden Material hergestellt, in denen ein Reagens- System absorbiert ist, das auf das Vorhandensein bzw. Vorliegen eines Analyt in der Test-Flüssigkeit mit einem visuell nachweisbaren Signal wie einer Farbänderung reagiert. Diese Farbänderung, die in einem oder in mehreren Test- Feldern des Streifens auftritt, kann das Ergebnis einer enzymatischen Reaktion sein, wobei ein Redox-Farbstoff oxidiert oder reduziert wird, um die gefärbte Reaktion zu erzeugen. Alternativ dazu, ist der Streifen aus einem Material hergestellt, durch welches der Analyt und dafür spezifische markierte Antikörper fließen können, um Analyt/markierter Antikörper-Konjugate zu bilden, die in einer spezifischen Nachweiszone des Streifens eingefangen werden, um eine nachweisbare Reaktion zu ergeben, die die Konzentration des Analyt in der flüssigen Testprobe widergibt.
Während die nachweisbare Reaktion, die mit solchen Streifen erhalten wird, visuell beobachtet werden kann, um ein qualitatives oder halb-quantitatives Maß des Analyt in der Testprobe zu erhalten, können eine größere Quantifizierung und eine schnellere und zuverlässigere Handhabung von Mehrfach-Teststreifen durch Ablesung der entwickelten Streifen mit einem Gerät bewerkstelligt werden. Eine derartige Ablesung mit einem Gerät wird gewöhnlich durch die Anwendung eines Reflexionsspektrometers durchgeführt, das die Intensität der Reflexion aus der Oberfläche des Test-Feldes bestimmt und ermittelt. Diese Sorte eines Geräts bestimmt die Intensität des reflektierten Lichts im entwickelten Streifen durch Beleuchtung des Streifens mit Licht bei einem Winkel (in typischer Weise von 90º), durch Nachweis des reflektierten Lichts bei einem anderen Winkel (in typischer Weise von 45º) und Auswahl der gemessenen Farbe oder des Wellenlängenbereichs bei entweder der Quelle oder dem Detektor.
Da das Spektrometer programmiert ist, um die Reflexionsablesung an einem besonderen Punkt in der Zeit durchzuführen, und die Intensität des visuell nachweisbaren Signals mit der Änderung der Umgebungstemperatur schwanken kann, weil die Reaktionsgeschwindigkeit und/oder das Gleichgewicht oft temperaturabhängig sind, besteht ein Bedarf für Mittel bzw. Maßnahmen, mit denen Temperaturvarianzen aus dem Assay herausgemittelt werden können.
Die vorliegende Erfindung beinhaltet die Verwendung thermochromer Flüssigkristalle im Zusammenhang mit der Ablesung von Teststreifen durch spektrofotometrische Mittel, um dazu beizutragen, die Ablesung des Spektrofotometers bezüglich Varianzen bei der bzw. durch die Umgebungstemperatur zu korrigieren. Die Anwendung thermochromer Flüssigkristalle (TLCs) in der Forschung und in Testverfahren breitet sich zunehmend insbesondere in den Gebieten von Fließ-Sichtbarmachungs- und Wärmeübertragungsstudien aus. Die TLCs reagieren auf Temperaturänderung mit einer Änderung ihrer Farbe, wie deren Name impliziert. Sie weisen in typischer Weise chirale (verdrehte) Molekularstrukturen auf und bestehen aus optischen Mischungen organischer Chemikalien. Der zutreffende Name für diese Materialien heißt cholesterische oder chirale nematische Flüssigkristalle. Der Begriff cholesterisch ist historisch und aus der Tatsache abgeleitet, dass die ersten Materialien, die die charakteristischen Eigenschaften und Strukturen thermochromer Flüssigkristalle zeigten, Ester von Cholesterin waren. Allerdins zeigen viele optisch aktive Chemikalien und Mischungen davon, die in einem Bezug zu Cholesterin oder weiteren Sterolen stehen, ebenfalls die cholesterische Flüssigkristall-Struktur. TLC-Mischungen können in zwei bestimmte unterschiedliche Typen gemäß ihren chemischen Zusammensetzungen eingeteilt werden. Diese Typen sind cholesterische, d. h. Formulierungen zur Gänze aus Chemikalien, die in Beziehung zu Cholesterin und weiterem Sterol stehen, und chirale nematische, d. h. Formulierungen zur Gänze aus nicht-Sterol-basierten Chemikalien. Eine dritte Kategorie von TLCs geht aus der Tatsache hervor, dass cholesterische und chirale nematische Chemikalien vermischt werden können, um Formulierungen zu ergeben, die ein Kontinuum physikalischer und chemischer Eigenschaften irgendwo zwischen denen ihrer reinen cholesterischen und reinen nematischen Vorstufen zeigen.
TLCs ergeben Farben durch selektive Reflexion von einfallendem weißen Licht. Herkömmliche temperaturempfindliche Mischungen färben sich von farblos (schwarz gegenüber einem schwarzen Hintergrund) nach rot bei einer gegebenen Temperatur und durchlaufen, mit dem Anstieg der Temperatur, die weiteren Farben des sichtbaren Spektrums nacheinander (orange, gelb, grün, blau violett), bevor sie wieder farblos (schwarz) bei noch höheren Temperaturen werden. Da die Farbänderungen reversibel sind, kehrt sich die Farb-Abfolge bei Abkühlung um. TLCs können in einer Anzahl unterschiedlicher Formen wie unversiegelten Flüssigkeiten, die im wesentlichen Öle mit der Konsistenz bei ihren Betriebstemperaturen zwischen derjenigen eines dünnen Öls und einer viskosen Paste sind, welche in dünnen einheitlichen Filmen angewandt werden, in mikroverkapselten Formen, in denen Tröpfchen der TLCs von einem kontinuierlichen Polymerüberzug umgeben sind, oder in überzogenen Platten verwendet werden, in denen ein dünner Film des Flüssigkristalls als Sandwich zwischen einer durchsichtigen Polymerplatte als Substrat und einem schwarzen absorbierenden Hintergrund vorliegt.

Zusammenfassung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft die Verbesserung spektrofotometrischer Testverfahren bezüglich des Vorliegens bzw. Vorhandenseins und/oder der Konzentration eines Analyt in einer flüssigen Testprobe, wenn ein temperaturempfindlicher Assay durchgeführt wird. Dieser Typ von Assay kann mit einem System-Typ angewandt werden, der eine spektrofotometrisch nachweisbare Farbänderung bei Kontakt eines festen Testmaterials mit einer flüssigen Probe ergibt, die den Analyt enthält. Die Verbesserung beinhaltet den Nachweis der Temperatur des festen Testmaterials durch spektrofotometrische Messung der Reflexion eines thermochromen Flüssigkristalls in enger Nähe zum festen Testmaterial. Nach Bestimmung der Temperatur werden die Ergebnisse des Assay bezüglich einer Änderung der Temperatur aus einer vorausgewählten Nominaltemperatur ausgeglichen, welcher das Testmaterial unterzogen worden ist.

Beschreibung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Mittel zur Korrektur von Änderungen der Umgebungstemperatur im Anschluß an die spektrofotometrische Ablesung von Teststreifen, die, bei Kontakt mit einem Analyt in einer flüssigen Testprobe, eine spektrofotometrisch nachweisbare Reaktion ergeben. Wird diese Reaktion durch Änderung der Umgebungstemperatur beeinflusst, so dass die spektrofotometrische Ablesung verfälscht wird, um ungenaue Ergebnisse zu liefern, ergibt die Anwendung der technischen Verfahrensweise der vorliegenden Erfindung ein Mittel, Ungenauigkeiten bei der Ablesung herauszurechnen, was auf bestehende Spektrofotometer anwendbar ist, wobei nur minimale Änderungen der Hardware erforderlich sind. Die technische Verfahrensweise ist sowohl auf den traditionellen kolorimetrischen Typ eines Assay-Streifens, worin ein Redox- Farbstoff seine Farbe durch eine enzymatische Reaktion ändert, als auch auf die in neuerer Zeit eingeführten immunochromatografischen Streifen anwendbar, in denen ein Ligand, der mit einem visuell nachweisbaren Marker markiert ist, mit einem Analyt zusammengebracht wird, um eine visuell nachweisbare Reaktion zu ergeben. Beide dieser technischen Verfahrensweisen und besonders die letztere sind gegenüber Änderungen der Umgebungstemperatur ziemlich empfindlich und können, in Abwesenheit eines Mittels zur Korrektur von Temperaturvarianzen, zu verfälschten Ergebnissen führen. Ein solcher Test ist der Test für Urobilinogen; abnorm hohe Gehaltsmengen davon können in Urin hämolytische und häpatische Krankheiten, eine Störung der Galle und weitere Gallentrakt-Disfunktionen anzeigen. Das Standardverfahren zum Nachweis von Urobilinogen in Urin wendet die Ehrlich-Reaktion an, wobei eine wässrige Lösung von p-Dimethylaminobenzaldehyd oder p-Diethylaminobenzaldehyd und Salzsäure verwendet werden. In der Gegenwart von Urobilinogen wird ein Komplex mit dem Ehrlich-Reagens erzeugt, der eine Absorption im sichtbaren Spektrum aufweist. Diese Reaktion ist besonders empfindlich gegenüber Varianzen der Umgebungstemperatur. Im Assay vom immunochromatografischen Typ müssen der markierte Ligand und/oder ein Bindungspartner davon entlang einem Streifen aus porösem Trägermaterial fließen und mit einem immobilisierten Bindungspartner gebunden werden, um ein visuell nachweisbares Signal in einer besonderen Zone des Streifens zu ergeben, wobei das Signal das Vorliegen und/oder die Konzentration des Analyts in der Test-Flüssigkeit anzeigt. Immunochromatografische Assayverfahren sind nicht immer empfindlich gegenüber der Temperatur in einem normalen Umgebungsbereich. Allerdings sind, in bestimmten Fällen, wie dem Test für Deoxypyridinolin (Dpd) in Urin, die Dpd- Antikörper ziemlich empfindlich gegenüber Temperaturänderungen. Diese Temperaturempfindlichkeit schwankt, abhängig von dem besonderen Analyt, nach dem gesucht wird, wodurch es erschwert ist, die Temperaturempfindlichkeit von Ab-An-Reaktionen vorherzusagen. Bei Enzymen oder weiteren typischen chemischen Reaktionen erhöht sich die Umsatzrate um annähernd das 2-Fache mit jedem Anstieg der Temperatur um 10ºC wegen dem Anstieg bei der molekularen Stoßgeschwindigkeit mit steigender Temperatur. Während es keinen Umsatz für eine Ab-An-Reaktion gibt, würde bei der Stoßgeschwindigkeit normalerweise erwartet werden, dass sie mit der Temperatur ansteigt. Außerdem kann die Ab- und An-Molekularkonfiguration zahlreiche Änderungen bei Temperaturvariation eingehen, was Reaktionsgeschwindigkeit und Umsatz verändern würde.
Eine gesteigerte Genauigkeit bei diagnostischen Assayverfahren, die mit diesen Streifen durchgeführt werden, ist mit sorgfältiger Temperatursteuerung erzielbar. Natürlich kann eine Steuerung der Temperatur auch erhalten werden, indem man die Assayverfahren in einer Testfläche durchführt, die bezüglich der Umweltbedingungen gesteuert ist. Dies reicht jedoch nicht immer aus, weil sich eine nachträgliche Anpassung bestehender Reflexionsspektrometer mit Temperatursteuerungsvorrichtungen, wie mit elektronischen Temperatursensoren, wegen des Aufwands und, in vielen Fällen, wegen der Kosten verbieten würde. Eine solche Temperatursteuerung würde auch die Anwendung von Erwärmungselementen und eine erhöhte Energieversorgung beinhalten, was alles die Ansprüche an Aufwand und Energie des Gerätes erhöhen würde. Die vorliegend offenbarte Erfindung stellt einen Ausgleich für Temperaturschwankungen durch Temperaturmessung unter Anwendung thermochromer Flüssigkristalle und eine Kompensation der Änderung bei der Temperatur durch Modifikation der Spektrofotometer-Software bereit.
Die Temperaturerfassung erfolgt durch Reflexionsmessungen eines thermochromen Flüssigkristalls, der die geeigneten charakteristischen Eigenschaften aufweist. Geeignete TLCs zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung ergeben eine sichtbare Farbänderung als Funktion der Temperatur. Die geeigneteste Farbänderung ist ein Ansteigen oder Absinken bei der optischen Reflexion der TLCs, wie dies durch einen der Filter eines Reflexionsspektrometers mit Mehrfach-Detektoren zur Identifizierung des reflektierten Lichts bei verschiedenen Wellenlängen aufgenommen wird. Alle TLCs ergeben eine Farbänderung von Schwarz → Farbe → Schwarz (unter der Annahme eines schwarzen Hintergrunds), was gewöhnlich der Fall ist. Somit muss die Aufnahme dieser Änderung durch ein Gerät in etwa einem Bereich in der Farbänderungsregion liegen, die sich in einer Position befindet, die mit dem Lesekopf des Gerätes gescannt werden kann. Die Anordnung des TLC könnte auf dem Teststreifen selbst erfolgen, um die Temperaturanpassung an einen besonderen Assay zu koordinieren und sicherzustellen, dass der TLC nicht länger seinen Platz eingenommen hat, als es seine langfristige Stabilität nahelegen würde. Am einfachsten wird der TLC auf dem Specimen-Tablett des Geräts knapp oberhalb des oberen Endes des Schlitzes zur Aufnahme des Teststreifens angeordnet, wie dies in Fig. 1 dargestellt ist. Bezüglich Fig. 1, ist das Specimen-Tablett 10, das normalerweise mit einem weißen-Eichstreifen 12 und einem Streifen-Anordnungseinsatz 14 ausgestattet ist, auch mit einem TLC 16 versehen, der knapp oberhalb der Einschubstelle zur Streifen-Plazierung angeordnet ist.
Die Instrumentensoftware wird modifiziert, um das Spektrometer zu befähigen, den Flüssigkristall abzulesen und seine reflektierte Farbe in eine Temperaturmessung durch eine vorbestimmte mathematische Beziehung zu übersetzen. Beispielsweise wird die Reflexion eines TLC-Materials, das am Tisch eines CLINITEK® 50 Urinanalyse-Geräts fixiert ist, durch die Grün- und Rotfilter des Geräts abgelesen, und es werden die Reflexionswerte aus jedem der Filter kombiniert. Dieser kombinierte numerische Wert wird dann herangezogen, um die Temperatur unter Anwendung einer vorab erstellten Beziehung zwischen den kombinierten roten und grünen Reflexionsmessungen und der Tisch-Temperatur zu berechnen. Die modifizierte Software und der thermochrome Flüssigkristall können von den Eigentümern bestehender Geräte installiert werden, wodurch sie auf den neuesten Stand gebracht werden, um die entsprechenden Vorteile aus dem Temperatur-Kompensiersystem der vorliegenden Erfindung zu nutzen. Das System kann natürlich auch in neue Spektrometer eingebaut werden, bevor diese in den Verkauf gehen. Diese technische Vorgehensweise ist einer Zufügung des Merkmals einer bezüglich der Temperatur kompensierten Chemie zu neuen oder bestehenden medizinischen Analysegeräten auf der Basis von Reflektrometrie vorzuziehen. Die Verwendung von TLCs ermöglicht es für den Hersteller der Analysegeräte, das Temperaturkompensationsmerkmal bei nur geringen zusätzlichen Kosten bereitzustellen und die Anwendung von Drahtbändern am Specimen-Tisch und/oder die Notwendigkeit für Schaltkreisbrett-Modifikationen zu vermeiden. Die Geräte werden auf den neuesten Stand gebracht, und zwar durch einfache Fixierung des TLC am geeigneten Ort und durch Modifizierung der Software.
Durch die Anwendung von Reflexionsmessungen einer temperaturabhängigen Fläche oder Unterlage (TLC) werden die Messungen auf die Temperatur bezogen und angewandt, temperaturabhängige Reagenzien zu korrigieren, wo eine Temperatursteuerung nicht verfügbar ist.
Der TLC kann auf jeden individuellen Teststreifen oder auf das entsprechende Gerät angewandt werden, wie vorher beschrieben. Verschiedene Variationen einer normalen TLC- Plattenherstellung sind für Variationen bei der jeweiligen Anwendung möglich. Falls es erwünscht ist, den TLC direkt auf den Reagens-Träger oder auf Komponenten des Gerätes zu legen, kann eine TLC-Aufschlämmung direkt durch Siebdruck auf den gewünschten Ort aufgebracht werden, wodurch die Positionierung des TLC an die verschiedenen Orte, Formen und Größen angepasst wird. Für größere Präzision kann eine Anzahl von TLCs überall auf dem Tisch oder Streifen angeordnet werden, um es zu ermöglichen, dass ein breiterer Temperaturbereich zur besseren Genauigkeit in einem engen Bereich verfolgt wird. In typischer Weise würde jeder TLC ein einziges Temperatur-Signal aufweisen. Das bevorzugte Verfahren ist es, einen Einzel-TLC mit breitem Temperaturbereich anzuordnen, der auf einem Teilstück des Gerätetisches zwischen dem weißen Eich-Chip und der Streifen- Plazierungsfläche fixiert wird, wie in Fig. 1 dargestellt, um die Temperatur des Teststreifens am genauesten aufzunehmen.
Die Instrumentensoftware ist entworfen, um die Reflexion und Farbe des TLC in Temperatur zu übersetzen. Das folgende Beispiel beschreibt mathematisch, wie sich die Urobilinogen- Algorithmuswerte als Funktion der Temperatur veränderten. In diesem Fall waren die Werte linear, die es ermöglichten, dass ein Delta-Decode für jede der Analyt-Gehaltsmengen berechnet wurde, wobei der Delta-Decode die Änderung beim Decode als Funktion der Temperatur für jede der getesteten Analyt- Gehaltsmengen betrifft. Die Delta-Decode-Werte wurden aufgenommen, bezogen auf eine Faktor-Änderung über eine 6ºC- Differenz zwischen 30 und 24ºC. Das 24ºC-Niveau wurde als die Normaltemperatur gewählt, da dies die üblichste Umgebungstempertur ist, bei der die Geräte angewandt werden und die Faktor-Differenz, wie sie in Fig. 7 aufgetragen ist, nicht als linear auftritt. Alle weiteren Temperaturen wurden auf diese Nominaltemperatur normalisiert. Da Nicht-Linearität eine komplexere Gleichung erforderlich machen würde, stellt die Normalisierung vielmehr bei mittlerer Temperatur als bei einem der Extremergebnisse bei jedem der Temperatur- Extremwerte eine geringere Abweichung dar. Wie durch das Beispiel aufgezeigt, wurde der temperaturabhängige Fehler beim Urobilinogen-Test durch das Temperatur- Korrekturverfahren der vorliegenden Erfindung herabgesetzt.
Das Verfahren zur Durchführung der vorliegenden Erfindung wird nun noch weiter durch die folgenden Beispiele erläutert.

Beispiel I

TLC-Proben, aufgebracht auf eine Mylar-Unterlage mit unterschiedlichen Gehaltsmengen von TLC, wurden von zwei verschiedenen Verkäufern erhalten. Dabei handelte es sich um spezielle Materialien, die zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung hergestellt wurden und hier als A und B bezeichnet sind. Die Temperaturabhängigkeit von einer der TLC-Proben (A) wurde an einem CLINITEK® 100-Gerät von Bayer Diagnostics unter Anwendung des folgenden Verfahrens getestet:
Der TLC wurde auf die Mylar-Unterlage in mehrfachen Durchgängen mit einem Drahtstab unter anschließender Ausbreitung des Materials mit dem Stab aufgebracht. Die größten Änderungen der Reflexion wurden festgestellt, als die größte Menge des TLC (gemäß der Anzahl der Durchgänge) zum Mylar gegeben wurde. Dies ist in Fig. 2 dargestellt. Dies verdeutlicht die Notwendigkeit zur sorgfältigen Qualitätskontrolle, um zu gewährleisten, dass die Dicken des TLC, die auf die Teststreifen oder das Gerät aufgetragen werden, von Streifen zu Streifen oder von Gerät zu Gerät konsistent bleiben.
Der andere TLC (B) wurde in ähnlicher Weise getestet. Das B- Material ergab eine Reaktion, die, bei visuell größerer Deutlichkeit, eine geringere Signal-Differenz bei den Dicken ergab. Das Problem bei diesem TLC war, dass die Farbänderung im Temperaturbereich von Interesse zu groß war. Es ist schwierig, Reflexionsänderungen zu handhaben, die in einer gegebenen Temperaturregion sowohl ansteigen als auch absinken. Obwohl das A-Material weniger sichtbare Änderung zeigte, war die Tatsache, dass die Reflexion mit Anstieg der Temperatur nur absinken würde, von Vorteil in instrumenteller Hinsicht. Dieser TLC konnte nicht verwendet werden, Temperaturen unterhalb 18ºC wegen eines starken Absinkens unterhalb dieser Temperatur zu verfolgen.
Um sicherzustellen, dass kein Hysteresis-Effekt, d. h., dass die beobachtete Reflexion davon abhängig war, ob die Temperatur anstieg oder absank, festgestellt wurde, wurden Daten unter Verwendung beider TLCs mit der Temperaturänderung in beiden Richtungen gesammelt.

Beispiel II

Zusätzliche Daten, die die Wirksamkeit der Verwendung thermochromer Flüssigkristalle als Verfahren zur Temperaturbestimmung im Zusammenhang mit der spektrofotometrischen Ablesung eines Analyse-Streifens stützen, sind grafisch in Fig. 3 dargestellt. Die Daten wurden über eine Dauer von 2 Tagen in einer Umgebungskammer gesammelt, die wiederholt zwischen 18 und 30ºC bei einer konstanten relativen Feuchte von 40% im Kreislauf gehalten wurde. Temperaturen wurden alle 5 min von 3 verschiedenen Positionen in Relation zum TLC aufgenommen, der am Specimen- Tisch des Spektrometers fixiert war. Ein CLINITEX® CT50- Gerät wurde zusammen mit einem Programm angewandt, das eine Ablesung alle 5 min auslösen würde, worauf die TLC- Reflexionsdaten entlang den Tisch-, Brett- und Umgebungstemperaturen gesammelt wurden. Die Tisch-Temperatur kam aus einer eingebetteten Probe an der Spitzenposition des Streifens, angrenzend an die TLC-Position. Die Brett- Temperatur kam aus einem Temperatur-Sensor, der sich auf dem Schaltkreis-Brett nahe dem Lesekopf des Geräts befand. Die Umgebungstemperatur kam aus einer Sonde ca. 30 cm entfernt vom Gerät. Die Daten wurden über 31 h gesammelt (insgesamt 374 Datenpunkte).
Die Signale, die aus jedem der IR-, roten, grünen und blauen Sensoren des Geräts erhalten wurden, wurden zu jedem Zeitpunkt gesammelt und in Fig. 3 aufgetragen. Die Prozent- Reflexion durch den IR-Filter zeigte und ergab wenig oder keine Änderung. Die Änderung bei den roten, grünen und blauen Filter-Signalen ist als Funktion der Temperatur in Fig. 3 dargestellt. Das kombinierte rote und grüne Signal wurde herangezogen, da eine größere Signaländerung zwischen 18 und 30ºC erhalten werden konnte. Mit diesen Daten und einer 2er- Polynomialregressionsanpassung durch die Datenpunkte wurde eine Gleichung entwickelt, mit der die Reflexionswerte durch die Rot- und Grün-Filter des Geräts in Temperatur überführt werden konnten. Diese Gleichung lautet:
TLC-Temperatur = 38,068 - 0,0883 (Rg + Rb) + 0,0000775 (Rg+Rb)²,
worin Rg die Prozent-Reflexion durch den Grün-Filter und Rb die %-Reflexion durch den Rot-Filter sind.
Die Beziehung zwischen der TLC-Reflexionsreaktion und der Temperatur zum Erhalt der obigen Gleichung wurde mit einem IBM-kompatiblen Computer erhalten, der durch einen serienmäßigen Zugangsanschluss an einen Baytech Multiport- Controller angeschlossen war. Die Ausgabe aus einem Cole- Palmer-Scanner-Thermopaar und die Ausgabe aus einem CLINITEK ®CT50-Gerät wurden durch den Baytech Controller abgestimmt. Die Ausgabe aus dem CT50 schloß Reflexionsablesungen durch die Rot-, Grün-, Blau- und IR-Filter ein. Die Ausgabe aus dem scannenden Thermopaar schloß Temperaturablesungen aus einer Sonde ca. 30 cm beabstandet vom Gerät ein, welche in den Tisch, wie oben beschrieben, eingebettet und am Haupt- Schaltkreisbrett nahe dem Lesekopf des Geräts befestigt war. Spezielle Software, programmiert in Visual Basic, wurde angewandt, um die 5minütigen Ablesungen durch das Gerät auszulösen und alle Datenströme zu erhalten und abzustimmen.
Die in Fig. 4 angegebenen Daten stellen die Korrelation der TLC-Reaktion (die Summierung der Grün- und der Rot-Filter- Reflexion) mit derjenigen der Probe dar, die in den Tisch eingebettet ist, der an das fixierte TLC-Material angrenzt. Aus Fig. 4 kann bestimmt werden, dass sogar unter rasch schwankenden Temperaturen gute Korrelation zwischen den durch die Probe aufgenommenen Temperaturen und denjenigen vorliegt, die vom TLC aufgenommen werden. Unter diesen rasch schwankenden Umgebungsbedingungen war die Korrelation zwischen dem TLC und der Sonde, die die Umgebungstemperatur misst, weniger robust. Fig. 3 korreliert die vom TLC aufgenommene Temperatur mit derjenigen der Tisch- Temperatursonde. Die Korrelation zeigt ein R² von 0,998 und ein Sy x X (Standardabweichung der Linie) von 0,203, worin der quadratische Regressionskoeffizient ist, der die Korrelation zwischen zwei Messungen angibt, wobei der Wert 1 eine perfekte Korrelation mit dem Wert 0 darlegt, der überhaupt keine Korrelation zwischen den zwei Messungen darlegt. Dies zeigt an, dass innerhalb einer Zuverlässigkeitsgrenze von 95% die Korrelation zwischen dem TLC und der Tisch-Sonde innerhalb eines halben Grades liegt.
Für optimale Ergebnisse muss der TLC ziemlich nahe am Teststreifen liegen. Es gibt in typischer Weise einen kleinen Temperatur-Gradient innerhalb des Geräts selbst, welcher, zumindest in einer rasch schwankenden Temperaturumgebung, Temperaturdifferenzen von 1 bis 3ºC verursachen würde. Demzufolge wird der TLC vorzugsweise auf dem Teststreifen selbst oder auf dem Specimen-Tisch nahe dem Streifen angeordnet, wie in Fig. 1 dargestellt.

Beispiel III

Die Befähigung eines Reflexionslese-TLC zur Temperaturkorrektur wird durch dieses Beispiel belegt, worin die Urobilinogen-Unterlage eines MULTISTIX SG ®-Streifens über mehrere Temperaturen von 18 bis 30ºC getestet wurde. Die Ergebnisse dieser Reagens-Unterlage sind dafür bekannt, dass sie gegenüber der Temperatur empfindlich sind, wie angezeigt durch die Produkt-Einschubstelle. Die Reflexionsmessungen sind empfindlich gegenüber Temperaturen, wie dargestellt in Fig. 5 und 6 mit Eich-Lösungen, enthaltend 0 und 4 mg/dL Urobilinogen in der flüssigen Testprobe. In allen Fällen zeigen die Messungen des Decode, d. h. das Algorithmusergebnis aus dem Gerät (worin Decode gleich den Reflexionswerten ist, erhalten aus Grün/IR-Filtern eines CLINITEK® 50- Spektrofotometers), eine negative Reaktion gegenüber Anstiegen der Temperatur und treten als linear auf. Die Faktor-Änderung pro Grad-Änderung aus 24ºC wird geeicht mit:
Delta(Faktor-Änderung) = 1 - Decoed30C/Decode24C
Diese Beziehung ist in Fig. 7 dargestellt, und sie ist fast linear. Es wurde keine Differenz gefunden, als die Faktor- Differenz bei einer niedrigeren Temperatur berechnet wurde. Die obige Beziehung wurde dann herangezogen, um einen korrigierten Decode als Funktion der Temperatur mit der folgenden Gleichung zu berechnen:
DecodeKorrigiert = Decode/{1 + (Decode · Steigung + Zwischenabschnitt) · (Ttatsächlich - 24)},
wobei Steigung = -2,94 · 10E-05 und Zwischenabschnitt = 0,0287, worin diese Werte aus der Linearregression des Delta(Faktor-Änderung) pro ºC aus 24ºC gegen Decode-Messung in Fig. 7 berechnet wurden.
Die Ergebnisse dieser Berechnung sind in Tabelle 1 angegeben. Tabelle 1
Wie durch Tabelle 1 aufgezeigt, wird eine signifikante Fehlerreduktion (bezüglich der Standardabweichung (SD)) in der Größenordnung vom ca. dem 4-Fachen durch Anwendung der TLC-Temperaturkorrektur auf die Daten ohne Änderung bei der Durchschnitts-Decode-Messung erzielt. Dies belegt, dass vom TLC erhaltene Temperaturdaten herangezogen werden können, um den durch Temperatur induzierten Fehler in Fällen signifikant herabzusetzen, in denen eine Temperatursteuerung nicht praktikabel oder verfügbar ist.
Die vorliegende Erfindung funktioniert auf dem Prinzip einer Messung der Reflexion des TLC-Materials durch ein Reflexions- Messgerät. Eine oder eine Kombination reflektierter Wellenlängen werden so ausgewählt, dass ein einziger Wert für eine gegebene Temperatur erhalten wird. Da sich die Farbe der TLC-Materialien von Schwarz → Farbe → Schwarz mit steigender Temperatur verändert, ist es wünschenswert, den nachgewiesenen Temperaturbereich auf eine Fläche einzugrenzen, worin eine oder eine Kombination von Wellenlängenwerten einen numerischen Wert ergeben. Die Reflexion des TLC-Materials wird durch Bezug dieser einzigen Werte auf eine gegebene Temperatur und durch Ableitung einer Gleichung geeicht, welche die numerische Berechnung der Temperatur ermöglicht, wenn nur die Reflexion des TLC- Materials bekannt ist. Die Temperatur des TLC-Materials ist die gleiche oder nahe bei der Temperatur des festen Testmaterials, wenn die beiden in hinreichend enger Nähe gehalten werden. Die Genauigkeit des Temperaturbestimmungsverfahrens kann in dem Maße sinken, wie das TLC-Material und das feste Testmaterial durch steigende Abstände getrennt voneinander vorliegen. Ein Beispiel einer derartigen Eichung ist in Fig. 4 dargestellt.
Temperatureffekte der immunologischen oder chemischen Reaktion bei gegebenen Analyt-Gehaltsmengen werden über den Analyt-Bereich hinweg bestimmt, in welchem ein entsprechender Nachweis erwünscht ist. Die chemische oder immunologische Reaktivität lässt sich in jeder Form wie als Einheiten, mg oder jeder weiteren Form ausdrücken, in welcher die Daten von Fig. 5 und 6 als Decode ausgedrückt sind. Eine Beziehung zwischen dem Decode-Wert, der ein Maß für die chemische oder immunologische Reaktivität ist, zu demjenigen der Temperatur kann aus den in Fig. 5 und 6 dargestellten Beziehungen aufgestellt werden. Wie in Fig. 7 dargestellt, ist es wünschbar, die Faktor-Änderung im Decode-Wert am Mittelpunkt des gewünschten Temperaturbereichs festzulegen, um eine Abweichung bei den Berechnungen zu minimieren, die den Decode zur Temperaturänderung in Beziehung setzen.
Sobald die Beiehung für ein gegebenes Los von Reagenzien und einen gegebenen Temperaturbereich aufgestellt ist, wird der gemessene Decode-Wert durch die Faktor-Differenz eingestellt und angepasst, die für diesen Decode-Wert und die Abweichung der Temperatur vom Nominalwert aufgestellt wurde. Diese Beziehung kann eine mathematische Gleichung sein, die die Berechnung eines korrigierten Decode aus einem gemessenen Decode und der Temperaturmessung ermöglicht. Im vorliegenden Beispiel ist diese Beziehung durch eine Gerade mit einer Steigung von -2,94 · 11OE-05 und einem Zwischenabschnitt von 0,0287 beschrieben. Demgemäß wird ein gemessener Decode-Wert von 600 bezüglich der Temperatureffekte durch eine Software korrigiert, welche die Gleichung anwendet und den Wert 563 für einen korrigierten Decode-Wert 562 berechnet. Eine aufgestellte Beziehung, die in der Software zwischen Decode und Analyt-Gehaltsmenge verankert ist, wird dann angewandt, um die Analyt-Konzentration in der Probe zu ergeben.

Claims

1. Assay zur Bestimmung des Vorliegens und/oder der Konzentration eines Analyt in einer fluiden Testprobe, in welcher das Vorliegen und/oder die Konzentration des Analyt durch Messung der Farbänderung in einem festen Testmaterial mit einem Reflexionsspektrometer bestimmt wird, nachdem das Testmaterial mit der fluiden Testprobe in Kontakt gebracht worden ist, und worin die Assay- Ergebnisse mit Änderungen bei der Temperatur des festen Testmaterials schwanken, gekennzeichnet durch die Anwendung des Reflexionsspektrometers, um die Temperatur des festen Testmaterials durch Messung der Reflexion eines thermochromen Flüssigkristalls in enger Nähe zum festen Testmaterial und durch Korrektur der Ergebnisse des Assay bezüglich der Abweichung der Temperatur von einer vorab ausgewählten Nominaltemperatur zu bestimmen.

2. Assay gemäß Anspruch 1, worin das feste Testmaterial ein Streifen aus einem absorbierenden Material mit einem darin absorbierten Reagens-System ist, das auf das Vorliegen eines Analyt in der Test-Flüssigkeitsprobe mit einer visuell nachweisbaren Farbänderung reagiert.

3. Assay gemäß Anspruch 1, worin der thermochrome Flüssigkristall vom cholesterischen Typ, chiralen, nematischen Typ oder einer Kombination davon ist.

4. Assay gemäß Anspruch 1, worin die Farbänderung durch eine enzymatische Reaktion mit dem Analyt verursacht wird, welche die Farbe eines Redox-Farbstoffs verändert, mit dem das feste Testmaterial beaufschlagt ist.

5. Assay gemäß Anspruch 1, worin die Farbänderung durch die Wechselwirkung eines Ligand, der einen visuell nachweisbaren Marker aufweist, mit dem Analyt verursacht wird.

6. Assay gemäß Anspruch 1, worin der Analyt Urobilinogen und die Testflüssigkeit Urin sind.

7. Assay gemäß Anspruch 1, worin der thermochrome Flüssigkristall auf dem festen Testmaterial angeordnet ist.

8. Assay gemäß Anspruch 1, worin das Reflexionsspektrometer einen Specimen-Tisch zur Plazierung des festen Testmaterials aufweist und der thermochrome Flüssigkristall auf dem Specimen-Tisch in direkter Angrenzung an die Fläche auf dem Specimen-Tisch angeordnet ist, wo das feste Testmaterial plaziert ist.

9. Assay gemäß Anspruch 1, worin die Temperatur des festen Testmaterials bestimmt wird durch:

i. Messung der Reflexion des TLC-Materials durch das Reflexionsspektrometer;

ii. Auswahl einer oder einer Kombination der reflektierten Wellenlängen, um einen einzigen Wert für eine gegebene Temperatur zu ergeben;

iii. Eichung der Reflexion des TLC-Materials durch Bezug des einzigen Wertes auf eine gegebene Temperatur;

iv. Ableitung einer Gleichung, die die numerische Berechnung der Temperatur ermöglicht, wenn nur die Reflexion des TLC-Materials bekannt ist; und

v. Lösung der Gleichung zum Erhalt der Temperatur.

10. Assay gemäß Anspruch 9, worin die Ergebnisse des Assay bezüglich einer Änderung der Temperatur korrigiert werden, durch:

i. Messung der Reflexion des festen Testmaterials durch das Reflexionsspektrometer;

ii. Auswahl einer oder einer Kombination der reflektierten Wellenlängen, um einen einzigen Wert für eine gegebene Analyt-Konzentration zu ergeben;

iii. Bestimmung der Beziehung zwischen der Farbe des festen Testmaterials, wie durch das Reflexionsspektrometer aufgenommen, und der Temperatur des festen Testmaterials bezüglich verschiedener Analyt- Konzentrationen über den Bereich der Analyt- Konzentration von Interesse hinweg;

iv. Berechnung einer Temperaturfaktor-Differenz in der aufgenommenen Farbe für jede der verschiedenen Analyt- Konzentrationen; und

v. Bestimmung des korrigierten Farbwertes, der vom Spektrometer aufgenommen wird, durch Anpassung des Farbwertes an die Temperaturfaktor-Differenz und an die Abweichung der Temperatur vom Nominalwert;

vi. Bestimmung des korrigierten Farbwertes aus der gemessenen Farbe und Temperatur; und

vii. Bestimmung der Analyt-Konzentration in der fluiden Testprobe aus dem korrigierten Farbwert.