DE69621731T2 - Bestimmung von Metallionen durch Sandwich-Ansammlungsassay - Google Patents

Bestimmung von Metallionen durch Sandwich-Ansammlungsassay

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Description

    HINTERGRUND DER ERFINDUNG 1. Gebiet der Erfindung
  • Die Erfindung betrifft ein Verfahren und Reagenzien zur Messung mehrwertiger Metallionen in wässrigen Medien, insbesondere von Blei-Ionen in physiologischen Flüssigkeiten.
    • 2. Beschreibung des Standes der Technik
  • Schwermetalle, wie Blei, Cadmium, Quecksilber usw., sind dafür bekannt, dass sie toxisch sind und schädliche Wirkungen auf Menschen ausüben. Blei und seine Verbindungen, die über Jahrhunderte hinweg in breitem Umfang über die Umwelt als Ergebnis ihrer industriellen Anwendungen verteilt worden sind, tragen eine signifikante Gesundheitsgefährdung in sich. Die Toxizität von Blei ist durch seine Affinität zu Thiol- und zellulären Phosphat- Gruppen von Enzymen und Proteinen bedingt, es inhibiert auch die Biosynthese von Häm und steigert die vorzeitige Zerstörung roter Zellen. Blei ist auch toxisch für das Zentrale Nervensystem, insbesondere bei Kindern. Es wird geschätzt, dass über 3 Millionen Vorschulkinder gefährlich erhöhte Blei-Konzentrationen in sich tragen. Während der größte Teil des Bleis der Umwelt aus der Verbrennung von bleihaltigem Benzin resultiert, stellt die konzentrierteste Blei-Quelle in der Umgebung von Kindern bleihaltige Farbe dar. Die Aufnahme von Blei kann über den Magen-Darm-Trakt, die Lungen oder die Haut erfolgen. Es häuft sich in Knochen, Nieren, der Leber und weiteren Organen an. Zusätzlich dazu, dass es Neurotoxizität zeigt und ergibt, ist Blei auch als ein wahrscheinliches Karzinogen eingestuft worden.
  • Die Bestimmung von Blei in Gesamtblut ist zur Verfolgung einer entsprechenden Kontamination wichtig, insbesondere bei Kindern. In 1991 setzten die Zentren zur Krankheitsüberwachung und -vorbeugung in den Vereinigten Staaten die zulässige Grenze der Blei-Konzentration im Blut von 25 auf 10 mg/dL herab und empfahlen, Blei im Blut aller Kinder unter einem Alter von 6 Jahren durch Messung zu überwachen. Somit wurde das übliche indirekte Verfahren der Blei-Bestimmung durch die Fluoreszenz von Zink-Protoporphyrin wegen der ungenügenden Empfindlichkeit ungeeignet. Die Messung von Blei in Gesamtblut bei Konzentrationen unterhalb 20 mg/dL stellt eine Herausforderung wegen der komplexen Natur der Matrix dar. Ein einfaches, zuverlässiges und preiswertes Verfahren zur Messung von Blei in Blut ist nicht verfügbar. Atomabsorptionsspektrofotometrie und Anodenstreif-Volametrie sind die am häufigsten angewandten Verfahren. Obwohl sie genau sein sollen, sind sie allerdings auch aufwendig, anfällig für Kontamination und teuer.
  • Über weitere Verfahren zur Blei-Bestimmung ist kürzlich berichtet worden. Die Anwendung stabiler Isotopenverdünnungs-Gaschromatografie- Massenspektrometrie (Herold et al. Clin. Chem. 40, 1994) zur Bestimmung von Blei in Urin und Gesamtblut ist beschrieben worden. Über eine spektrofotometrische Bestimmung von Blei in Wasser mit einem Porphyrin-System ist ebenfalls berichtet worden (Schneider und Horning, Analyst 118, 933, 1993). Es ist auch eine Messung von Blei durch eine Blei-selektive Optode, mit subnanomolarer Nachweisgrenze, dargelegt worden (Simon et al. Anal. Chem. 64, 1534, 1992). Enzym-basierte Bionachweis-Systeme für Blei, in denen 8- Aminolävulinsäure-Dehydrase (Silbergeld, US 5,354,652 vom 11. Oktober 1994) oder Isozitrat-Dehydrogenase (Henkens et al. US 5,217,534 vom 08. Juni 1993) angewandt werden, sind ebenfalls vorgeschlagen worden.
  • WO-A-95 14926 offenbart einen Assay unter Anwendung eines ersten Sandwich-Chelators, der an ein Protein gebunden ist, das an einer festen Trägerunterlage immobilisiert ist. Ein zweiter Sandwich-Chelator ist an ein Enzym gebunden, das eine daran immobilisierte Reporter-Gruppe aufweist.
  • US-A-4,080,171 betrifft ein System, worin eine Flüssigkeit durch ein Filterpapier filtriert wird, das eine funktionelle Gruppe zum Ionenaustausch und funktionelle Gruppen zur Bindung eines Chelat bildenden Ions aufweist.
    • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung mehrwertiger Metallionen unter Anwendung eines Sandwich-Aggregationsassay. Ein oder mehrere Chelat bildende Mittel mit der Befähigung zur Bildung von Komplexen mit mehrwertigen Metallionen in mindestens einem 2 : 1- oder höheren Stöchiometrieverhältnis werden an einen geeigneten Träger wie Latexpartikel durch kovalente Bindungen oder durch nicht-kovalente Wechselwirkungen, wie hydrophobe Wechselwirkungen, gebunden. Bei Komplexierung mit den Metallionen aggregieren die Träger des Komplexiermittels und verursachen eine Erhöhung der Lichtabsorption oder Lichtstreuung, die proportional zur Konzentration von Metallionen in der Testprobe sind. Die Messung der Lichtabsorption oder Lichtstreuung mit einem geeigneten Gerät, wie einem Spektrofotometer oder Nephelometer, stellt ein Mittel zur Messung der Konzentration von Metallionen dar.
    • BESCHREIBUNG BEVORZUGTER AUSFÜHRUNGSFORMEN
  • Die vorliegende Erfindung wird zum Nachweis und zur Messung einer Vielzahl von Metallionen angewandt, einschließlich von Blei, Kupfer, Cadmium, Kobalt, Calcium, Chrom, Eisen, Aluminium, Mangan, Molybdän, Quecksilber, Nickel, Uran, Vanadin, Zink, Magnesium und dgl.. Die Empfindlichkeit und Selektivität des Systems aus einem Chelat bildenden Mittel, das mit einem Träger zusammengebracht ist, hängt vom eingesetzten Chelat bildenden Mittel ab. Ferner kann die Selektivität durch Verwendung geeigneter Masken, wie von Neocuproin zur Maskierung von Kupfer, noch gesteigert werden. Die Metallionen werden am häufigsten in einer Matrix, wie Wasser, Blut, Urin, Serum, Milch oder dgl., vorgefunden. Es sollte auch klar sein, dass Anionen gemäss den Grundzügen der vorliegenden Erfindung ebenfalls gemessen werden können, wie z. B. Sulfid und Carbonat, und zwar durch Auswahl eines geeigneten Komplexiermittels.
  • Die Chelat bildenden Mittel, die Komplexe, z. B. mit Blei, bilden, können, ohne darauf eingeschränkt zu sein, aus einer Vielzahl von Verbindungen, wie aus Mercaptoamiden, Mercaptothioamiden, Mercaptanen, Mercaptoaminen, Mercaptothionen, Aminothionen, Thiohydroxamsäuren, Hydroxypyridinthionen, Aminothiophenolen, Aminophenolen und aus Dithiocarbamaten ausgewählt sein.
  • Das Chelat bildende Mittel kann an einen geeigneten Träger zum Zeitpunkt der Bildung der Reaktionsmischung ge- oder verbunden werden, oder es kann in einer Form vorliegen, die dazu befähigt ist, sich mit einem Träger zu verbinden. Im letzteren Fall kann beispielsweise eine Wechselwirkung zwischen einem Ligand und einem spezifischen Bindungspartner für den Ligand, wie ein Antikörper-Antigen, Hapten-anti-Hapten-Antikörper oder Avidin-Biotin, genutzt werden. Der Bindungspartner kann an den Träger entweder durch kovalente oder nicht-kovalente Mittel angebunden werden.
  • Ein Konjugat, das den Ligand und das Chelat-Bildungsmittel umfasst, das einen Komplex mit dem Metallion in mindestens einem 2 : 1- oder höheren Stöchiometrieverhältnis bildet, ist herstellbar, wobei für alle praktischen Zwecke das Maximalverhältnis durch die Wertigkeit des Metalls gesteuert wird. Somit betragen die meisten Verhältniswerte von Konjugat zu Metall 2 bis 3 : 1. Bei Kontakt mit den Metallionen bildet das Konjugat einen Komplex, der seinerseits wiederum die Aggregation bzw. Zusammenlagerung des Trägers wegen der Ligand-Bindungspartner-Wechselwirkung induziert bzw. herbeiführt.
  • Der Träger kann in der Reaktionsmischung löslich oder unlöslich sein, so lange die Aggregation des Trägers zu einer messbaren Änderung der Lichtabsorption oder -steuerung führt. Der Träger ist in typischer Weise ein teilchenförmiges Material und kann ein Mikropartikel wie Latexpartikel, hergestellt durch Emulsions- oder Suspensionspolymerisation, Feinpigmente, Partikel aus Oxiden, z. B. aus Silizium-, Titan- oder Zinkoxid, und Sulfate wie Barium- oder Calciumsulfat sein.
  • Die Mikropartikel können neutrale oder synthetische Makromoleküle, z. B. Polysaccharide, bestimmte Polypeptide oder Dendrimere sein, die Makromoleküle können linear, globulär oder vernetzt sein. Die Mikropartikel können einen mittleren Durchmesser im Bereich von ca. 0,01 bis ca. 10, vorzugsweise von ca. 0,01 bis ca. 1 und am meisten bevorzugt von ca. 0,1 bis ca. 0,25 um aufweisen. Die einzige Einschränkung bei den Mikropartikeln der Wahl ist es, dass sie keine Ionen enthalten sollten, die die spezifische Chelat-Bildungsreaktion oder den spezifischen Metall-Nachweis stören.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform wird ein Konjugat aus Biotin- und Thiomilchsäure, die durch ein Polyether-Verbindungsstück aneinander gebunden sind, mit einer bleihaltigen Probe in Kontakt gebracht. Ein 2 : 1- Konjugat/Blei-Komplex wird gebildet. Der Komplex wird dann mit Latexpartikeln in Kontakt gebracht, die mit Avidin überzogen sind. Wegen der hohen Affinität von Biotin zu Avidin tritt Aggregation ein, und es wird die Steigerung der Absorption, die proportional zur Konzentration von Blei ist, mit einer geeigneten Analysevorrichtung, wie einem Spektrofotometer, gemessen.
  • In den folgenden Beispielen sind verschiedene Gesichtspunkte des erfindungsgemäßen Gegenstandes dargelegt. Es wird verständlich sein, dass die nun folgenden Zubereitungen und Vorgehensweisen lediglich zum Zwecke einer weiteren Verdeutlichung angegeben sind und dass weitere äquivalente Bestandteile, Mengenverhältnisse und Vorgehensweisen gemäss den Grundzügen der vorliegenden Erfindung angewandt werden können.
    • Beispiel 1: Herstellung von Reagens 1 zur Blei-Bestimmung
  • Eine Vorratslösung (2,0 L) von 2,5 mg/mL (2-Phenyl)ethylthiomilchsäureamid in Ethanol wurde hergestellt. Eine Anteilsmenge (8 mL) dieser Lösung wurde zu 10 mL 0,01 N NaOH gegeben und verrührt. Zu dieser Lösung wurden 0,5 mL 5%-iger Polyvinyltoluol-Latex gegeben und die Mischung wurde 2 h lang zur Bildung der Zusammensetzung von Reagens 1 gerührt.
    • Beispiel 2: Bestimmung von Blei mit Reagens 1
  • Eine Probe von Reagens 1 (0,30 mL) wurde mit 1,7 mL 0,1 M 2-Amino-2- methylpropanol (AMP)-Puffer (pH = 10), enthaltend 0,1 N NaCl, in einer 3 mL Küvette vermischt. Eine 10 mL Probe einer wässrigen Lösung von Bleinitrat (1,0 · 10&supmin;&sup5; M) wurde zugefügt, um 5,0 · 10&supmin;&sup8; M Pb²&spplus; in der Küvette zu erhalten, dies wurde vermischt und die Änderung der Absorption bei 600 Nanometern (nm) nach 5 min mit einem Cary 3 Spektrofotometer (Varian Analytical Instruments) aufgenommen. Weitere Konzentrationen wurden durch Zugabe von 2, 5 und 10 mL 1,0 · 10&supmin;&sup4; M Bleinitrat erhalten, um [Pb²&spplus;]-Konzentrationen von 1,0, 2,5 bzw. 5,0 · 10&supmin;&sup7; M zu erhalten. Tabelle 1 zeigt die Reaktionsdaten von Blei, die mit dem Spektrofotometer erhalten wurden: Tabelle 1
    • Beispiel 3: Herstellung von Reagens 2 zur Blei-Bestimmung
  • Eine Vorratslösung (2,0 L) von 2,5 mg/mL (2-Phenyl)ethylamid von N-(2-Mercaptopropionyl)glycin in Ethanol wurde hergestellt. Eine Anteilsmenge (20 mL) dieser Lösung wurde zu 10 mL 0,01 N NaOH gegeben und verrührt. Zu dieser Lösung wurden 0,5 mL 5%-iger Polyvinyltoluol-Latex gegeben und die Mischung wurde 2 h lang zur Bildung der Zusammensetzung von Reagens 2 gerührt. Beispiel 4: Tabelle 2 zeigt die Reaktionsdaten von Blei, erhalten mit Reagens 2 unter Anwendung der Verfahrensweise von Beispiel 2: Tabelle 2
    • Beispiel 5: Blei-Assay
  • Eine Probe von Reagens 2 (0,30 mL) wurde mit 1,3 mL 0,14 M 2-Amino-2- methylpropanol (AMP)-Puffer (pH = 10), enthaltend 0,13 N NaCl, in einer 3 mL Küvette vermischt. Eine 0,4 mL Probe einer wässrigen Lösung von Bleinitrat (0, 10, 15, 20, 30 und 50 mg/dL Pb²&spplus;) wurde zum Puffer in der Küvette gegeben und vermischt, worauf die Absorption bei 600 nm nach 5 min mit einem Spektrofotometer aufgenommen wurde. Eine Probe der Blei-Reaktionen ist in Tabelle 3 angegeben: Tabelle 3
  • Der Blei-Gehalt in den in Tabelle 3 angegebenen Daten ist mit toxischen Konzentrationen von Blei vergleichbar, die in Blut in Fällen einer Bleivergiftung vorgefunden werden.
    • Beispiel 6: Herstellung von Reagens 3 zur Calcium-Bestimmung
  • Eine Vorratslösung (2,0 mL) von Dodecylphosphat in Ethanol wurde zubereitet. Eine Anteilsmenge (0,10 mL) wurde zu 10 mL 0,01 N NaOH gegeben und verrührt. Zu dieser Lösung wurde 0,5 mL 5%-iger Polyvinyltoluol-Latex gegeben und die Mischung wurde 2 h lang zur Bildung der Zusammensetzung von Reagens 3 gerührt.
    • Beispiel 7: Bestimmung von Calcium mit Reagens 3
  • Eine Probe von Reagens 3 (0,30 mL) wurde mit 1,7 mL 0,2 N NaOH in einer 3 mL Küvette vermischt. Proben (5 bis 10 mL) einer wässrigen Lösung von Calciumchlorid (0,1 M) wurden zugegeben und vermischt, worauf die Änderung der Absorption bei 600 nm mit einem Cary Spektrofotometer nach 5 min aufgenommen wurde. Die Reaktionen auf unterschiedliche Calcium-Gehaltsmengen sind in Tabelle 4 angegeben: Tabelle 4
  • Zur Herstellung des in den Reagenzien zur Blei-Bestimmung verwendeten Chelat-Bildungsmittels wurden, wenn nichts Anderes angegeben ist, die Reaktionsteilnehmer und Lösungsmittel in Reagens-Reinheit verwendet, wie von den Lieferanten der Chemikalien erhalten. Dimethylsulfoxid (DMSO) wurde über Molekularsieben (4 Ä) (Aldrich) getrocknet. 1,17-Diamino-3,6,9,12,15- pentaoxaheptadecan wurde gemäß einem veröffentlichten allgemeinen Verfahren synthetisiert (Lehn, Tetrahedron 29, 1629, 1979). Die Schmelzpunkte wurden an einem Thomas-Hoover-Kapillarapparat bestimmt. ¹H-NMR-Spektren wurden mit einem Varian Gemini 200 MHz Spektrometer aufgenommen, und die chemischen Verschiebungen sind in Parts per Million (d) feldabwärts von Tetramethylsilan angegeben. Beispiel 8: Herstellung von N-(2'-Phenylethyl)-2-mercaptopropionamid
  • N-Hydroxysuccinimid (0,58 g, 5,0 mMol) und Dicyclohexylcarbodiimid (1,03 g, 5,0 mMol) wurden zu einer Lösung von Thiomilchsäure (0,53 g, 5,0 mMol) in CH&sub2;Cl&sub2; (8 mL) gegeben. Die Mischung wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt und hinein in 2-Phenethylamin (0,61 g, 5,0 mMol) filtriert. Die Reaktionsmischung wurde 24 h lang bei Raumtemperatur gerührt und dann filtriert, worauf das Lösungsmittel im Vakuum aus dem Filtrat entfernt wurde. Der Rückstand wurde an Kieselgel mit CH&sub2;Cl&sub2; und CH&sub2;Cl&sub2;/MeOH (98/2) als Eluierungsmittel chromatografiert, um 0,68 g (65%) des N-(2'-Phenylethyl)- 2-mercaptopropionamid-Produkts als Feststoff mit einem F. von 78 bis 79ºC zu ergeben. ¹H-NMR(CDCl&sub3;): δ 1,51 (d, 3H), 1,93 (d, 1H), 2,84 (t, 2H), 3,30 -3,60 (m, 3H), 6,90 (br s, 1H), 7,15-7,38 (m, 5H) Beispiel 9: Herstellung des N-(2-Phenylethyl)amids von 2-Mercaptopropionylglycin
  • N-Hydroxysuccinimid (0,58 g, 5,0 mMol) und Dicyclohexylcarbodiimid (1,03 g, 5,0 mMol) wurden zu einer Lösung von 2-Mercaptopropionylglycin (0,82 g, 5,0 mMol) in DMSO (16 mL) gegeben und die Reaktionsmischung wurde 5 h lang bei Raumtemperatur gerührt. Die Mischung wurde hinein in 2-Phenethylamin (0,60 g, 5,0 mMol) filtriert und über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt und der Rückstand wurde an Kieselgel mit CHCl&sub3;/MeOH (97/3) als Eluierungsmittel chromatografiert, um 0,55 g (41%) des Produkts als Feststoff mit einem F. von 116 bis 118,5ºC zu ergeben. ¹H-NMR (CDCl&sub3;): δ 1,51 (d, 3H), 2,02 (d, 1H), 2,81 (t, 2H), 3,33-3,60 (m, 3H), 3,86 (d, 2H), 6,29 (br s, 1H), 7,10-7,37 (m, 5H) Beispiel 10: Herstellung eines Biotin-Thiomilchsäure-Konjugats
  • Eine Lösung von Di-t-Butylcarbonat (0,78 g, 3,57 mMol) in Ethylether (10 mL) wurde 3 h lang zu einer Lösung von 1,17-Diamino-3,6,9,12,15- pentaoxaheptadecan (1,00 g, 7,1 mMol) in DMSO (10 mL) bei 16 bis 20ºC getropft. Die Reaktionsmischung wurde bei Raumtemperatur 24 h lang gerührt. Eine hinreichende Menge Wasser und Ethylether wurde zugefügt, um die Reaktionsmischung zu verteilen. Die organische und wässrige Schicht wurden getrennt, die wässrige Schicht wurde zuerst mit Ethylether und dann mit CH&sub2;Cl&sub2; extrahiert. Die organischen Schichten wurden vereinigt und über K&sub2;CO&sub3; getrocknet. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt und der Rückstand wurde an deaktiviertem basischen Aluminiumoxid mit CHCl&sub3;/MeOH (98/2) chromatografiert, um 0,90 g (33%) des mono-BOC-geschützten Produkts NH&sub2;(CH&sub2;CH&sub2;O)&sub5;CH&sub2;CH&sub2;NH-BOC als blassgelbe, viskose Flüssigkeit zu ergeben. ¹H- NMR (CDCl&sub3; + D&sub2;O): δ 1,41 (s, 9H), 2,82 (br s, 2H), 3,28 (t, 2H), 3,45- 3,67 (m, 22H)
  • N-Hydroxysuccinimid (0,12 g, 1,04 mMol) und Dicyclohexylcarbodiimid (0,21 g, 1,02 mMol) wurden zu einer Lösung von Biotin (0,24 g, 0,98 mMol) in DMSO (2 mL) gegeben. Die Mischung wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt und hinein in das t-Butoxycarbonyl (BOC)-geschützte Amin NH&sub2;(CH&sub2;CH&sub2;O)&sub5;CH&sub2;CH&sub2;NH-BOC (0,35 g, 0,96 mMol) filtriert. Die Reaktionsmischung wurde bei Raumtemperatur 20 h lang gerührt. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt und der Rückstand wurde an Kieselgel mit CHCl&sub3;/MeOH (9/1) als Eluierungsmittel chromatografiert, um 0,60 g (100%) Biotin- Derivat:
  • als gelatinösen Feststoff zu ergeben. ¹H-NMR (CDCl&sub3;): δ 1,43 (s, 9H), 1,57-1,82 (m, 6H), 2,22 (t, 2H), 2,67-2,97 (m, 2H), 3,07-3,68 (m, 25H), 4,26-4,35 (m, 1H), 4,45-4,54 (m, 1H), 5,10 (br s, 1H), 5,38 (br s, 1H), 6,32 (br s, 1H), 6,70 (br s, 1H)
  • Das Biotin-Derivat wurde mit Trifluoressigsäure (10 mL) behandelt und die Lösung wurde bei Raumtemperatur 0,5 h lang gehalten. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt und der Rückstand wurde in Dimethylformamid (2 mL) gelöst und mit Triethylamin basisch gestellt. Zu dieser Lösung wurde 1 mMol N-Hydroxysuccinimidester von Thiomilchsäure gegeben. Die Mischung wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt, der Rückstand wurde in CHCl&sub3; erneut aufgelöst und mit von Sauerstoff befreitem Wasser gewaschen, um eine Oxidation der Sulfhydryl-Gruppen zu verhindern. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt und der Rückstand wurde an Kieselgel mit CHCl&sub3;/MeOH (9/1 bis 8/1) chromatografiert, um das Konjugat herzustellen:
  • ¹H-NMR (CDCl&sub3; + D&sub2;O): δ 1,37-1,95 (m, 10H), 2,23 (t, 2H), 2,61- 2,97 (m, 3H), 3,16 (q, 1H), 3,37-3,72 (m, 24H), 4,28 (m, 1H), 4,45-4,55 (m, 1H)
    • Beispiel 11: Herstellung von Avidin-Latexpartikeln (60 mg/mg)
  • 4,0 mL von 5,0% (G/V) 165 nm Kern-Schale-Latexpartikeln aus einem Polyvinyltoluol-Kern und einer Polyvinylbenzylchlorid-Schale wurden gemäß US- Patentanmeldung mit der Nr. 08/330,259 vom 27. Oktober 1994 hergestellt. Die Kern-Schale-Latexpartikel wurden zu 15,0 mL 0,01 M Phosphat-Puffer mit pH = 9,5 gegeben und 30 min lang gerührt. 20 mL 0,01 M Phosphat-Puffer mit pH = 9,5, enthaltend 12,0 mg Avidin, wurden dann zugefügt, und es wurde weitere 30 min lang gerührt. Die Suspension wurde bei 40ºC 3 h lang in einem Inkubator mit mechanischem Schüttler inkubiert. Nach 3 h wurde die Suspension aus dem Inkubator entnommen, 5,0 mL 2 M Ethanolamin wurden zugegeben und die Mischung weitere 18 h lang bei 40ºC inkubiert. Gleiche Volumina der Suspension wurden in 2 Röhrchen gegeben und bei 16000 Upm 1 h lang bei einer Temperatur von 8 bis 15ºC in einer gekühlten Ultrazentrifuge zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen, und es wurden 10,0 mL Lösung von 0,9% (G/V) NaCl und 0,02% (G/V) Tween ® -20 zum Pellet in jedem Röhrchen gegeben, mit Ultraschall behandelt und bei 16000 Upm zentrifugiert. Die Resuspendierungs-, Ultraschall- und Zentrifugationsstufen wurden 2 Mal mit 10 mL Anteilsmengen der NaCl-Lösung wiederholt. Die Pellets wurden dann vereinigt und in 100 ml Lösung aus 0,9% (G/V) NaCl, 0,2% Tween ® -20 und aus 0,5 mM NaOH resuspendiert. Diese Lösung wurde dann erneut mit Ultraschall behandelt, um eine einheitliche Avidin-Latexsuspension zu erhalten. Die Avidin-Partikel wurden bei 4ºC aufbewahrt.
    • Beispiel 12: Bestimmung von Blei mit Biotin-Thiomilchsäure-Konjugat (Reagens 4)
  • Eine Vorratslösung von 5,0 · 10&supmin;&sup5; M Biotin-Thiomilchsäure-Konjugat wurde in Methanol, enthaltend 0,05% V/V Tributylphosphin, zubereitet. Eine Anteilsmenge (40 mL) dieser Lösung wurde zu 2,0 mL 0,2 N NaCl und 0,05% Triton ® X-100 (Rohm and Haas) gegeben und verrührt, um R1 zu bilden. R2 bestand aus einer 2 mg/mL Lösung von 60 mg/mg Avidin-Latexpartikeln (Beispiel 11) in 0,9% (G/V) NaCl und 0,1% (G/V) Triton ® X-100.
  • Der Assay von Blei wurde an einem RA-XT-Analysegerät (Bayer Corporation, Tarrytown, New York, USA) bei 37ºC mit den Null-Ordnung-Quadrat-Rate- Chemieparametern durchgeführt:
  • RA-XT-Parameter:
  • R1: 320 mL
  • R2: 80 mL
  • Probenvolumen: 4 mL
  • Filter: 600 nm
  • Verzugszeit: 15 s
  • R2-Verzug: 1 min
  • Wässrige Blei-Proben wurden zubereitet, um 0,0 bis 0,1 mM Blei zu enthalten. Die Proben wurden auf 1 : 100 am Gerät verdünnt, um Endkonzentrationen von 0 bis 20 mg/dL zu ergeben.
  • Die quadratische Rate (Q) in (AU/min), die vom Gerät aufgenommen wird, ist in Tabelle 5 angegeben und wurde zur Erstellung der in Fig. 1 dargestellten Reaktionskurve eingesetzt. Tabelle 5
  • Als Vergleichsversuch wurde die Blei-Reaktion auch in der Abwesenheit des Biotin-Konjugats ermittelt und bestimmt. Dabei wurde Beispiel 12 ohne Zugabe des Biotin-Milchsäure-Konjugats wiederholt, um zu zeigen, dass die Agglutination wegen der Bildung des 2 : 1-Komplexes und nicht wegen einer nicht-spezifischen Agglutination der Avidin-Latexpartikel durch das zweiwertige Kation erfolgte. Die Ergebnisse sind in Tabelle 6 angegeben: Tabelle 6
    • Beispiel 13: Herstellung des Chelat-Bildungsmittels (Reagens 5), angewandt zur Kupfer-Bestimmung
  • N-Hydroxysuccinimid (0,24 g, 2,08 mMol) und Dicyclohexylcarbodiimid (0,42 g, 2,04 mMol) wurden zu einer Lösung von Biotin (0,50 g, 2,05 mMol) in DMSO (5,5 mL) gegeben. Die Mischung wurde 5 h lang bei Raumtemperatur gerührt und hinein in N-Ethylethylendiamin (0,22 mL, 2,05 mMol) filtriert. Die Mischung wurde 3 h lang bei Raumtemperatur gerührt. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt und der Rückstand wurde an Aluminiumoxid mit CHCl&sub3; und CHCl&sub3;/MeOH chromatografiert, um 0,25 g (39%) Biotinamin zu ergeben:
  • ¹H-NMR (CDCl&sub3; + D&sub2;O): δ 1,09 (t, 3H), 1,35-1,85 (m, 6H), 2,22 (t, 2H), 2,55-2,97 (m, 5H), 3,05-3,5 (m, 4H), 4,22-4,37 (m, 1H), 4,43- 4,57 (m, 1H)
  • Das Biotinamin (143 mg, 0,45 mMol) wurde in einer Mischung aus DMSO (1 mL) und Aceton (1 mL) bei 0 bis 5ºC gelöst. Zu dieser Lösung wurde eine Mischung aus Schwefelkohlenstoff (27 mL) und Aceton (30 mL) gegeben und nach Rühren über 10 min bei 0 bis 5ºC wurde eine Lösung von NaOH (19 mg) in Wasser (91 mL) zugefügt, worauf die Mischung bei 0 bis 5ºC 20 min lang gerührt wurde. Aceton wurde zugegeben, um Biotindithiocarbamat auszufällen:
  • welches durch Filtration abgetrennt und mit Ethylether gewaschen wurde. Das Produkt wurde im Vakuum getrocknet und unter Argon aufbewahrt. Das Biotindighicarbamat kann auch zur Bestimmung von Blei und weiteren Schwermetallen verwendet werden.
    • Beispiel 14: Bestimmung von Kupfer mit Biotindithiocarbamat-Konjugat (Reagens 5)
  • Eine Vorratslösung von 9,2 · 10&supmin;&sup5; M Biotindithiocarbamat-Konjugat wurde in 1,0 · 10&supmin;&sup4; M NaOH zubereitet. Eine Anteilsmenge dieser Lösung (44 mL) wurde zu 2 mL 0,2 N NaCl und 0,05% Tween ® 20 (ICN) gegeben und verrührt (R1). R2 bestand aus einer 2 mg/mL Suspension von 60 mg/mg Avidin- Latexpartikeln (Beispiel 11) in 0,9% (G/V) NaCl und 0,1% Tween ® -20.
  • Der Assay von Kupfer wurde am RA-XT bei 37ºC mit den Null-Ordnung- Quadrat-Rate-Chemieparametern durchgeführt:
  • RA-XT-Parameter:
  • R1: 320 mL
  • R2: 80 mL
  • Probenvolumen: 4 mL
  • Filter: 600 nm
  • Verzugszeit: 15 s
  • R2-Verzug: 1 min
  • Wässrige Proben wurden zubereitet, um 0,0 bis 1,0 · 10&supmin;&sup4; M Kupfer zu enthalten. Die Proben wurden 100-fach am RA-XT verdünnt, um Endkonzentrationen von 0,0 bis 6,4 mg/dL Kupfer zu ergeben. Die vom Gerät aufgenommene Q- Rate (AU/min) ist in Tabelle 7 angegeben und wurde zur Auftragung der in Fig. 2 dargestellten Reaktionskurve eingesetzt: Tabelle 7

Claims (9)

1. Test-Zusammensetzung zur Bestimmung der Menge eines mehrwertigen Metallions in einem wässrigen Medium unter Anwendung eines Sandwich- Aggregationsassay, bestehend im wesentlichen aus:
I. einem Chelat bildenden Mittel mit der Befähigung zur Bildung eines Komplexes aus dem Chelat bildenden Mittel und den mehrwertigen Metallionen in einem Stöchiometrie-Verhältnis von mindestens 2 : 1 und
II. Trägern für das Chelat bildende Mittel, worin das genannte Chelatbildende Mittel:
a) an die genannten Träger gebunden ist oder
b) in der Form eines Konjugats mit einem Ligand vorliegt und ein spezifischer Bindungspartner für den genannten Ligand an die genannten Träger gebunden ist, worin, bei der Komplexierung des Chelat bildenden Mittels mit dem mehrwertigen Metallion, die an die komplexierten Chelat bildenden Mittel gebundenen Träger durch die Befähigung gekennzeichnet sind, zu aggregieren, um dadurch einen Anstieg der Lichtabsorption zu verursachen, der proportional zur Konzentration des mehrwertigen Metallions im wässrigen Medium ist.
2. Test-Zusammensetzung gemäß Anspruch 1, worin das Ion aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus Blei, Kupfer, Cadmium, Kobalt, Chrom, Eisen, Aluminium, Mangan, Molybdän, Quecksilber, Nickel, Uran, Vanadin, Zink und aus Magnesium.
3. Test-Zusammensetzung gemäß Anspruch 1, worin das Ion Blei ist.
4. Test-Zusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, worin der Träger mindestens einer ist, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Latexpartikeln, Feinpigmenten, Oxid-Partikeln und aus Sulfaten, worin die mittlere Partikelgröße der Träger vorzugsweise ca. 0,001 bis ca. 10 um beträgt.
5. Test-Zusammensetzung gemäß Anspruch 4, worin das Paar aus Ligand/spezifischem Bindungspartner aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus Biotin/Avidin und Haptenen/anti-Hapten-Antikörpern.
6. Test-Zusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, worin die Träger kovalent an das Chelat bildende Mittel gebunden sind.
7. Test-Zusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7, worin das Chelat-bildende Mittel aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus Mercaptoamiden, Mercaptothioamiden, Mercaptanen, Mercaptoaminen, Mercaptothionen, Aminothionen, Thiohydroxamsäuren, Hydroxypyridinthionen, Aminothiophenolen, Aminophenolen und aus Dithiocarbamaten.
8. Verfahren zur Bestimmung der Menge eines Ions in einer Matrix, umfassend die Stufen (a), wobei man das Ion mit der Test-Zusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7 in Kontakt bringt, und (b), wobei man die entstandene Aggregation in der Reaktionsmischung als Funktion der Menge des Ions in der Matrix misst.
9. Verfahren gemäß Anspruch 8, wobei die entstandene Aggregation durch Messung der Lichtabsorption oder Lichtstreuung der Reaktionsmischung gemessen wird.
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