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Die
vorliegende Erfindung betrifft ein hochwirksames Verfahren zur Reinigung
von Blut in Patienten, die von akutem Organversagen betroffen sind,
und welches ohne Schwierigkeiten in Verbindung mit anderen bekannten
Blutreinigungsverfahren verwendet werden kann. Obwohl es vorzugsweise
bei der Behandlung von akutem Organversagen angewendet wird, kann
das Verfahren gemäß der vorliegenden
Erfindung auch, möglicherweise
in Verbindung mit oder verursacht durch einen septischen Schock,
dazu verwendet werden, die Wirksamkeit bekannter Verfahren zur Behandlung
von Patienten mit chronischem Organversagen vorteilhaft verbessern.
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In
Patienten, die an Organversagen leiden, hält das Blut allmählich unendlich
große
Mengen verschiedener Substanzen zurück, die allgemein als "Toxine" bezeichnet werden,
und welche normalerweise, bei gesunden Testpersonen, von den jeweiligen
Organe aus dem Blutkreislauf eliminiert werden können. Die Anhäufung dieser
Toxine führt,
wenn es nicht behandelt wird, zu einem breiten Spektrum von Organfehlfunktionen und
möglicherweise
zum Tod; und akute Syndrome kennzeichnen sich durch einen hohen
Prozentsatz an Cytokinen unter den zu entfernenden Toxinen.
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Die
am häufigsten
verwendeten Systeme zur Reinigung des Bluts von Toxinen sind deren
Adsorption auf festen Medien (Hämo-
und Plasmaperfusion) oder Ultrafiltrieren des Bluts oder Plasmas
durch geeignete semipermeable Membranen, entweder durch Konvektion
mit Hilfe eines Druckgradienten (TMP) durch die Membran (Hämo- oder
Plasmafiltration), oder durch Diffusion, indem das Blut oder Plasma,
das zu reinigen ist, in Kontakt mit einer Seite der Membran gebracht
wird, und eine geeignet formulierte Waschlösung in Kontakt mit der Gegenseite
gebracht wird (Hämodialyse).
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Alle
obigen Systeme weisen jedoch Nachteile auf. Hämoperfusion besteht aus dem
direkten Filtrieren des Bluts durch einen Filter aus adsorbierendem
Material, der dazu höchst
biokompatibel gemacht werden muß.
Dies erreicht man gewöhnlich
durch Beschichtung der adsorbierenden Teilchen mit geeignetem Material, das
jedoch ernstlich die Fähigkeit
von Partikeln, Toxine zurückzuhalten,
beeinträchtigt.
Im Fall der Plasmaperfusion wird das Blut erst gefiltert um das
Plasma zu trennen, das man dann durch das adsorbierende Material laufen
läßt. Obwohl
dies bis zu einem gewissen Grad das Problem der Biokompatibilität während der
Perfusion löst,
kann die Zunahme der Viskosität
des Bluts während
der Filtration zu einer starken Gerinnung über die Membran führen, so
daß das
Blut auf jeden Fall mit Anticoagulantien (Heparin) behandelt werden
muß.
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Hämo- und
Plasmafiltration andererseits stehen nur für das Entfernen von Toxinen
mit großem
Molekulargewicht zur Verfügung
und bewirken einen beträchtlichen
Gewichtsverlust, welcher durch Zuführen einer Infusionslösung in
das Blut des Patienten kompensiert werden muß. Gemäß EP-A-0451429 kann das obige Problem
teilweise lösen,
indem man das Ultrafiltrat regeneriert, indem man die darin enthaltenen
Toxine mit mittelgroßem
Molekulargewicht adsorbiert, wobei man es durch Hämoperfusionsfiltereinsätze, die
auf nicht beschichteter Aktivkohle basieren, wie DETOXIL 2TM, das von SORIN BIOMEDICA von Saluggia,
Italien, hergestellt wird, basieren, filtriert, so daß das regenerierte
Ultrafiltrat, so wie es ist oder mit Zusätzen, als Infusionslösung verwendet
werden kann.
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Hämodialyse,
besonders wenn sie mit einer oder mehreren der obigen Verfahren
kombiniert ist, ist am effektivsten, weist aber verhältnismäßig lange Reinigungszeiten
auf, und kann daher kein ausreichendes Entfernen der Toxine bei
akuten Fällen
gewährleisten.
Besonders das Entfernen des Cytokine ist ziemlich schwach, so daß Organfehlfunktionen,
die durch akutes Organversagen verursacht werden, im Moment nur gehemmt
werden können,
anstelle sie vollständig
zu vermeiden.
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Es
ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung die vorher erwähnten Nachteile
zu überwinden,
wodurch ermöglicht
wird, Blut schnell und effektiv von allem und jeglichem Toxin, einschließlich der
Cytokine, zu reinigen.
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Gemäß der vorliegenden
Erfindung wird die Verwendung von nicht beschichteter Aktivkohle,
eines hydrophoben oder Ionenaustausch-Polystyrol-Harzes oder deren
Mischungen, wie in Anspruch 1 beansprucht wird, zur Verfügung gestellt.
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Eine
Vielzahl nicht einschränkender
Ausführungsformen
der vorliegenden Erfindung werden mit Hilfe von Beispielen mit Bezug
auf die beigelegten Zeichnungen beschrieben werden, worin:
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1 zeigt
schematisch einen Testkreislauf, der ein Gerät gemäß der vorliegenden Erfindung
beinhaltet, und das zum Testen des Verfahrens gemäß der Erfindung
verwendet wird;
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2 bis 7 zeigen
Testgraphen, die das Entfernen der hauptsächlich im Ultrafiltrat vorkommenden
Cytokine bei Anwendung des Kreislaufs der 1 darstellen.
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Grob
gesagt, basiert die vorliegende Erfindung auf der Beobachtung, daß nicht
beschichtete Aktivkohle – der
sich, gemäß EP-A-0451429,
als wertvolle Hilfe bei der Reinigung eines Ultrafiltrats, durch
Adsorption, von toxischen Substanzen allgemein (und β2Microglobulin
im besonderen) mit einem Molekulargewicht im besonderen im Bereich
von 300 bis 1500 Dalton (theoretisch kann das Adsorptionsspektrum
von Aktivkohle von 100 bis 20,000 Dalton reichen) und die in anormalen
Mengen in Patienten, die an chronischer Urämie leiden, vorhanden sind,
erwiesen hat, – und
kann überraschenderweise
auch dazu verwendet werden – besonders
in Verbindung mit hydrophoben und/oder Ionenaustauscherharzen – Akutpatienten
zu behandeln, um ebenfalls ein schnelles und praktisch vollständiges Entfernen
der Toxinklasse, die als Cytokine bekannt sind, und die im Moment
mit keinem anderen bekannten Verfahren oder keinem anderen Gerät effektiv
entfernt werden können,
zu ermöglichen.
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In
Anbetracht der bekannten adsorbierenden Eigenschaften von Aktivkohle
innerhalb des obigen Molekulargewichtbereichs, kann man davon ausgehen,
daß zumindest
ein Teil der Cytokine von einem Aktivkohlefilter zurückgehalten
werden, wobei das Molekulargewicht der hauptsächlich bekannten Cytokine im
Bereich zwischen 9,000 und 17,000 Da liegt (nur IL-6 weist ein Molekulargewicht
von 26,000 Da auf, d. h. es liegt außerhalb des bekannten Adsorptionsbereichs
von Aktivkohle).
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Um
die Ziele der vorliegenden Erfindung trotzdem zu erreichen, ist
es im Gegensatz zu einem lediglichen Einfangen von mindestens einem
Teil der im Blutkreislauf akuter Patienten vorhandenen Cytokine,
von entscheidender Wichtigkeit, sie so schnell wie möglich zu
eliminieren.
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Bislang
war in der vorhandenen Literatur kein Anzeichen davon zu finden,
daß Aktivkohle – besonders, wenn
sie, wie noch zu sehen sein wird, in Verbindung mit Harzen verwendet
wird – auch
in der Lage ist, ein ausreichend schnelles Entfernen der Cytokine
zu gewährleisten,
um eine effektive Behandlung akuter Patienten zu ermöglichen.
Der Dank gebührt
der Erkenntnis der Forscher des Anmelders, die diese Fähigkeit
nun jedoch ans Tageslicht gebracht haben und sie durch die Behandlung
des Blutkreislaufs akuter Patienten entsprechend einer speziellen
Sequenz optimiert haben. Zu Anfang wird eine Ultrafiltration oder
Plasmafiltration durchgeführt,
wobei der Blutstrom, der gereinigt werden soll, mit der ersten Seite
einer bekannten semipermeablen Membran, z. B. einer Polysulfonmembran
(PSF, SPAN), in Kontakt gebracht wird, wodurch ein Druckgradient
(TMP) aufrecht erhalten wird, um mit Hilfe von Konvektion auf einer
zweiten Seite der Membran gegenüber
der ersten einen Strom des Ultrafiltrats oder Plasmafiltrats aufzufangen,
das in einen Sekundärkreislauf
geführt
wird, während
der Rest des Blutstroms (Eluats) entfernt wird.
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Der
obige Schritt wird unter Verwendung einer Membran mit entsprechenden
physikalisch-chemischen und Permeabilitätseigenschaften (Porosität, Hydrophobizität, usw.)
durchgeführt,
um zu ermöglichen, daß die meisten
(im wesentlichen alle) der im ankommenden Blutstrom vorhandenen
Cytokine durch die Membran in den Ultrafiltrat-/Plasmafiltratstrom
gelangen können.
Der Ultrafiltrat-/Plasmafiltratstrom, der die Cytokine, die eliminiert
werden sollen, enthält,
wird dann aus dem Sekundärkreislauf
durch Filtervorrichtungen, die Teil des Sekundärkreislaufs sind, zugeführt und
so angeordnet, daß der
Strom, welcher die zu eliminierenden Cytokine enthält, in Kontakt
mit nicht beschichteten Aktivkohlegranula, z. B. in einer ersten
Filterkartusche (Adsorptionssäule),
oder auch mit Granula eines hydrophoben oder Ionenaustauscherharzes,
das mit den Kohlegranula vermischt ist, oder, vorzugsweise, in einer
zweiten Filterkartusche (Adsorptionssäule), die zur ersten hydraulisch
in Serie geschaltet ist, gebracht wird.
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Dies
ermöglicht
nicht nur eine schnelle Elimination der Cytokine, die in den zwei
Filtereinsätzen
zurückgehalten
werden, wodurch das Ziel der Erfindung erreicht wird, sondern auch,
wie in EP-A-0451429 beschrieben, eine Regeneration des Ultrafiltrats/Plasmafiltrats
(Aktivkohle ist auch in der Lage, jegliche andere Toxine mittleren
Molekulargewichts, wie z. B. Hippursäure, Harnsäure, β2Microglobulin, usw. zurückzuhalten), das
daher als Reinfusionslösung
verwendet werden kann und dem Eluat vom Ultrafilter/Plasmafilter
hinzugefügt
werden kann, wodurch ein gereinigter Blutstrom erzeugt wird, der
dann auf bekannte Art und Weise in den Körper des Patienten zurückgeführt wird.
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Entsprechend
der Erfindung werden die Cytokine schnell und effektiv entfernt
(und darüber
hinaus wird die Lebensdauer der Filterkartuschen des Sekundärkreislaufs
verlängert),
wenn die Aktivkohle auch in Verbindung mit einem hydrophoben Harz
verwendet wird, z. B. Harze mit einem Grundgerüst aus vernetzten, aromatischen
Polymeren, makrovernetzte und/oder makroporöse Harze, so wie die kommerziell
als AMBERLITETM (Styrol-Methacrylatharz)
und AMBERCHROMTM (Copolymer Divinylbenzol-Polystyrolharz)
bekannt und/oder ein synthetisches, kohlenstoffhaltiges Harz wie
AMBERSORBTM. Alle Harze, die von ROHM&HAAS hergestellt
und vermarktet werden und normalerweise bei der Herstellung von
Fruchtsäften
und anderen Lebensmittelprodukten verwendet werden, sind mit den
amerikanischen FDA Standards Nr. 21 CFR 173.65 konform und als nicht
toxisch klassifiziert, und können
daher auch für
medizinische Zwecke eingesetzt werden. Trotzdem war noch herauszufinden,
daß solche
Harze (die normalerweise als Füllungen
für Chromatographiesäulen oder
als immobilisierenden Zusätze
für aktive
Substanzen verwendet werden) auch effektiv – und darüber hinaus, da sie es sind – beim Zurückhalten
von Cytokinen sind, und, was weiter geht, in einem solchen Ausmaß, daß es möglich ist,
sie bei der Behandlung von Syndromen akuten Organversagens zu verwenden.
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Die
Harze, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, besitzen
eine Granulatgröße von 20 bis
100 (250–350
für AMBERLITETM) μm
(Tausendstel eines Millimeters), und eine Porosität von 100
bis 300 Angström
für AMBERCHROMTM, 30 bis 480 Angström für AMBERSORBTM,
und 130 bis 150 Angström
für AMBERLITETM.
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Unter
Bezugnahme auf 1, wurde das obige Verfahren
in dem gezeigten Kreislauf getestet und kann in das in EP-A-0451429
beschriebene Gerät
eingebaut werden, wobei man einfach die einzelnen Kartuschen mit
nicht beschichteter Aktivkohle (DETOXIL-2TM von
SORIN Biomedica von Saluggia) durch zwei getrennte Hämoperfusionskartuschen
ersetzt, die miteinander hydraulisch in Serie geschaltet sind und
jeweils mit Aktivkohle und mit einem (oder einer Mischung) der obigen
Harze gepackt sind. Die Hauptkomponenten eines solchen Geräts sind
bereits im Kreislauf der 1 dargestellt, welches einen
Haupthydraulikkreislauf 1 umfaßt, der eine Umwälzpumpe 2 und
Vorrichtungen zur Versorgung eines zu reinigenden Blutstroms darstellt, und
die, im Beispiel gezeigt, durch eine verzweigte Leitung 3,
die in einen Speicherbehälter 4,
der mit einer vorher bestimmten Menge an Blut zur Behandlung, eintaucht,
definiert sind. Der Kreislauf 1 ist mit einem Filter 5 (Ultrafilter
oder Plasmafilter) hydraulisch in Serie geschaltet, welcher eine
Filtervorrichtung darstellt, die durch eine semipermeable Membran
definiert ist, und welcher für
die Filterung des Blutstroms durch Konvektion zur Verfügung steht,
um einen Ultrafiltrat/Plasmafiltratstrom in einen Sekundärkreislauf 8 zu
bilden, der hydraulisch vom Kreislauf 1 abzweigt. Das Ultrafiltrat/Plasmafiltrat
durchfließt
Kreislauf 8 und wird mit einem Eluatstrom kombiniert, der
aus Filter 5 durch ein Ablaßrohr 9 austritt,
um einen Strom gereinigten Bluts zu bilden, der unter Verwendung
bekannter Verfahren in den Körper
des Patienten zurück
geführt
werden kann. Für
Testzwecke, im Beispiel gezeigt, treten sowohl Kreislauf 8 als
auch Rohr 9 in das Speicherbehältnis 4 aus, so daß das Blut
im Speicherbehältnis
zyklenweise eine vorher bestimmte Zeit lang chargenweise behandelt
werden kann. Sekundärkreislauf 8 zeigt
zwei Filter dar, die miteinander hydraulisch in Serie geschaltet
sind, einen ersten, der durch eine Hämoperfusionskartusche 11,
die mit nicht beschichteter Aktivkohle gepackt ist, definiert ist,
und eine zweite, die durch eine ähnliche
Kartusche 12, die mit einem (oder mehreren) der vorher
erwähnten Harze
gepackt ist, definiert ist. Die Sammelstellen 15 stehen
stromauf- und stromabwärts
der Filter 11, 12 zur Verfügung, um die Reinigung des
Bluts im Speicherbehältnis 4 überwachen
zu können.
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Wie
in den Graphen der 2 bis 7 gezeigt
und wie später
genauer beschrieben wird, ermöglicht die
vorliegende Erfindung eine schnelle, stetige Reduktion der Cytokine,
die im Blut im Speicherbehältnis 4 vorhanden
sind. Eine Vielzahl praktischer Ausführungsformen der vorliegenden
Erfindung werden nun mit Hilfe von Beispielen beschrieben.
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BEISPIEL 1
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– Charakterisierung der Adsorption
an Aktivkohle und Harzen
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Nicht
beschichtete Aktivkohle und die Harze, die in Tabelle 1 aufgelistet
sind, werden, vorgewaschen, unter Ausnutzung ihrer Schwerkraft in
kleine Säulen
(2.5 cm Länge
auf 1.2 cm Innendurchmesser), die aus Polystyrolröhrchen hergestellt
wurden, gepackt, bis zu einem Gesamtgewicht von 1.3 g. Die Harze
wurden ausreichend gewaschen und in einer 50% Lösung aus Methanol und Wasser
gelagert. Unmittelbar vor der Perfusion werden die so hergestellten
Kartuschen mit 20 Volumeneinheiten der Kartusche (20 Volumina) an
steriler, physiologischer Kochsalzlösung gewaschen und dann mit
menschlichem Plasma (10 mL) beschickt. Normales humanes Plasma wird
dann hergestellt, das 2–2.5 μCi (Microcurie) 125I markierte Cytokine enthält, wie z.
B. TNF-α (NEN-Du Pont,
spezifische Aktivität
59.2 μCi/mg),
IL-1β (Amersham,
spezifische Aktivität
3000 Ci/mmol), IL-6 (Amersham, spezifische Aktivität 1100 Ci/mmol)
und IL-8 (Amersham, spezifische Aktivität 2000 Ci/mmol). Nicht markierte
Cytokine werden zu 100 mL durchmischten Plasmas bis zur vorgegebenen
Konzentration gegeben, und spezifisch 500 pg/mL für TNF-α, 20 ng/mL
für IL-1β, 50 ng/mL
für IL-6,
und 20 ng/mL für IL-8.
Nach ausreichendem Durchmischen werden 0.2 mL des Plasmas, das die
Cytokine enthält,
in einem γ-Szintillationsmeßgerät ausgezählt. Jedes
Cytokin wird getrennt in einem sterilen, mit Einzeldurchgang versehenen
Kreislauf vom Typ der 1, bei dem Rohr 8 fehlt
und Filter 5 die (Harz- oder Kohlenstoff-) Kartusche umfaßt, die
wie oben beschrieben hergestellt wurde, untersucht. Das verwendete
Primärvolumen
des Kreislaufs beträgt
5 mL, und die Blutflußgeschwindigkeit
durch die Testkartusche wird auf 30 mL/Stunde gehalten. Aliquots
von 0.2 mL werden alle 30 Minuten stromabwärts von der Testkartusche genommen.
Die Menge an freiem Iod in den Plasmaproben wird unter Anwendung
des Perchlorsäureverfahrens
und durch Messung der Radioaktivität im Überstand bestimmt. Die Perfusion
wird gestoppt, wenn die Radioaktivität in Anzahl pro Minute (counts
per minute, c. p. m.) in den stromabwärts von der Kartusche genommenen
Proben gleich der in den Basisproben ist, da so die Sättigung
der Kartusche anzeigt wird. Die Kartuschen werden dann vom Kreislauf
getrennt, in 20 Volumeneinheiten isotonischer Kochsalzlösung gewaschen
und geöffnet.
Aliquots jedes getesteten adsorbierenden Produkts werden auf Filterpapier
getrocknet, gewogen und in Auszählröhrchen gegeben.
Die Ergebnisse werden in ng gebundenes Cytokin auf 1 g jedes adsorbierenden
Produkts angegeben, gemäß folgender
Formel: [(cpm gebunden/cpm
Basis)/mg gewogene Probe] × 100 (1)
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Die
Ergebnisse sind in Tabelle 1 gezeigt.
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BEISPIEL 2
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– Filtration/Adsorption in
einem in vitro Rezirkulationsmodell
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Vierhundert
(400) mL frisches, humanes Blut, das in ACD abgezapft wurde, werden
zu 5 mg LPS gegeben und für
4 Stunden bei 37°C
inkubiert. Das Blut wird dann recalcifiziert, zu 5 U/mL Heparin
(Liquemin, La Roche, Basel, Schweiz) gegeben und in einem geschlossenen
Kreislaufmodell wie in 1 zirkuliert. Ein Ultrafilter
(BELLCO S. p. A. HFTO4 0.5 m2 Polysulfonmembran)
wird mit der Blutseite des Bereichs des Speicherbehältnisses 4,
welches das mit LPS versetzte Blut enthält, verbunden. Das Ultrafiltrat
wird durch das Rohr 8 zugeführt, das zusammen mit einer
einzelnen Adsorberkartusche 11 oder 12, bestehend
aus 130 g Aktivkohle oder Harz, eingebaut ist. Nach Passieren der
Adsorberkartusche wird das Ultrafiltrat im Speicherbehältnis 4 rezirkuliert.
Die Blutflußgeschwindigkeit
im Hauptkreislauf wird auf 200 mL/Minute gehalten und die Flußgeschwindigkeit
des Ultrafiltrats bei 30 mL/Minute, indem der Transmembrandruck
(TMP) kontrolliert wird, und die Dauer der Rezirkulierung jedes
Tests beträgt
120 Minuten. Proben zur Bestimmung von IL-1β, TNF-α, IL-8 und den Rezeptor-Antagonisten
von IL-1 (IL-1ra) werden stromaufwärts vom Ultrafilter (als "Blutspiegel") in verschiedenen
Zeitabständen
genommen, z. B. nach 0, 5, 15, 30, 60, 90 und 120 Minuten; und weitere
Proben werden stromauf- und stromabwärts von der Adsorberkartusche
(Positionen 15) in Zeitabständen von 0, 15, 30, 60, 90
und 120 Minuten genommen. Die Blutproben werden unmittelbar danach
bei 1000 rpm 20 Minuten lang bei 4°C zentrifugiert, und das sich
erholte Plasma wird bei –80°C gelagert,
bis zur Bestimmung von IL-1β,
TNF-α, IL-8
und des Rezeptorantagonisten von IL-1 (IL-1ra) unter Verwendung
kommerziell erhältlicher ELISA-Kits
untersucht wird. Die Ergebnisse sind in den 2 bis 7 gezeigt.
Wie man sehen kann, ermöglichen
die Harze nicht nur eine höhere
Adsorption aller Cytokine verglichen mit Aktivkohle (Tabelle 1),
sondern auch eine schnellere Elimination hoher Cytokinmengen aus
dem Blut, wie man sowohl an den hohen Entfernungsprozentsätzen als
auch an den guten Clearancesniveaus sehen kann. Wie in den 2 und 3 gezeigt
ist, ermöglicht
Aktivkohle trotzdem auch allein ein ausgezeichnetes Entfernen der
Cytokine aus dem Ultrafiltrat, das nur in Bezug auf TNF-α eingeschränkt ist,
was jedoch größtenteils
von den Harzen (5) zurückgehalten wird (90%ige Eliminierung
und Clearance von 24). Daher besteht die ideale Anwendung der vorliegenden
Erfindung aus einer Doppeladsorption des Ultrafiltrats, erst auf
Kohlenstoff und dann auf Harz, möglicherweise
wird ein spezielles Harz ausgewählt
(oder eine Kombination verschiedener Harze), abhängig von den Mengen verschiedener
Cytokine, die adsorbiert werden sollen, wobei eine angemessene Lebensdauer der
Kartuschen 11 und 12 sichergestellt werden soll.
