BR9700196B1 - Dispositivo e método para a remoção extracorpórea de toxinas, em particular citoquinas, especialmente para o tratamento de pacientes afetados por insuficiência orgânica aguda - Google Patents

Description

“Dispositivo e método para a remoção extracorpórea de toxinas, em particular citoquinas, especialmente para o tratamento de pacientes afetados por insuficiência orgânica aguda”. A presente invenção refere-se a um método altamente efetivo para a purificação do sangue em pacientes afetados por uma insuficiência orgânica aguda, e que pode ser utilizado sem problemas em combinação com outros métodos conhecidos de purificação do sangue. Apesar de preferencialmente ser utilizado na insuficiência orgânica aguda, possivelmente em conjunção com ou causado por choque séptico, o método de acordo com a presente invenção pode também ser utilizado com vantagens no incremento da eficiência de métodos conhecidos para o tratamento de pacientes afetados por insuficiência orgânica crônica.

Nos pacientes que sofrem de insuficiência crônica, o corpo gradualmente vai retendo infinitas quantidades de várias substâncias conhecidas como toxinas, e que, se saudável, os órgãos do corpo teriam condições de eliminá-las da corrente sanguínea. O acúmulo de ditas toxinas, se não tratado, resulta em uma ampla gama de disfunções orgânicas e eventualmente na morte; e síndromes agudas são caracterizadas por um alto percentual de citoquinas entre as toxinas a serem removidas.

Os sistemas mais comumente utilizados para a remoção de toxinas são por adsorsão das mesmas em um meio sólido (hemo- e plasmaperfusão), ou por ultrafiltragem do sangue ou do plasma através de apropriadas membranas semipermeáveis, tanto por convecção com o auxílio de um gradiente de pressão (TMP) através da membrana (hemo ou plasmafiltração), ou por difusão colocando o sangue ou plasma a ser purificado em contato com um lado da membrana, e uma solução de lavagem apropriada em contato com o lado oposto (hemodiálise).

Todos os sistemas supra, contudo, apresentam desvantagens. A hemoperfusão consiste em filtrar o sangue diretamente através de um filtro ou material adsorvente, que portanto deve ser altamente biocompatível. Isto é normalmente conseguido cobrindo-se as partículas adsorventes com um material apropriado o qual, contudo, prejudica seriamente a capacidade de adsorsão das partículas. No caso de plasmaperfusão, o sangue é inicialmente filtrado para separar o plasma, que é então filtrado através de uma material adsorvente. Ainda que este, de certa forma resolva o problema da biocompatibilidade durante a perfusão, o aumento da viscosidade do sangue durante a filtração pode resultar em uma coagulação extensiva do sangue através da membrana, de forma que o sangue deve ser tratado com anticoagulantes (heparina).

Hemo e plasmafiltração, por outro lado, somente conseguem remover toxinas de alto peso molecular, e produz uma considerável perda de peso que deve ser compensada pela alimentação de uma solução infusora no sangue do paciente. De acordo com o pedido de patente italiano 67168-A/90 depositado em 9 de março de 1990, o problema supra pode ser parcialmente resolvido pela regeneração do ultrafiltrado, pela absorção de toxinas de peso molecular médio-alto pela sua filtragem através de cartuchos de hemoperfusão baseados em carbono ativo não recobertos, tal como DETOXIL 2 (MR), produzido pela Sorin Biomedica de Saluggia, Italia, de forma que o ultrafiltrado regenerado pode ser utilizado, nesta forma ou com adições, como uma solução de infusão. A hemodiálise, particularmente se combinada com um ou mais dentre os métodos supra, é a mais efetiva, mas é relativamente lenta em termos de tempo de purificação, e portanto falha em obter uma remoção suficiente de toxinas durante uma crise aguda. Em particular, disfunções orgânicas causadas pela insuficiência orgânica aguda somente podem ser retardadas em oposição a prevenção completa. É um objetivo da presente invenção superar os supra mencionados inconvenientes para permitir ao sangue ser efetiva e rapidamente purificado de qualquer e toda toxina, incluindo citoquiinas.

De acordo com a presente invenção, é provido um método para a purificação de uma corrente sangüínea de toxinas e citoquinas, o método comprendendo a fase de ultrafiltragem ou plasmafiltragem, a fase de purificação do ultrafiltrado ou plasmafiltrado, e a fase de compensação na qual o ultrafiltrado ou plasmafiltrado purificado é adicionado a um eluato recuperado a juzante do ultrafiltro ou plasmafiltro; caracterizado pelo fato de que a fase de ultrafiltração ou plasmafiltração é realizada de forma a permitir a passagem de citoquinas para eliminação no ultrafiltrado ou plasmafiltrado; e que a fase de purificação do ultrafiltrado ou plasmafiltrado é realizada por adsorsão, alimentando o ultrafiltrado ou plasmafiltrado a uma coluna de adsorsão na qual o material adsorvente compreende carbono ativado não recoberto e/ou resinas de poliestireno hidrofóbicas ou trocadoras de íons, preferencialmente Amberlite (MR), Amberchrom (MR), Ambersorb (MR). O ultrafiltrado ou plasmafiltrado é preferencialmente submetido a uma dupla fase de adsorsão, inicialmente através de uma coluna de carbono ativado e então através de uma coluna embalada com resina hidrofóbica ou trocadora de íons.

De acordo com a presente invenção, é também previsto um dispositivo para a purificação do sangue, particularmente para o tratamento de pacientes afetados por uma insuficiência orgânica aguda, o dispositivo compreendendo um circuito de alimentação de uma corrente sangüínea a ser purificada; um ultrafiltro ou plasmafiltro em serie com o circuito de alimentação; um circuito de coleta para a coleta do ultrafiltrado ou plasmafiltrado de dito ultrafiltro ou plasmafiltro, o circuito de coleta sendo conectado em forma de ramal em relação ao plasma- ou ultrafiltro; e meios de filtragem hidraulicamente em série com o circuito de coleta; caracterizado pelo fato de que dito plasmafiltro ou ultrafiltro permite a passagem no ultrafiltrado ou plasmafiltrado de todas as citoquinas presentes em dita corrente sanguínea; e que ditos meios filtrantes compreendem um primeiro filtro adsorvente contendo carbono ativado, e um segundo filtro adsorvente contendo uma resina de poliestireno hidrofóbica ou trocadora de íons, e localizado a juzante de dito primeiro filtro.

Em particular, a resina utilizada é um polímero aromático reticulado, macroreticulado e/ou macroporoso, ou uma resina carbonácea sintética tal como Amberlite (MR), Amberchrom (MR), Ambersorb (MR).

Realizações não limitativas da presente invenção serão descritas por meio de exemplo, com referência às figuras em anexo, nas quais: - A figura 1 mostra, esquematicamente, um circuito teste de implemento do dispositivo de acordo com a presente invenção, e utilizado para testar o método de acordo com a presente invenção; e - As figuras 2-7 mostram gráficos de teste mostrando a remoção das principais citoquinas no ultrafiltrado utilizando o circuito da figura 1.

De modo simplista, a presente invenção é baseada na observação de que o carbono ativado não recoberto [que de acordo com dito pedido de patente italiano 67168-A/90 provou um valoroso auxiíio na purificação de um ultrafiltrado, por adsorsão, de substâncias tóxicas em geral (e beta 2 microgobulina em particular) de uma amplitude de peso molecular de 300 a 1.500 Dalton (teoricamente o espectro de adsorsão do carbono ativado pode ser de 100 a 20.000 Danton) e presente em quantidades anormais em pacientes afetados com uremia crônica] pode surpreendentemente ser utilizado - particularmente em conjunção com resinas hidrofóbicas e trocadoras de íons - para o tratamento de pacientes crônicos, para também permitir a rápida e praticamente total remoção da classe de toxinas conhecidas como citoquinas, e que no presente não são efetivamente removidas por qualquer método ou dispositivo conhecido.

Em vista da notória natureza adsorvente do carbono ativado na supra gama de pesos moleculares, pode-se considerar óbvio que ao menos parte das citoquinas seriam retidas por um filtro de carbono ativado, visto que o peso molecular das principais citoquinas conhecidas está entre 9.000 e 17.000 Dalton (somente a IL-6 apresenta um peso molecular de 26.000 Danton, isto é fora do conhecido campo de adsorsão do carbono ativado). Para tingir os objetivos da presente invenção, contudo, ao contrário de uma mera captura de parte das citoquinas presentes na corrente sangüínea de pacientes agudos, é de vital importância eliminá-las tão rápido quanto possível.

Até o momento, nenhuma indicação foi dada pela literatura existente de que o carbono ativado - especialmente se utilizado, como será visto, em conjunção com resinas - seja também apto a assegurar uma remoção suficientemente rápida das citoquinas para permitir um tratamento efetivo a pacientes agudos. Graças a visão dos presentes inventores, contudo, tal capacidade foi trazida à luz e foi otimizada para o tratamento da corrente sangüínea de pacientes agudos de acordo com uma seqüência específica. Para inicia-la, é realizada uma ultrafiltragem ou plasma filtragem, na qual a corrente sangüínea a ser purificada é posta em contato com o primeiro lado de uma membrana semipermeável conhecida, por exemplo uma membrana polisulfônica (PSF, SPAN) através da qual um gradiente de pressão (TMP) é mantido para que se colete, por convecção, no segundo lado da membrana, oposto ao primeiro, uma corrente de ultrafiltrado ou plasmafiltrado, a qual é desviada a um segundo circuito enquanto que o resto da corrente sangüínea (eluato) é removido.

De acordo com a presente invenção, a fase supra é realizada utilizando-se uma membrana com tais características físico-químicas e de permeabilidade (porosidade, hidrofobia, etc.) de modo a permitir que a maioria (substancialmente todas) das citoquinas presentes na corrente sangüínea entrante passem através da membrana junto ao ultrafiltrado/plasmafiltrado. A corrente de ultrafiltrado/plasmafiltrado que contém as citoquinas a serem eliminadas é então alimentada por dito circuito secundário através de meios de filtragem que são parte do circuito secundário e que se localizam de tal forma que a corrente que contém as citoquinas a serem eliminadas é posta em contato com grânulos de carbono ativado, por exemplo no interior de um primeiro cartucho filtrante (coluna de adsorsão), assim como com grânulos de uma resina hidrofóbica ou de troca iônica misturados com os grânulos de carbono ou, preferencialmente, no interior de um segundo cartucho filtrante (coluna de adsorsão) hidraulicamente em série com o primeiro.

Isto possibilita não apenas a rápida eliminação das citoquinas, que ficam retidas nos dois cartuchos, assim atingindo o objetivo da presente invenção, mas também, como descrito no pedido de patente italiano 67168-A/90, para a regeneração do ultrafiltrado ou plasmafiltrado (carbono ativado está também apto a reter qualquer outra toxina de peso molecular médio tal como ácido hipúrico, ácido úrico, beta 2 microglubulina,etc.) que pode assim ser usado como uma solução de reinfusão e adicionado ao eluato do ultrafiltro ou plasmafiltro para formar uma corrente sangüínea purificada que é então alimentada de forma conhecida no corpo do paciente.

De acordo com a invenção, as citoquinas são removidas mais rápida e efetivamente (e acima de tudo, a vida útil dos cartuchos filtrantes do circuito secundário é estendida) se o carbono ativado é usado em conjunção com uma resina hidrofóbica, por exemplo resinas com base em um polímero aromático reticulado, macroreticulada e/ou macroporosa, tais como as comercialmente conhecidas por suas marcas Amberchron (MR) (resina estireno-metacrilato) e Amberlite (MR) (copolímero de resina divinilbenzeno-poliestireno), e/ou uma resina carbonácea sintética tal como a Ambersorb (MR). Todas estas resinas são produzidas e comercializadas pela empresa Rohm & Haas e são normalmente utilizadas na manufatura de sucos de frutas e outros produtos alimentares, classificadas como não tóxicas pelo padrão FDA Americano nr. 21 CFR 173.65, e pode portanto ser também empregada para propósitos médicos. Ainda, permanece ser descoberto que ditas resinas (que são normalmente usadas como filtros para colunas de cromatorafia ou como suportes imobilizantes para substancias ativas) são também efetivas - e mais ainda - na retenção das citoquinas, e, ainda mais, a uma taxa que permite a estas serem utilizadas no tratamento de síndromes de insuficiência orgânica aguda.

As resinas utilizadas na presente invenção apresentam um tamanho de partícula de 20 a 100 microns (250-350 para o Amberlite MR), e uma porosidade de 100 a 300 Angstrons para o Amberchron, 30 a 480 Angstrons para o Ambersorb, e 130 a 150 Angstrons para 35o Amberlite.

Com referência a figura 1, o método de acordo com a invenção foi testado no circuito mostrado, e pode ser implementado no dispositivo descrito no pedido de patente italiano 67.168-A/90 - o conteúdo do qual é incorporado ao presente para qualquer referência necessária - pela simples substituição do cartucho de carbono ativado não coberto simples (Detoxil-2 (MR) da Sorin Biomedica de Salgai) por dois cartuchos separados de hemoperfusão em série cada qual, respectivamente, contendo carbono ativado no primeiro e as supra resinas (ou mistura destas) no segundo. Os principais componentes de tal circuito são mostrados no circuito da figura 1, a qual compreende um circuito hidráulico principal (1) dotado de uma bomba de circulação (2) e meios para suprir uma corrente sanguínea a ser purificada, e que, no exemplo mostrado, é definido por um duto de ramificação (3) imerso no interior de um reservatório (4) preenchido com uma determinada quantidade de sangue para tratar. O circuito (1) é hidraulicamente conectado em série com um filtro (5) (ultrafiltro ou plasmafiltro) apresentando meios de filtragem definidos por uma membrana semipermeável, dotada para prover à filtragem de uma corrente sangüínea por convecção para formar uma corrente de ultrafiltrado ou plasmafiltrado no interior de um circuito secundário (8) hidraulicamente derivado do circuito (1). O ultrafiltrado ou plasmafilltrado flui ao longo do circuito (8) e é combinado com uma corrente de eluato, que sai do filtro (5) ao longo do tubo de descarga (9), para formar uma corrente de sangue purificado, que pode ser retro alimentada utilizando-se de meios conhecidos no corpo do paciente. Para os propósitos do teste, no exemplo mostrado, tanto o circuito (8) quanto o tubo (9) descarregam no reservatório (4), de forma que o sangue no reservatório é tratado em lotes ciclicamente por um determinado período de tempo. De acordo com a invenção, o circuito secundário (8) apresenta dois filtros hidraulicamente em série, o primeiro definido por um cartucho de hemoperfusão (11) contendo carbono ativado não recoberto, e um segundo definido por um cartucho similar (12) contendo uma ou mais das resinas supra citadas. São providos de amostragem (15) a montante e a juzante dos filtros (11,12) para monitorar a purificação do sangue do reservatório (4).

Como mostrado nas figuras 2-7, de acordo com os gráficos melhor definidos a seguir, a presente invenção permite uma rápida e ágil redução das citoquinas presentes no reservatório de sangue (4). Algumas realizações práticas da presente invenção serão descritas a seguir a título de exemplo.

Exemplo 1 - Caracterização da adsorsão pelo carbono ativado e pelas resinas: Carbono ativado não recoberto e as resinas listadas na Tabela 1 são inseridas, prelavadas, por gravidade em pequenas colunas (2,5 cm de comprimento por 1,2 cm de diâmetro interno) formadas por tubos de poliestireno, a um peso total de 1,3 g. As resinas são exaustivamente lavadas e armazenadas em uma solução a 50% de metanol e água. Imediatamente antes da perfusão, os cartuchos assim formados são lavados com 20 vezes o volume do cartucho (20 volumes) com uma solução salina fisiológica estéril e então acondicionados com plasma humano (10 ml). É então preparado plasma humano normal contendo de 2-2,5 uCi (microcurie) de 1251 de citoquinas rotuladas, tais como TNF-alfa (NEN-Du Pont, atividade especifica 59,2 uCi/mg), IL-1 Beta (Amersham, atividade específica 3000 Ci/mmol), IL-6 (Amersham, atividade específica 1100 Ci/mmol) e IL-8 (Amersahm, atividade específica 2000 Ci/mmol). Citoquinas não marcadas são adicionadas a 100 ml de plasma agitado para a concentração indicada, e especificamente 500 pg/ml para o TNF-alfa, 20 ng/ml para o IL- 1 beta, 50 ng/ml para o IL-6, e 20 ng/ml para o IL-8. Após exaustiva agitação, o,2 ml do plasma contendo as citoquinas são contados em um contador de cintilação y. Cada citoquina é estudada separadamente em um circuito estéril de passagem simples do tipo ilustrado na figura 1, no qual a ramificação (8) está ausente e o filtro (5) compreende o cartucho (resina ou carbono) preparado conforme supra descrito. O volume primário do circuito usado é 5 ml, e o fluxo de sangue através do cartucho de teste é mantido em 30 ml/hora. Amostras de 0,2 ml são tomadas abaixo do cartucho de teste a cada 30 minutos. A quantidade de iodina livre nas amostras de sangue é determinada usando o método do ácido perclórico e contagem radioativa no supernatante. A perfusão é parada quando a radioatividade c.p.m. nas amostras tomadas após o cartucho equiparam-se àquelas das amostras básicas, assim indicando a saturação do cartucho. Os cartuchos são então disconectados do circuito, lavados em 20 volumes de solução salina isotônica, e abertos. Amostras de cada produto adsorvente testado são secadas em filtro de papel, pesadas e colocadas em tubos para contagem. Os resultados estão expressos em ng de citoquina ligada a 1 g de cada produto adsorvente, de acordo com a seguinte fórmula: (1) [(cpm ligada/cpm basica)/mg da amostra pesada] x 100 Os resultados são mostrados na Tabela 1 abaixo: Tabela 1 Exemplo 2 - Filtração/Adsorção em um modelo de recirculação "in vitro". 400 ml de sangue humano fresco de ACD são adicionados a 5 ml de LPS e encubados por 4 horas a 37oC. O sangue é então recalcificado, adicionado a 5 U/ml de heparina (Liquemin, La Roche, Basle, Suiça), e circulada em um modelo de circuito fechado como na figura 1. Um ultrafiltro (Bélico SpA HFT04 0,5 m2 membrana polisulfonica) é conectada ao compartimento do lado do sangue do reservatório (4) contendo sangue alterado LPS. O ultrafiltrado é alimentado ao longo do ramal (8) dotado de um simples cartucho adsorvente (11) ou (12) de 130 g de carbono ativado ou resina. Após passar através do cartucho adsorvente o ultrafiltrado é recirculado para o reservatório (4). O fluxo de sangue no circuito principal é mantido a 200ml/minuto e o ultrafiltrado flui a uma taxa de 30 ml/minuto através do controle da pressão transmembrânica (TMP), e a duração da recirculação para cada teste é de 120 minutos. Amostras para determinar IL-151beta, TNF-alfa, IL-8 e o receptor antagonista do IL-1 (IL-1ra) são tomadas a montante do ultrafiltro (como nível de sangue) a diferentes intervalos de tempo, isto é a 0, 5, 15, 30, 60, 90 e 120 minutos; e outras amostras são tomadas a montante e a juzante do cartucho adsorvente (pontos 15) a intervalos de tempo de 0, 15, 30, 60, 90 e 120 minutos. As amostras de sangue são imediatamente centrifugadas a 1000 rpm por 20 minutos a 4oC, e o plasma recuperado é armazenado a -80oC até ensaio para determinar IL-1 beta, TNF-alfa, IL-8 e o receptor antagonista do IL- 1 25(IL-1ra) usando kits comerciais ELISA. Os resultados são mostrados nas figuras 2-7.

Como pode ser visto, as resinas não somente proveem a uma grande adsorsão de citoquinas quando comparada com o carbono ativo (Tabela 1), como também a uma mais rápida eliminação dos altos níveis de citoquina do sangue, como visto tanto pelos altos percentuais de remoção quanto pelos bons níveis de abertura. Como mostrado nas figuras 2 e 3, contudo, somente o carbono ativado também prove a um excelente remoção das citoquinas do ultrafiltrado, a qual é limitada somente para o TNF-alfa, o qual, contudo, é bem retido (figura 5) pelas resinas (90% nível de eliminação e abertura de 24). A aplicação ideal da presente invenção consiste de uma dupla adsorsão do ultrafiltrado, primeiro em carbono e então em resina, possivelmente selecionando uma resina específica (ou combinação de resinas específicas) dependendo do nível das várias citoquinas a serem adsorvidas, para assegurar uma adequada vida útil dos cartuchos (11) e (12).

Claims (12)

1. Dispositivo para a purificação do sangue, compreendendo um circuito de alimentação (1) de uma corrente sanguínea a ser purificada; um ultrafiltro ou plasmafiltro (5) em série com o circuito de alimentação (1); um circuito de coleta (8) para a coleta do ultrafiltrado ou do plasmafiltrado de dito ultrafiltro ou plasmafiltro (5), o circuito de coleta (8) sendo conectado como um ramal em relação ao plasmafiltro ou ultrafiltro (5); e meios de filtragem (11, 12) hidraulicamente em série com o circuito de coleta (8), os ditos meios de filtragem compreendendo um primeiro filtro adsorvente (11) contendo carbono ativado e o dito plasmafiltro ou ultrafiltro (5) permitindo a passagem no ultrafiltrado ou plasmafiltrado de ao menos todas as citoquinas selecionadas do grupo consistindo de IL-1 β, IL-6, IL-8, TNF e misturas destas, caracterizado pelo fato de, em combinação com o abaixo: - os ditos meios de filtragem também compreendendo um segundo filtro adsorvente (12) contendo uma resina de poliestireno hidrofóbico ou trocadora de íons, e localizado a jusante do primeiro filtro (11); - tal que o dispositivo é capaz de ser usado para o tratamento de doentes afetados com falhas agudas de órgãos.

2. Dispositivo, conforme reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a resina utilizada no segundo filtro (12) é um polímero aromático reticulado, macroreticulado e/ou macroporoso, e/ou uma resina carbonácea sintética.

3. Dispositivo, conforme reivindicações 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que ditas resinas apresentam um tamanho de partícula de 20 a 350 micra, preferencialmente de 10 a 100 ou 250 a 350 micra, e uma porosidade de 100 a 300 Angstrom.

4. Dispositivo, conforme reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que as resinas hidrofóbicas são selecionadas do grupo de resinas estireno- metacrilato e copolímeros de divinilbenzenoestireno.

5. Dispositivo, conforme reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que as resinas trocadoras de íons são selecionadas do grupo de resinas carbonáceas sintéticas.

6. Método para a remoção extracorpórea de toxinas, em particular citoquinas, o método compreendendo a fase de ultrafiltragem ou plasmafiltragem; a fase de purificação do ultrafiltrado ou plasmafiltrado; e a fase de compensação na qual o ultrafiltrado ou plasmafiltrado é adicionado a um eluato recuperado a jusante do ultrafiltro ou plasmafiltro; caracterizado pelo fato de que a fase de ultrafiltração ou plasmafiltração é realizada de forma a permitir a passagem de citoquinas para eliminação no ultrafiltrado ou plasmafiltrado; e que a fase de purificação do ultrafiltrado ou plasmafiltrado é realizada por adsorção, alimentando o ultrafiltrado ou plasmafiltrado em uma coluna de adsorção na qual o material adsorvente compreende carbono ativado não recoberto e/ou resinas de poliestireno hidrofóbicas ou trocadoras de íons.

7. Método, conforme reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o ultrafiltrado ou plasmafiltrado é submetido a uma dupla fase de adsorção, inicialmente através de uma coluna de carbono ativado e então através de uma coluna contendo ditas resinas hidrofóbicas ou trocadoras de íons.

8. Método, conforme reivindicações 6 ou 7, caracterizado pelo fato de que ditas resinas hidrofóbicas são selecionadas entre as resinas dos grupos de estireno-metacrilato e divinilbenzeno-poliestireno.

9. Método, conforme reivindicações 6 a 8, caracterizado pelo fato de que as resinas são selecionadas do grupo de resinas carbonáceas sintéticas.

10. Método, conforme reivindicações 6 a 9, caracterizado pelo fato de que são usadas resinas hidrofóbicas sintéticas.

11. Método, conforme reivindicações 6 a 10, caracterizado pelo fato de que ditas resinas estão de conformidade com o padrão 21 CFR 173.65 do FDA Americano.

12. Método, conforme reivindicações 6 a 11, caracterizado pelo fato de que ditas resinas apresentam um tamanho de partícula de 20 a 350 micra, preferencialmente de 10 a 100 ou 250 a 350 micra, e uma porosidade de 100 a 300 Angstroms.