DE69716728T2 - Zytofluorometrisches verfahren zur bestimmung von antikörper gegen tumorantigene im serum - Google Patents

Description

• Die vorliegende Erfindung bezieht sich ein cytofluorometrisches Verfahren zum Nachweis von Antikörpern, die gegen Tumorantigene gerichtet sind, im Serum.
• Die Wichtigkeit eines Nachweises von gegen Tumorantigene gerichtete Antikörper im Serum für diagnostische und prognostische Zwecke ist seit langer Zeit erkannt.
• Vor kurzem wurde ferner eine neue Klasse von Tumorantigenen beschrieben, die von Antikörpern erkannt wird, die durch die Immunisierung von Säugetieren mit Proteinen gewonnen werden, welche aus der Säugetierleber (WO 92/10197) mit Perchlorsäure extrahierbar sind.
• Es wurde insbesondere eins von diesen Antigenen isoliert und sequenziert, nämlich ein Protein mit einer Molekulargewicht von etwa 14 kDa, das im folgenden als UK 114 bezeichnet wird. Es ist mit einer Antitumoraktivität ausgestattet und, wenn es Tieren verabreicht wird, die eine unterschiedliche Art darstellen im Vergleich zu der Art, aus dem es extrahiert wurde, induziert Antikörper, die Tumorantigene erkennen, welche auf der Membran von Tumorzellen exprimiert sind.
• Es wurde auch die Existenz von natürlichen Antikörpern gezeigt, die sowohl an das UK 114 Protein als auch an die Tumorzellen binden.
• Eine hohe Konzentration von diesen natürlichen Antikörpern könnte möglicherweise ein Schutzfaktor gegen die Entstehung einer Neoplasie darstellen, was die Entwicklung von bösartigen Tumoren beeinflussen kann.
• Die Konzentration von Antikörper im Serum von Patienten, die durch bösartige Tumore bewirkt oder durch die exogene Verabreichung von UK 114 induziert werden kann, könnte, obwohl sie nicht direkt mit einer cytotoxischen Aktivität in Verbindung zu bringen ist, dennoch ein nützlicher Hinweis für die Kontrolle einer Therapie und für diagnostische Zwecke sein.
• Die Bedeutung eines Verfahrens ist somit offenkundig, welches die Bestimmung von Antitumor-Antikörper, nämlich von entweder natürlichen oder induzierten Anti-UK 114 Antikörper, in den Seren von Krebspatienten und gleichzeitig die Bestimmung der verschiedenen Klassen von Immunglobulinen (IgG, IgA, IgM, IgE, IgD) erlaubt sowie die Unterscheidung zwischen IgG1, IgG2, IgG4 ermöglicht, d. h. die Immunglobulin G-Subtypen, die spezifisch für die cytotoxischen Effekte verantwortlich sind.
• Es wurde nun ein besonders empfindliches und wirksames Verfahren gefunden, welches die Bestimmung der Antitumor-Antikörper sowie ihre Typisierung erlaubt. Das Verfahren basiert auf der cytofluorometrischen Methode und ist durch die Verwendung von vollständigen, toten Zellen, im allgemeinen des Tumortyps, oder von plastischen Mikrokügelchen, welche das Antigen an ihrer Oberfläche gebunden aufweisen, charakterisiert.
• Mit dem Ausdruck "vollständige, tote Zellen" sind nicht-lebensfähige Zellen gemeint, die durch chemische oder physikalische Verfahren inaktiviert wurden, welche keine Membranpermeabilisierung oder eine Denaturierung des Antigens, das auf der Membran selbst exprimiert ist, bewirken.
• Die Verwendung von toten Zellen erlaubt die Herstellung von gebrauchsfertigen Kits, ohne dass Probleme oder Risiken auftreten, die mit der Handhabung von lebensfähigen Tumorzellen verbunden sind.
• Das Verfahren nach der Erfindung erlaubt femer die gewünschte Differenzierung zwischen den verschiedenen Klassen und Typen der Serumimmunglobuline (IgG&sub1;, IgG&sub2;, IgG&sub4;).
• Die Zellen, die gemäß der Erfindung verwendet werden können, stellen vorzugsweise stabilisierte Tumorzelllinien mit Karzinom-, Sarkom-, Lymphom- oder Melanomursprung dar, die an ihrer Oberfläche Tumorantigene exprimieren, nämlich das UK 114 Antigen. Beispiele für diese stabilisierte Tumorzellen umfassen die HAT 29 Zelllinie von einem Dickdarmkarzinom, KATO III von einem Magenkarzinom, NICH von einem Lungenkarzinom, CTL-16 von einem Brustkarzinom und ähnliches.
• Chemische Verfahren für die Inaktivierung der Zellen gemäß der Erfindung umfassen die Behandlung mit wässrigen Lösungen von Aldehyden, wie Formaldehyd oder Glutaraldehyd, oder mit aldehydischen oder nicht-aldehydischen Fixiermittel. Die Verwendung von Formaldhyd in Konzentrationen von 0,1, bis 10%, vorzugsweise von 0,2 bis 4%, und über einen Zeitraum von 30 Minuten bis 24 Stunden, vorzugsweise von 30 Minuten bis 60 Minuten, ist bevorzugt.
• Alternativ können die Zellen durch physikalische Verfahren inaktiviert werden, wie Temperaturveränderungen, β- oder γ-Bestrahlungen, Zustandsänderungen.
• Das Verfahren nach der Erfindung umfasst die Inkubation der Serumprobe mit den toten Tumorzellen und nachfolgend die Zugabe der anti-Spezies IgG, Antikörper, die mit Fluoreszenzmarker konjugiert sind.
• Das Ablesen wird dann optisch (Mikroskop) durchgeführt oder vorzugsweise unter Verwendung eines Cytofluorometers oder einer FACS-Vorrichtung (fluoreszenzaktivierter Zellsortierer). Dies erlaubt die Bestimmung der Zahl der positiven Zellen und somit des Antikörpertiters.
• Alternativ kann im Fall der Anti-UK 114 Antikörper die erste Inkubation in Gegenwart des Komplements durchgeführt werden, wobei in der Nachweisphase Anti-Komplement fluoreszierende Antikörper-Fraktionen verwendet werden.
• Es wurde tatsächlich beobachtet, dass die Komplementkomponenten (insbesondere C&sub9;) eine wichtige Rolle bei der Bestimmung des cytolytischen Effektes der Antikörper spielen. Das oben offenbarte Verfahren ermöglicht somit die Untersuchung dieses cytotoxischen Effektes.
• Es ist auch möglich zur Vermeidung von Störungen durch Antigene, die andere als UK 114 Antikörper erkennen, das Serum mit UK 114 als Kontrolle vor-adsorbieren zu lassen, um durch den Unterschied nur die spezifische Interaktion der Antikörper, die mit den UK 114 verwandten Antikörper reagieren, zu bestimmen.
• Die Erfindung stellt ferner einen gebrauchsfertigen Kit für die Durchführung der oben beschriebenen Verfahren bereit, der eine Suspension der vollständigen toten Tumorzellen oder die UK 114 Antigen enthaltende Mikrokügelchen, Anti-Spezies IgG oder Anti-Komplement fluoreszierende Antikörper und zusätzlich geeignete Puffer, Verdünnungsmittel und Reagentien für die cytofluorometrische Analyse umfasst. Positive und negative Testkontrollen sind auch enthalten.
• Das folgende Beispiel beschreibt weiter die Erfindung.
Beispiel
• KATO III Magenkarzinomzellen, die sowohl in Kultur als auch in Suspensionen wuchsen, wurden in 2% Formaldehyd in gepufferter Phoshat-Salzlösung, ph 7,2 (PBS), fixiert.
• Die Fixierung wurde bei Raumtemperatur für 15 Minuten durchgeführt. Die Zellen wurden dann in PBS, die 0,1 M Kochsalz enthielt, gewaschen und dann bei 4ºC in PBS bis zur Verwendung aufbewahrt.
• Für die indirekte Immunfluoreszenzreaktion wurden 1 · 10&sup6; Zellen für 30 Minuten bei Raumtemperatur mit dem zu testenden menschlischen Serum inkubiert, 1 : 10 verdünnt in PBS, dann dreimal in PBS gewaschen, inkubiert mit Ziegen-Ig Anti-Mensch Ig und markiert mit Fluoresceinisothiocyanat. Nach dreimaligem Waschen in PBS wurden die Zellen mit einem FACScan®-Gerät (Becton-Dickinson), ausgerüstet mit einem 15 mW Anregungslaser, bei 488 nm analysiert.
• Die Fig. 1 zeigt die FACScan®-Analyse eines Serums von einem normalen Menschen.
• Nach Waschen wurden die Zellen mit Kaninchen-Anti-Mensch IgG, markiert mit Fluorescein, inkubiert. Der Mi-Balken zeigt den Bereich, in den die fluoreszierenden positiven Zellen fallen. 1,68% der Zellen lagen in diesem Bereich. Das Ergebnis dieses Tests muss als negativ angesehen werden.
• Die Fig. 2 zeigt die FACScan®-Analyse eines Serums von einem Patienten, der mit einem UK 114 enthaltenden Leberextrakt, UK 101 genannt, behandelt wurde.
• In dem Serum dieses Patienten sind Antikörper vorhanden, die das Antigen (UK 114) erkennen, welches auf der KATO III-Zelloberfläche vorhanden ist. Die Antikörper binden an die KATO III-Zelloberfläche und werden dann ihrerseits durch die fluoreszierenden Anti-Mensch Ig- Antikörper gebunden. Der größte Teil der Zellen (87,34%) waren somit bei dem Fluoreszenztest positiv (sie liegen innerhalb des Bereiches des Mi-Balkens).
• In der Fig. 3 werden die Kurven des negativen Test (Fig. 1) und des positiven Tests (Fig. 2) miteinander verglichen. Die beiden Kurven sind deutlich unterschiedlich.

Claims (9)

1. Verfahren zur Bestimmung der Anwesenheit und des Titers von autologen Antikörpern gegen Tumorantigene auf der Tumorzelloberfläche, umfassend die Cytofluorometrie von vollständigen toten Zellen, die durch chemische Behandlung inaktiviert wurden und diese Antigene exprimieren oder von plastischen Mikrokügelchen, die das Antigen an ihrer Oberfläche gebunden aufweisen, wobei diese Zellen oder Mikrokügelchen zuvor mit dem zu analysierenden Serum inkubiert wurden.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Zellen durch Behandlung mit Formaldehyd, Glutaraldehyd, aldehydischen oder nicht-aldehydischen Fixierungsmitteln inaktiviert wurden.

3. Verfahren nach Anspruch 2, wobei die Zellen durch Behandlung mit Formaldehyd inaktiviert werden.

4. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche zum Nachweis von Antikörpern, die das 14 kDa-Protein erkennen, welches aus Säugerleber durch Perchlorsäurebehandlung extrahierbar ist.

5. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche zur selektiven Analyse der Antikörper, die zu verschiedenen Klassen von Serumimmunoglobulinen (IgG&sub1;, IgG&sub2;, IgG&sub4;) gehören.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die Zellen aus Tumoren stammen.

7. Verfahren nach Anspruch 6, wobei die Tumorzellen ausgewählt werden aus stabilisierten Tumorzellinien mit entweder Karzinom-, Lymphom-, Sarkom- oder Melanomursprung, welche Tumorantigene über ihrer Oberfläche exprimieren.

8. Verfahren nach Anspruch 4, wobei ein Kontrollserum verwendet wird, welches erhalten wird durch Behandeln des Serums mit dem 14 kDa-Protein aus Säugerleber.

9. Diagnostisches Kit zur Verwendung in den Verfahren der Ansprüche 1 bis 8, umfassend eine Suspension von toten vollständigen Tumorzellen, geeigneten Puffern und Reagentien für die cytofluorometrische Analyse.