DE69706596T2

DE69706596T2 - Farbstoff-markiertes Antikörperkonjugat und Verfahren zu seiner Herstellung

Info

Publication number: DE69706596T2
Application number: DE69706596T
Authority: DE
Inventors: Mahito Hirai; Jinsei Miyazaki; Nobuyuki Shigetou
Original assignee: Matsushita Electric Industrial Co Ltd
Current assignee: Panasonic Corp
Priority date: 1996-04-03
Filing date: 1997-04-03
Publication date: 2002-07-11
Anticipated expiration: 2017-04-04
Also published as: EP0800083A2; EP0800083A3; US5922618A; EP0800083B1; DE69706596D1

Description

Die Erfindung betrifft ein Antikörperkonjugat, das mit einem Cyaninfarbstoff markiert ist, und ein Verfahren zur Herstellung des Antikörperkonjugats.
Farbstoffmarkierte Antikörper wurden in Analysen wie der Immunchromatographie aufgrund ihrer reaktiven Spezifität verwendet.
Cyaninfarbstoffe, die reaktive funktionelle Gruppen aufweisen, werden häufig als Farbstoff benutzt, um Antikörper zu markieren (Bioconjugate Chemistry, Vol. 4, No. 2, Seiten 105- 111, 1993). Die funktionellen Gruppen im Cyaninfarbstoff binden an Amino- oder Garboxygruppen der Antikörper zu kovalenten Bindungen. Zwanzig bis fünfzig Moleküle des Farbstoff s binden an ein Molekül des Antikörpers. Die so hergestellten farbstoffmarkierten Antikörper sind im allgemeinen leicht mit dem bloßen Auge zu erkennen. Solch farbstoffmarkierte Antikörper werden in der Immunchromatographie verwendet, zum Beispial um Spuren von einigen Bestandteilen nachzuweisen, wie menschliches Chorion-Gonadotropin (hCG), das nur im Urin von schwangeren Frauen vorhanden ist.
Jedenfalls hatten die herkömmlichen farbstoffmarkierten Antikörper eine begrenzte Fähigkeit beim Nachweis einiger Antigene. Eine geringe Konzentration von Substanzen, die nachgewiesen werden sollen, machte den Nachweis schwierig.
Um die zuvor angesprochenen Probleme zu lösen, stellt die Erfindung ein empfindlicheres farbstoffmarkiertes Antikörperkonjugat bereit, das sogar eine geringe Konzentration der gesuchten Substanzen nachweist.
Ein erster Gegenstand der Erfindung ist ein farbstoffmarkiertes Antikörperkonjugat, umfassend ein Antikörperkonjugat und einen Cyaninfarbstoff, worin das Antikörperkonjugat einen unter Verwendung eines polyfunktionellen Reagenz polymerisierten Antikörper umfaßt und das Antikörperkonjugat mit einem Cyaninfarbstoff markiert ist. Herkömmliche farbstoffmarkierte Antikörper hatten eine begrenzte Empfindlichkeit für einen zufriedenstellenden Nachweis, weil sie nur 2 Stellen zur Bindung an Antigene haben. Im Gegensatz dazu hat das erfindungsgemäße farbstoffmarkierte Antikörperkonjugat eine sehr herausragende Empfindlichkeit, weil das Antikörperkonjugat polymerisierte Antikörper umfaßt, die viele reaktive Stellen für Antigene haben. Daher weist das farbstoffmarkierte Antikörperkonjugat selbst eine geringe Konzentration der gesuchten Substanzen mit hoher Empfindlichkeit nach, wenn das erfindungsgemäße farbstoffmarkierte Antikörperkonjugat in der Immunchromatographie eingesetzt wird. Weiterhin ist das erfindungsgemäße farbstoffmarkierte Antikörperkonjugat für Biosensoren geeignet.
Die Art der Antikörper, die für diese Erfindung anwendbar sind, ist nicht besonders eingeschränkt. Unabhängig von ihrem Ursprung oder ihrer Unterklasse können alle Antikörper eingesetzt werden. Beispiele von bevorzugten Antikörpern, mit anderen Worten Immunglobuline (Tg), umfassen Maus IgG, Maus IgM, Maus IgA, Maus IgE, Ratten IgG, Ratten IgM, Kaninchen IgG. Kaninchen IgM, Ziegen IgG, Ziegen IgM, Schaf IgG und Schaf IgM. Solche Antikörper sind entweder kommerziell erhältlich oder können direkt von diesen Tieren gesammelt werden.
Bei dem ersten Gegenstand der Erfindung wird bevorzugt, daß das polyfunktionelle Reagenz Dithio-bis-(sulfosuccinimidylpropionat) (bezeichnet als DTSSP) ist.
Bei dem ersten Gegenstand der Erfindung wird bevorzugt, daß der Cyaninfarbstoff ein Cyaninfarbstoff ist, der die chemische Struktur hat, die durch die Formel I repräsentiert wird
worin X ein Halogen repräsentiert, M repräsentiert Wasserstoff oder ein Alkalimetall, und n repräsentiert eine ganze Zahl von 1 bis 4.
Rote Farbstoffe sind mit bloßem Auge leicht zu erkennen. Wann Geräte, wie Sensoren, zum Nachweis verwendet werden, sind auch andere Farbstoffe als rote nützlich.
Beispiele für das Halogen, das durch X in der Formel I repräsentiert wird, umfassen Fluor, Chlor, Brom und Iod. Beispiele für das Metall, das durch M repräsentiert wird, umfassen Lithium, Natrium und Kalium.
Bei dem ersten Gegenstand der Erfindung wird bevorzugt, daß das Antikörperkonjugat über eine kovalente Bindung an das Farbstoff-Grundgerüst des Cyaninfarbstoffs gebunden ist. Die kovalente Bindung ist üblicherweise eine kovalante Bindung zwischen Succinimidylgruppen des Cyaninfarbstoffs und Aminogruppen des Antikörpers.
Das erfindungsgemäße farbstoffmarkierte Antikörperkonjugat hat üblicherweise einen Polymerisationsgrad von 2 bis 50.
Ein zweiter Gegenstand der Erfindung ist ein Yerfahren zur Herstellung eines farbstoffmarkierten Antikörperkonjugats, umfassend die Schritte des Polymerisierens von Antikörper unter Verwendung eines polyfunktionellen Reagenz in Anwesenheit eines Puffers, der einen pH-Wert im neutralen oder leicht alkalischen Bereich hat, und Zugeben eines Cyaninfarbstoffs zu dem Puffer, um den polymerisierten Antikörper zu markieren. Phosphatpuffer-Lösung (PBS) ist ein Beispiel eines bevorzugten Puffers. Der pH-Wert des Puffers liegt normalerweise zwischen 7,0 und 8,0.
Fig. 1 ist eine perspektivische Ansicht eines Beispiels für einen immunchromatographischen Sensor als Ausführungsform der Erfindung.
Der Cyaninfarbstoff, der in der Erfindung verwendet wird, wird zum Beispiel durch Lösen eines Carboxylsäure-Derivats, das durch die Formel II repräsentiert wird, in einem organischen Lösungsmittel und anschließendes Rühren der Mischung zusammen mit Hydroxysuccinimid hergestellt.
worin X ein Halogen repräsentiert, M repräsentiert Wasserstoff oder ein Alkalimetall, und n repräsentiert eine ganze Zahl von 1 bis 4.
Formel III zeigt ein Beispiel des Reaktionsschemas zur Synthese des Cyaninfarbstoffs, der durch Formal I repräsentiert wird. Formel II
Die Synthese, die in Formel III gezeigt ist, wird nachfolgend erklärt.
Indolylsulfonat, das durch die Formel V repräsentiert wird, wird durch Lösen von Phenylhydrazinsulfonsäure, repräsentiert durch die Formel IV, und Isopropylmethylketon in einem molaren Verhältnis von 0,5 zu 2 in einem sauren Lösungsmittel, wie Essigsäure, und Erhitzen der Mischung auf etwa 70 bis 130ºC für 1 bis 5 Stunden hergestellt. Formel IV Formel V
Ein Metallsalz des Indolylsulfonats, das durch die Formel VI repräsentiert wird, wird durch Mischen einer alkoholischen Lösung, zum Beispiel Methanol-Lösung, von Indoleniumsulfonat, das durch die Formel V repräsentiert wird, und Isopropylalkohol, der mit Kaliumoxid gesättigt wurde, um das Kaliumsalz des Indoleniumsulfonats zu bilden, hergestellt. Formel VI
worin M Wasserstoff oder ein Alkalimetall repräsentiert.
Ein Metallsalz eines Carboxyalkylindolylsulfonats, das durch die Formel VII repräsentiert wird, wird durch Mischen eines Metallsalzes, das durch die Formel VI repräsentiert wird, zum Beispiel das Kaliumsalz, und einer equimolaren Menge einer halogenierten Alkylsäure, wie Iodpropionsäure, in einem organischen Lösungsmittel, wie o-Dichlorbenzol, und anschließendes Erhitzen der Mischung auf etwa 80-130ºC für 2 bis 12 Stunden, um das Kaliumsalz des Carboxyethylindolylsulfonats zu bilden, hergestellt. Dia halogenierte Alkylsäure hat im Hinblick auf die Löslichkeit in Wasser vorzugsweise 1 bis 4 Kohlenstoffatome.
Iodpropionsäure, die 3 Kohlenstoffatome hat, ist geeignet, weil sie in Wasser löslich ist und leicht mit Indolenin reagiert. Formel VII
worin X ein Halogen repräsentiert, M repräsentiert Wasserstoff oder ein Alkalimetall, und n r®präsentiert eine ganze Zahl von 1 bis 4.
Ein Carboxylsäure-Derivat, das durch die Formel II repräsentiert wird, wird durch Lösen eines Metallsalzes, das durch die Formel VII repräsentiert wird, zum Beispiel das Kaliumsalz des Carboxylethylindolylsulfonats, und Ethylorthoformiat in einem molaren Verhältnis von 0,5 zu 2 in einem basischen organischen Lösungsmittel, wie Pyridin, und Erhitzen der Mischung auf etwa 80 bis 120 W für 1 bis 3 Stunden, um ein Propionsäure-Derivat zu bilden, hergestellt.
Ein Cyaninfarbstoff, der durch die Formel I repräsentiert wird, wird durch Mischen eines Carboxylsäure-Derivats, das durch Formel II repräsentiert wird, und Hydroxysuccinimid in einem molaren Verhältnis von 0,5 zu 2 und Dicyclohexylcarbodiimid in einem molaren Verhältnis von 0,5 zu 2 als Kondensationsagenz in Lösung in einem organischen Lösungsmittel, zum Beispiel Dimethylformamid-Lösung, und anschließendes Rühren der Mischung für 2 bis 12 Stunden hergestellt.
Beispiele für das Halogen in den Formeln I, II und VII umfassen Fluor, Chlor, Brom und Iod. Beispiele für das Metallsalz in den Formeln I, II, VI und VII beinhalten Lithiumsalze, Natriumsalze und Kaliumsalze.
Polyfunktionelle Reagenzien, die für die Erfindung anwendbar sind, können ein Reagenz sein, das zumindest zwei funktionelle Gruppen in einem Molekül aufweist, von denen jede Gruppe an Protein bindet. Succinimidylester-Gruppen sind ein Beispiel für solche funktionellen Gruppen. Zusätzlich zu DTSSP umfassen die Beispiele für polyfunktionelle Agenzien für die Erfindung Bis-(sulfosuccinimidyl)suberat (BS³), repräsentiert durch die Formel VIII, Disuccinimidyltartrat (DST), repräsentiert durch die Formel IX, Ethylenglykol-bis- (succinimidylsuccinat) (EGS), repräsentiert durch die Formel X, und N-succinimidyl-3-(2-pyridylthio)propionat (SPDP), das durch die Formel XI repräsentiert wird.
Die Polymerisation von Antikörpern unter Verwendung eines Reagenz, das zumindest zwei Succinimidylester-Gruppen aufweist, wird mit Bezug auf die Formeln XII bis XV erklärt.
Formel XII zeigt, daß ein Reagenz, das zumindest zwei Succinimidylester-Gruppen aufweist, mit einem Antikörper gemischt wird. Formel XIII zeigt, daß eine Aminogruppe des Antikörpers in die Nähe einer Ester-Bindungsstelle einer der Succinimidylester-Gruppen kommt.
Wie in Formel XIV gezeigt, reagiert die Aminogruppe des Antikörpers mit der Ester-Bindungsstelle der Succinimidylester- Gruppe. Ein Wasserstoffatom wird konsequenterweise von der Aminogruppe weggenommen und dann wird Succinimid aus der Succinimidylester-Gruppe eliminiert. Als Ergebnis bildet das Succinimid zusammen mit dem Wasserstoffatom Hydroxysuccinimid. Gleichzeitig bilden die Reste der Succinimidylester- Gruppe und die Reste der Aminogruppe, die ihr Wasserstoffatom verloren hat, eine Amidbindung. Schließlich bindet das Reagenz über eine Amidbindung an den Antikörper. Formel XIV
Formel XV zeigt, daß ein anderer Antikörper in ähnlicher Weise über eine Amidbindung an die andere Succinimidylester- Gruppe bindet, weil die obige Reaktion auch an der anderen Succinimdylester-Gruppe erfolgt. Diese Reaktion geschieht in Folge, so daß Antikörper polymerisiert werden. Formel XV
Das erfindungsgemäße farbstoffmarkierte Antikörperkonjugat wird zum Beispiel hergestellt durch Lösen von Maus IgG in PBS, Zugeben von DTSSP zu der Lösung in einem molaren Verhältnis von 100, bezogen auf Maus IgG, Polymerisieren der Maus IgG, Zugeben einer PHS-Lösung eines Cyaninfarbstoffes, der durch die Formel I repräsentiert wird, zur Mischung und anschließendes Rühren der Lösung bei 4 bis 30ºC über Nacht. Ausführungsformen der Erfindung werden vorgestellt. In diesem Zusammenhang sind X und M in den Formeln 1, II, VI und VII Iod bzw. Kalium, und n ist 2. Der verwendete Antikörper war Maus IgG.

(1) Synthese des Cyaninfarbstoffs

Der Cyaninfarbstoff, der durch die Formel T repräsentiert wird, wurde durch eine Folge von Reaktionen die in Formel III gezeigt sind, wie folgt synthetisiert:

1. Synthese von Indolylsulfonat

Phenylhydrazinsulfonsäure, 10 g (53 mmol), und Isopropylmethylketon, 16,8 ml (160 mmol), wurden in 30 ml Essigsäure gelöst, gefolgt von einem 3 stündigen Rückfluß. Nach Abkühlung der Reaktionsmischung auf 0ºC und 1 Stunde stehenlassen, wurde der gebildete Feststoff durch Filtration gesammelt. Der gesammelte Feststoff wurde zweimal mit Ether gewaschen und unter vermindertem Druck getrocknet; es wurden 11,8 g Indolylsulfonat erhalten. Die Ausbeute betrug 93%. Tabelle 1 zeigt die Struktur des Indolylsulfonats, chemische Verschiebungen der NMR in Dimethylsulfoxid (DMSO) und Zuordnung der Signale. Tabelle 1

2. Synthese des Kaliumsalzes von Indolylsulfonat

Indolylsulfonat, 11,8 g (49 mmol), das in der Weise, wie unter Punkt 1. beschrieben, synthetisiert worden war, wurde in 20 ml Methanol gelöst. Es wurden etwa 300 ml mit Kaliumoxid gesättigter Isopropylalkohol zu der Mischung gegeben, gefolgt von Rühren. Der resultierende fahlgelbe Feststoff wurde durch Filtration gesammelt. Der gesammelte Feststoff wurde zweimal mit Isopropylalkohol gewaschen und unter reduziertem Druck getrocknet; es wurden 7,4 g des Kaliumsalzes von Indolylsulfonat gebildet. Die Ausbeute betrug 55%. Tabelle 2 zeigt die Struktur des Kaliumsalzes, die chemische Verschiebung des NMR in Dimethylsulfoxid (DMSO) und Zuordnung der Signale. Tabelle 2
3. Synthese des Kaliumsalzes von Carboxyethylindolylsulfonat 5,5 g (20 mmol) Kaliumsalz des Indolylsulfonats, das in der wie in obigem Punkt 2. beschriebenen Weise synthetisiert wurde, und 5 g (25 mmol) Iodpropionsäure wurden in 50 ml Orthodichlorbenzol suspendiert. Die Suspension wurde in einem Argonstrom bei 110ºC 12 Stunden gerührt. Im frühen Stadium der Reaktion bei der Temperatur wurde die Suspension in etwa 30 Minuten zu einer Lösung gelöst. Nach dem 12-stündigen Rühren wurde die Reaktionslösung auf Raumtemperatur abgekühlt und der resultierende Oberstand entfernt. Der rötliche Rückstand wurde mehrere Mal mit Isopropylalkohol und zweimal mit Ether gewaschen, gefolgt durch Trocknen unter reduziertem Druck; es wurden 8,9 g des Kaliumsalzes von Caboxyethylindolylsulfonat erhalten. Die Ausbeute betrug 93%. Tabelle 3 zeigt die Struktur des Kaliumsalzes, die chemische Verschiebung des NMR in Dimethylsulfoxid (DMSO) und Zuordnung jedes Signals. Tabelle 3
m: mehrere

4. Synthese von Carboxylsäure-Derivaten

Kaliumsalz von Carboxyethylindolylsulfonat, 5 g (11 mal), das in der wie in obigem Punkt 3. beschriebenen Weise synthetisiert wurde, wurde in 20 ml Pyridin gelöst. Zu der Lösung wurden nach und nach 3,1 g (21 mmol) Ethylorthoformiat tropfenweise über 15 Minuten zugegeben, während die Mischung unter Rückfluß im Argonstrom gehalten wurde. Die Reaktionsmischung wurde für 2 Stunden unter Rückfluß gehalten und auf Raumtemperatur abgekühlt. Zur Ausfällung wurden 80 ml Ether zu der Reaktionsmischung gegeben, der Überstand wurde entfernt. Der resultierende rötlich-braune Feststoff wurde in 10 ml Ethanol gelöst. Zu der Lösung wurden 200 ml Ether gegeben und unter Rühren wurde wieder ausgefällt. Der Feststoff wurde durch Filtration gesammelt und mit Ether gewaschen, anschließend wurde unter vermindertem Druck getrocknet; es wurden 2,5 g eines Carboxylsäure-Derivats erhalten. Die Ausbeute betrug 29%. Tabelle 4 zeigt die Struktur des Carboxylsäure-Derivats, die chemische Verschiebung des NMR in Dimethylsulfoxid (DMSO) und Zuordnung jedes Signals. Tabelle 4
m: mehrere

5. Synthese des Cyaninfarbstoffs

Carboxylsäure-Derivate, 1 g (1,2 mol), die in der unter obigem Punkt 4. beschriebenen Weise synthetisiert wurden, und Hydroxysuccinimid, 0,28 g (2,4 mmol), wurden in 20 ml Dimethylformamid gelöst. Zu der Lösung wurden nach und nach 5 ml Dimethylformamid-Lösung, die 0,49 g (0,24 nd) Dicyclohexylcarbodiimid enthielt, tropfenweise über 15 Minuten unter Rühren bei 0ºC zugegeben. Die Mischung wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Der gebildete Feststoff wurde durch Filtration entfernt. Etwa 300 ml Ether wurden zu dem Filtrat gegeben. Der resultierende rötlich-braune Feststoff wurde durch Filtration gesammelt und zweimal mit Ether gewaschen, gefolgt von Trocknen unter vermindertem Druck; es wurden 0,68 g eines Cyaninfarbstoffs erhalten, der durch die Formel I repräsentiert wird. Die Ausbeite betrug 25%. Der Cyaninfarbstoff wird hiernach als "IC3-OSu" bezeichnet. Tabelle 5 zeigt die Struktur von IC3-OSu, die chemische Verschiebung des NMR in Dimethylsulfoxid (DMSO) und Zuordnung jedes Signals. Tabelle 5
m: mehrere

Polymerisation von Maus IgG

Maus IgG, 10,g (6,667 · 10&supmin;&sup5; mmol), wurde in 1 ml PBS gelöst. Zu der Lösung wurden 0,1 ml PBS-Lösung zugegeben, die 4,057 mg (0,006667 mmol, 100 Equivalente) DTSSP (hergestellt durch Pierce Chemical Company) enthielt, während bei Raumtemperatur gerührt wurde. Nach 30-minütigen Rühren bei 35ºC wurde eine Gelfiltration mit einer Sephadex G25M Säule (hergestellt von Pharmacia) durchgeführt, es wurden ungefähr 6 ml PBS-Lösung mit aggregiertem IgG (IgG agg.) zu geben. Die Konzentration der erhaltenen Lösung wurde wie folgt bestimmt.
Die Absorption bei 280 nm wurde mit 0,5 ml der erhaltenen Lösung gemessen und betrug 2,43. Da die beobachtete Absorption bei 280 nm auf IgG zurückzuführen ist, wurde die Konzentration an IgG (IgG agg.) durch die Gleichung I ermittelt unter der Voraussetzung, daß der molare Extinktionskoeffizient von IgG bei 280 nm 2,099 · 10&sup5; betrug.
(IgG agg.] = 2,43/2,099 · 10&sup5; = 1,158 · 10&supmin;&sup5; (M) Gleichung I

(2) Farbstoffmarkierung des Antikörperkonjugats

IC3-DSu, das in der unter Punkt (1) beschriebenen Weise erhalten wurde, wurde in 0,2 ml PBS gelöst, um 27,5 mg einer. Farbstoff-Lösung herzustellen. Die Farbstoff-Lösung wird hiernach als "SLIC3" bezeichnet. SLIC3 wurde tropfenweise zu der IgG agg.-Lösung gegeben, die nach der unter Punkt (2) beschriebenen Weise erhalten wurde. Die Mischung wurde 20 Stunden bei 40C stehengelassen und dann gegen 20 Liter PBS dialysiert, um nicht umgesetzte Farbstoffmoleküle zu entfernen. Etwa 6 ml einer PBS Lösung von Antikörperkonjugat wurden dann mit SLIC3 markiert.
Die Zahl der SLIC3 Moleküle pro Molekül IgG in dem erhaltenen SLIC3-markierten Antikörperkonjugat wurde wie folgt bestimmt: Die Absorptionen bei 280 nm und 550 nm wurden zunächst mit der erhaltenen Lösung gemessen und betrugen 6,78 bzw. 38,1. Die beobachteten Absorptionen sind auf SLIC3 zurückzuführen, weil das Antikörperkonjugat keine Absorption bei 550 nm hat. Daher wurde die Konzentration von SLIC3 [SLIC3] durch die Gleichung II bestimmt unter der Voraussetzung, daß der molare Extinktionskoeffizient von SLIC3 bei 550 nm 8,55 · 10&sup4; betrug.
[SLIC3] = 38,1/8,55 · 10&sup4; = 4,46 · 10&supmin;&sup4; (M) Gleichung II
Obwohl die beobachtete Absorption bei 280 nm in der Tat durch das Antikörperkonjugat verursacht wurde, wurde die wirkliche Konzentration des Antikörperkonjugats [IgG agg.] bestimmt, indem der Einfluß der Absorption von SLIC3 bei 280 nm berücksichtigt wurde. Daher wurde die wirkliche Konzentration des Antikörperkonjugats [IgG agg.] durch die Gleichungen III und Iv bestimmt unter der Voraussetzung, daß Ab280, IgG für die Absorption bei 280 nm steht, die vom Antikörperkonjugat stammt, der molare Extinktionskoeffizient von SLIC3 bei 280 in 9,8 · 103 und der molare Extiktionskoeffizient des Antikörperkonjugats bei 280 nm 2,099 · 10&sup5; betrug.
Ab280, IgG = 6,78 - (4,46 · 10&supmin;&sup4; · 9,8 · 10³) = 2,41 Gleichung III
[IgG agg.] = 2,41/2,099 · 10&sup5; = 1,150 · 10&supmin;&sup5; (M) Gleichung IV
Schließlich wurde die Zahl der SLIC3 Moleküle, die an jedes IgG Molekül gebunden sind, durch die Gleichung V bestimmt.
[SLIC3]/[IgG agg.] = 4,46 · 10&supmin;&sup4;/1,150 · 10&supmin;&sup5; = 25,8 (Moleküle) Gleichung V

(3) Überprüfen des farbstoffmarkiertan Maus IgG Konjugats

Die Farbintensität (Empfindlichkeit) aufgrund der Aggregation des farbstoffmarkierten Antikörperkonjugats wurde durch Messung der Absorption bei 550 nm mit dem resultierenden farbstoffmarkierten Maus IgG-Konjugat für immunchromatographische Sensoren untersucht. Als Vergleichsbeispiel wurde die Farbintensität (Empfindlichkeit) aufgrund der Aggregation eines farbstoffmarkierten Antikörpers ähnlich untersucht, indem die Absorption bei 550 nm mit einem farbstoffmarkierten Antikörper, der in der gleichen Weise wie oben beschrieben hergestellt wurde, außer daß der Antikörper nicht polymerisiert wurde, gemessen wurde. Als Ergebnis der Messung wurde die Absorption des farbstoffmarkeiten Antikörperkonjugats der Ausführungsform mit etwa 0,8 bestimmt. Andererseits betrug die Absorption des farbstoffmarkierten Antikörpers aus dem Vergleichsbeispiel etwa 0,07. Das führt zu dem Schluß, daß das erfindungsgemäße farbstoffmarkierte Antikörperkonjugat eine etwa 10-fach höhere Sensitivität hat als die Sensitivität des farbstoffmarkierten Antikörpers des Vergleichsbeispiels. Die Konfiguration des imnunchromatographischen Sensors und die Messung der Absorption waren wie folgt.
(Konfiguration des immunchromatographischen Sensors) Fig. 1 zeigt ein Beispiel eines immunchromatographischen Sensors. Im immunchromatographischen Sensor 1 ist ein erstes Glasfilterpapier, die Antikörper-immunobilisierende Membran 6 und ein zweites Glasfilterpapier in dieser Reihenfolge auf einer Trägerplatte 2 angebracht. Die Antikörperimmobilisierende Membran besteht aus Nitrocellulose. Die Trägerplatte wird aus Kunststoff, wie Polyvinylchlorid, gebildet. Ein Ende des ersten Glasfilterpapiers, mit dem die Antikörper-immobilisierende Membran 6 nicht in Kontakt steht, ist der wasserverteilende Bereich 3 (linkes Ende in Fig. 1). Das Ende des ersten Glasfilterpapiers, mit dem die Antikörperim mobilisierende Membran 6 in Kontakt steht, ist der markierte Antikörper-Bereich 4, wo ein farbstoffmarkiertes Antikörperkonjugat imprägniert ist. Im Vergleichsbeispiel ist der markierte Antikörper-Bereich 4 mit farbstoffmarkiertem Antikörper imprägniert, der nicht polymerisiert ist. Der Antikörper-inmiobilisierende Bereich 5 ist durch Adsorption an einer vorbestimmten Stelle der Antikörper-immobilisierenden Membran 6 vorgesehen. Ein Antikörper, der mit dem gleichen Antigen reagieren könnte wie die farbstoffmarkierten Antikörper, wird am Antikörper-immobilisierenden Bereich 5 immobilisiert. Das zweite Glasfilterpapier fungiert als wasserabsorbierender Bereich 7.

(Messung dar Absorption)

Ein Beispiel zur Messung der Absorption mit dem Sensor 1 wird wie folgt durchgeführt. Eine Probe, wie Urin, wird zunächst auf den wasserverteilenden Bereich 3 aufgetragen. Dem Prinzip der Chromatographie folgend bewegt sich die Probe in Richtung des wasserabsorbierenden Bereichs 7 in die Richtung, die durch den Pfeil A in Fig. 1 angedeutet wird. Während sich die Probe in Richtung des wasserabsorbierenden Bereichs 7 bewegt, bindet der markierte Antikörper an das in der Probe enthaltene Antigen im markierten Antikörper-Bereich 4. Das Antigen, an das der markierte Antikörper gebunden ist, und die Probe bewegen sich in Richtung des Antikörper-immobilisierenden Bereichs 5 und das Antigen bindet an den immobilisierten Antikörper und wird dort immobilisiert. Der Antikörperimmobilisierende Bereich 5 wird mit Licht L1 bestrahlt, das eine vorbestimmte Wellenlänge wie 550 nm hat. Die Absorption wird durch Messung des von L1 reflektierten Lichtes L2 gemessen.
Wie zuvor erklärt, hat das erfindungsgemäße farbstoffmarkierte Antikörperkonjugat eine höhere Sensitivität, weil das Antikörperkonjugat viele reaktive Stellen für das Antigen hat. Daher macht das Einführen der erfindungsgemäßen Antikörperkonjugate in Sensoren, die Immunchromatographie nutzen, es möglich, empfindlichere Sensoren herzustellen als jene, die markierte Antikörper verwenden, die mit herkömmlichen Verfahren hergestellt wurden.

Claims

1. Farbstoffmarkiertes Antikörperkonjugat, umfassend ein Antikörperkonjugat und einen Cyaninfarbstoff, wobei das Antikörperkonjugat einen unter Verwendung eines polyfunktionellen Reagenzes polymerisierten Antikörper umfaßt, und das Antikörperkonjugat mit dem Cyaninfarbstoff markiert ist.

2. Farbstoffmarkiertes Antikörperkonjugat nach Anspruch 1, wobei das polyfunktionelle Reagenz Dithiobis-(sulfosuccinimidylpropionat) ist.

3. Farbstoffmarkiertes Antikörperkonjugat nach Anspruch 1, wobei der Cyaninfarbstoff ein Cyaninfarbstoff ist, der die chemische Struktur hat, die durch Formel I repräsentiert wird

worin X ein Halogen repräsentiert, M repräsentiert Wasserstoff oder ein Alkalimetall, und n repräsentiert eine natürliche Zahl von 1 bis 4.

4. Farbstoffmarkiertes Antikörperkonjugat nach Anspruch 3, wobei das Antikörperkonjugat durch kovalente Bindung an das Farbstoff-Grundgerüst des Cyaninfarbstoffs gebunden ist.

5. Verfahren zur Herstellung eines farbstoffmarkierten Antikörperkonjugats nach Anspruch 1, umfassend die Schritte des Polymerisierens von Antikörper unter Verwendung eines polyfunktionellen Reagenz in Anwesenheit eines Puffers, der einen pH-Wert im neutralen oder leicht alkalischen Bereich hat, und Zugeben eines Cyaninfarbstoffes zu dem Puffer, um den polymerisierten Antikörper zu markieren.

6. Verfahren nach Anspruch 5, wobei das polyfunktionelle Reagenz Dithio-bis-(sulfosuccinimidylpropionat) ist.

7. Verfahren nach Anspruch 5, wobei der Cyaninfarbstoff ein Cyaninfarbstoff ist, der die chemische Struktur hat, die durch Formel I repräsentiert wird.

8. Verfahren nach Anspruch 5, wobei der Puffer ein Phosphatpuffer ist.