DE69632910T3

DE69632910T3 - Cellulasen enthaltende waschmitteln

Info

Publication number: DE69632910T3
Application number: DE69632910T
Authority: DE
Inventors: Bernardus Hermanus LENTING; Rudolf Franciscus Wilhelmuscornelis Van Beckhoven; Karl-Heinz Maurer; Beatrix Kottwitz; Albrecht Weiss; Pieter Van Solingen
Original assignee: Henkel AG and Co KGaA
Current assignee: Henkel AG and Co KGaA
Priority date: 1995-04-28
Filing date: 1996-04-26
Publication date: 2009-09-24
Anticipated expiration: 2016-04-27
Also published as: DE69632910T2; WO1996034092A2; EP1275712A2; DE69632910D1; AR001733A1; AU710006B2; MX9708139A; NZ307548A; CN1185807A; KR19990008083A; EP1275712A3; EP0827534A2; ES2224169T5; EP0827534B1; DE69636606T2; EP0827534B2; ES2272620T3; AU5692796A; WO1996034092A3; ATE271127T1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung neuer Cellulasen mit verbesserten Eigenschaften in Waschmitteln und wässrigen Waschlösungen. Sie betrifft ferner Waschmittel und Waschmittelzusätze, welche diese neuartigen Cellulasen enthalten.
Cellulasen – auch als cellulolytische Enzyme bezeichnet – sind Enzyme, die zur Hydrolyse der β-D-glucosidischen Verbindungen in Zellulosen imstande sind. Die cellulolytischen Enzyme wurden traditionell in drei Klassen unterteilt: Endoglucanasen, Exoglucanasen (oder Cellobiohydralasen) und β-Glucosidasen (Knowles, J. et al. (1987), TIBTECH 5, 255–261). Cellulolytische Enzyme können durch eine Vielzahl von Bakterien, Hefen und Pilze gebildet werden. Eine Beschreibung von Mikroorganismen, die Cellulasen bilden, findet sich z. B. in GB-A-2094826 .
Für den Einsatz cellulolytischer Enzyme wurden mehrere Anwendungen entwickelt:

– Abbau von (Holz-)Zellstoff zu Zuckern zwecks (Bio-)Äthanolherstellung
– diverse Textilbehandlungsverfahren wie z. B. ”Stone Washing” und ”Biopolishing”
– Einsatz in Waschmittelzusammensetzungen

Die Verwendung von Cellulasen in Waschmittelzusammensetzungen begann mit Cellulasen, die zur Reduzierung der Härte (d. h. zum ”Weichmachen”) baumwollhaltiger Textilien imstande waren, wie z. B. in GB-B-1358599 dargelegt.
Bekanntermaßen sind Waschmittelzusammensetzungen, die Cellulasen enthalten, wirksam bei der Schmutzentfernung, d. h. Reinigung. Die Wirksamkeit cellulolytischer Enzyme (Cellulasen) bei der Reinigung von Wäschestücken ist seit geraumer Zeit anerkannt. So legen z. B. GB-A-2075028 , GB-A-2095275 und GB-A-2094826 Waschmittelzusammensetzungen offen, die Cellulase zur Optimierung ihrer Reinigungsleistung enthalten.
Vorbekannt ist ferner, das Cellulasen in Textilwaschmitteln farbauffrischend wirken können. Baumwollhaltige Textilien erscheinen nach wiederholtem Wa schen ”vergraut”, höchstwahrscheinlich infolge Störung des Faserverbunds durch die mechanische Krafteinwirkung. Das Zerren an der Faser lässt diese in Unordnung geraten und reißen. Die Verwendung von Cellulasen als Farbauffrischungsmittel für farbige Textilien wird in EP-A-0220016 beschrieben. Eigentlich werden Cellulase-Mischungen aus dem Bakterienstamm Humicola insolens (DSM 1800) in Waschmitteln gemeinhin dazu verwendet, sog. Antipilling- und Farbbelebungseffekte zu bewirken. Das von dem Mikroorganismus in seiner Wildtyp-Form gebildete cellulolytische Enzymsystem ist unter dem Handelsnamen Celluzyme^® von der Fa. Novo-Nordisk erhältlich. Auch eine geklonte (einzelne) Cellulase desselben Ursprungs, die unter dem Handelsnamen Carezyme^® angeboten wird, wird in Waschmitteln verwendet.
Der wesentliche Nachteil der vorbekannten Cellulasen mit Farbauffrischungseffekt besteht darin, dass diese Enzyme aggressiv die zellulosehaltigen Fasern angreifen, wodurch sich Schäden infolge unerwünschten Zugfestigkeitsverlusts des textilen Materials ergeben.
Anderseits zeigen die vorbekannten Cellulasen, die eine gute Reinigungswirkung aufweisen, kaum eine Farbauffrischungswirkung. Das weltweit erste handelsübliche Waschmittel mit Cellulasen enthielt eine bakterielle Cellulase. Dieses von einer Bazillenart stammende Enzym gehört zu den vorgenannten alkalischen Endoglucanasen und greift Zellulosefasern nicht an. Es heißt, dass dieses Enzym beim Waschen eine Reinigungswirkung hat. Eigenschaften, die sich auf Antipilling- oder Farbbelebungsverhalten beziehen, wurden für dieses Enzym jedoch nicht beschrieben.
Aus den vorstehenden Ausführungen wird deutlich, dass nach wie vor der Wunsch besteht, in Waschmittel-Anwendungen über verbesserte Cellulasen zu verfügen. Durch den Einsatz von Cellulase-Mischungen, wie in der internationalen Patentanmeldung WO-A-95/02675 vorgeschlagen, sollen die vorgenannten Leistungen bei der Wäschereinigung erzielbar sein. Nach unserer Kenntnis ist der Einsatz einzelner Enzyme, die beim Einsatz in der Wäschereinigung all diese Merkmale aufweisen, jedoch bisher nicht gelungen.
Überraschenderweise wurde nun festgestellt, dass bei Verwendung bestimmter einzelner Cellulasen, die eine Reinigungs-, Antiredepositions-, Farbauffrischungs- und Antipilling-Wirkung bei der Wäschereinigung aufweisen, keineswegs eine inakzeptable Schädigung der gewaschenen Textilien stattfindet.
Die vorliegende Erfindung betrifft demgemäß die Verwendung einer einzelnen Cellulase aus Bacillus sp. CBS 669.93 oder CBS 670.93, wie in den Ansprüchen definiert, bei der das Verhältnis aus Zugfestigkeitsverlust (TSL, gemäß nachstehender Begriffsbestimmung) und Antipilling-Wirkung (AP) in wässrigen Waschlösungen weniger als 1 beträgt.
Die Messung des Zugfestigkeitsverlusts (TSL, engl. Tensile Strength Loss) stellt ein Verfahren zur Ermittlung der Schädigung dar, die durch mechanische Beanspruchung oder enzymatische Einwirkung an Fasern verursacht wird. Wohlgemerkt muss es sich dabei im Rahmen der vorliegenden Erfindung um Baumwollfasern handeln. Das Verfahren misst die Zugfestigkeit einzelner Fasern im nassen Zustand. Eine Beschreibung des Verfahrens findet sich in der deutschen Norm DIN 53 857, Teil 1 sowie in der internationalen Norm ISO 2267.
Die Tatsache, dass sich der Effekt in der Regel erst nach etwa 20–25 Waschgängen nennenswert bemerkbar macht, bedeutet, dass aufgrund der mechanischen Kräfte, die bei der Wäsche auf die Baumwollfaser einwirken, stets ein gewisser Zugfestigkeitsverlust stattfindet. Es muss daher der Zugfestigkeitsverlust einer Kontrolltextilie, die ohne Cellulase, jedoch ansonsten mit derselben Waschmittelzusammensetzung und in einer gleichen Waschmaschine mit gleichem Waschprogramm gewaschen wurde, subtrahiert werden. Zur Kalibrierung der Werte wird eine Zubereitung der (einzelnen) Endoglucanase V von Humicola insolens (EG V) in gleichen Enzymproteinmengen im Waschmittel als Standard verwendet, wobei der Wert des Zugfestigkeitsverlustes bei dieser Probe abzüglich des Kontrollwerts, der mit dem cellulasefreien Waschmittel gewonnen wurde, als 100% TSL gesetzt wird. Eine Beschreibung der Cellulase EG V findet sich z. B. in der internationalen Patentanmeldung WO 91/17243 . Die Messung der Proteinmenge kann z. B. mittels des BCA-Pierce-Verfahrens erfolgen, wie es von R. E. Brown et al. in Anal. Biochem. 1989, vol. 180, S. 136–139 beschrieben wird.
Zum Vergleich eignet sich eine Zubereitung einer vorgenannten Bacillus-Cellulase, die von der Fa. Kao unter dem Handelsnamen KAC^® 500 oder KAC^® 700 angeboten wird. Diese verursacht gegenüber dem Kontrollwaschversuch ohne Cellulase allgemein einen sehr geringen Zugfestigkeitsverlust.
Durch den Angriff von Cellulasen auf vorstehende Mikrofibrillen, Faserkügelchen (sog. ”Pills”) und Baumwollflusen, die auf der Oberfläche einer Baumwolltextilie vorliegen, werden diese Pilling-Erscheinungen optisch erkennbar beseitigt. Zur Prüfung dieser Wirkung müssen Waschgänge unter Verwendung eines Waschmittels mit und ohne Cellulase durchgeführt werden, wie es im Zusammenhang mit der TSL-Bestimmung beschrieben wurde. Auch der Antipilling-Effekt ist erst nach einer zunehmenden Anzahl Waschgänge am ausgeprägtesten. In der Regel werden daher 15–40 Waschgänge verwendet, um diese Wirkung der Cellulase nachzuweisen.
Zur Quantifizierung dieses Effekts bestehen drei verschiedene Möglichkeiten:

1. Visuelle Bewertung durch eine Gruppe von Testpersonen (Panel)
2. Messung der Lichtreflexion (L-Wert des CIELAB-Systems)
3. Bestimmung der Baumwollflusen durch optische Messung

Die Bewertung anhand des L-Werts gemäß dem CIELAB-System (Commission Internationale de l’Éclairage) wurde von U. Hotz in Tenside Surf. Det. 1993, vol. 30, S. 388, beschrieben.
Die optische Messvorrichtung, die bei dem zur Bestimmung von Antipilling-Eigenschaften bevorzugten Verfahren verwendet wird, besteht aus einer Lichtquelle, einem Mikroskop-Rohr sowie einer CCD-Farbkamera, die das von der Oberfläche der Textilie zurückgeworfene Licht erfasst. Je nach der Menge der Faserkügelchen und Flusen, die auf der Oberfläche des Wäschestücks vorhanden ist, ändert sich die reflektierte Lichtmenge, die mittels digitaler Bildanalyse ermittelt wird. Mit einem solchen System lässt sich Menge der auf Textilien vorliegenden Faserkügelchen und Flusen in der Regel nach 15–40 Waschgängen quantitativ ermitteln – je nach Art und Wirkung der Cellulase, die dem Wasch mittel hinzugefügt worden ist. Ein optisches System, das zur Messung des ”Pilling”-Grades verwendbar ist, wurde von T. Müller-Kirschbaum und H. Grundmann in SÖFW, Band 118 (1992), S. 483–499 beschrieben.
Ungeachtet des Verfahrens, das zur Bestimmung der Antipilling-Wirkung der zu prüfenden Cellulase verwendet wird, muss die Standard-Cellulase EG V unter denselben Bedingungen geprüft und ihre Wirkung mittels desselben Verfahrens beurteilt werden, und zwar unter Berücksichtigung des Werts, der sich bei Verwendung des cellulasefreien Waschmittels ergeben hat. Der für EG V erhaltene Wert wird als AP = 100% gesetzt.
Wie sich aus dieser Festlegung ergibt, ist das Verhältnis des Zugfestigkeitsverlusts (TSL) zur Antipilling-Wirkung (AP) bei der vorbekannten Cellulase EG V aus Humicola insolens gleich 1. Da sich die vorgenannte Bacillus-Cellulase, die von der Kao Corp. unter dem Handelsnamen KAC^® 500 bzw. KAC^® 700 angeboten wird, durch einen niedrigen AP-Wert sowie einen überaus niedrigen TSL-Wert auszeichnet, ist das Verhältnis auch bei dieser Cellulase annähernd gleich 1. Bei Cellulasen gemäß vorstehender Definition, die erfindungsgemäß – insbesondere in Waschmitteln – verwendbar sind, ist das Verhältnis von TSL zu AP dagegen möglichst so weit wie möglich unter 1, vorzugsweise sogar kleiner als 0,8 und insbesondere innerhalb eines Wertebereichs von 0,001–0,5 angesiedelt. Ein TSL/AP-Verhältnis von 0,5 bedeutet z. B., dass bei einer Enzymkonzentration, die dieselbe Antipilling-Wirkung wie die Standardcellulase hat, nur 50% des Zugfestigkeitsverlusts (TSL) auftritt.
Die wässrige Waschlösung enthält die Cellulase gemäß vorstehender Begriffsbestimmung vorzugsweise in Konzentrationen von 0,01 mg/l–0,2 mg/l, insbesondere von 0,015 mg/l–0,1 mg/l. Die Konzentrationsangabe bezieht sich auf das Gewicht des cellulolytischen Proteins. Daneben dürfen alle in Waschlösungen normalerweise vorgefundenen Inhaltsstoffe vorhanden sein.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung sieht die Verwendung einer einzelnen Cellulase gemäß vorstehender Begriffsbestimmung mit einem TSL/AP- Verhältnis von unter 1 vor, um einen vergrauungsverhindernden Effekt auf Textilien, insbesondere farbige Textilien, auszuüben.
Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird eine einzelne Cellulase gemäß obiger Begriffsbestimmung mit einem TSL/AP-Verhältnis von unter 1 dazu verwendet, auf Textilien einen weichmachenden Effekt auszuüben.
Zudem bezieht sich die vorliegende Erfindung auf die Verwendung einer einzelnen Cellulase gemäß obiger Begriffsbestimmung mit einem TSL/AP-Verhältnis von unter 1 zu dem Zweck, auf Textilien – speziell farbige Textilien – eine farbauffrischende bzw. dem Verblassen der Farben entgegenwirkende Wirkung zu erzielen.
Zudem bezieht sich die vorliegende Erfindung auf die Verwendung einer einzelnen Cellulase gemäß obiger Begriffsbestimmung mit einem TSL/AP-Verhältnis von unter 1 mit dem Ziel, dem Verknittern von Textilien entgegenzuwirken und das Bügeln von Textilien zu erleichtern.
Wir haben festgestellt, dass die Verwendung einer einzelnen Cellulase gemäß obiger Begriffsbestimmung – im Gegensatz zu vorbekannten farbauffrischenden Cellulase-Mischungen – keine unerwünscht starke Schädigung von Baumwolle bewirkt, bei der ein Zugfestigkeitsverlust auftritt.
Weiter ist festgestellt worden, dass bei der Verwendung einer Cellulase gemäß obiger Begriffsbestimmung – anders als bei vorbekannten farbauffrischenden Cellulasen – keine Ansammlung des Enzyms auf dem Wäschestück nach wiederholtem Waschen stattfindet.
Gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung richtet sich diese auf Waschmittel-Zusammensetzungen, Waschmittelzusätze und Weichspüler-Zusammensetzungen, die eine einzelne Cellulase gemäß obiger Begriffsbestimmung enthalten.
Wie eingangs erwähnt, bezieht sich die vorliegende Erfindung allgemein auf die Verwendung neuartiger Cellulasen. Bevor die Erfindung hier detaillierter offen gelegt wird, sollen jedoch zunächst folgende Begriffe definiert werden:
”Cellulase” ist eine generische Bezeichnung für Enzyme, die auf Zellulose und deren Derivate wirken und diese zu Glucose, Cellobiose oder Cellooligosaccharide hydrolysieren.
”Wirtzelle” bezeichnet eine Zelle, die als Wirt und Expressionsvehikel für einen rekombinanten DNA-Vektor fungieren kann, der eine das native Protein oder ein Derivat kodierende DNA enthält.
Der Begriff ”Reinigung” bezeichnet die Entfernung von Schmutz, der Wäschestücken anhaftet.
Der Begriff ”Pilling” bezeichnet hier die Bildung von Faserkügelchen (”Pills”) und Flusen auf der Oberfläche baumwollhaltiger Textilien infolge gebrochener oder ungeordneter Fasern.
Mit dem Begriff ”Antipilling” ist die Verhinderung der Bildung von Faserkügelchen und Flusen auf der Oberfläche baumwollhaltiger Textilien sowie die Entfernung solcher Faserkügelchen und Flusen von der Oberfläche baumwollhaltiger Textilien gemeint. Bei der Behandlung farbiger baumwollhaltiger Gewebe führt die Antipilling-Wirkung in der Regel zu einer Farbauffrischung.
Der Begriff ”Farbauffrischung” bezeichnet in diesem Zusammenhang die Wiederherstellung des angenehm frischen Aussehens farbiger Textilien, die aus cellulosebasierten Fasern bestehen oder solche enthalten, nachdem die farbige Textilie infolge der Behandlung speziell mit Textilwaschmitteln ”vergraut” gewirkt hat.
Der Begriff ”Redeposition” bezeichnet in diesem Zusammenhang die Ablagerung von Schmutz oder Farbkomponenten, die bei der Wäsche oder Textilbehandlung aus diesen Textilien bzw. Stoffen entfernt worden sind.
Der Begriff ”Antiredeposition” bezeichnet in diesem Zusammenhang die Aktivität der Cellulase, die Wiederablagerung (Redeposition) von Schmutz oder Farbkomponenten auf dem Stoff zu verhindern oder zu verringern.
Mit ”Waschlösung” ist eine wässrige Lösung zum Reinigen, Spülen oder Konditionieren (d. h. Weichmachen) von Textilien gemeint.
In einem bevorzugten Aspekt betrifft die Erfindung die Verwendung einer Cellulase, die aus Mikroorganismen erhältlich ist, welche gemäß dem ”Budapester Vertrag über die Internationale Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen für die Zwecke von Patentverfahren” beim Central Bureau voor Schimmelcultures, Baarn/Niederlande, am 23. Dezember 1993 unter den Hinterlegungsnummern CBS 669.93 und CBS 670.93 hinterlegt wurden und in der internationalen Patentanmeldung WO-A-95/18219 beschrieben sind. Diese Stämme wurden als neue Arten der Gattung Bacillus klassifiziert, die zu keiner der derzeit bekannten rRNA-Gruppen von Bacillus gehören. Die hinterlegten Arten werden im Sinne dieser Patentanmeldung als CBS 669.93 und CBS 670.93 bezeichnet.
Erhältlich sind diese Mikroorganismen z. B. aus Wasser- und Bodenproben, die aus alkalischen Umgebungen wie z. B. alkalischen Böden und Natronseen gewonnen wurden.
Diese Mikroorganismen wurden anschließend mittels eines Agar-Diffusionstests auf Carboxymethylcellulose-Agar (CMC-Agar) durchmustert. Stämme, die bei diesem Test einen Hemmhof aufwiesen, wurden als potenziell Cellulase erzeugende Stämme isoliert. Sodann wurden genomische Gen-Bibliotheken der alkalitoleranten Cellulase-erzeugenden Stämme angelegt. Rekombinante Klone wurden einer Durchmusterung per Agar-Diffusionstest auf CMC-Agar unterzogen. Rekombinante Klone, bei denen ein Hemmhof um die Kolonie feststellbar war, wurden isoliert. Einzelne Cellulasen wurden durch Fermentierung der rekombinanten Klone in 4·YEP-Medium über 48 Std. bei 30°C erzeugt. Die so erhaltenen einzelnen Cellulasen wurden dann – ggf. gereinigt, wie in Beispiel 1 beschrieben – den vorgenannten Tests zur TSL- und AP-Bestimmung unterzogen.
Dabei wurde überraschenderweise festgestellt, dass mit den aus CBS 670.93 oder CBS 669.93 erhältlichen Cellulasen in beiden Tests gute Ergebnisse erzielt wurden, wobei das Verhältnis von TSL zu AP unter 1 lag.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird eine aus CBS 670.93 abgeleitete Cellulase von ca. 50 kD – abgeschätzt auf Grundlage der Aminosäuresequenz (SEQ ID-Nr. 2) des reifen Proteins – verwendet, die hierin als ”BCE 103” bezeichnet wird. Aus der Analyse des Gens, das die Aminosäurese quenz dieser Cellulase von ca. 50 kD codiert, ergab sich unter Verwendung des TFastA-Programms (Sequenzanalyse-Softwarepaket 6.0 der Genetic Computer Group, University of Wisconsin, Biotechnology Center, Madison, Wisconsin), wie von Pearson und Lipman in Proc. Nat. Acad. Sci., vol. 85, S. 2444–2448 (1988) beschrieben, dass diese Cellulase eine 89%-ige Sequenzgleichheit sowie eine 92,5%-ige Sequenzähnlichkeit zu der Cellulase CelA des Bacillus sp. N-4 (Fukomori et al., J. Bacter., vol. 168, S. 479–485) aufweist.
In einer gleichermaßen bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird eine aus CBS 669.93 abgeleitete Cellulase von ca. 63 kD – abgeschätzt auf Grundlage der Aminosäuresequenz des reifen Proteins – verwendet, die hierin als ”BCE 113” bezeichnet wird. Aus der Analyse des Gens, das die Aminosäuresequenz dieser Cellulase von ca. 63 kD codiert, ergab sich unter Verwendung des TFastA-Programms (Sequenzanalyse-Softwarepaket 6.0 der Genetic Computer Group, University of Wisconsin, Biotechnology Center, Madison, Wisconsin), wie von Pearson und Lipman in Proc. Nat. Acad. Sci., vol. 85 (1990), S. 2444–2448 beschrieben, dass diese Cellulase eine 58%-ige Sequenzgleichheit sowie eine 72%-ige Sequenzähnlichkeit zu der Cellulase CelB des Bacillus lautus (Jorgensen et al., Gene, vol. 93 (1990), S. 55–60) aufweist. Die Aminosäuresequenz von BCE 113 ist in SEQ ID-Nr. 3 dargestellt. Die vorliegende Erfindung umfasst weiterhin die Verwendung von Cellulasen mit einer Aminosäurensequenz, die dazu um mehr als 72%, vorzugsweise um mehr als 80% und insbesondere um mehr als 90%, identisch ist, sowie Waschmittel, die eine solche Cellulase enthalten.
Eine in erfindungsgemäßen Waschmitteln verwendbare Cellulase erzielt neben der Tatsache, das sie ein TSL/AP-Verhältnis von unter 1 liefert, in der Regel gute Ergebnisse beim Antiredepositions-Versuch, wie in Beispiel 5 beschrieben. Die Weißbeständigkeit weißer Textilien wird per Reflektanzmessung ermittelt. Je höher der Reflektanzwert, desto stärker ist die Antiredepositions-Wirkung der geprüften Cellulase. Auch bei dem in Beispiel 5 beschriebenen Weichmach-Test schneiden sie gut ab. Als ”Depilling” bezeichnet man die Entfernung ungeordneter und/oder gebrochener Fibrillen und/oder Mikrofasern, die ein farbiges baumwollhaltiges Gewebe in der Regel ”vergraut” erscheinen lassen. Je mehr dieser ungeordneten und/oder gebrochenen Fibrillen entfernt werden, desto besser das optische Erscheinungsbild der baumwollhaltigen farbigen Wäschestücke. Die ”Depilling”-Wirksamkeit kann durch Gruppen von Testpersonen beurteilt werden, ist jedoch auch mittels eines Bildanalysesystems quantifizierbar, wie oben im Zusammenhang mit der AP-Bewertung dargestellt. Cellulasen, die das oben definierte Sollverhältnis erfüllen, zeichnen sich allgemein dadurch aus, dass sie bei dem (in den Beispielen definierten) Antiredepositions-Test eine REM-Differenz von mindestens 4, vorzugsweise mindestens 5 Einheiten erzielen und ihr ”Depilling”-Ergebnis mindestens demjenigen vergleichbar ist, das mit der aus CBS 670.93 erhältlichen Cellulase erreicht wird.
Die nach der vorliegenden Erfindung verwendbaren Cellulasen sind durch einen gentechnisch entwickelten Prozess herstellbar. In einem ersten Schritt kann das Gen, das die erfindungsgemäße Cellulase codiert, mittels λ-Phagen-Vektoren (Expressionsvektoren) und E. coli-Wirtszellen kloniert werden. Alternativ ist ein PCR-Klonierungsverfahren unter Einsatz von auf konservierten Domänen konstruierten Consensus-Primern möglich. Die Expression des die erfindungsgemäße Cellulase codierenden Gens in E. coli ergibt nachweislich ein aktives Protein.
Nach einem ersten Klonierungsschritt in E. coli lässt sich ein Cellulase-Gen auf einen bevorzugteren industriellen Expressionswirt wie z. B. eine Bacillus- oder Streptomyces-Art, einen Fadenpilz wie Aspergillus oder eine Hefe übertragen. Die in diesen Wirtsorganismen erzielbare starke Expression und Sekretion erlaubt die Ansammlung der erfindungsrelevanten Cellulase in dem Fermentationsmedium, aus dem sie sich anschließend gewinnen lässt.
Die erfindungsgemäßen Cellulasen werden in Waschmitteln vorzugsweise in Mengen von 8·10^–5 Gew.-% (0,8 ppm) bis 8·10^–3 Gew.-% (80 ppm), speziell von 1·10^–4 Gew.-% (1 ppm) bis 4·10^–3 Gew.-% (40 ppm) – bezogen auf das cellulolytische Protein – verwendet. Die Waschmittel-Zusammensetzungen, die eine erfindungsgemäß definierte Cellulase enthalten, können überdies Tenside des anionischen, nichtionischen, kationischen, amphoteren oder zwitterionischen Typs sowie Mischungen dieser Tensidklassen umfassen. Überdies können erfindungsgemäße Waschmittel-Zusammensetzungen sonstige vorbekannte Waschmittel-Inhaltsstoffe wie z. B. Gerüststoffe, Bleichmittel, Bleichaktivatoren, Kor rosionsverhinderer, Sequestrierungsmittel, Soil-Release-Polymere, Duftstoffe, weitere Enzyme, Enzymstabilisatoren usw. umfassen.
Als Gerüststoffe kommen insbesondere solche in Frage, die den Klassen der Polycarboxylsäure zuzurechnen sind, insbesondere polymere Acrylsäuren, Methacrylsäuren, Maleinsäuren, Kopolymere derselben sowie oxidierte Kohlehydrate, wie in der internationalen Patentanmeldung WO-A-03/16110 beschrieben, Schichtsilikate (speziell Bentonite), Alumosilikate (speziell Zeolithe), kristalline oder amorphe Alkalimetall-Silikate (insbesondere Natriumsilikat) sowie Alkalimetall-Karbonate (insbesondere Natriumcarbonat). Die erwähnten Polycarboxylsäuren werden in der Regel in Form ihrer Alkalimetallsalze, insbesondere in Form ihrer Natrium- oder Kaliumsalze eingesetzt. Bei den vorzugsweise integrierten Zeolithen handelt es sich speziell um solche des A-, P- oder X-Typs oder Mischungen derselben. Von den Alkalimetall-Silikaten werden diejenigen bevorzugt, die ein SiO₂/Alkalimetalloxid-Molverhältnis von 1,5–3,0 aufweisen. Gerüststoffe dieser Art sind in erfindungsgemäßen Waschmitteln vorzugsweise in Mengen von 20 Gew.-% bis 80 Gew.-%, enthalten.
Nichtionische Tenside können in den erfindungsgemäßen Waschmitteln vorhanden sein, vorzugsweise in Mengen von höchstens 10 Gew.-%, noch bevorzugter von 2–6 Gew.-% (bezogen auf das Waschmittel insgesamt). Als nichtionische Tenside sind Alkyl-Polyglycoside mit 10-22 Kohlenstoffatomen in der Alkylkomponente sowie Alkoxylate (speziell Ethoxylate und/oder Propyloxylate) von linearen oder verzweigten C_10-22-Alkoholen, vorzugsweise von C_12-18-Alkoholen geeignet. Der Alkoxylationsgrad dieser Alkohole liegt dabei im Bereich von 1–20, vorzugsweise bei 3–10. Ihre Herstellung kann auf vorbekannte Weise durch Reaktion der entsprechenden Alkohole mit den entsprechenden Alkylenoxiden erfolgen. Besonders geeignet sind Fettalkohol-Derivate, wobei deren verzweigtkettige Isomere, insbesondere die sog. Oxoalkohole, zur Herstellung geeigneter Alkoxylate einsetzbar sind. Demnach sind die Ethoxylate primärer Alkohole, die lineare Dodecyl-, Tetradecyl-, Hexadecyl- oder Oxodecyl-Radikale und Mischungen derselben aufweisen, besonders zielführend. Zudem können entsprechende Ethoxylierungs- bzw. Propoxylierungsprodukte von Alkylaminen, vicinalen Dionen und Carboxylsäureamiden, die den erwähnten Alkoholen hinsicht lich der Alkylkomponente entsprechen, sowie von Akylphenolen mit 5-12 Kohlenstoffatomen in der Alkylkomponente verwendet werden.
Geeignete anionische Tenside sind insbesondere diejenigen vom Sulfat- oder Sulfonattyp, obzwar auch andere Arten – z. B. Seifen, langkettige N-Acyl-Sarkosinate, Salze von Fettsäure-Cyanamiden und Salze von Äthercarboxylsäuren, die aus langkettigen Alkyl- oder Alkylphenyl-Polyglycoläthern und Chloressigsäuren gewonnen werden können – verwendbar sind. Vorzugsweise werden anionische Tenside in Form ihrer Natriumsalze eingesetzt. Tenside sind vorzugsweise in Mengen von 2–30 Gew.-%, vorzugsweise 5–20 Gew.-% enthalten.
Besonders geeignete Tenside des Sulfattyps sind die Schwefelsäure-Monoester langkettiger primärer Alkohole natürlichen und synthetischen Ursprungs, die zwischen 10 und 20 Kohlenstoffatomen aufweisen, d. h. die Schwefelsäure-Monoester von Fettalkoholen wie z. B. Kokosnussöl-, Talgfett- oder Oleyl-Alkoholen, aber auch diejenigen der C_10-20-Oxoalkohole sowie sekundärer Alkohole von gleicher Kettenlänge. In Frage kommen insbesondere die Schwefelsäure-Monoester aliphatischer primärer Alkohole und sekundärer Alkohole sowie Alkylphenole, die mit 1–6 Mol Ethylenoxid ethyliert wurden. Auch sulfatierte Fettsäure-Alkanolamide und sulfatierte Fettsäure-Monoglyceride sind geeignet.
Bei den Tensiden vom Sulfonat-Typ handelt es sich primär um die Alkylbenzol-Sulfonate mit C_9-15-Alkylgruppen, Sulfosuccinsäure-Mono- und -Diester mit 6-22 Kohlenstoffatomen in ihren Alkoholkomponenten sowie a-Sulfofettsäureester wie z. B. die a-sulfonierten Methyl- oder Ethylester von hydriertem Kokosnussöl-, Palmkernöl- oder Talgfettsäuren. Als Sulfonat-Tenside geeignet sind ferner die durch Sulfoxidation oder Sulfochlorierung von C_12-18-Alkanen mit anschließender Hydrolyse oder Neutralisation oder durch Addition von Bisulfit zu Olefinen gewinnbaren Alkansulfonate sowie Olefinsulfonate, d. h. Mischungen aus Alken- und Hydroxyalkansulfonaten und -disulfonaten, die z. B. aus langkettigen Monoolefinen mit endständiger oder interner Doppelbindung durch Sulfonierung mit gasförmigem Schwefeltrioxid und anschließender alkalischer oder saurer Hydrolyse des Sulfonierungsprodukts darstellbar sind.
Bleichmittel werden vorzugsweise der Gruppe der persauerstoffhaltigen Verbindungen wie z. B. Wasserstoffperoxid, Alkaliperborat, Alkalipercarborat, Alkalipersilikat und/oder Alkalipersulfat entnommen. Besonders bevorzugt werden Natriumperborat-Monohydrat und Natriumpercarbonat. Bleichmittel können in Mengen von 5–25 Gew.-%, insbesondere von 7–20 Gew.-% vorhanden sein.
Zu den Bleichaktivatoren gehören insbesondere N- oder O-Acyl-Verbindungen, z. B. polyacylierte Alkylendiamine, besonders Tetraacetyl-Ethylendiamin, N-acylierte Triazine, insbesondere 1,5-Diacetyl-2,4-dioxohexahydro-1,3,5-triazin, acylierte Glycolurile, insbesondere Tetraacetyl-Glycoluril, N-acylierte Hydantoine, Hydrazide, Triazole, Urazole, Diketopiperazine, Sulfurylamide und -cyanurate, ferner Carboxyl-Anhydride, insbesondere Phthalanhydrid, Carboxylsäureester, insbesondere Natrium-Isononanoyloxybenzolsulfonat und acylierte Zuckerderivate, insbesondere Pentaacetylglucose. Der Bleichaktivator kann auf übliche Weise mit schalenbildenden Substanzen beschichtet oder – ggf. unter Zuhilfenahme von Granulationshilfsmitteln – granuliert sein und gewünschtenfalls weitere Zusätze wie z. B. Farbstoffe enthalten. Bevorzugt wird ein Bleichaktivator eingesetzt, der unter Waschbedingungen Peroxocarboxylsäuren mit 2-12 Kohlenstoffatomen bildet, insbesondere Peroxoessigsäure. Als besonders bevorzugter Bleichaktivator gilt Tetraacetylethylendiamin (TAED), granuliert mit Carboxymethylcellulose in einer mittleren Korngröße von 0,01–0,8 mm, wobei die Herstellung mittels des im Europäischen Patent EP-B-0 037 026 beschriebenen Verfahrens erfolgen kann. Neben den vorgenannten Bleichaktivatoren – bzw. auch an ihrer Stelle – sind so genannte Bleichkatalysatoren verwendbar, bei denen es sich um Übergangsmetall-Komplexe handelt.
An Enzymen können die erfindungsgemäßen Waschmittel neben der erfindungsgemäß definierten Cellulase auch Proteasen, Lipasen, Cutinasen, Amylasen, Pullulanasen, andere Cellulasen, Hemicellulasen, Xylanasen, Oxidasen und/oder Peroxidasen enthalten. Diese können in Mengen bis zu 5 Gew.-%, vorzugsweise 0,2–2 Gew.-% vorhanden sein.
Die erfindungsgemäßen Waschmittel-Zusammensetzungen können in jeder praktisch handhabbaren Form formuliert werden, z. B. als Pulver oder Flüssigkeit.
Zur Herstellung von Waschmitteln mit hoher apparenter Dichte von z. B. 650–950 g/l wird ein Verfahren mit einem Extrusionsschritt bevorzugt, wie es in dem Europäischen Patent EP-B-0 486 592 beschrieben ist.
Weichspüler-Zusammensetzungen, die die erfindungsgemäße Cellulase enthalten, können neben dieser auch kationische Tenside – vorzugsweise vom sog. Esterquat-Typ – enthalten, die die Textilien weich machen und die weichmachenden Eigenschaften der Zusammensetzungen verstärken können.
BEISPIELE
Beispiel 1: Herstellung von Cellulasen
– Durchmusterung auf Cellulase produzierende Mikroorganismen
Cellulase produzierende Mikroorganismen wurden auf zweierlei Weise isoliert:

1) Suspension der Boden- und Wasserproben in 0,85%-iger Salzlösung mit direkter Weiterverwendung in dem Agar-Diffusionstest auf Carboxymethylzellulose-Agar (CMC-Agar) zur Identifikation von Kolonien, die Cellulase erzeugten.
2) Anreicherung der Boden- und Wasserproben mit cellulasehaltigen Stämmen durch Inkubation in einem zellulosehaltigen flüssigen Minimal-Medium oder GAM-Medium während 1–3 Tagen bei 40°C. Kulturen, in denen Bakterienwachstum feststellbar war, wurden mit dem CMC-Agar-Diffusionsassay zur Identifikation Cellulase erzeugender Kolonien auf Cellulase-Aktivität analysiert.

– Isolation alkalitoleranter, cellulaseproduzierender Stämme
Stämme, bei denen im Agar-Diffusionstest Hemmhöfe festgestellt worden waren, wurden in 25 ml GAM-Medium in 100-ml-Schüttelflaschen in einem Inkubationsschüttler (New Brunswick Scientific, Edison/NJ, USA) bei 250 r. p. m. und 40°C insgesamt 72 Std. lang fermentiert. Die Bestimmung der CMCase-Aktivität erfolgte in der Kulturbrühe bei pH 9 und 40°C.
– Isolation von Cellulase-Genen
Es wurden genomische Genbibliotheken der alkalitoleranten Cellulase-produzierenden Stämme in Plasmid pTZ18R (Mead, D. A., et al. (1986), Protein Engineering 1, 67) angelegt. Rekombinante Klone wurden mittels Agar-Diffusion auf CMC-Agar durchmustert, wie von Wood, P. J., et al. (1988), Methods in Enzymology 160, 59–74, beschrieben. Stämme, bei denen Hemmhöfe um die Kolonie feststellbar waren, wurden isoliert. Die CMCase-Aktivität der rekombinanten Stämme wurde nach 48-stündiger Fermentierung bei 30°C in einem 4·YEP-Medium bestimmt. Die Plasmid-DNA der rekombinanten Stämme wurde isoliert, woraufhin die DNA-Inserts durch Restriktionsenzymanalyse und Nukleotidsequenzanalyse charakterisiert wurden.
– Medien
Das beim CMC-Agar-Diffusionstest sowie zur Anreicherung verwendete Minimal-Medium (pH 9,7) bestand aus 1% KNO₃, 0,1% Hefeextrakt (Difco), 0,1% KH₂PO₄, 0,02% MgSO₄·7H₂O, 1% Na₂CO₃, 4% NaCl und 0,25% CMC (Sigma C-4888). Zur Verfestigung wurde 1,5% Agar hinzugefügt.
Das zur Enzymproduktion der Spenderstämme dienende komplexe Medium (GAM) bestand aus Pepton (Difco) 0,5%, Hefeextrakt (Difco) 0,5%, Glucose. H₂O 1%, KH₂PO₄ 0,1%, MgSO₄·7H₂O 0,02%, Na₂CO₃ 1% und NaCl 4%. Der pH-Wert wurde mit 4 M HCl auf 9,5 eingestellt, woraufhin 1% CMC hinzugefügt wurde.
Das zur rekombinanten Enzymproduktion aus E. coli verwendete komplexe Medium (4·YEP) bestand aus 4 % Hefeextrakt (Difco), 8% Pepton (Difco), 0,2% Lactose und 100 μg/ml Ampicillin.
– CMC-Agarplatten-Diffusionsassay auf Kolonien
Zellsuspensionen in 0,85%-iger Salzlösung wurden auf CMC-haltigem Minimalmedium kultiviert. Nach 1- bis 3-tägiger Inkubation bei 40°C wurden die Platten auf Replikaplatten übertragen und die Mutterplatte jeweils 15 Minuten lang mit 0,1% Kongorot geflutet. Danach erfolgte Entfärbung der Platten mit 1 M NaCl über 30 Minuten. Stämme, bei denen ein Klärungshof um die Kolonie feststellbar war, wurden als potenziell Cellulase erzeugende Mikroorganismen isoliert.
– CMC-Agarplatten-Diffusionsassay auf flüssige Fraktionen
Proben von je 40 μl Enzymlösung oder Fermentationsbrühe wurden in Vertiefungen pipettiert, die aus einer 5-mm-Schicht des Minimal-Mediums in einer Petrischale ausgestanzt worden waren. Nach 16-stündiger Inkubation bei 40°C wurde die Cellulase-Aktivität per Kongorot/NaCl-Behandlung getestet. Der Durchmesser des Klärungshofs ist ein Maß für die CMCase-Aktivität.
– Erhaltene Cellulase
Aus den Versuchen wurde ein Cellulase erzeugender Mikroorganismus isoliert, der daraufhin als CBS 670.93 hinterlegt wurde. Er wurde als neue Art der Gattung Bacillus klassifiziert. Klonierungsversuche mit CBS 670.93 als Donorstamm führten zur Isolation eines E. coli-Klons, der zur Erzeugung einer als BCE 103 bezeichneten Cellulase imstande war. Die Nukleotid-Sequenz des diese Cellulase codierenden Gens wurde analysiert. Von der Cellulase BCE 103 wurde mittels Standardverfahren zur Gewinnung und Sequenzierung von Peptiden (Finlay & Geisow (Hsg.), Protein sequencing – a practical approach, 1989, IRL Press) die N-terminale Aminosäurensequenz bestimmt. Die Ableitung der Aminosäuresequenz erfolgte aus der Nukleotidsequenz unter Verwendung der N-terminalen Aminosäuresequenz als Ausgangspunkt des reifen Proteins.
Die Nukleotidsequenz für BCE 103 ist in SEQ ID-Nr. 1, die Aminosäurensequenz in SEQ ID-Nr. 2 dargestellt.
– Reinigung der Cellulase
Nach der Fermentierung wurden die Zellen mittels Zentrifugieren (8000 r. p. m.) aus der Kulturflüssigkeit separiert. Die Cellulase im Überstand wurde mit Ammoniumsulfat (65% gesättigt) ausgefällt. Das Präzipitat wurde in 25 mM Phosphatpuffer pH 7 + 5 mM EDTA bis zu einer Leitfähigkeit von 7 mS/cm gelöst. Die Lösung wurde auf eine Anionenaustauschsäule (Q-Sepharose FF, Durchmesser 5 cm, Länge 10 cm) aufgetragen, die daraufhin mit 25 mM Phosphatpuffer pH 7 + 5 mM EDTA bis zu einer Extinktion von 0,2 AU gewaschen wurde. Die Säule wurde über 80 Minuten mit einem Gradienten aus 0–0,5 M NaCl in 25 mM Phosphat pH 7 und anschließend über 10 Minuten mit einem Gradienten aus 0,5–1 M NaCl beaufschlagt. Je nachdem, welche Cellulase sich in der Säule befand, erfolgte die Elution im ersten oder zweiten Gradienten. Nach der Elution wurde die Säule im Aufwärtsstrom mit 1 M NaOH gereinigt und anschließend wieder mit 25 mM Phosphat pH 7 + 5 mM EDTA äquilibriert. Die erhaltene Cellulase wies je nach Elution eine Reinheit von bis zu 80% auf.
– Charakterisierung
CMCase-Assay
Tests auf Cellulase-Aktivität wurden anhand modifizierter, vom PAHBAH-Verfahren abgeleiteter Methoden durchgeführt (Lever M. Anal. Biochem. 1972, 47, 273–279 und Lever M. Anal. Biochem. 1977, 81, 21–27).
Verfahren
Ein Reaktionsgefäß wird mit 250 μl 2,5% CMC in 50 mM Glycinpuffer pH 9 (niedrigviskoses CMC, bezogen von der Fa. Sigma) und 250 μl Proben der in geeignetem Puffer gelösten Cellulase befüllt. Das Reaktionsgefäß wird 30 Minuten lang bei 40°C im Wasserbad inkubiert, woraufhin 1,5 ml einer täglich frisch angesetzten PAHBAH-Lösung (1% PAHBAH in 100 ml 0,5 M NaOH mit 100 μl Bismutlösung bestehend aus 48,5 g Bismutnitrat, 28,2 g Kaliumnatriumtartrat sowie 12,0 g NaOH in 100 ml) hinzugefügt werden. Die Mischung wird 10 Mi nuten lang bei 70°C erhitzt, dann 2 Minuten lang auf Eis gekühlt. Es wird eine Extinktionsmessung bei 410 nm vorgenommen. Um den Einfluss der Hintergrund-Extinktion der Enzymproben zu neutralisieren, wird ein Kontrollversuch wie folgt durchgeführt. Ein Röhrchen mit Substrat wird unter denselben Bedingungen wie das Versuchsröhrchen inkubiert. Nach der Inkubation werden 1,5 ml PAHBAH und das Enzympräparat hinzugefügt (in dieser Reihenfolge). Eine Einheit (U) wird als die Enzymmenge definiert, die 1 μmol Glucose aus CMC-Äquivalent (bestimmt als reduzierende Zucker pro Minute pro Gramm Produkt) erzeugt.
Der zur Bestimmung der pH/Temperatur-Profile verwendete Puffer stellt ein Phosphat/Citrat-System dar. Die Ermittlung der pH/Temperatur-Profile erfolgte anhand einer festen Enzymkonzentration, die in den linearen Bereich des bei pH 7 und 40°C gemessenen Dosis-Wirkungsprofils fällt. Diese Enzymkonzentration wurde zur Aktivitätsmessung unter allen sonstigen bestimmten Bedingungen verwendet.
Die Ergebnisse für die Cellulase BCE 103 sind in 1 dargestellt. Diese Cellulase zeichnet sich durch gute Aktivität bei alkalischen pH-Werten aus, was sie für den Einsatz in Waschmitteln mit alkalischem pH-Wert qualifiziert.
Beispiel 2
Analoge Verfahren führten auf der Basis des alkalophilen Bazillenstamms CBS 669.93 zur Gewinnung der Cellulase BCE 113. Die Ergebnisse für diese Cellulase BCE 113 sind in 2 dargestellt. Auch diese Cellulase zeigt gute Aktivität im alkalischen pH-Bereich und ist daher zur Verwendung in Waschmitteln mit alkalischem pH-Wert geeignet.
Beispiel 3: Messung von Zugfestigkeit und Antipilling-Eigenschaften
Wie bei der Beurteilung des Zugfestigkeitsverlusts (TSL) beschrieben, wurden Waschversuche durchgeführt, bei denen als Waschmittelmatrix ein Buntwaschmittel ohne Bleichmittel, Parfüm und Enzyme (105 g Waschmittel pro Wasch gang, pH 10,5) verwendet wurde. Als Waschmaschine diente ein Gerät vom Typ Miele^® W 717, Temperatur 40°C, Normalprogramm, Wasserhärte 16°dH (deutscher Härte), 3,5 kg Wäschemenge, 25-malige Wäsche.
Versuche wurden mit einer erfindungsgemäßen Zusammensetzung (D1) sowie in Vergleichen (C1 bis C3) wie folgt parallel in identischen Maschinen durchgeführt:

C1:: Waschmittel-Matrix ohne Cellulase
C2:: Waschmittel-Matrix + 0,288 mg Endoglucanase V aus Humica insolens
C3:: Waschmittel-Matrix + Cellulasemischung aus Humica insolens, kommerziell erhältlich als Granulat Celluzyme^® 0,7T.
D1:: Waschmittel-Matrix + 0,288 mg Cellulase BCE 103
D2:: Waschmittel-Matrix + 0,288 mg Cellulase BCE 113

Zusammensetzung	TSL
C1	0
C2	100
C3	38
D1	12

Bei Verwendung von Waschmaschinen des Typs Miele^® W 914 unter ansonsten identischen Bedingungen ergaben sich folgende Resultate: Tabelle 2: Ergebnisse der Messungen des Zugfestigkeitsverlusts (TSL) [%]

Zusammensetzung TSL

C1 0

C2 100

D2 0,6
Beispiel 4: Messung der Antipilling-Leistung und Berechnung des TSL/AP-Verhältnisses
Die Beurteilung der Antipilling-Leistung erfolgte mit erhöhten Cellulase-Konzentrationen zwecks besserer quantitativer Wirkungsmessung. Ein Buntwaschmittel (5 g/l, 10 Waschgange bei 40°C) mit hinzugefügter Cellulase, gemäß Tabelle 3, wurde zur Wäsche eines Sweatshirt-Baumwollstoffs eingesetzt, der (nach 25-maliger Wäsche bei 60°C mit einem Waschmittel ohne Cellulase) bereits ”Pilling” aufwies. Die Beurteilung des Pilling erfolgte anhand des oben beschriebenen optischen Messsystems. Dem Material, das das Pilling aufwies, wurde ein Pilling-Grad von 0% zugeordnet. Tabelle 3: Ergebnisse der Messungen der Antipilling-Leistung (AP)

Enzymkonzentration Pilling-Grad AP [%] von BCE 103

EG V BCE 13

25 μg/ml –12,8% –8,4% 65%

37,5 μg/ml –16,0% –9,6% 59%

50 μg/ml –22,8% –15,6% 68%
Für die Cellulase BCE 103 lässt sich ein AP-Mittelwert von 64% errechnen. Die Cellulase BCE 113 zeigte unter denselben Bedingungen eine mittlere AP-Leistung von 100%.
Anhand der TSL-Werte aus Tab. 1 und 2 ergeben sich für die verschiedenen Cellulasen die in folgender Tabelle 4 zusammengestellten TSL/AP-Verhältnisse: Tabelle 4: TSL/AP-Verhältnisse

Enzym Verhältnis

EG V 1

BCE 103 0,02

BCE 113 0,02
Beispiel 5: Weitere Testverfahren
– Prüfung des Antiredepositions-Verhaltens
20 ml 0,5% pigmentierter Rußanschmutzung (täglich frisch bereitet, bestehend aus 86% Kaolin, 8% Ruß (Flammruß 101, bezogen von Degussa AG), 4% Eisenoxidschwarz und 2% Eisenoxidgelb (von Henkel Genthin GmbH) wurde in einem Waschmittel (Persil color^® ohne Enzyme, 5 g/l, pH 8,5) unter Rühren (90 r. p. m.) mit einem weißen Baumwollstoff (vorgewaschen, Durchmesser 5 cm, Bezugsquelle: Windelbleiche, Krefeld) inkubiert. Sodann wurde Cellulase bis zu einer Endkonzentration von 1 mU/ml hinzugefügt. Diese Mischung wurde 30 Minuten lang bei 40°C und 90 r. p. m. inkubiert. Zur Kontrolle wurde dieselbe Inkubation ohne Beimischung von Cellulase durchgeführt. Im Anschluss an die Inkubation wurde das textile Material unter fließendem kalten Wasser gründlich ausgespült. Nach der Trocknung wurde die Weiße des Stoffs unter Verwendung eines Kolorimeters vom Typ Dr. Lange^® Micro Color per Remissionsmessung ermittelt (4 Messungen pro Materialprobe). Der Kontrollwert wurde vom Probenwert in Abzug gebracht. Die Ergebnisse (als REM-Differenzwert) sind in Tabelle 5 dargestellt.
– Prüfung der Faserschädigung
Ein Wattebausch (100% Baumwolle, Warenhandels-GmbH, Buchholz, Marke Oliva, Vertrieb: ALDI) wurde in 40 ml Waschflotte (Persil color^® ohne Enzyme, 5 g/l, pH 8,5) inkubiert und nach Hinzufügung von Cellulase in einer Endkonzentration von 1 mU/ml in einer dicht verschlossenen Flasche 20 Stunden lang bei 40°C unter Rühren (90 r. p. m.) inkubiert. Im Anschluss an die Inkubation wurde anhand des in Beispiel 1 dargestellten PAHBAH-Verfahrens die Faserschädigung durch Ermittlung der in Lösung befindlichen Menge reduzierender Zucker bewertet. In einem Kontrollversuch wurde dieselbe Inkubation ohne Hinzufügung von Cellulase durchgeführt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 5 zusammengefasst.
– Adsorptionsversuch
Aus einem weißen Baumwollstoff (Windelbleiche, Bielefeld), vorgewaschen mit deutschem Persil^® ohne Enzyme bei 60°C, wurden runde Stücke von 9 cm Durchmesser (ca. 0,920 g) geschnitten. Ein Stoffstück wurde 60 Minuten lang bei 30°C in 50 ml eines 50 mM Glycin-NaOH-Puffers (pH 9) mit 0,1% SDS und 1 ml einer Cellulaseprobe (600 mU/ml) inkubiert. Aus dem Inkubat wurden bei T = 0 und T = 60 Minuten jeweils 2-ml-Proben gezogen und direkt im Verhältnis 1:2 mit 50 mM MES-Puffer (pH 6,5) verdünnt und bis zur Messung bei 4°C gelagert. In einem Kontrollversuch wurde dieselbe Inkubation ohne Hinzufügung des Baumwollstoffs durchgeführt. Die Aktivitätsmessung wurde mit Hilfe eines PAHBAH-Verfahrens gemäß der Beschreibung in Beispiel 3, jedoch bei pH 6,5 in einem 50 mM MES-Puffer durchgeführt. Die Adsorption wurde als relative Adsorption ausgedrückt, wobei die zu Versuchsbeginn (T = 0) eingebrachte Aktivität als 100% gesetzt wurde. Aus dem 100%-Aktivitätswert ergibt sich durch Abzug der Restaktivität (in %) die Adsorption (in %). Die Ergebnisse sind in Tabelle 5 dargestellt. Tabelle 5: Ergebnisse des Andiredepositions-, Faserschädigungs- und Adsorptionsversuchs

Enzym Antiredeposition (ΔREM) Faserschädigung [mU] Adsorption

BCE 103 5,0 0,025 7

KAC^® ^a) 7,5 0,006 0

EG V 1,2 0,155 36

a) Cellulase der Fa. Kao

Die Leistungen der Cellulase BCE 113 waren in diesen Versuchen derjenigen der Cellulase BCE 103 mindestens gleichwertig.
– Weichmachversuch
Die Weichheit von gemäß Beispiel 3 behandelten Textilproben wurde (allerdings nach 15 Waschgängen) von einer aus 5 Personen bestehenden Expertengruppe durch Befühlen auf einer Skala von 0 (25 Waschgänge in cellulasefreiem Waschmittel) bis 6 (ungewaschene Probe) beurteilt. Zum Waschen wurden die in Beispiel 2 definierten Zusammensetzungen verwendet. Die durchschnittlichen Bewertungen sind in Tab. 6 dargestellt. Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen zeigten erkennbar die besten Leistungen. Tabelle 6: Ergebnisse des Weichmachversuchs

Zusammensetzung Note

C1 0

C2 2,1

C3 1,5

D1 2,3

D2 2,2
Erklärung zu den Abbildungen
1 zeigt die relativen Aktivitäten der Cellulase BCE 103. Auf diese Grafik wird in Beispiel 1 als pH/Temperatur-Profil verwiesen. Alle Aktivitäten sowohl für 40°C als auch für 60°C sind auf die als 100% gesetzte maximale Aktivität bezogen.
2 zeigt die relativen Aktivitäten der Cellulase BCE 113.
3 zeigt die DNA-Sequenz (SEQ ID-Nr. 1) sowie die abgeleitete Aminosäurensequenz (SEQ ID-Nr. 2) der aus CBS 670.93 gewonnenen 50-kD-Cellulase. Die Leader-Peptid-Sequenz, die nach Sekretion zu dem reifen Enzym aufgespalten wird, ist schattiert dargestellt.
4 zeigt die DNA-Sequenz (SEQ ID-Nr. 4) sowie die abgeleitete Aminosäurensequenz (SEQ ID-Nr. 3) der aus CBS 669.93 gewonnenen 63-kD-Cellulase. Die Leader-Peptid-Sequenz, die nach Sekretion zu dem reifen Enzym aufgespalten wird, ist unterstrichen dargestellt.

Claims

Verwendung einer einzelnen Cellulase, die eine Aminosäuresequenz mit mehr als 72% Sequenzidentität zu der im Folgenden aufgeführten Aminosäuresequenz (BCE 113):

oder mit der im Folgenden aufgeführten Aminosäuresequenz (BCE 103):

mit einem Verhältnis zwischen Zugfestigkeitsverlust (Tensile Strength Loss, TSL) und Antipilling-Eigenschaften (AP) von unter 1 in wässrigen Waschlösungen aufweist.
Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die wässrige Waschlösung die Cellulase in Konzentrationen von 0,01 mg/l bis 0,2 mg/l, insbesondere 0,015 mg/l bis 0,1 mg/l, umfasst.
Verwendung einer einzelnen Cellulase nach Anspruch 1, um eine vergrauungsinhibierende Wirkung auf Textilien, insbesondere farbige Textilien, auszuüben.
Verwendung einer einzelnen Cellulase nach Anspruch 1, um eine weich machende Wirkung auf Textilien auszuüben.
Verwendung einer einzelnen Cellulase nach Anspruch 1, um eine Farbauffrischung an Textilien, insbesondere farbigen Textilien, zu bewirken.
Verwendung einer einzelnen Cellulase nach Anspruch 1, um eine Farbverschlechterung von Textilien, insbesondere farbigen Textilien, zu hemmen.
Verwendung einer einzelnen Cellulase nach Anspruch 1, um das Verknittern von Textilien zu hemmen und das Bügeln von Textilien zu erleichtern.
Verwendung nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass das Verhältnis zwischen TSL und AP unter 0,8 liegt.
Verwendung nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass das Verhältnis zwischen TSL und AP im Bereich von 0,001 bis 0,5 liegt.
Verwendung nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Cellulase eine Aminosäuresequenz mit mehr als 90% Sequenzidentität zu der in Anspruch 1 angegebenen Aminosäuresequenz für BCE 113 aufweist.
Verwendung nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Cellulase die im Folgenden aufgeführte Aminosäuresequenz aufweist:
Verwendung nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Cellulase die im Folgenden aufgeführte Aminosäuresequenz aufweist:
Waschmittelzusammensetzung, die eine einzelne Cellulase nach einem der Ansprüche 1 oder 10 bis 12 mit einem Verhältnis zwischen Zugfestigkeitsverlust (Tensile Strength Loss, TSL) und Antipilling-Eigenschaften (AP) von unter 1 in wässrigen Waschlösungen aufweist.
Waschmittelzusammensetzung nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass sie 0,8 ppm bis 80 ppm der Cellulase umfasst.
Waschmittelzusammensetzung nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass sie 1 ppm bis 40 ppm der Cellulase umfasst.