DE69712493T2

DE69712493T2 - Mikrobizide zusammensetzung

Info

Publication number: DE69712493T2
Application number: DE69712493T
Authority: DE
Inventors: Nilo Ram N Castanedo Cancio; Madaisy De La Caridad Cueto Sanchez; Grisell Diaz Martinez; Mirtha Mayra Gonzalez Bedia; Carlos Manuel Gonzalez Lorenzo; Margarita Machado Rodriguez; Esther Lilia Martin Triana; Alain Ramirez Dieguez; Eloisa Salazar Yera
Original assignee: CT DE BIOACTIVES QUIMICOS CBQ
Current assignee: CT DE BIOACTIVES QUIMICOS CBQ
Priority date: 1996-06-21
Filing date: 1997-06-23
Publication date: 2003-03-13
Anticipated expiration: 2017-06-24
Also published as: ES2180060T3; DE69712493D1; AU3333897A; JP3573467B2; WO1997049283A2; EP0920804B1; AU738787B2; EP0920804A1; US6316014B1; CA2258911C; WO1997049283A3; CA2258911A1; JP2000512301A; BR9709932A; CU22676A1; ATE217147T1

Description

Technisches Gebiet

Die vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet der Mikrobiologie und insbesondere eine mikrobizide Zusammensetzung, die als Wirkstoff 1-(5- Bromfur-2-yl)-2-brom-2-nitroethen enthält, die als chemisches Sterilisationsmittel für Kulturmedien zur Bekämpfung von bakteriellen und pilzlichen Verunreinigungen verwendet wird.

Stand der Technik

Die Verunreinigung von Kulturmedien beispielsweise bei der Herstellung von in vitro gezüchteten Pflanzen, führt zu erheblichen Verlusten im Gesamtverfahren, da im Autoklaven nur die momentan vorliegenden Verunreinigungen beseitigt werden. In einigen Fällen werden verschiedene Antibiotika, wie Cefotaxim, Novobiocin und Dihydrostreptomycin, zur Verhinderung von Verunreinigungen verwendet, wobei aber keine zufriedenstellende Ergebnisse erzielt werden.
Ferner beschreibt WO-89/11793 die Verwendung von 2-(2-Brom-2- nitroethenyl)-furan als industrielles antimikrobielles Mittel mit breitem Wirkungsspektrum.
Die Verbindung 1-(5-Bromfur-2-yl)-2-brom-2-nitroethen ist aus der Literatur bekannt (Z. N. Nazarova, 1972, "Synthesis of some furylnitroolefins with potential biological activity", Khim. Farm. Zh., Bd. 6(10), S. 5-8 und Z. N. Nazarova et al. 1972, "Physicochemical properties and reactivity of furylnitroolefins, Zh. Org. Khim., Bd. 8(2), S. 404-411). Ferner ist diese Verbindung als wirksames Mittel mit antibakterieller und antimykotischer Aktivität bekannt (EP-A-0 678 516).

Offenbarung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung stellt eine mikrobizide Zusammensetzung bereit, die in vorteilhafter Weise zur Bekämpfung von Verunreinigungen in Kulturmedien, z. B. von bakteriellen oder pilzlichen Verunreinigungen, verwendet werden kann.
Diese technische Lösung, die auch zur Sterilisation von festen und flüssigen Kulturmedien herangezogen werden kann, eignet sich insbesondere zur Herstellung von in vitro gezüchteten Pflanzen. Überraschenderweise wurde festgestellt, dass durch diese Anwendung das herkömmliche Verfahren zur Sterilisation, das bei diesen Medien erforderlich ist, ersetzt werden kann und sogar die Zugabe der erforderlichen Hormone beim Wurzelbildungsvorgang von in vitro gezüchteten Kulturpflanzen entfallen kann.
Die Haupteinschränkung, die bei der Verwendung dieses Wirkstoffes als Sterilisationsmittel in festen Medien bestand, lag in der fast gänzlich fehlenden Wasserlöslichkeit und in der verringerten Auflösungsgeschwindigkeit in einem wässrigen Medium. Ein möglicher Lösungsweg für diese Schwierigkeit besteht in festen Dispersionen, die eine Verringerung der Teilchengröße bis auf das molekulare Niveau ermöglichen.
Das hier vorgeschlagene Verfahren stellt eine mikrobizide Zusammensetzung bereit, die als Wirkstoff 1-(5-Bromfur-2-yl)-2-brom-2- nitroethen (als Sterilisationsmittel) enthält und aus einer Dispersion besteht, die durch Fusion oder Copräzipitation dieser Verbindung in einer physiologisch inerten und in Wasser leicht löslichen Matrix, die durch ein hochmolekulares Poiyethylenglykol und andere Polymere gebildet ist, hergestellt worden ist.
Um die Dispersion durch Fusion des 1-(5-Bromfur-2-yl)-2-brom-2- nitroethens durchzuführen, erfolgt die Auswahl der Parameter bezüglich der Herstellungsverfahren und der Temperatur sowie bezüglich der Rührzeiten auf der Grundlage des Schmelzpunkts und der thermischen Stabilität des gewählten Wirkstoffes und des gewählten Polymeren. Die Verbindung 1-(5-Bromfur-2-yl)-2-brom-2-nitroethen schmilzt ohne Zersetzung bei einer Temperatur von 89-90ºC und ist bis zu 110ºC thermisch stabil.
Jedoch beeinflussen Zubereitungen von festen dispersen Systemen des Wirkstoffes mit Polymeren, deren Schmelzpunkte über 110ºC liegen, die thermische Stabilität des Wirkstoffes, so dass ein Verfahren unter Copräzipitation in einem Lösungsmittel empfohlen wird.
Um den Dispergiervorgang durch Schmelzen des 1-(5-Bromfur-2-yl)-2- brom-2-nitroethens durchzuführen, wird ein physikalisches Gemisch aus dem Wirkstoff und PEG-6000 in einem Verhältnis von 1 : 20 bis 1 : 1 bis zum Schmelzen bei der Temperatur von 60-80ºC erwärmt und 15 Minuten unter konstantem Rühren gehalten, bis ein vollständig homogener Schmelzzustand erreicht worden ist. Anschließend wird das geschmolzene Gemisch in Form einer dünnen Schicht auf gekühlte Bleche aus rostfreiem Stahl gegossen und darauf verteilt, was einen raschen Erstarrungsvorgang gewährleistet. Der auf diese Weise erhaltene Feststoff wird durch Mahlen und Sieben auf eine Teilchengröße von weniger als 0,2 mm gebracht.
Der Schmelzpunktbereich von festen Dispersionen aus dem Wirkstoff und PEG-6000 variiert mit der Zusammensetzung des Gemisches und beträgt 53-54ºC für die durch Schmelzdispersion erhaltene feste Dispersion mit einem Gehalt an 30%, deren Zusammensetzung mit der eutektischen Zusammensetzung des binären Systems aus Wirkstoff und PEG-6000 zusammenfällt.
Um eine Dispersion durch Copräzipitation von 1-(5-Bromfur-2-yl)-2- brom-2-nitroethen zu erhalten, wird das Gemisch aus dem Wirkstoff und dem Polymeren in Verhältnissen vor. 1 : 20 bis 1 : 1 in einem polaren Lösungsmittel, das in einem Zeitraum von 10 bis 60 Minuten auf eine Temperatur von 40 bis 60ºC erwärmt wird, gelöst. Anschließend wird eine Rotationsverdampfung unter Vakuum bei einer Temperatur von 40-80ºC durchgeführt. Der auf diese Weise erhaltene Feststoff wird zur Erzielung einer Teilchengröße von weniger als 0,2 mm gemahlen und gesiebt.
Für die Zubereitung eines flüssigen Kulturmediums mit einem Gehalt an 1-(5-Bromfur-2-yl)-2-brom-2-nitroethen wird die Verbindung unter Verwendung von Tensiden, wie Solutol IIS-15 und Gremophor zu einer wässrigen Zubereitung verarbeitet. Diese Zusammensetzungen werden im Hinblick auf eine gute Stabilität und Löslichkeit der Verbindung und mit solchen Konzentrationen hergestellt, dass die Organismen, die im Medium gezüchtet werden, nicht beeinträchtigt werden.
Nachdem stabile Zusammensetzungen mit einem Gehalt an 1-(5-Bromfur- 2-yl)-2-brom-2-nitroethen unter Anwendung der vorstehend beschriebenen Verfahren hergestellt worden waren, wurden verschiedene Tests durchgeführt, um die optimale Dosis insbesondere der als Sterilisationsmittel verwendeten Verbindung in den für die Vermehrung von in vitro gezüchteten Pflanzen verwendeten festen Kulturmedien zu ermitteln. Die Phytotoxizität wurde unter Berücksichtigung von Nekrose, Chlorose, Vermehrungskoeffizient und Abstand von Verbindungspunkt (junction) zu Verbindungspunkt (für Kartoffeln) bewertet.
Für die untersuchten Kulturen (Bananen, Kartoffeln und Zuckerrohr) lag die optimale Dosis für 1-(5-Bromfur-2-yl)-2-brom-2-nitroethen im Bereich von 30 bis 45 ug/ml.
Die nachstehenden Beispiele dienen der Erläuterung der Erfindung, ohne den Schutzumfang zu beschränken.

Beispiel 1

Einfluss von Temperatur und Zeit auf die Reinheit der durch das Schmelzverfahren erhaltenen festen Dispersion

Eine Untersuchung des Einflusses von Temperatur und Zeit auf die Reinheit der Zusammensetzung mit einem Gehalt an 1-(5-Bromfur-2-yl)-2- brom-2-nitroethen, die durch das Schmelzverfahren erhalten worden war, wurde durchgeführt.
Es wurde festgestellt, dass die Reinheit des Wirkstoffes in der erhaltenen festen Dispersion von der Temperatur und der Rührzeit abhängt. In Tabelle 1 sind für 1-(5-Bromfur-2-yl)-2-brom-2-nitroethen die prozentualen Reinheitswerte aufgeführt, die durch Dispersion dieser Verbindungen in fester Phase in PEG 6000 (30 : 70) unter Anwendung von Schmelztemperaturen von 80 bis 120ºC und Rührzeiten von 15 bis 60 Minuten erhalten worden sind.
Die Untersuchung wurde in sämtlichen Fällen gemäß den nachstehenden Angaben durchgeführt.
Bei einer Temperatur von 80ºC und einer Rührzeit von 15 Minuten wurde das physikalische Gemisch von 1-(5-Bromfur-2-yl)-2-brom-2- nitroethen und PEG 6000 (30 : 70) bis zur Schmelztemperatur erwärmt und 15 Minuten konstant gerührt, bis eine vollständig homogene Schmelze erhalten wurde. Das geschmolzene Gemisch wurde in Form einer dünnen Schicht auf gekühlte Bleche aus rostfreiem Stahl gegossen. Der erhaltene Feststoff wurde zu einer Teilchengröße von weniger als 0,2 mm gemahlen und gesiebt. Die Reinheit des Wirkstoffes in der unter den vorstehenden Bedingungen erhaltenen Dispersion betrug bei Bestimmung durch Gaschromatographie etwa 99,89%. Tabelle 1 Einfluss der Temperatur und der Zeit auf die Reinheit der nach dem Schmelzverfahren erhaltenen festen Dispersion

Beispiel 2

Bestimmung der Lösungseigenschaften von 1-(5-Bromfur-2-yl)-2-brom-2- nitroethen im Anschluss an das Schmelzverfahren oder an das Copräzipitationsverfahren

Für die Erzielung von homogenen wässrigen Lösungen/Suspensionen des Wirkstoffes sind dessen Lösungseigenschaften von Bedeutung.
In Tabelle 2 findet sich ein Vergleich der Lösungsgeschwindigkeiten des Wirkstoffes mit Feuchthaltemittel, in mikronisiertem Zustand und bei standardmäßigen Teilchengrößen unter Verwendung einer festen Dispersion in PEG-6000 bei einem Wirkstoffgehalt von 30%. Es lässt sich feststellen, das sich die Wirkstoffeigenschaften in signifikanter Weise verbessern, wobei die Geschwindigkeit und die Homogenität der Verteilung im Kulturmedium gewährleistet werden. Tabelle 2 Bewertung der Auflösungsgeschwindigkeit von 1-(5-Bromfur-2-yl)-2-brom-2- nitroethen, das im Kulturmedium in verschiedenen Formen enthalten ist

Beispiel 3

Bestimmung der chemischen Stabilität des in PEG dispergierten/verdünnten Wirkstoffes

Die chemische Stabilität des in Polyethylenglykol gelösten/dispergierten Wirkstoffes wurde durch quantitative Gaschromatographie untersucht.
Die für eine Dauer von 385 Tagen durchgeführte Untersuchung der chemischen Stabilität ergab keine Anzeichen für eine Zersetzung. Tabelle 3 Bewertung der chemischen Lagerstabilität der festen Dispersion in PEG-6000 bei einem Wirkstoffgehalt von 30% (gaschromatische Untersuchung)

Beispiel 4

Aktivität einer Zubereitung mit einem Gehalt an 1-(5-Bromfur-2-yl)- 2-brom-2-nitroethen gegenüber ausgewählten Mikroorganismen

Nach Beendigung der Untersuchungen über die Zubereitung wurde ein in vitro-Test durchgeführt, um die Aktivität des Produkts gegen verschiedene landwirtschaftliche Pathogene und verunreinigende Mikroorganismen, die beim Verfahren zur in vitro-Züchtung von Pflanzen vorhanden sind, durchgeführt. Die Untersuchungen mit Bakterien wurden durch das Reihenverdünnungsverfahren in Teströhrchen (W. R. Bailey und E. S. Scott, Diagnostic Microbiology, 4. Auflg., S. 313-329, The C. V. Mosby Co., St. Louis, 1974) unter Modifikation gemäß E. Silveira (E. Silveira et al. Determinación de la minima concentración inhibitoria (M. C. I.) de sustancias bioactivas, Boletin Cientifico ISCM IV(2), 1986) durchgeführt. Die Wirkung gegen Pilze wurde aufgrund des Wachstumsdurchmessers von Kolonien bewertet (Casadens II: Metodo de investigaciones fitopatólogicas, Institute Iberoamericano de Cooperacion para la Agricultura, San Jose de Costa Rica, 1985) durchgeführt.
Die zur Bewertung der biologischen Aktivität des Produkts verwendeten Konzentrationen betrugen 1 bis 100 ug/ml. Das Kulturmedium, die Temperatur und die Inkubationszeiten wurden an die Bedingungen und die Eigenschaften des zu testenden Mikroorganismus angepasst. Die LD&sub5;&sub0;- Werte wurden in ug/ml gemäß dem Probit-Verfahren (D. J. Finney, Probit- Analyse, 3. Auflg., Cambridge University Press, 1971) berechnet.
Die Ergebnisse dieser Untersuchung sind in Tabelle 4 aufgeführt.

Tabelle 4

In vitro-Tests zur Ermittlung der LD&sub5;&sub0;-Werte gegen die folgenden, landwirtschaftlich bedeutenden Mikroorganismen

1.1. gram-negative Bakterien LD/50 ug/ml
1.1.1. Familie der Pseudomonadaceae
Xanthomonas vesicatoria 15-25
Pseudomonas cichorii 15-25
1.1.2. Familie der Enterobacteriaceae
Erwinia Chrysanthemi 20-30
gram-negative Bazillen (Verunreinigungen in biologischen Anlagen) 20-30
1.2. gram-positive Bakterien
1.2.1. Familie der Bacillaceae
gram-negative Bazillen (Verunreinigungen in biologischen Anlagen) 20-30
2.1. monomorphe hefeähnliche Pilze
2.1.1. Familie der Dematiaceae
Alternaria porri 1,9-2,5
Alternaria solani 1,5-2,3
2.1.2. Familie der Pythiaceae
Phythophtora parasitica 1,9-3,2
2. 1.3. Familie der Tuberculariaceae
Fusarium oxysporium 10,4-11,5
2.1.4. Familie der Melanconiaceae
Colletotrichum gloesporioides 1,0-1,8
2.1.5. Familie der Estilbaceae
Scierotium rolfii 0,2-0,9
2.1.6. Familie der Dothideaceae
Mycosphaerella mussicola 3,0-7,0
Mycosphaerella fijiensis 3,0-7,0
2.1.7. Familie der Moniliaceae
Aspergillus niger 15,5-17,5
Penicillium sp 15,6-18,5
Cladosporium sp 10,6-11,4

Beispiel 5

Bestimmung des Einflusses von 1-(5-Bromfur-2-yl)-2-brom-2-nitroethen auf Kulturmedien, die bei der in vitro-Züchtung von Pflanzen verwendet werden

Im Anschluss an den Nachweis der in vitro-Wirkung des Wirkstoffes gegen pilzliche und bakterielle Verunreinigungen bei der in vitro- Züchtung von Bananen, Kartoffeln und Zuckerrohr führten wir folgende Versuche durch.
Ein wirksames Auswaschen der Flaschen und Deckel, die bei der Herstellung von in vitro-Pflanzen verwendet wurden, wurde unter Einsatz eines Detergens durchgeführt, wobei sie mit einer ausreichenden Menge Wasser gespült wurden. Anschließend wurden die Flaschen in eine Natriumhypochloritlösung mit einer Konzentration von 0,5% für eine Zeitspanne, die nie unter 3 Minuten lag, getaucht. Sodann wurden die Flaschen umgekehrt aufgestellt und in vollständig trockenem Zustand vor Ablauf von 24 Stunden verwendet.
Nach Herstellung des Kulturmediums und Erreichen einer Temperatur von 60-80ºC wurde die Zubereitung in einer Gewichtsmenge, die zur Erzielung einer Konzentration von 35 ug/ml erforderlich war, zugegeben. 24 Stunden später wurden die erforderlichen Volumina in die einzelnen Kolben zur Durchführung des Pflanzenzüchtungsverfahrens gegeben.
Die Konzentration wurde auf der Grundlage der Wirksamkeit und des Ausbleibens von phytotoxischen Wirkungen in den untersuchten Kulturmedien ausgewählt.
Dieser Bereich betrug 1-50 ug/ml. Das Verhalten der in vitro- Kulturen von Bananen, Kartoffeln und Zuckerrohr wurde nach 72 Stunden und während der für die Züchtung erforderlichen Zeitspanne bewertet, um die folgende Subkultur im Multiplikationsmedium durchzuführen. Eine derartige Untersuchung wurde im Wurzelbildungs-Kulturmedium durchgeführt.
Die Phytotoxizität wurde unter Bewertung von Nekrose, Chlorose, Multiplikationskoeffizient und Abständen von Verbindungsstelle zu Verbindungsstelle (für Kartoffeln) bewertet. Die optimale Dosis in den drei untersuchten Kulturen betrug etwa 30 und 45 ug/ml.
Zwei Untersuchungen im vergrößerten Maßstab wurden mit einer Musa sp.-Kultur in der Multiplikationsphase durchgeführt. Der prozentuale Anteil an abgestorbenen Pflanzen während der drei Tests betrug 0,81% für die im vergrößerten Maßstab unter Zusatz des Wirkstoffes durchgeführten Versuche und l1% für das Standardverfahren.
Die bei dieser Untersuchung erzielten Ergebnisse sind in Tabelle 5 aufgeführt. Tabelle 5 Wirkung der festen Dispersion mit einem Gehalt an 1-(5-Bromfur-2- yl)-2-brom-2-nitroethen gegen verunreinigende Mikroorganismen in dem für die Herstellung von in vitro-Pflanzen von Musa sp. verwendeten Kulturmedium
Aus diesen Tests lässt sich der Schluss ziehen, dass sich die Verunreinigungen ähnlich wie bei der Kontrolle unter physikalischer Sterilisation des Kulturmediums unter Verwendung eines Autoklaven verhielten und ab dem 11. Tag zunahmen. Ferner wurde eine Zunahme des Multiplikationskoeffizienten bei Arbeiten mit dem chemischen Sterilisationsmittel festgesellt.
Das Wurzelbildungsmedium ohne Autoklavisierung und ohne Zugabe von Hormonen zur Stimulation der Wurzelbildung zeigte eine sichtbare Wirkung, die der Wirkung beim Standardverfahren überlegen war, wobei stärkere und reichlichere Wurzeln innerhalb kürzerer Zeitspannen gebildet wurden. Die nachgewiesene prozentuale Verunreinigung war im Vergleich zur Kontrolle nicht signifikant. Tabelle 6 Einfluss der festen Dispersion mit einem Gehalt an 1-(5-Bromfur-2- yl)-2-brom-2-nitroethen auf die Entwicklung von "in vitro"-Pflanzen
Zwei Untersuchungen im vergrößerten Maßstab wurden an einer Musa sp.-Kultur in der Multiplikationsphase durchgeführt.
Ferner wurde ein Test an Musa sp. mit Klonen von Gran nayne und FHIA-03 im Wurzelbildungs-Kulturmedium ohne Zugabe von die Wurzelbildung fördernden Hormonen durchgeführt (A. I. A.). Beide Klone verhielten sich in den Varianten, bei denen eine chemische Sterilisation durchgeführt worden war, besser, da eine größere Menge an stärkeren Wurzeln nach 5 Tagen beobachtet wurde, während bei der Kontrolle mit dem Standardverfahren innerhalb der gleichen Zeitspanne nur eine geringe Wurzelentwicklung festgestellt wurde.

Claims

1. Mikrobizide Zusammensetzung, umfassend 1 -(5-Bromofur-2-yl)-2-bromo-2-nitroethen, und auch ein wasserlösliches Polymer enthaltend.

2. Mikrobizide Zusammensetzung nach Anspruch 1, bei der das benutzte Polymer ein Polyethylenglykol hohen Molekulargewichts ist.

3. Mikrobizide Zusammensetzung nach Anspruch 1, bei der das benutzte Polyethlyenglykol hohen Molekulargewichts vorzugsweise ein Molekulargewicht zwischen 6000 und 20000 hat.

4. Mikrobizide Zusammensetzung nach Anspruch 3, bei der das Polyethylenglykol PEG 6000 ist.

5. Verfahren zum Erhalt der mikrobiziden Zusammensetzung nach Anspruch 1, bei dem ein Festdispersionsverfahren verwendet wird.

6. Verfahren nach Anspruch 5, bei dem, die Zusammensetzung erhalten wird durch Dispersion mittels Schmelzen.

7. Verfahren nach Anspruch 4, bei dem die Zusammensetzung erhalten wird durch gemeinsames Fällen unter Verwendung von Lösungsmitteln.

8. Verfahren nach Anspruch 7, bei dem die benutzten Lösungsmittel polare Lösungsmittel sind.

9. Verfahren nach Anspruch 8, bei dem die benutzten Lösungsmittel Ethanol, Chloroform, Methanol oder Isopropylalkohol unter anderen Lösungsmitteln sind.

10. Verwendung einer Zusammensetzung, umfassend 1-(5-Bromofur-2-yl)-2-bromo-2-nitroethen und ein Polyethylenglykol hohen Molekulargewichts als Sterilisierungsmittel für die Kontaminiationskontrolle von Kulturmedien.

11. Verwendung einer Zusammensetzung, umfassend 1-(5-Bromofur-2-yl)-2-bromo-2-nitroethen und ein Polyethylenglykol hohen Molekulargewichts als Sterilisierungsmittel zur Kontaminationskontrolle bei Kulturmedien, die bei der Herstellung von "in vitro" kultivierten Pflanzen verwendet werden.

12. Verwendung einer Zusammensetzung, umfassend 1-(5-Bromofur-2-yl)-2-bromo-2-nitroethen und ein Polyethylenglykol hohen Molekulargewichts als Verwurzelungsmittel in Kulturmedien, die bei der Herstellung von "in vitro" kultivierten Pflanzen verwendet werden.

13. Verfahren zur Sterilisierung von bei der Herstellung von "in vitro" kultivierten Pflanzen benutzten Kulturmedien, bei dem als Sterilisierungsmittel eine Zusammensetzung, umfassend 1-(5-Bromofur- 2-yl)-2-bromo-2-nitroethen und ein Polyethylenglykol hohen Molekulargewichts verwendet wird.

14. Verfahren nach Anspruch 13, bei dem das Sterilisierungsmittel gleichzeitig benutzt wird als Verwurzelungsmittel in Kulturmedien, die bei der Herstellung von "in vitro" kultivierten Pflanzen verwendet werden.

15. Verfahren nach Anspruch 13 und 14, bei dem die optimale Dosis von benutztem 1-(5-Bromofur-2-yl)-2-bromo-2- nitroethen im Bereich von 30 bis 45 ug/ml, liegt.