DE69623523T2

DE69623523T2 - Analysator von fluoreszierenden Teilchen mit Verzögerungsschaltung zur Ermöglichung der Subtraktion von aus unterschiedlichen Orten stammenden Fluoreszenzpulsen

Info

Publication number: DE69623523T2
Application number: DE69623523T
Authority: DE
Inventors: Michael A. Hoffman
Original assignee: Becton Dickinson and Co
Current assignee: Becton Dickinson and Co
Priority date: 1995-04-06
Filing date: 1996-03-29
Publication date: 2003-07-31
Anticipated expiration: 2016-03-30
Also published as: US5682038A; ES2179134T3; EP0737855A1; DE69623523D1; EP0737855B1

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung betrifft optische Instrumente und insbesondere Instrumente zum Unterscheiden und Quantifizieren von Emissionen aus fluoreszierenden Partikeln. Eine Hauptaufgabe der vorliegenden Erfindung besteht in der Reduzierung von Übersprechen bei der Detektion von Fluorochromen, wenn mehr als ein Erreger-Laser verwendet wird.
Forschungs- und Test-Laboratorien müssen in der Lage sein, das Vorhandensein von bestimmten Entitäten, z. B. Antigenen, detektieren zu können, die möglicherweise nur unter Schwierigkeiten direkt detektierbar sind. In manchen Fällen kann man die Entitäten mit Fluorochromen markieren, die detektierbar sind. Beispielsweise kann ein Antikörper eines Antigens mit einem Fluorochrom derivatisiert werden. Der derivatisierte Antikörper kann mit einer Blutprobe gemischt werden. In dem Ausmaß, in dem das Antigen in einer Zelle vorhanden ist, wird der derivatisierte Antikörper an dieses gebunden, so dass die eingebundene Blutzelle fluoreszierend gemacht wird. Die fluoreszierenden Zellen können in ein Zytometrie-System eingegeben werden, in dem sie mit monochromatischer Laserstrahlung beleuchtet werden können, die das Fluorochrom erregt. Ein Photodetektor kann daraufhin die Intensität der Fluoreszenz detektieren.
Oft ist es erforderlich, Blutzellen zu identifizieren, die eine bestimmte Kombination von Antigenen enthalten. Zu diesem Zweck können mehrere Antikörper mit jeweiligen Fluorochromen markiert werden und dann an die jeweiligen Antigene gebunden werden. Anschließend werden die Zellen beleuchtet, und die resultierenden fluoreszierenden Emissionen werden detektiert und gemessen.
Die Fluorochrome werden im größtmöglichen Ausmaß dahingehend gewählt, dass sie distinkte Emissionsspektra aufweisen. Eine typische Fluoreszenz-Analysevorrichtung kann einen Blau-Laser enthalten, um Fluorochrome zu erregen, die grünes, gelbes bzw. rotes Licht emittieren. Dichroitische Spiegel oder andere Wellenlängendispersions-Elemente teilen die Emissionen in grüne, gelbe und rote Strahlen, die auf jeweilige Photodetektoren gerichtet werden. In der Praxis ist es schwierig, mehr als drei Fluorochrome allein anhand ihrer Wellenlänge zu unterscheiden, was aufgrund von Überlappungen der Emissionsspektra der Fall ist.
Die Anzahl unterscheidbarer Fluorochrome kann vergrößert werden, indem mehr als eine Erreger-Wellenlänge verwendet wird. Bei diesem Ansatz wird die Tatsache genutzt, dass sich die Fluorochrome nicht nur in ihren Emissionsspektra, sondern auch in ihren Erregungsspektra unterscheiden. Im Idealfall könnten zwei Fluorochrome mit einander nicht überlappenden Emissionsspektra auch dann unterschieden werden, wenn die Emissionsspektra identisch sind. Die Unterscheidung könnte durchgeführt werden, indem die Fluorochrome zu unterschiedlichen Zeiten mit zwei Lasern beleuchtet werden, von denen jeder so gewählt ist, dass er nur ein einziges jeweiliges Fluorochrom erregt. Die resultierenden Emissionen erscheinen im Ausgangssignal eines einzelnen Photodetektors als zwei distinkte Impulse.
Im Kontext eines Durchflusszytometrie-Systems wird dieser Ansatz implementiert, indem unterschiedliche Stellen entlang des Durchflussrohrs mit unterschiedlichen Laser-Wellenlängen beleuchtet werden, von denen jede vorzugsweise ein jeweiliges Fluorochrom erregt, z. B. PerCP und APC. Man lässt markierte Zellen hintereinander an den beiden Stellen entlangströmen. Wenn sich eine Zelle an der ersten Stelle befindet, entspricht ein Photodetektor-Impuls dem ersten Fluorochrom; wenn sich die Zelle später an der zweiten Stelle befindet, entspricht ein Photodetektor-Impuls dem zweiten Fluorochrom. Die Impulse werden in der Analog-Domäne geleitet und zumindest minimal bearbeitet. Dann werden sie zu digitalen Daten konvertiert, die dann in der Digital- Domäne derart gehandhabt werden können, dass sie die gewünschte Information über die Zellen liefern.
Bei einem derartigen Durchflusszytometrie-System entspricht jeder erzeugte Impuls vorwiegend einem jeweiligen Fluorochrom. Aufgrund einander überlappender Emissionen und Erregungsspektra kann jeder Impuls Anteile, d. h. ein "Übersprechen", von anderen Fluorochromen enthalten. Es lassen sich zwei Arten von Übersprechen unterscheiden: "strahl-internes"-Übersprechen resultiert aus Überlappung in den Emissionsspektra von Fluorochromen, die von einem gemeinsamen Laserstrahl erregt werden; "Inter-Strahl"-Übersprechen resultiert aus Überlappung in den Emissionsspektra von Fluorochromen, die von unterschiedlichen Laserstrahlen erregt werden. Es existieren optische Techniken zum Reduzieren beider Arten von Übersprechen; diese sind jedoch unzureichend. Somit ist eine Post-Detektions-Korrektur von Übersprechen erforderlich.
Die Mathematik der Übersprech-Reduzierung ist bekannt. Generell kann ein Übersprechen aus einem primär einem Fluorochrom entsprechenden Messwert entfernt werden, indem ein Übersprech-Term subtrahiert wird, der eine Funktion von Messwerten ist, die primär den anderen Fluorochromen entsprechen. Insbesondere kann der Übersprech-Term eine Summe von Produkt-Termen sein; jeder Produkt-Term ist ein Fluorochrom-Messwert, der mit einem Koeffizienten multipliziert ist. Die Koeffizienten können während eines Kalibrierungs- Durchlaufs empirisch bestimmt werden.
Eine unkomplizierte Verfahrensweise besteht darin, die Übersprech-Reduktion digital zu implementieren. Das Photodetektor-Ausgangssigal wird digitalisiert; die resultierenden Daten können derart manipuliert werden, dass man Grob- Fluorochrom-Messwerte enthält, die in der zur Übersprech-Reduzierung erforderlichen Weise kombiniert werden können. Bei manchen Durchflusszytometrie-Systemen wird ein Teil des Verarbeitungsvorgangs, der zur strahl-internen Übersprech-Reduzierung erforderlich ist, in die Analog-Domäne verschoben.
Beispielsweise kann eine Analog-Spitzen-Halte- oder -Integratoreinrichtung einzelne Werte ausgeben, die mittels eines Analog-/Digital-Konverters einmal abgetastet werden können anstatt der vielen Male, die bei zur Spitzen-Detektion oder -Integration in der Digital-Domäne erforderlich sind. Zusätzlich wird durch Subtraktion zeitlich koinzidierender Impulse in der Analog-Domäne der vom Digital-Prozessor zu leistende Arbeitsaufwand verkleinert.
Bei der Reduzierung strahl-internen Übersprechens handelt es sich um eine Aufgabe, die sich als gut geeignet für die analoge Verarbeitung erwiesen hat. Bei einem einzelnen Laserstrahl werden sämtliche Fluorochrome erregt und somit zur gleichen Zeit detektiert. Somit werden Impulse, die den unterschiedlichen Fluorochromen entsprechen, welche einer bestimmten Zelle oder einem anderen Partikel zugeordnet sind, gleichzeitig erzeugt. Diese Impulse werden in einen Subtraktor eingegeben, der ein Übersprechen von Fluorochromen mit signifikant überlappenden Emissionsspektra subtrahiert. Bei einem Drei- Fluorochrom-System kann das Übersprechen zwischen den beiden extremen Emissionsspektra oft ignoriert werden, so dass jedem Fluorochrom-Impuls ein Übersprechen nur eines anderen Fluorochrom-Impulses subtrahiert wird, um einen übersprechfreien Impuls zu erzeugen. Die korrigierten Impulse werden dann von einer Spitzen-Halteeinrichtung derart verarbeitet, dass sie einen konstanten Wert einnehmen, der mit einer relativ niedrigen Rate von einem Analog-/Digital-Konverter abgetastet werden kann. Somit empfängt der Digital-Prozessor für jeden Impuls eine einzige übersprech-korrigierte Quantität.
Bei der analogen Inter-Strahl-Übersprechreduzierung muss die Tatsache berücksichtigt werden, dass die aus unterschiedlichen Erreger-Strahlen resultierenden Impulse zu unterschiedlichen Zeiten erzeugt werden. Dieses Problem kann dadurch gehandhabt werden, dass in den Weg einer zuvor erzeugten Fluoreszenz eine Verzögerungseinrichtung eingeführt wird, die den Impuls um die Zeit verzögert, die der Partikel benötigt, um von der ersten Erregungs- Stelle zu der zweiten Erregungs-Stelle zu strömen. Im Verlauf des Konzipierens der vorliegenden Erfindung wurde jedoch festgestellt, dass Systeme, die mit analoger Inter-Strahl-Übersprechreduzierung versehen sind, möglicherweise unpräzise Ergebnisse erzeugen. Es besteht Bedarf an einer Verbesserung, mit der die Zuverlässigkeit der analogen Inter-Strahl-Übersprechreduzierung erhöht wird.

ÜBERBLICK ÜBER DIE ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung betrifft eine Fluoreszenzpartikel-Analysevorrichtung, die aufweist: 1) ein Paar von Lasern oder eine andere Erregungsquelle zum Beleuchten erster und zweier Erregungs-Stellen; 2) ein Durchflussrohr oder eine andere Vorrichtung zum Leiten von Partikeln an der ersten Stelle entlang und dann an der zweiten Stelle entlang; 3) eine Optik zum Ausrichten von Fluoreszenz von den Partikeln bei Stimulierung an den ersten und zweiten Stellen; 4) einen oder mehr Photodetektoren zum Erzeugen von Impulsen als Reaktion auf jeweilige Detektion von Strahlungen, einschließlich Fluoreszenz, von den ersten und zweiten Stellen; 5) eine Verzögerungseinrichtung zum Verzögern eines Impulses, der erzeugt wird, während sich ein Partikel an der ersten Stelle befindet, relativ zu einem Impuls, der erzeugt wird, während sich der gleiche Partikel an der zweiten Stelle befindet; und 6) einen Impuls-Subtraktor zum Korrigieren von Übersprechen in mindestens einem der Impulse durch Subtrahieren eines Beitrags, der von dem anderen der Impulse angezeigt wird. Der Analog-Ausgang des Systems kann zur nachfolgenden Datenverarbeitung digitalisiert werden.
Eine derartige Analyseeinrichtung ist beschrieben in der dem Stand der Technik zugehörigen Veröffentlichung REVIEW OF SCIENTIFIC INSTRUMENTS, NOV. 1991, USA, Vol. 62, Nr. 11, S. 2751-2764, ISSN 0034-6748; STEINKAMP, J. A. et al.: "Improved multilaser/multi-parameter flow cytometer for analysis and sorting of cells and particles".
Die vorliegende Erfindung ermöglicht die Detektion eines verzögerten ersten Zeitgebungs-Impulses, der aufgrund an einer ersten Stelle detektierter Strahlung erzeugt wird, und eines unverzögerten zweiten Zeitgebungs-Impulses, der aus an der zweiten Stelle detektierter Strahlung resultiert. Vorzugsweise werden Hinweise für Anstiegs- und Abfall-Impuls-Übergänge mittels vorbestimmter Schwellwerte gegeben. Die Schwellwerte können unabhängig für den verzögerten ersten Impuls und den unverzögerten zweiten Impuls gesetzt werden. Alternativ kann eine Spitzen-Detektion durchgeführt werden.
Ein Controller bestimmt aus diesen Impulsen einen Zeitgebungsfehler. Beispielsweise können die Zeiten, die den Anstiegs- und Abfall-Übergangs- Hinweisen zugeordnet sind, für jeden verzögerten ersten Impuls und jeden unverzögerten zweiten Impuls gemittelt werden. Die Mittelwerte werden verglichen, um einen Zeitgebungsfehler für den zugehörigen Zeitgebungs-Partikel zu erhalten. Der Zeitgebungsfehler kann über zahlreiche Partikel hinweg gemittelt werden, um von Partikel zu Partikel auftretende Zeitgebungsschwankungen zu beseitigen. Der zeitlich gemittelte Fehler wird mit einer Fehler- Toleranz verglichen. Falls der Fehler die Toleranz überschreitet, wird die Verzögerungseinrichtung derart eingestellt, dass der Fehler unter die Toleranz reduziert wird. Wahlweise kann eine Bedienungsperson durch ein Flag auf einen übermäßigen Fehler aufmerksam gemacht werden, wobei diese Person entscheiden kann, wann die Verzögerung neu eingestellt wird.
Die vorliegende Erfindung kann während eines speziell vorgesehenen Kalibrierungs-Durchlaufs in einem "Kalibrierungs-Modus" angewandt werden, oder sie kann zum Regeln der Verzögerungseinrichtung während eines Proben-Durchlaufs verwendet werden. Im letztgenannten Fall können Probe-Partikel als Zeitgebungs-Partikel dienen. Im erstgenannten Fall können speziell vorbereitete Partikel zu Zeitgebungs-Zwecken verwendet werden. Beispielsweise kann die Fluoreszenz der Zeitgebungs-Partikel vorbestimmt werden.
In Fällen, in denen die ersten und zweiten Fluoreszenz-Impulse an dem gleichen Photodetektor-Ausgang erzeugt werden, besteht ein Risiko, dass der Subtraktor den unverzögerten ersten Fluoreszenz-Impuls und/oder einen überflüssigerweise erzeugten verzögerten zweiten Fluoreszenz-Impuls bearbeitet. Das bevorzugte Verfahren zum Handhaben dieses Problems besteht darin, das Ausgangssignal des Subtraktors zu gattern, um den vorlaufenden unverzögerten ersten Fluoreszenz-Impuls zu beseitigen, die koinzidierenden Impulse durchlaufen zu lassen, und dann den verzögerten zweiten Fluoreszenz-Impuls zu beseitigen. Alternativ dazu kann das Photodetektor-Ausgangssignal demultiplext werden, so dass der unverzögerte erste Fluoreszenz-Impuls den Subtraktor nicht erreicht und der verzögerte zweite Fluoreszenz-Impuls nicht erzeigt wird.
In jedem Fall muss das Gattern oder das Schalten zeitlich gesteuert werden. Vorzugsweise wird das Gattern oder Schalten durch eine Detektion initiiert, die an der zweiten Erregungs-Stelle vorgesehen ist. Alternativ kann das Gattern oder Schalten relativ zu einer Detektion an der ersten Stelle zeitgesteuert werden. In jedem Fall besteht der Problemaspekt darin, die gewünschte Doppel-Detektion eines Partikels von zwei einzelnen Detektionen zweier Partikel zu unterscheiden, die in dem Partikelstrom nicht sauber getrennt sind. Somit sollte der zum Gattern oder Schalten verwendete Impuls eindeutig einer gewählten der beiden Erregungs-Stellen zugeordnet sein.
Mit der vorliegenden Erfindung ist gewährleistet, dass die Impulse, die subtrahiert werden, hinreichend konkurrent sind, dass das Differenzimpuls-Ausgangssignal des Subtraktors als eine präzise übersprech-korrigierte Repräsentation der Quantität eines jeweiligen Fluorochroms dienen kann. Ohne die vorliegende Erfindung könnten Veränderungen in der Partikel-Strömungsrate und/oder die Verzögerung selbst zur Folge haben, dass der verzögerte erste Fluoreszenz-Impuls zu einen unterschiedlichen Zeitpunkt an dem Subtraktor eintrifft als der unverzögerte zweite Impuls. In diesem Fall wäre bei dem resultierenden Differenzimpuls das Übersprechen nicht optimal reduziert.
Die Erfindung bietet den weiteren Vorteil, dass sie mit minimalen Veränderungen in existierenden Durchflusszytometrie-Systemen implementiert werden kann. Diese und weitere Merkmale und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden aus der folgenden Beschreibung im Zusammenhang mit den beigefügten Zeichnungen ersichtlich.

KURZBESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

Fig. 1 zeigt eine schematische Ansicht eines Durchflusszytometrie-Systems gemäß der vorliegenden Erfindung.
Fig. 2 zeigt ein Flussdiagramm eines beim Betrieb des Systems gemäß Fig. 1 praktizierten Verfahrens.

BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN

Gemäß der vorliegenden Erfindung weist ein Durchflusszytometrie-System 10 zum Charakterisieren eines Blutzellen-CEL eine Laser-Quelle 12, ein Durchflussrohr 14, ein optisches Subsystem 16, einen Photodetektor-Subsystem 18, einen Analog-Impuls-Prozessor 20, einen Analog-/Digital-Konverter 22 und einen Digital-Datenprozessor 24 auf. Die Laser-Quelle 12 enthält einen Rot- Laser LZ1 und einen Blau-Laser LZ2. Das Photodetektor-Subsystem 18 enthält vier Photodetektoren, einen "Rot-Fluoreszenz"-Photodetektor PDR, einen "Gelb-Fluoreszenz"-Photodetektor PDY, einen "Grün-Fluoreszenz"-Photodetektor PDG, einen Seitenstreulicht-Detektor PDS und einen Vorwärtsstreulicht- Detektor PDF. Der Analog-Impuls-Prozessor 20 enthält eine variable Verzögerungseinrichtung 30, einen Analog-Impuls-Subtraktor 32, einen gegatterten Sechs-Kanal-Verstärker 34, und eine Sechs-Kanal-Spitzen-Halteeinrichtung 36, einen Vier-zu-eins-Multiplexer 40, einen Zwei-Kanal-Schwellwert-Detektor 42 und einen Controller 44.
Eine Funktion des Durchflusszytometrie-Systems 10 besteht darin, festzustellen, welche von vier Antigenen - sofern vorhanden - in den Blutzellen, einschließlich Zellen-CEL, enthalten sind. Zu diesem Zweck werden jeweilige Antikörper für die Antigene mit jeweiligem Fluorochrom-Allophycocyanin (APC), Peridinen-Chlorophyllprotein (PerCP), Fluorescinisothiocyanat (FITC) und R- Phycoerythrin (RPE) derivatisiert. Die Blutzellen werden mit einer Mixtur dieser derivatisierten Antikörper unter dahingehend hinreichenden Bedingungen inkubiert, dass die Antikörper sich mit ihren jeweiligen Antigenen verbinden können, um die Blutzellen zu markieren. Generell wird jede von den Zellen emittierte Fluoreszenz leicht von jeglicher Hintergrund-Fluoreszenz unterschieden, die durch ungebundene Antikörper beigesteuert wird; wo dies nicht der Fall ist, können die ungebundenen Antikörper vor der Fluoreszenz-Analyse der Zellen weggespült werden. Die markierten Blutzellen werden dann in einem durch das Durchflussrohr 14 fließenden Strom serialisiert, wobei das Rohr die Bewegung der Zeitgebungs-Partikel und der Probe-Zellen einschließlich des Zellen-CEL an den Durchflussrohr-Stellen LC1 und LC2 vorbei in der durch den Strömungspfeil ARW angedeuteten Richtung leitet.
Zum Markieren der fluorochrom-markierten Zellen geben die Laser LZ1 und LZ2 ein hoch monochromatisches Licht zu den jeweiligen Durchflussrohr- "Erregungs"-Stellen LC1 und LC2 aus, die um ungefähr 120 Mikron voneinander entfernt sind. Der Laser LZ1 ist ein Diodenlaser der eine Rot-Strahlung mit 635 nm erzeugt. Alternativ kann Rotlicht mit 633 nm von einem kostenaufwendigeren Helium-Neon-Laser erzeugt werden, um einen stärker Gauß'schen Strahl zu erzeugen. Der Laser LZ2 ist ein Argon-Ionen-Laser, der Blaulicht mit 488 Namometer (nm) erzeugt. Obwohl aus zeichnerischen Gründen anders dargestellt, sind die Laser LZ1 und LZ2 vorzugsweise orthogonal zu der Richtung angeordnet, entlang der die Emissionen detektiert werden, um das Rauschen in den Emissionssignalen zu minimieren.
Wenn ein Zell-CEL eine Durchflussrohr-Stelle LC1 erreicht, erregt das auftreffende Rotlicht aus dem Laser LZ1 jedes vorhandene APC-Fluorochrome stark, wobei die PerCP-, FITC- und RPE-Fluorochrome am schwächsten erregt werden. Die Emissionen von der Stelle LC1 werden von dem optischen Subsystem 16 auf den Rot-Fluoreszenz-Photodetektor PDR gerichtet. Das optische Subsystem 16 enthält in herkömmlicher Weise dichroitische Spiegel, die Emissionen mittels Wellenlängenbereichen (rot, gelb, grün) in Strahlen unterteilen, die auf die betreffenden der Photodetektoren PDR, PDY und PDG gerichtet werden. Somit richtet das optische Subsystem 16 primär Rot-APC auf den Rot- Photodetektor PDR.
Wenn das Zellen-CEL die Durchflussrohr-Stelle LC2 erreicht, werden sämtliche PerCP-, FITC- und RPE-Fluorochrome stark erregt, während jegliches APC am wenigsten stark erregt wird. Die dichroitischen Spiegel des optische Subsystems 16 teilen die Emissionen gemäß den Wellenlängen, so dass grüne, d. h. vorwiegend FTIC-, Emissionen auf den Photodetektor PDG gerichtet werden, gelbe, d. h. vorwiegend RPE-, Emissionen auf den Photodetektor PDY gerichtet werden und rote Emissionen, die vorwiegend PerCP-Emissionen sind, auf den Photodetektor PDR gerichtet werden. Zusätzlich sammelt das optische Subsystem 16 von dem Laser LZ2 Blaulicht, das seitlich gestreut wird, um von dem Lateralstreuungs-Photodetektor PDS detektiert zu werden. Das optische Subsystem 16 sammelt von dem Laser LZ2 ferner Blaulicht, das in einer Vorwärtsrichtung (jedoch außerhalb des Hauptstrahls) gestreut wird, um von dem Vorwärtsstreulicht-Detektor PDF detektiert zu werden; das optische Subsystem 16 verdeckt den aus dem Laser LZ2 ausgegebenen Hauptstrahl gegenüber dem Photodetektor PDF. Jeder Photodetektor gibt einen elektrischen Impuls aus, wenn eine jeweilige Detektion erfolgt ist.
Die Photodetektor-Ausgangssigale aus dem Photodetektor-Subsystem 18 werden dem Analog-Impulsprozessor 20 zugeführt. Die Ausgangssignale der Fluoreszenz-Photodetektoren PDR, PDY und PDG werden an jeweilige erste, zweite und dritte Eingänge des Vier-mal-Vier-Impuls-Substraktors 32 angelegt. Das Ausgangssignal des Fluoreszenz-Photodetektor PDR wird ferner dem Eingang der variablen Verzögerungseinrichtung 30 zugeführt, deren Ausgangssignal an einen vierten Eingang des Impuls-Subtraktors 32 angelegt wird. Somit trifft ein verzögerter APC-Impuls an dem Subtraktor zur gleichen Zeit ein wie die unverzögerten PerCP-, RPE- und FITC-Impulse. Zusätzlich trifft ein unverzögerter APC-Impuls vor den anderen ein, und ein verzögerter PerCP-Impuls trifft vor den anderen ein; sämtliche Auswirkungen dieser überflüssigen Impulse an den Ausgängen des Subtraktors 32 werden durch das Gatter 34 beseitigt.
Idealerweise würden bei der Übersprech-Reduzierung von jedem Fluoreszenz- Impulse Bruchteile jedes der anderen Impulse subtrahiert, die gleichzeitig an dem Subtraktor 32 eintreffen. Anders ausgedrückt finden die folgenden Gleichungen Abwendung:
wobei die V-Angaben auf der linken Seite der Gleichungen Werte der Impulse sind, die auf Übersprechen korrigiert sind, und die V-Angaben auf den rechten Seitenbereichen der Gleichungen Impulswerte sind, wie sie in den Subtraktor 32 eingegeben werden. Die (nichtüberschriebenen) Minuend-Koeffizienten-C- Angaben repräsentieren das optionale Skalieren, das bei dem Minuend-Impuls vorgenommen werden kann (z. B. zum Kompensieren von Ungleichförmigkeiten der Detektorempfindlichkeit), von dem die übrigen skalierten Impulse zu subtrahieren sind. Die Minuend-Koeffizienten sind notwendigerweise positiv und werden typischerweise auf Einer-Werte gesetzt; d. h. in der Praxis sind die Minuend-Impulse nicht skaliert.
Die (überschriebenen) Subtrahenden-Koeffizienten-C-Angaben repräsentieren den empirisch bestimmten Beitrag des in dem Subskript angegebenen Fluorochroms zu dem Impuls, der in dem Superskript angegeben ist. Die Subtrahenden-Koeffizienten sind überwiegend positiv und betragen weniger als eins, da der Netto-Effekt der Subtrahenden-Terme darin besteht, ein Übersprechen aus dem Minuenden-Term zu entfernen. (Somit involviert die Übersprech- Reduzierung typischerweise das Subtrahieren eines Bruchteils eines Impulses von einem anderen Impuls.) Da jedoch die Subtrahenden-Terme auch Übersprech-Komponenten enthalten können, kann ihre Subtrahierung das Übersprechen in dem Subtrahenden-Term möglicherweise überkompensieren. Deshalb können einige Subtrahenden-Koeffizienten negativ sein, um diese Überkompensation zu beseitigen.
Die Subtrahenden-Koeffizienten können empirisch unter Verwendung bekannter Kalibrationsvorgänge bestimmt werden. Die meisten der Subtrahenden- Koeffizienten sind abhängig von dem relativen Verstärkungsfaktor der Photovervielfacher. Der relative Verstärkungsfaktor zwischen Impulsen, die von dem gleichen Photovervielfacher detektiert werden, verändert sich nicht, so dass die Koeffizienten für die jeweiligen Fluorochrome weniger abhängig von der Instrumenten-Einstellung sind. Die Koeffizienten C und C betragen somit beide ungefähr 0,05, unabhängig von dem Verstärkungsfaktor des Photodetektors PDR. C tendiert dazu, im Bereich von 0,1 bis 0,3 zu variieren; und C tendiert dazu, im Bereich von 0,01 bis 0,02 zu variieren. Die übrigen Subtrahenden-Koeffizienten sind tendienziell kleiner; aus diesem Grund werden die jeweiligen Subtrahenden-Terme in der Praxis oft ignoriert, wobei diese Koeffizienten effektiv auf null gesetzt werden.
Nachdem die Koeffizienten gesetzt sind, führen die Impuls-Subtraktoren diese vier Subtraktionen an durchlaufenden Impulsen durch, wobei die jeweiligen Unterschiede den jeweiligen Ausgängen zugeführt werden. Jeder der von dem Subtraktor 32 ausgegebenen Differenz-Impulse entspricht dem Wert der Emissionen aufgrund eines jeweiligen Fluorochroms, das auf Übersprechen korrigiert ist. Die Ausgangssignale des Subtraktors 32 werden an vier der sechs Impuls-Eingänge des Sechs-Kanal-Gatters 34 ausgegeben. Die anderen beiden Impuls-Eingänge des Sechs-Kanal-Gatters 34 sind jeweils mit den Ausgängen der Streulicht-Photodetektoren PDS und PDF verbunden. Das Gatter 34 lässt Impulse durch, während sich eine Zelle an der Stelle LC2 befindet, ist jedoch anderweitig im Schließzustand, um Störimpulse abzuhalten. Die zurückgewiesen Impulse enthalten nicht nur Zufallsrauschen, sondern auch Artefakte, die von dem Analog-Impuls-Subtraktor 32 erzeugt werden, während er den unverzögerten APC- und den verzögerten PerCP-Impuls aus der variablen Verzögerungseinrichtung 30 verarbeitet.
Die sechs Ausgangssignale aus dem Gatter 34 werden in die Sechs-Kanal- Spitzen-Halteeinrichtungen 36 eingegeben. Die gehaltenen Spitzen, die aus der Sechs-Kanal-Spitzen-Halteeinrichtung 36 ausgegeben werden, werden mittels des Sechs-Kanal-Analog-/Digital-Konverters 22 in jeweilige Digitalwerte umgesetzt. Die aus dem Sechs-Kanal-Analog-/Digital-Konverter 22 ausgegebenen sechs Spitzen-Werte werden dann von dem Digital-Datenprozessor 24 verarbeitet, der die digitalen Spitzen-Lesewerte verwendet, um Fluorochrome und somit Antigene zu identifizieren und somit zu quantifizieren. Bei alternativen Ausführungsformen wird ein Sechs-Kanal-Impulsintegrator anstelle der Spitzen-Halteeinrichtung 36 oder zusätzlich zu dieser verwendet.
Bei einer typischen Durchflussrate gelangen die Zellen in ungefähr 20 Mikrosekunden (us) von der Durchflussrohr-Stelle LC1 zu der Durchflussrohr-Stelle LC2. Somit wird die variable Verzögerungseinrichtung derart eingestellt, dass sie eine Verzögerung von ungefähr 20 Millisekunden bewirkt. Falls jedoch aufgrund von Variationen in der Durchflussrate oder in der durch die Verzögerungseinrichtung 30 bewirkten Verzögerung die elektrische Verzögerung und die Durchflussverzögerung nicht aneinander angepasst sind, sind die verzögerte erste Fluoreszenz-Spitze und die unverzögerte zweite Fluoreszenz-Spitze nicht korrekt ausgerichtet. Folglich kann der Analog-Impuls-Subtraktor 32 inakkurate Ergebnisse liefern. Deshalb ist gemäß der vorliegenden Erfindung eine Kalibrierung und/oder Regelung der von der variablen Verzögerungseinrichtung 30 bewirkten Verzögerung vorgesehen.
Die variable Verzögerungseinrichtung 30 kann derart eingestellt werden, dass sie eine Verzögerung bewirkt, die gleich der Verzögerung zwischen einer Detektion eines Partikels an der Stelle LC1 und einer Detektion des gleichen Partikels an der Stelle LC2 ist. Da nur der Photodetektor PDR optisch mit der Stelle LC1 verbunden ist, wird sein Ausgangssignal notwendigerweise verwendet, um den Partikel an der Stelle LC1 zu detektieren. Da sämtliche fünf Photodetektoren optisch mit der Stelle LC2 verbunden sind, könnte jeder von ihnen für die Detektion der Stelle LC2 verwendet werden. Um jedoch eine Ambiguität zwischen der Detektion des gleichen Partikels an der Stelle LC2 und einer Detektion eines eng nachfolgenden Partikels an LC1 zu vermeiden, verhindert die Fluoreszenz-Analysevorrichtung 10 die Verwendung eines Impuls-Ausgangssignals aus dem Photodetektor PDR für den zweiten Zeitgebungs-Impuls. Die übrigen vier Photodetektoren sind an ihren Ausgängen mit jeweiligen Eingängen eines Multiplexers 40 verbunden, dessen Einstellung bestimmt, welcher Photodetektor den zweiten Zeitgebungs-Impuls erzeugt. Anzumerken ist, dass dies bedeutet, dass der zweite Zeitgebungs-Impuls das Ergebnis von Fluoreszenz oder Streulicht sein kann.
Die Zeitgebung des ersten Zeitgebungs-Impulses (aufgrund von Fluoreszenz von der Stelle LC1) relativ zu dem zweiten Zeitgebungs-Impuls (aufgrund von Fluoreszenz oder Streuung an der Stelle LC2) wird mit Hilfe des Schwellwert- Detektors 42 bestimmt. Der Schwellwert-Detektor 42 weist einen ersten Eingang, der mit dem Ausgang der variablen Verzögerungseinrichtung 30 verbunden ist, und einen zweiten Eingang auf, der mit dem Ausgang des Multiplexers 40 verbunden ist. Die Schwellwerte werden unabhängig für die beiden Eingänge gesetzt. Der Schwellwert-Detektor 42 gibt an, wann die Anstiegs- oder Abfall-Übergänge eines durch die Verzögerungseinrichtung 30 verzögerten Zeitgebungs-Impulses den ersten Eingangs-Schwellwert überschreiten; die beiden Angaben für jeden ersten Zeitgebungs-Impuls werden einem ersten Ausgang des Schwellwert-Detektors 42 zugeführt. Der Schwellwert-Detektor 42 gibt an, wann die Anstiegs- oder Abfall-Übergänge eines unverzögerten Zeitgebungs-Impulses aus dem Multiplexer 40 den zweiten Eingangs-Schwellwert überschreiten; diese beiden Angaben aus dem zweiten Zeitgebungs-Impuls werden aus einem zweiten Ausgang des Schwellwert-Detektors 42 ausgegeben. Beide Ausgänge des Schwellwert-Detektors 42 sind mit jeweiligen Eingängen des Controllers 44 verbunden.
Der Controller 44 stellt einen Fehler zwischen verzögerten Zeitgebungs- Impulsen und unverzögerten zweiten Zeitgebungs-Impulsen fest. Für jeden Zeitgebungs-Impuls werden die Zeiten, zu denen die Überschreitungen der Anstiegs- oder Abfall-Schwellwerte angegeben werden, gemittelt, um einen der Impuls-Spitze zugehörigen Zeitpunkt zu bestimmen. Für jedes Paar der ersten und zweiten Zeitgebungs-Impulse werden die Spitzen-Zeiten subtrahiert. Diese Differenz wird über eine statistisch zuverlässige Anzahl, z. B. zwanzig, von Zeitgebungs-Partikeln hinweg gemittelt, um den Fehler zu errechnen. Falls der Fehler größer als eine vorbestimmte Toleranz - z. B. 0,5 us - ist, kann der Controller 44 die Verzögerungseinrichtung 30 derart einstellen, dass der Fehler auf einen innerhalb des Toleranzbereiches liegenden Wert reduziert wird.
Der Controller 44 leitet ferner die Zeitgebung für das Gatter 34 und den Analog-/Digital-Konverter 22 aus dem vom Schwellwert-Detektor 42 gelieferten Angaben ab. Ferner kommuniziert der Controller 44 mit einem Host-Computer. Eine Bedienungsperson kann den Host-Computer dazu verwenden, Koeffizienten für den Subtraktor 32 und die vom Bediener getroffene Wahl für die Quelle des zweiten Zeitgebungs-Impulses (d. h. die Einstellung des Multiplexers 40) zu übertragen.
Der Controller 44 kann dem Host-Computer mitteilen, dass ein Zeitgebungs- Fehler gefunden worden ist, so dass eine Kalibrierungs-Betriebsart angesetzt werden kann, in der die Bedienungsperson entscheidet, ob der Fehler korrigiert werden soll oder nicht. Gemäß einem alternativen Regelungsmodus werden die Korrekturen automatisch durchgeführt.
Typischerweise werden Streulichtimpulse entweder aus dem Photodetektor PDS oder dem Photodetektor PDF für Zeitgebungs-Zwecke verwendet, so dass zweite Zeitgebungs-Impulse unabhängig davon erzeugt werden, ob die Zeitgebungs-Partikel fluoreszierend sind oder nicht. Bei der bevorzugten Ausführungsform ist nur ein Rot-Photodetektor PDR optisch mit der Durchflussrohr- Stelle LC1 gekoppelt. Somit sind die bevorzugten Zeitgebungs-Partikel Blutzellen, die mit APC markiert sind. Die Zeitgebungs-Partikel müssen jedoch keine Blutzellen sein; beispielsweise können auch fluoreszierende Latex-Partikel für die Zeitgebungs-Kalibrierung verwendet werden.
Bei dem bevorzugten Kalibrierungs-Modus lässt man einen Satz APC-angefärbter Zellen an den Stellen LC1 und LC2 vorbeiströmen. Rot-Fluoreszenz, die an der Steile LC1 erregt wird, wird von dem Photodetektor PDR detektiert und mittels der variablen Verzögerungseinrichtung 30 verzögert; der resultierende Zeitgebungs-Impuls wird auf einen Schwellwertdetektor-Eingang gerichtet. Der erste Schwellwert-Detektor 42 detektiert einen Anstiegs-Übergang des ersten Zeitgebungs-Impulses und dann einen Abfall-Übergang an dem gleichen Impuls. Der Schwellwert, an dem die Detektionen durchgeführt werden, wird automatisch derart gesetzt, dass er gerade über dem Rausch-Plateau des Ausgangssignals des Photodetektors PDR liegt. Die Übergangs-Detektionen werden dem Controller 44 zugeführt, der somit diesen Übergängen die Übergangszeiten t1 und t2 zuordnet.
Das nachfolgende Streulicht (oder die Grün- oder Gelb-Fluoreszenz-) Detektion an der Durchflussrohr-Stelle LC2 wird zu dem anderen Eingang des Schwellwert-Detektors 42 geleitet. Der Schwellwert-Detektor 42 liefert Angaben der Anstiegs- und Abfall-Übergänge in dem zweiten Zeitgebungs-Impuls, Der Schwellwert, an dem die Übergänge detektiert werden, wird manuell von einer Bedienungsperson gesetzt, vorzugsweise derart, dass er über dem Rausch-Plateau des Streulicht-Photodetektors PDB liegt. Die Übergangs- Angaben für den zweiten Zeitgebungs-Impuls werden dem Controller 44 zugeführt, der diesen Angaben die Zeiten t3 und t4 zuordnet.
Aufgrund der relativen Symmetrie dieser Detektionsimpulse lässt sich die Spitze des ersten Zeitgebungs-Impulses im mittleren Bereich zwischen den Anstiegs- und Abfall-Übergangs-Überschreitungen finden, so dass der Spitze des ersten Zeitgebungs-Impulses eine Zeit t5 = (t2 + t1)2 zugeordnet werden kann und der Spitze des zweiten Zeitgebungs-Impulses eine Zeit t6 = (t4 + t3)2 zugeordnet werden kann. t6 - t5 ergibt dann den Zeitgebungs-Fehler für den einzelnen Partikel. Das Intervall wird über mehrere Kalibrierungs-Zellen hinweg gemittelt, um einen zeitlich gemittelten Zeitgebungs-Fehler zu erhalten, Anders ausgedrückt ist der Zeitgebungs-Fehler e, der über N mit APC angefärbte Kalibrierungs-Zellen gemittelt ist, gegeben durch:
Der Zeitgebungs-Fehler wird mit einer Zeitgebungsfehler-Toleranz verglichen. Falls der Fehler größer als die Toleranz ist, wird die Verzögerung dahingehend eingestellt, dass der Fehler unter die Toleranz reduziert wird. Falls der Fehler nicht größer als die Toleranz ist, wird keine Einstellung vorgenommen. Die Toleranz wird niedrig genug gesetzt, um akkurate Subtraktionsergebnisse erhalten zu können; beispielsweise kann ein Zeitgebungs-Fehler, der größer als 1,0 us ist, dazu führen, dass irreführende Differenzen aus dem Subtraktor 32 ausgegeben werden. Die Toleranz wird hoch genug gesetzt, dass die Verzögerung nicht zu oft geändert wird; beispielsweise sollte eine in einem Kalibrierungs- Durchlauf vorgenommene Einstellung während des nächsten Proben-Durchlaufs keine weitere Einstellung erfordern. Ein praktischer Wert für die Zeitgebungs-Toleranz beträgt 0,5 us.
Eine Alternative besteht darin, den unverzögerten ersten Zeitgebungs-Impuls mit dem unverzögerten zweiten Zeitgebungs-Impuls zu vergleichen, um die Übergangszeit zu bestimmen, die ein Partikel benötigt, um sich von der Erregungs-Stelle LC1 zu der Erregungs-Stelle LC2 zu bewegen. Ein Controller kann diese Übergangszeit mit der dem ersten Zeitgebungs-Impuls auferlegten Verzögerung vergleichen, um einen Zeitgebungs-Fehler zu bestimmen, der wie oben angegeben korrigiert wird. Der Nachteil dieses Ansatzes besteht darin, dass die Variationen in der Verzögerungseinrichtung selbst nicht berücksichtigt werden.
Anstelle des Kalibrierungs-Modus kann die Bedienungsperson einen "Regelungs"-Modus wählen, in dem die Verzögerung während eines Proben-Durchlaufs ohne weitere Bediener-Intervention geregelt wird. Im Verlauf eines Proben-Durchlaufs sucht der Controller 44 nach einem Paar von Detektionsergebnissen aus dem Schwellwert-Detektor 42, denen ein Paar von Detektionsergebnissen aus dem Schwellwert-Detektor 42 folgt. Wenn dieses Muster festgestellt wird, wird die repräsentierte Durchflusszeit aufgezeichnet. Nach zwanzig derartigen Paaren werden die Durchflusszeiten gemittelt und dazu verwendet, festzustellen, ob die Verzögerungseinrichtung 30 eine Einstellung verlangt oder nicht. Falls eine Einstellung erforderlich ist, wird sie ohne Bediener- Intervention im Regel-Modus durchgeführt.
Zu beachten ist, dass, wenn eine Fluoreszenz-Detektion für ein Zeitgebungssignal verwendet wird, die Zeitgebungs-Zellen mit dem entsprechenden Fluorochrom markiert werden müssen. Wenn beide Zeitgebungs-Impulse auf Fluoreszenz-Detektionen basieren, sollte jedes Zeitgebungs-Partikel mit zwei Fluorochromen markiert werden, obwohl die Möglichkeit besteht, dass ein einzelnes Fluorochrom an jeder Durchflussrohr-Erregungs-Stelle die gewünschten Emissionen erzeugt.
Das oben erläuterte Verfahren 100 ist in dem Flussdiagramm gemäß Fig. 2 überblickartig gezeigt. In dem Schritt 101 wird die erste Stelle mit Rotlicht bestrahlt, und die zweite Stelle wird mit Blaulicht bestrahlt. In Schritt 102 wird veranlasst, dass die Zeitgebungs-Zellen nacheinander an den beiden Stellen vorbeiströmen; die Zeitgebungszellen werden vorzugsweise mit APC markiert. In Schritt 103 werden, während die Zeitgebungs-Zellen die Stellen passieren, von den Photodetektoren (PDR und PDB) Paare von Zeitgebungs-Impulsen erzeugt. Jedes Paar enthält einen unverzögerten ersten Zeitgebungs-Impuls, der auf der Detektion von APC-Emissionen an der ersten Stelle basiert, und einen unverzögerten zweiten Zeitgebungs-Impuls, der auf der Detektion von PerCP-Emissionen basiert, die von der zweiten Stelle emittiert werden. In dem Schritt 104 werden die ersten Zeitgebungs-Impulse um den gewählten Verzögerungs-Betrag verzögert.
In Schritt 105 wird das Intervall (Spitze zu Spitze) zwischen den unverzögerten ersten und den unverzögerten zweiten Impulsen für jedes Paar von Zeitgebungs-Impulsen bestimmt. Das Intervall wird über sämtliche Zeitgebungs- Paare hinweg gemittelt, um einen Fehler festzustellen. (Alternativ können die Intervalle zwischen unverzögerten ersten und unverzögerten zweiten Zeitgebungs-Impulsen zeitlich gemittelt werden, um eine Taget-Verzögerung zu bestimmen, die mit der eingestellten Verzögerung verglichen wird, um den Fehler zu erhalten.) In dem Schritt 106 wird diese Target-Verzögerung mit der tatsächlichen für die Verzögerungseinrichtung 30 eingestellten Verzögerung verglichen. Im Schritt 107 ändert, falls der Fehler eine vorbestimmte Toleranz überschreitet, der Controller 44 die tatsächliche Verzögerung, um den Fehler auf einen Wert innerhalb eines vorbestimmten Zeitgebungs-Toleranzbereiches zu reduzieren.
In Schritt 108 lässt man den Probe-Partikel an den beiden Stellen vorbeiströmen. In Schritt 109 wird die Rot-Fluoreszenz beider Stellen detektiert, so dass am Ausgang des Photodetektors PDR ein Paar unverzögerter Fluoreszenz- Impulse auftritt. In Schritt 110 wird der erste unverzögerte Fluoreszenz- Impuls durch die Verzögerungseinrichtung 30 derart verzögert, dass ein verzögerter erster Fluoreszenz-Impuls erzeugt wird, der zeitlich mit dem unverzögerten zweiten Fluoreszenz-Impuls übereinstimmt. In Schritt 111 werden die zuvor beschriebenen Subtraktionen (mit entsprechender Skalierung) durchgeführt, um übersprech-korrigierte Fluoreszenz-Impulse zu erhalten.
Die offenbarte Übersprech-Reduzierung, denen die Analog-Impulse unterzogen werden, kann durch optische Techniken zum Minimieren von Übersprechen ergänzt werden. Eine Übersprech-Reduzierung in der optischen Domäne kann ohne einen zusätzlichen Photodetektor implementiert werden gemäß der Lehre der gleichzeitig eingereichten U.S.-Patentanmeldung "Fluorescence Particle Analyzer with Spatially Split Wavelength Filter" von Robert A. Hoffman und William Treytl. Zu diesem Zweck weist das optische Untersystem 16 ein Teilungs-Wellenlängen-Filter, eine Sammellinse und ein räumliches Filter mit zwei Aperturen auf.
Das Teilungs-Wellenlängen-Filter ist optisch zwischen den Durchflussrohr- Erregungs-Stellen LC1 und LC2 und dem Photodetektor PDR angeordnet. Das Teilungsfilter enthält ein Tiefpass-Wellenlängenfilter und ein Hochpass-Wellenlängenfilter, beide mit Durchlassgrenzen im mittlerem Bereich zwischen den Emissionsspektren-Spitzen für PPC und PerCP. (Das Tiefpass-Wellenlängenfilter ist ein Hochpassfrequenzfilter; ähnlich ist das Hochpass-Wellenlängenfilter ist ein Tiefpassfrequenzfilter.) Die Sammellinse bildet bei dem Tiefpass- Wellenlängenfilter die Stelle LC1 bei dem Hochpass-Wellenlängenfilter die Stelle LC2 ab. Das räumliche Filter weist ein mit jeder Abbildungs-Stelle ausgerichtetes Nadelloch auf, um die optische Isolation der Emissionen von den Erregungs-Stellen LC1 und LC2 zu verbessern.
Somit lässt das Tiefpass-Wellenlängenfilter APC-Emissionen, die an der Erregungs-Stelle LC1 stark erregt werden, vorzugsweise durch, und zwar auf Kosten der PerCP-Emissionen, die an der Stelle LC1 nur schwach erregt werden; ähnlich lässt das Hochpass-Wellenlängenfilter PerCP-Emissionen, die an der Erregungs-Stelle LC2 stark erregt werden, vorzugsweise durch, auf Kosten der APC-Emissionen, die an der Stelle LC2 nur schwach erregt werden. Somit repräsentiert ein erstes Paar von Fluoreszenz-Impulsen, das von dem Photodetektor PDR ausgegeben wird, APC-Emissionen, bei denen ein Maß an PerCP- Übersprechen entfernt ist, während der zweite Impuls des Impuls-Paars PerCP-Emissionen repräsentiert, bei denen ein Maß an APC-Übersprechen entfernt ist. In dieser Weise wird das Übersprechen, das von dem Analog-Impuls- Prozessor 20 gehandhabt werden muss, reduziert.
Obwohl vorstehend eine bevorzugte Ausführungsform beschrieben worden ist, umfasst die vorliegende Erfindung einen Bereich von Alternativen. Die Erfindung erfordert mindestens zwei Erregungs-Stellen. Es kann jedoch eine größere Anzahl vorgesehen sein. Die Erfindung kann für jedes Paar von drei oder mehr Erregungs-Stellen angewandt werden. Ferner können Drei-Wege-Übersprechen oder "stärker mehrwegiges" Übersprechen mittels dreier oder mehr Erregungs-Stellen gehandhabt werden, indem zwei oder mehr Verzögerungseinrichtungen parallel verwendet werden.
Die verschiedenen Stellen können durch jeweilige Laser erregt werden. Alternativ kann ein einzelner Laser die Erregung für zwei oder mehr Stellen erzeugen, z. B. mit einem Strahlteiler. Auch andere Erregungsquellen, z. B. eine Xenon-Blitzlampe, können verwendet werden. Es können wellenlängen-dispersive, -selektive oder -verschiebende Elemente verwendet werden, so dass die beiden Stellen durch unterschiedliche Wellenlängen erregt werden. Alternativ können zwei Stellen durch dieselbe Wellenlänge erregt werden. In diesem Fall können die Emissionen unterschiedlich gefiltert werden, um ein Fluorochrom an der ersten Stelle und ein anderes Fluorochrom an der zweiten Stelle zu betonen.
Es ist wichtig, dass mindestens ein Zeitgebungssignal derart beschaffen ist, dass es von einer eindeutigen Stelle her erzeugt worden sein kann. Bei der bevorzugten Ausführungsform wird dieses Erfordernis erfüllt, indem ein Streulicht-Detektor verwendet wird, der nur mit der zweiten Stelle gekoppelt ist, oder indem Photodetektoren verwendet werden, die nur Licht in Wellenlängenbereichen empfangen, die nicht an der ersten Durchflussrohr-Stelle erzeugt worden sein können. Die Fluoreszenz tritt stets an einer längeren Wellenlänge auf als die Erregungs-Wellenlänge. Die erste Stelle wird durch Rotlicht erregt, so dass die gesamte resultierende Fluoreszenz rot oder infrarot sein muss. Die zweite Stelle wird durch Blaulicht beleuchtet, das Blau, Gelb-, Grün- und Rot-Fluoreszenz erzeugen kann. Da die Gelb- und Grün-Fluoreszenz nicht an der ersten Stelle erzeugt werden kann, können die Detektionen von Grün- und Gelb-Fluoreszenz zur Zeitgebungs-Kalibrierung dienen.
Gemäß einer alternativen Ausführungsform wird Streulicht sowohl an der ersten als auch an der zweiten Stelle mit einem zweiten Detektor detektiert. Jede passierende Zelle erzeugt notwendigerweise zwei Streulicht-Detektionen, und auf diesen beruht vorwiegend das Regulieren der variablen Verzögerung für Fluoreszenz-Detektionen. Der Vorteil dieses Ansatzes besteht darin, dass er unabhängig von dem Markieren der Blutzellen verwendbar ist; dies ist insbesondere nützlich beim Regeln der Verzögerung während eines Proben-Durchlaufs. Nachteilig ist, dass ein zusätzlicher Photodetektor erforderlich ist. Dies kann gehandhabt werden durch Verwendung einer Optikfaser zum Leiten von Streulicht von der ersten Stelle zu dem Detektor, der zum Detektieren des an der zweiten Stelle gestreuten Streulichts verwendet wird, oder zu einem der Fluoreszenz-Photodetektoren, die ausschließlich für die zweite Stelle vorgesehen sind. In den letztgenannten Fällen ist das Identifizieren der Stelle, von der Streulicht emittiert würde, im wesentlichen unzweideutig.
Falls Sorgfalt darauf verwandt wird, Fälle, in denen zwei Zellen eng genug aufeinanderfolgen, dass eine zweite Zelle an einer ersten Stelle mit einer ersten Zelle an einer zweiten Stelle verwechselt wird, zu vermeiden (z. B. durch Steuern des Einführens von Zellen in das Durchflussrohr) oder derartigen Fällen entgegenzuwirken (z. B. durch Detektieren dieser Fälle und Ignorieren jeglicher zweideutiger Impulse, die aus ihnen resultieren), dann können beide Zeitgebungssignale von dem gleichen Photodetektor abgenommen werden. Beispielsweise können zwei Impulse aus einem einzelnen Streulicht-Detektor zu Zeitgebungs-Zwecken verwendet werden. Alternativ können zwei Rot-Fluoreszenz-Impulse zur Zeitgebung verwendet werden. Ein Schwellwert-Detektor detektiert einfach zwei Übergänge, die zum Berechnen einer Impulszeitgebungs-Trennung verwendet werden können.
Die Subtraktion kann an den Impulsen in der Form vorgenommen werden, wie diese von den jeweiligen Photodetektoren ausgegeben werden, oder nachdem die Impulse verarbeitet worden sind. Selbstverständlich verändert jede Einrichtung, einschließlich der Verzögerungseinrichtung 30, den durchlaufenden Impuls auf irgendeine Weise. Die vorliegende Erfindung sorgt jedoch für beabsichtigte Impuls-Transformationen vor der Subtraktion. Beispielsweise kann die Spitzen-Haltefunktion vor der Subtraktion implementiert werden. Dies erleichtert die Zeitgebungs-Toleranz bei der Impuls-Ausrichtung. Das Durchführen der Subtraktion nach dem Spitzen-Halten kann jedoch Fehler kompoundieren, die durch das Spitzen-Halten eingeführt werden.
Das Problem des Durchführens der Übersprech-Reduzierung vor dem Spitzen- Halten hängt mit einer Begrenzung des Durchführens einer Übersprech-Reduzierung in der Digital-Domäne zusammen. Durch die Konvertierung zum Digitalen werden Quantisierungsfehler eingeführt, die durch Operationen in der Digital-Domäne kompoundiert werden können. Das Durchführen einer Übersprech-Reduzierung in der Analog-Domäne gemäß den Lehren der vorliegenden Erfindung kann das Kompoundieren von Quantisierungsfehlern reduzieren. Andererseits kann die gemäß der vorliegenden Erfindung vorgesehene Analog- Übersprech-Reduzierung durch weitere Übersprech-Reduktion in der Digital- Domäne ergänzt werden.
Die vorliegende Erfindung umfasst auch eine Ausführungsform, bei der überflüssige unverzögerte erste Fluoreszenz-Impulse und verzögerte zweite Fluoreszenz-Impulse dem Analog-Impuls-Subtraktor nicht vorgelegt werden. Ein Demultiplexer kann den ersten Impuls dem Impuls-Subtraktor durch die Verzögerung zuleiten und dann den zweiten Fluoreszenz-Impuls direkt dem zweiten Eingang des Impuls-Subtraktors zuführen. Die Zeitgebung der Weiterleiteinrichtung kann auf der Basis der Streulicht-Detektionen bestimmt werden. Beispielsweise kann der Weiterleitungs-Schalter entweder durch einen Abfall- Übergang einer Streulicht-Detektion an der ersten Durchflussrohr-Stelle oder durch den Anstiegs-Übergang einer Streulicht-Detektion an der zweiten Durchflussrohr-Stelle getriggert werden.
Anstelle eines ausschließlichen Rückgriffs auf sichtbares Licht kann auch Strahlung sowohl mit längerer als auch mit kürzerer Wellenlänge für die Erregung verwendet werden, und ferner können Materialien verwendet werden, die in nichtsichtbaren Strahlungsbereichen fluoreszieren. Selbstverständlich müssen diese Variationen durch eine geeignete Wahl optischer Elemente und Detektoren aufgenommen werden. Hier bezieht sich der Ausdruck "Strahlung" auf elektromagnetische Strahlung.
Im Kontext eines Durchflusszytometrie-Systems lässt man Blutzellen stationäre Laser-Strahlen passieren. Im Kontext eines Abtast-Mikroskops können die Laser-Strahlen relativ zu den stationären fluoreszierenden Partikeln bewegt werden. Diese und weitere Modifikationen und Variationen der bevorzugten Ausführungsformen liegen im Ermessen der vorliegenden Erfindung, deren Umfang nur die folgenden Ansprüche begrenzt ist.

Claims

1. Fluoreszenz-Analysator (10) mit:

einer Erregerquelle (12) zum Beleuchten einer ersten Stelle (LC1) mit einer ersten Erreger-Wellenlänge und einer zweiten Stelle (LC2) mit einer zweiten Erreger-Wellenlänge;

einer Bewegungsvorrichtung zum relativen Führen eines Tast-Partikels und von Zeitgebungs-Partikeln entlang der ersten Stelle und dann der zweiten Stelle mit einer vorbestimmten Geschwindigkeit;

einem optischen Subsystem (16) zum Lenken der von der ersten und der zweiten Stelle ausgehende Strahlung;

einer Photodetektorvorrichtung (18) zum Ausgeben von Impulsen als Reaktion auf Veränderungen der Strahlung, die auftreten, wenn sich einer der Partikel an einer der genannten Stellen befindet, wobei die Photodetektorvorrichtung einen ersten Satz unverzögerter erster Fluoreszenz- Impulse ausgibt, der mindestens einen unverzögerten ersten Fluoreszenz-Impuls enthält, wenn sich der Tast-Partikel an der ersten Stelle befindet, die Photodetektorvorrichtung einen zweiten Satz zweiter Fluoreszenz-Impulse ausgibt, der mindestens einen unverzögerten zweiten Fluoreszenz-Impuls enthält, wenn sich der Tast-Partikel an der zweiten Stelle befindet, der Photodetektor erste Zeitgebungs-Impulse zu Zeiten ausgibt, zu denen sich einer der Zeitgebungs-Partikel an der ersten Stelle befindet, und der Photodetektor zweite Zeitgebungs-Impulse zu Zeiten ausgibt, zu denen sich einer der Zeitgebungs-Partikel an der zweiten Stelle befindet;

einer Vorrichtung (30) zur variablen Verzögerung, zum Verzögern jedes unverzögerten ersten Fluoreszenz-Impulses des ersten Satzes relativ zu jedem unverzögerten zweiten Fluoreszenz-Impuls des zweiten Satzes, um einen Satz verzögerter erster Fluoreszenz-Impulse zu erzeugen, wobei die Verzögerungsvorrichtung die unverzögerten ersten Zeitgebungs- Impulse derart verzögert, dass jeweilige verzögerte erste Zeitgebungs- Impulse erzeugt werden, und wobei die Verzögerungsvorrichtung einen Verzögerungssteuereingang aufweist;

einer Impulsdetektionsvorrichtung (42) zum Erzeugen von Zeitgebungsangaben, die entsprechenden Referenzpunkten an den Zeitgebungs- Impulsen entsprechen, wobei die Impulsdetektionsvorrichtung mit der Photodetektorvorrichtung verbunden ist, um die ersten Zeitgebungs- Impulse und die zweiten Zeitgebungs-Impulse zu empfangen;

einer Steuervorrichtung (44) zum Einstellen der Verzögerungsvorrichtung zur Steuerung der Zeitgebungs-Ausrichtung des Satzes verzögerter erster Fluoreszenz-Impulse relativ zu dem Satz unverzögerter zweiter Fluoreszenz-Impulse, wobei die Steuervorrichtung mit der Verzögerungsvorrichtung verbunden ist, um die Verzögerung zwischen jedem unverzögerten zweiten Fluoreszenz-Impuls und jedem verzögerten ersten Fluoreszenz- Impuls zu steuern; und

einer Impulssubtraktionsvorrichtung (32) zum Erzeugen eines Differenz- Impulses, der proportional zu einem der Fluoreszenz-Impufse minus eines Betrags ist, welcher linear mit dem unverzögerten zweiten Fluoreszenz-Impuls variiert, wobei die Impulssubtraktionsvorrichtung mindestens einen ersten Eingang aufweist, der mit der Verzögerungsvorrichtung verbunden ist, um den verzögerten ersten Satz zu empfangen, die Impulssubtraktionsvorrichtung mindestens einen zweiten Eingang aufweist, der mit der Photodetektorvorrichtung verbunden ist, um den zweiten Satz zu empfangen, dadurch gekennzeichnet, dass die Steuervorrichtung mit der Impulsdetektionsvorrichtung verbunden ist, um von dieser die Zeitgebungsangaben zu empfangen, die Steuervorrichtung aus den Zeitgebungsangaben einen Zeitgebungsfehler bestimmt und, wenn der Zeitgebungsfehler eine vorbestimmte Fehlertoleranz überschreitet, die Steuervorrichtung die Verzögerungsvorrichtung derart einstellt, dass der Zeitfehler reduziert wird.

2. System nach Anspruch 1, bei dem die vorbestimmten Referenzpunkte Punkte sind, an denen Vorder- und Rückflanken der Zeitgebungs-Impulse vorbestimmte Schwellwerte überschreiten.

3. System nach Anspruch 1, bei dem die Steuervorrichtung den Zeitgebungsfehler bestimmt, indem sie eine jeweilige aktuelle Verzögerung, die durch die Verzögerungsvorrichtung erzeugt wird, mit der Zeitdifferenz zwischen einem unverzögerten ersten Zeitgebungs-Impuls und einem jeweiligen unverzögerten zweiten Zeitgebungs-Impuls vergleicht, der über die Zeitgebungs-Partikel gemittelt ist.

4. System nach Anspruch 1, bei dem die vorbestimmten Referenzpunkte Punkte sind, an denen Vorder- und Rückflanken der Zeitgebungs-Impulse vorbestimmte Schwellwerte überschreiten, die Zeitgebungsdifferenz äquivalent zu ((t&sub4; + t&sub3;) - (t&sub2; + t&sub1;)) ist, wobei t&sub1; die Zeit der Detektion der Vorderflanke des jeweiligen unverzögerten ersten Detektions-Impulses, t&sub2; die Rückflanke des jeweiligen unverzögerten ersten Detektions-Impulses, t&sub3; die Vorderflanke des jeweiligen unverzögerten zweiten Zeitgebungs- Impulses und t&sub4; die Rückflanke des jeweiligen unverzögerten zweiten Zeitgebungs-Impulses ist.

5. Verfahren mit folgenden Schritten:

Beleuchten einer ersten Stelle (LC1) mit Strahlung einer ersten Wellenlänge und Beleuchten einer zweiten Stelle (LC2) mit Strahlung einer zweiten Wellenlänge;

serielles Vorbeiströmenlassen eines Satzes von Zeitgebungs-Partikeln an der ersten Stelle und der zweiten Stelle in dieser Reihenfolge;

für die Zeitgebungs-Partikel, Erzeugen jeweiliger unverzögerter erster Zeitgebungs-Impulse, wenn die Zeitgebungs-Partikel jeweils die erste Stelle erreichen, und Erzeugen jeweiliger unverzögerter zweiter Zeitgebungs-Impulse, wenn die Zeitgebungs-Partikel jeweils die zweite Stelle erreichen;

Verwenden einer Verzögerungsvorrichtung (30), die die ersten unverzögerten Zeitgebungs-Impulse verzögert, um jeweilige verzögerte erste Zeitgebungs-Impulse zu erzeugen;

Bestimmen eines Zeitgebungsfehlers zwischen den verzögerten ersten Zeitgebungs-Impulsen und den unverzögerten zweiten Zeitgebungs-Impulsen;

falls der Fehler größer ist als eine vorbestimmte Toleranz, Einstellen der Verzögerungsvorrichtung zum Reduzieren des Fehlers unter die Toleranz;

Vorbeiströmenlassen eines Fluoreszenz-Partikels (CEL) an den ersten und zweiten Stellen in dieser Reihenfolge;

Detektieren der vom dem Partikel ausgegebenen Fluoreszenz zum Erzeugen eines unverzögerten ersten Fluoreszenz-Impulses, während sich der Fluoreszenz-Partikel an der ersten Stelle befindet, und zum Erzeugen eines unverzögerten zweiten Fluoreszenz-Impulses, während sich der Fluoreszenz-Partikel an der zweiten Stelle befindet;

Verwenden der Verzögerungsvorrichtung (30) zum Verzögern des unverzögerten ersten Fluoreszenz-Impulses; und

Subtrahieren eines Bruchteils des zweiten Impulses von dem verzögerten ersten Fluoreszenz-Impuls oder dem unverzögerten zweiten Fluoreszenz- Impuls.