DE69618957T2

DE69618957T2 - Dna-polymerase verlängungs assay

Info

Publication number: DE69618957T2
Application number: DE69618957T
Authority: DE
Inventors: L. Cole; C. Kuo; B. Olsen
Original assignee: Merck and Co Inc
Current assignee: Merck and Co Inc
Priority date: 1995-06-07
Filing date: 1996-06-03
Publication date: 2002-08-14
Anticipated expiration: 2016-06-04
Also published as: CA2222688A1; JPH11506607A; WO1996040994A1; ATE212676T1; EP0833945A4; ES2170861T3; DE69618957D1; EP0833945A1; EP0833945B1

Description

Gebiet der Erfindung

Diese Erfindung betrifft einen neuen empfindlichen Assay zum Nachweis und zur quantitativen Bestimmung der Anwesenheit eines Enzyms, welches Wirkung entfaltet, um ein einzelsträngiges Oligonukleotid-Produkt zu bilden, oder Inhibitoren eines solchen Enzyms.

Hintergrund der Erfindung

Enzyme, welche Polynukleotide als Substrate verwenden, sind oft für die biochemische Funktion vieler Organismen und Viren von fundamentaler Bedeutung. Diese Gruppe von Enzymen schließt beispielsweise Endonukleasen, Exonukleasen und Ribozyme ein. Eine Reihe von Enzymen wirkt auf Substrate ein, um einzelsträngige Oligonukleotid-Produkte zu ergeben. Beispielsweise spaltet die Influenzavirus-Endonuklease mit einem Cap versehene Wirtszelltranskripte 10 bis 13 Basen vom 5'-Ende. Sequenzspezifische RNA-Endonukleasen sind bekannt; beispielsweise dient die 2-5A-abhängige RNase, die bei höheren Tieren gefunden wird, zur Spaltung einzelsträngiger Bereiche von RNA 3' von UpNp-Dimeren, mit einer Präferenz für UU- und UA-Sequenzen. Darüber hinaus spalten Ribozyme bekanntermaßen einzelsträngige RNAs an spezifischen Erkennungssequenzen.
Obwohl erkannt wurde, daß Inhibitoren oder Aktivatoren diese Enzyme neue Klassen therapeutischer oder präventiver Verbindungen, insbesondere gegen Viruserkrankungen, sein könnten, wurde die Identifizierung solcher Verbindungen durch das Fehlen eines bequemen Assay-Systems behindert.
Ein ideales Enzym-Assay-System sollte aufweisen: a) hohen Durchsatz, b) das Vermögen, enzymkatalysierte Spaltung von unspezifischer Nukleotidspaltung zu unterscheiden, und c) hohe Empfindlichkeit. Frühere Nukleotidspaltungsassays beinhalteten den Einsatz von Polyacrylamid-Gelelektrophorese, um Produkt von Substrat zu trennen (Plotch et al., 1981, Cell 23: 847-858), was für die Bearbeitung großer Probenzahlen nicht bequem ist.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung

Diese Erfindung betrifft einen neuen genauen, empfindlichen, schnellen Assay, welcher für ein gewähltes Enzym spezifisch ist, das auf ein Substrat einwirkt, um ein einzelsträngiges Oligonukleotid-Produkt zu erzeugen. Diese Erfindung umfaßt ein Verfahren zur Messung der Enzymaktivität einer Probe, von der angenommen wird, daß sie entweder ein Enzym, welches auf ein Oligonukleotid-Substrat einwirkt, um ein einzelsträngiges Oligonukleotid-Produkt zu erzeugen, oder einen Inhibitor eines solchen Enzyms enthält, umfassend:
a) Zugeben des Oligonukleotid-Substrats zu der Probe, deren Aktivität untersucht werden soll, um das einzelsträngige Cligonukleotid-Produkt zu erzeugen;
b) Hybridisieren des einzelsträngigen Oligonukleotid-Produkts mit einer DNA-Matrize, welche DNA-Matrize einen ersten Abschnitt, der im wesentlichen komplementär zu dem Oligonukleotid-Produkt ist, und einen Matrizen-5'-Verlängerungsbereich, der mit dem ersten Abschnitt verknüpft ist, wobei der Verlängerungsbereich mindestens ein Nukleotid umfaßt, umfaßt, unter Hybridisierungsbedingungen zur Bildung eines RNA-DNA-Heteroduplexes oder eines DNA:DNA-Duplexes;
c) Zugeben eines markierten Mononukleotids, welches komplementär zu dem zweiten Abschnitt der DNA-Matrize ist;
d) Zugeben einer DNA-Polymerase zu dem Heteroduplex oder Duplex unter Bedingungen, welche es der DNA-Polymerase ermöglichen, die Addition des markierten Mononukleotids zu dem 3'-Ende des Oligonukleotid-Produkts zu katalysieren, um ein markiertes Polymeraseprodukt zu erzeugen; und
e) Messen der Menge an markiertem Polymeraseprodukt als Maß der Menge an Enzymaktivität der Probe.
Eine weitere Ausführungsform dieser Erfindung ist ein Verfahren zur Bestimmung der Stelle, an der eine Endonuklease ein Oligonukleotid-Substrat spaltet, um ein einzelsträngiges Spaltprodukt zu erzeugen, umfassend:
a) Zur Verfügung stellen von mindestens einer DNA-Matrize für eine Probe, wobei die DNA-Matrize einen ersten 3-Abschnitt und einen 5-Verlängerungsbereich umfaßt, unter der Voraussetzung, daß der 3'-Abschnitt für komplementär zu dem und von derselben Länge wie das Spaltprodukt erachtet wird und der 5-Verlängerungsbereich mindestens ein Nukleotid umfaßt;
b) Zugeben von Spaltprodukt zu der Probe unter Hybridisierungsbedingungen zur Bildung einer RNA:DNA-Heteroduplex- oder DNA:DNA-Duplex-Struktur;
c) Zugeben eines markierten Mononukleotids, welches komplementär zu dem 5- Verlängerungsbereich ist, zu der Probe;
d) Zugeben einer DNA-Polymerase unter Bedingungen, die das Stattfinden einer Polymerasereaktion erlauben, zu der Probe, wobei das markierte Mononukleotid dem 3'-Ende des Spaltprodukts hinzugefügt wird, falls der 5'-Abschnitt der DNA- Matrize komplementär zu dem und von derselben Länge wie das Spaltprodukt ist; und
e) Feststellen, ob die Reaktion von Schritt d) stattfindet.
Erfindungsgemäß kann die zu untersuchende Probe eine unbekannte Menge eines Enzyms enthalten, welches auf ein Oligonukleotid-Substrat (entweder DNA oder RNA) einwirkt, um ein einzelsträngiges Oligonukleotid-Produkt zu erzeugen. Beispiele solcher Enzyme schließen verschiedene Endonukleasen, einschließlich entweder DNA- oder RNA-Endonukleasen, und Ribozyme ein. Besonders bevorzugt sind virale Endonukleasen und Ribozyme.
In einer Ausführungsform der Erfindung kann die in einer Probe vorhandene Menge an Enzym quantitativ bestimmt werden. In einer alternativen Ausführungsform kann die Probe eine bekannte Menge an Enzym und eine Substanz, deren Inhibierungsaktivität bestimmt werden soll, enthalten. Die Menge an markiertem Polymeraseprodukt wird mit der Menge an markiertem Polymeraseprodukt, welches von einer Kontrollprobe, wo keine Inhibitoren anwesend waren, erzeugt wurde, verglichen und das Ausmaß der in der Probe vorhandenen Inhibierungsaktivität kann bestimmt werden.
In einem weiteren Aspekt dieser Erfindung kann der Assay eingesetzt werden, um die Position, an der das Enzym sein Substrat spaltet, leicht zu identifizieren. Bei dieser Ausführungsform des Assays wird mindestens eine und vorzugsweise eine Reihe von DNA- Matrizen hergestellt, die jeweils eine unterschiedliche Länge und einen 5'-Verlängerungsbereich aufweisen. Endonuklease-Spaltprodukt wird zugegeben. Falls der DNA-Matrizen- Verlängerungsbereich komplementär zu dem Spaltprodukt ist und dieselbe Länge wie das Spaltprodukt besitzt, wird er hybridisieren und eine Polymerase-Additionsreaktion kann stattfinden. Falls der Matrizen-Verlängerungsbereich nicht dieselbe Länge wie das Spaltprodukt hat, so daß das 3'-OH des Spaltprodukts die Polymerisation nicht primen kann, wird die Polymerasereaktion nicht stattfinden.
In einer weiteren Ausführungsform dieser Erfindung wird Ribozym-Aktivität anstelle von Endonuklease-Aktivität unter Verwendung dieses Assays bestimmt.
Zur Bestimmung der Menge an vorhandenem markiertem Polymeraseprodukt kann ein beliebiges Nachweisverfahren eingesetzt werden. Ein bevorzugtes Verfahren ist das Leiten der Probe, die markiertes Polymeraseprodukt und überschüssiges markiertes Mononukleotid enthält, durch einen Filter, welcher das markierte Polymeraseprodukt abfängt, und Bestimmung der Menge an markiertem Polymeraseprodukt, welches auf dem Filter abgefangen wurde.

Kurzbeschreibung der Figuren

Fig. 1 ist ein Flußdiagramm, welches den DNA-Polymerase-Verlängerungsassay dieser Erfindung illustriert.
Fig. 2 ist eine Photographie eines Phosphorimager-Scans eines 20% Acrylamid/6 M- Harnstoff-Polyacrylamidgels, welche die Auswirkungen der Primerlänge und Temperatur auf polymerase-katalysierte Verlängerungsreaktionen demonstriert. Die als 19 gekennzeichnete Spur entspricht einem RNA-Primer ohne Cap (19 nt) mit der Sequenz des AIMV-Substrats (5'-GUUUUUAUUUUUAAUUUUG-3') (SEQ-ID-NR. 1); die als 14-6 gekennzeichneten Spuren entsprechen RNA-Primern der angegebenen Länge, von 3'-Deletionen des 19-nt- Primers abgeleitet. Die als β gekennzeichnete Spur entspricht einer 13-nt-RNA, abgeleitet vom 5'-Ende von β-Globin-mRNA (5'-ACACUUGCUULJUG-3') (SEQ-ID-NR. 2). Die als D gekennzeichnete Spur entspricht einer 13-nt-DNA mit der AIMV-Primersequenz (5'- GTTTTTATTTTTA-3') (SEQ-ID-NR. 3).
Fig. 3 ist ein Diagramm, welches das lineare Verhalten der DNA-Polymerase-Amplifizierung demonstriert. Die Reaktionen wurden wie in Beispiel 2 beschrieben durchgeführt. Die durch die Punkte gezogene Linie ist eine lineare Anpassung an die Daten nachdem Verfahren der kleinsten Quadrate mit einem Korrelationskoeffizienten von 0,9999.
Fig. 4 ist ein Gel, welches eine polymerase-katalysierte Verlängerung des Influenza- Endonuklease-Spaltprodukts, wie in Beispiel 1 beschrieben demonstriert.

Definitionen

In der Patentbeschreibung und den Ansprüchen sollen die folgenden Definitionen gelten:
"nt" ist die Abkürzung für Nukleotid.
"AIMV" ist die Abkürzung für Alfalfa-Mosaikvirus.
"Im wesentlichen komplementär" bedeutet, daß ausreichend Komplementarität vorliegt, damit unter den angewandten Versuchsbedingungen der 3'-Bereich des Primers mit dem DNA-Matrizenstrang hybridisieren wird, so daß der so gebildete Duplex in der Lage ist, als Substrat für eine DNA-Polymerase zu dienen. "Im wesentlichen komplementär" erfordert ferner, daß ausreichend Komplementarität vorliegt, damit sich ein Duplex bilden kann, und daß der Duplex ausreichend Stabilität aufweist, so daß seine Schmelztemperatur höher als der Gefrierpunkt des Lösungsmittelsystems ist. In Fällen, in denen das Substrat RNA ist, bedeutet "im wesentlichen komplementär" dann, daß ausreichend Komplementarität vorliegt, damit der 3'-Bereich des RNA-Primers mit dem DNA-Matrizenstrang hybridisieren wird, so daß der Heteroduplex in der Lage ist, als Substrat für eine DNA-Polymerase zu dienen; ferner, daß ausreichend Komplementarität vorliegt, damit sich der Heteroduplex bilden wird und ausreichend Stabilität besitzt, so daß dessen Schmelztemperatur höher als der Gefrierpunkt des Lösungsmittelsystems ist.
Ein "Oligonukleotid" hat eine Länge von mindestens zwei Nukleotiden.
"Im wesentlichen wiederholt" bedeutet, daß das Oligonukleotid aus mindestens 80% derselben Base, vorzugsweise mindestens 90% derselben Base und noch bevorzugter mindestens 95% derselben Base, aufgebaut ist.
"Von AIMV abgeleitet" bedeutet, daß das Oligonukleotid zu mindestens 80% homolog zu dem 5'-Ende der AIMV 4-RNA ist und in der Lage ist, als Substrat von Influenza-Endonuklease zu dienen, d. h., es kann durch Influenza-Endonuklease gespalten werden.
"Ribozym" ist ein Enzymtyp, der aus RNA statt Protein besteht.
"Enzym" soll verschiedene biologische Moleküle einschließen, die katalytische Funktionen besitzen, unabhängig davon, ob das Molekül proteinhaltig ist, und schließt speziell Ribozyme ein.
Das Substrat kann jedes beliebige Oligonukleotid-Substrat sein, entweder DNA oder RNA, auf welches durch ein Enzym eingewirkt wird, um ein einzelsträngiges Oligonukleotid- Produkt zu erzeugen. Es kann modifiziert sein, d. h., durch ein 5'-Cap, falls das Enzym diesen Substrattyp benötigt. In einer Ausführungsform verwendet der Assay 5'-gecappte RNA, welche durch die Influenza-Endonuklease gespalten wird. Ein 5'-gecappter RNA- Vorläufer kann eingesetzt werden, um eine 19-nt-RNA herzustellen, die ein 5'-Triphosphat enthält. Dieses wird dann mit einer Guanylyltransferase behandelt. Guanylyltransferasen sind wohlbekannt und können im Handel erhalten werden; beispielsweise kann Vaccinia- Virus-Guanylyltransferase von Bethesda Research Laboratories, Gaithersburg, MD, bezogen werden. Das Resultat ist ein 5'-gecapptes RNA-Substrat von 19 nt, welches von der Influenza-Endonuklease unter Bildung eines 13-nt-Produkts gespalten wird. Vorzugsweise ist das Endonuklease-Substrat von dem 5'-Ende der AIMV 4-RNA abgeleitet, von welcher zuvor nachgewiesen wurde, daß sie ein Substrat für die Influenza-Endonuklease ist, und welche an Nukleotid A13 gespalten wird.
In einer alternativen bevorzugten Ausführungsform ist das Enzym ein Ribozym, z. B. ein Hammerkopf-Ribozym, Haarschleifen-Ribozym oder ein Ribozym vom Gruppe I Intron-Typ, und das Substrat ist ein RNA-Molekül. Nachdem Ribozyme im allgemeinen die Anwesenheit eines zweiwertigen lons zur Funktion benötigen, ist es wichtig, daß diese in der Assay- Reaktionsmischung vorhanden sind. In Abhängigkeit von dem gewählten speziellen Ribozym schließen die bekannten wichtigen Ionen, welche für die Aktivität benötigt werden, ein: zweiwertige Metallkationen, wie z. B. Zn²&spplus;, Mn²&spplus;, Mg²&spplus; oder Ca²&spplus;. Das Oligoribonukleotid- Substrat wird dann durch das Ribozym in Gegenwart des Kations gespalten.
Das Oligonukleotid-Produkt wird dann als Primer für eine durch DNA-Polymerase katalysierte Verlängerungsreaktion eingesetzt. Eine DNA-Matrize ist erforderlich, damit die Polymerase-Verlängerungsreaktion ablaufen kann. Die DNA-Matrize ist ein Molekül mit zwei Abschnitten: es enthält einen 3'-Bereich, welcher im wesentlichen komplementär zu dem Oligonukleotid-Produkt ist, verknüpft mit einem Matrizen-5'-Verlängerungsbereich. Obwohl der 5'-Verlängerungsbereich theoretisch aus beliebigen gewünschten Nukleotiden gebildet werden kann, ist es bevorzugt, daß sie im wesentlichen wiederholte Nukleotide sind und daß die in dem Verlängerungsbereich vorhandenen Nukleotide nicht in dem 3'-komplementären Bereich vorliegen, um Spezifität für ein an der richtigen Position gespaltenes Produkt zu erzielen. In der am meisten bevorzugten Ausführungsform ist der 5'-Verlängerungsbereich aus wiederholten Nukleotiden aufgebaut. Falls der 5'-Verlängerungsbereich nicht aus im wesentlichen wiederholten Nukleotiden aufgebaut ist, kann es Spezifitätsprobleme mit dem Assay geben, falls der Verlängerungsbereich nicht ausreichend lang ist, um das Signal des korrekten Spaltprodukts im Verhältnis zu unspezifischen Produkten zu verstärken.
Es gibt keine bestimmte Grenze hinsichtlich der Länge des Verlängerungsbereichs, er kann so kurz wie ein einziges Nukleotid sein oder so lange wie es vorhandene Syntheseverfahren erlauben (bis zu 50 Nukleotide oder mehr). In bevorzugten Ausführungsformen hat der 5'- Verlängerungsbereich mindestens eine Länge von einem Nukleotidrest und bevorzugter eine Länge von mindestens etwa 10 Resten. Somit sollte der Matrizenverlängerungsbereich vorzugsweise ein Poly-dC-, ein Poly-dG-, ein Poly-dA- oder ein Poly-dT-Bereich sein. In einer bevorzugten Ausführungsform dieser Erfindung ist der Matrizenverlängerungsbereich ein Poly-dC-Rest von 10 nt Länge.
Während der durch DNA-Polymerase katalysierten Verlängerungsreaktion wird das Oligonukleotid-Produkt in der Länge durch markierte Nukleotide verlängert werden, welche komplementär zu den in dem DNA-Matrizenverlängerungsbereich vorliegenden Nukleotiden sind. Wenn beispielsweise der Matrizenverlängerungsbereich ein Poly-C von 10 Resten ist, wird das Oligonukleotid-Produkt durch eine markierte Poly-G-Sequenz um 10 Basen verlängert werden. Obwohl jeder Markierungstyp, der herkömmlicherweise auf dem Gebiet der Nukleotid-Assays verwendet wird, eingesetzt werden kann, um die Nukleotide zu markieren, welche in den Produktverlängerungsbereich inkorporiert werden, wie z. B. Fluoreszenz- oder Absorptionsmarkierungen, ist es bevorzugt, eine radioaktive Markierung einzusetzen. In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Produktverlängerungsbereich α-³²P-markiertes Poly-dGMP (wie in Fig. 1 gezeigt).
Darüber hinaus ist das 3'-OH des Primers vorzugsweise blockiert, um zu verhindern, daß eine polymerase-katalysierte Verlängerung am 3'-OH-Ende der Matrize stattfindet. Zahlreiche Blockierungsmaterialien sind bekannt und geeignet und schließen Cordycepin (3'-Desoxyadenosin) und andere 3'-Gruppierungen ohne ein 3-OH ein. In einer Ausführungsform dieser Erfindung ist das 3'-OH mit einem (3-Amino-2-hydroxy)propoxyphosphoryl blockiert. In einer weiteren Ausführungsform dieser Erfindung ist das 3-OH durch die Einführung einer 3-3'-A-5'-Verknüpfung blockiert. Obwohl es möglich ist, einen Assay dieser Erfindung ohne Blockierung des 3-OH des Primers zu fahren, trägt die Blockierung des 3'-OH-Endes dazu bei, ein Hintergrundsignal zu verhindern, und dies trägt zur Erhöhung der Empfindlichkeit des Assays bei.
Zahlreiche DNA-Polymerase-Enzyme sind bekannt und können in dem DNA-Polymerase- Reaktionsschritt dieser Erfindung eingesetzt werden. In einer Ausführungsform, in der das Enzymsubstrat eine RNA ist, ist Sequenase® Version 2, eine Mutante von Bakteriophagen- T7-DNA-Polymerase (erhalten von United States Biochemicals, Cleveland, Ohio), in der die 3'-zu-5'-Exonukleaseaktivität durch in vitro-Mutagenese eliminiert ist (Tabor et al., 1989, J Biol. Chem. 264: 6447-6458), eine bevorzugte DNA-Polymerase. Diese Polymerase ist bevorzugt, da sie in der Lage ist, Oligoribonukleotide als Primer einzusetzen, mit hoher Genauigkeit repliziert und keine 3'-zu-5'-"Korrektur"-Aktivität besitzt.
In Abhängigkeit von der Art der eingesetzten Markierung kann der Nachweis des markierten Hybrid-Polymeraseprodukts durch irgendein geeignetes Mittel erzielt werden. Im allgemeinen kann dies einen Schritt der Abtrennung von markiertem Mononukleotid von markiertem Hybrid-Polymeraseprodukt beinhalten. In einer bevorzugten Ausführungsform wird der Nachweis erzielt durch Filtration der Probenmischung (welche zu diesem Zeitpunkt in dem Assay-Verfahren das markierte Hybrid-Polymeraseprodukt und überschüssiges markiertes Mononukleotid enthält) durch eine Nylonmembran. Die nicht inkorporierten markierten Mononukleotide fließen durch die Membran, während das markierte Hybrid- Polymerasereaktionsprodukt abgefangen wird. Falls die Markierung eine radioaktive Markierung war, kann die an den Filter gebundene Menge an Radioaktivität dann mit Hilfe eines Phosphorimagers oder eines Plattenlese-Szintillationszählers quantitativ bestimmt werden.
Dieser Assay besitzt deutliche Vorteile gegenüber Assays des Standes der Technik insofern als er keinen Elektrophoreseschritt beinhaltet und im Format einer 96-Mulden-Mikrotiterplatte durchgeführt werden kann. Andere wesentliche Vorteile des Assays dieser Erfindung liegen darin, daß er die Substratspaltungsreaktion nur an der korrekten Position in der Sequenz überwacht und dadurch unspezifische RNA-Spaltprodukte ausscheidet. Ebenfalls von Bedeutung ist, daß dieser Assay empfindlich genug ist, um 200 Attomol (2 · 10&supmin;¹&sup6; Mol) Produkt, die in einer typischen Spaltreaktion gebildet werden, nachzuweisen.
Die Spezifität der Assays einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird durch die Wahl der DNA-Matrize und die hohe Genauigkeit der T7-DNA-Sequenase®-Polymerase erzielt. Unter den Bedingungen einer typischen Reaktion werden mehr als 90% des Substrats nicht gespalten, dies stört jedoch die Spezifität des Assays nicht, da das ungespaltene RNA-Substrat nicht als Primer für die Polymerisation dient, weil das 3'-Ende mit der Matrize keine Basenpaarung eingehen kann. Darüber hinaus werden unspezifische Spaltprodukte, z. B. diejenigen, die an einer anderen Stelle als der Enzymspaltstelle gespalten wurden, nicht verlängert werden. Obwohl diese kürzeren (oder längeren) Sequenzen mit der Matrize hybridisieren mögen, werden sie durch die DNA-Polymerase nicht verlängert, da diese Reaktion die Anwesenheit von Nukleotiden erfordern würde, welche in der Reaktionsmischung nicht vorliegen.
Die Polymerase-Verlängerungsreaktion hängt von der Hybridisierung des Primers mit der DNA-Matrize ab. Deshalb werden zur effektiven Hybridisierung des Primers mit der DNA- Matrize Polymerase-Verlängerungsreaktionen vorzugsweise bei mindestens 10ºC unterhalb der Schmelztemperatur des Primer:Matrize-Komplexes durchgeführt. Eine typische bevorzugte Reaktionstemperatur ist 0ºC für einen Primer:Matrize-Komplex mit einer Schmelztemperatur von 14ºC.
Fig. 2 illustriert die Spezifität der durch Polymerase katalysierten Verlängerungsreaktion und die Auswirkungen der Temperatur. In einem Influenza-Endonuklease-Assay wird ein gecapptes AIMV-RNA-Substrat eingesetzt, welches zu einem 13-nt-RNA-Produkt gespalten wird. Synthetische RNA- und DNA-Primer verschiedener Längen und Sequenzen ohne Cap wurden mit der DNA-Matrize hybridisiert und mit Polymerase und α-³²P-dGTP verlängert. Wenn die Reaktion bei 0ºC durchgeführt wird, sind die einzigen Primer, die eine effiziente Verlängerung ergeben, die 13-nt-AIMV-RNA und die entsprechende Sequenz als DNA. Obwohl unvollständig verlängerte Produkte auf dem Gel sichtbar sind, wurden die Reaktionsbedingungen so optimiert, daß die intensivste Bande einer vollständigen Primerverlängerung entspricht. Eine schwächere Bande oberhalb der intensivsten Bande entspricht einer Einzelbasen-Addition. Mehrere DNA-Polymerasen katalysieren bekannterweise die Addition einer einzelnen Base an die 3'-OH-Termini einer glattendigen DNA (Clark, 1988, Nucl. Acids Res. 16: 9677-9686); mutmaßlich liegt eine ähnliche Aktivität auch bei der verwendeten Sequenase®-Polymerase vor. Die viel weniger intensiven Banden in der Spur, die den 14-nt-RNA-Primer enthält, sind einer kleinen Verunreinigung der 13-nt- RNA zuzuschreiben, die in dem 14-nt-Ribonukleotid vorliegt. Keine Verlängerungsprodukte werden beobachtet, wenn entweder der 19-nt-Primer vollständiger Länge, AIMV-Primer, die kleiner als 13 nt sind, oder eine heterologe 13-nt-RNA, die von dem 5'-Ende des β-Globin- Transkripts abgeleitet ist (5'-ACACUUGCUUUUG-3') (SEQ-ID-NR. 2), eingesetzt werden. Die Sequenase®-Reaktion verlängert selektiv die AIMV-13-nt-Primer und schließt Sequenzen aus, die ungespaltenem AIMV-Substrat oder kürzeren unspezifischen Spaltprodukten entsprechen. Es ist bemerkenswert, daß die hohe Genauigkeit der Sequenase® eine inkorrekte Verlängerung von AIMV-Primern verhindert, die sich in der Länge um nur eine einzige Base unterscheiden.
Es wurde erfindungsgemäß festgestellt, daß die Polymerase-Verlängerungsreaktion bequem durch Filtration durch Nylonmembranen überwacht werden kann. Unter den beschriebenen Bedingungen kann eine quantitative Bindung des verlängerten Produkts beobachtet werden, wobei nur eine kleine Menge (weniger als 0,0003%) des nicht inkorporierten α-³²P-dGTP auf der Nylonmembran zurückgehalten wird. Für großvolumige Screeningzwecke kann das Filtrationsverfahren unter Einsatz eines 96-Mulden-Kollektors durchgeführt werden und die filtergebundene Radioaktivität kann entweder mit einem Phosphorimager-Instrument oder einem Mikroplatten-Szintillationszähler quantitativ bestimmt werden. Fig. 3 zeigt die Empfindlichkeit und das lineare Verhalten bei Einsatz von Nylonmembran-Filtration und Phosphorimager-Nachweis für die Verlängerung des AIMV- RNA-Primers von 13 nt. Eine ausgezeichnete Linearität wird bis zu 200 pM Primer in einem Reaktionsvolumen von 20 ul beobachtet. Man beachte, daß unter typischen Assaybedingungen etwa 10% des Substrats in Hybrid-Polymeraseverlängerungsreaktionsprodukt überführt werden wird, entsprechend 40 pM Produkt; diese Menge liegt gut innerhalb des Linearitätsbereichs und der Nachweisgrenzen des Assays.
Es wird eine primerunabhängige Hintergrundreaktion beobachtet, welche sich als schwache Bande, die oberhalb der Hauptverlängerungsprodukte über alle Spuren in Fig. 2 läuft, und als ein y-Anfangswert ungleich Null in Fig. 3 manifestiert. In Abwesenheit von Matrize fehlt das erstere Hintergrundsignal und das letztere ist drastisch verringert, was nahelegt, daß sie korreliert sind. Die Hintergrundsignale sind unabhängig von der Anwesenheit von Influenza- Kernprotein, sie sind jedoch von Sequenase® abhängig. Somit ist der Hintergrund auf eine durch Sequenase® katalysierte Addition von α-³²P-dGTP an die einzelsträngige Matrize zurückzuführen. Wesentlich höhere Hintergrundsignale werden beobachtet bei Verwendung einer Matrize, bei der die 3'-OH-Gruppe nicht durch eine Aminolinker-Gruppierung blockiert ist, was nahelegt, daß die Reaktion ein freies 3'-OH erfordert. Die Hintergrundsignale können weiter verringert werden durch Behandlung der aminolinker-blockierten Matrize mit ddATP und terminaler Desoxynukleotidyltransferase, was die Anwesenheit einer Verunreinigung, die ein freies 3'-OH enthält, in der Matrize nahelegt.
Zur eindeutigen Charakterisierung des gekoppelten Influenza-Endonuklease/Polymerase- Verlängerungsprozesses wurden eine Reihe von Reaktionen unter Verwendung von m&sup7;G³²P-markiertem AIMV-Substrat und unmarkiertem dGTP durchgeführt und mittels Gelelektrophorese analysiert. Fig. 4 zeigt, daß in Abwesenheit von Kernprotein das AIMV- Substrat als einzelne Bande entsprechend einer Länge von 19 nt wandert. Die Inkubation von Substrat mit Influenza-Kernprotein führt zu einem hauptsächlichen Spaltprodukt sowie zu Nebenprodukten, welche kürzer sind. Das Hauptprodukt entspricht einer Spaltung bei A13; dieses Produkt wird nach Inkubation mit GTP verlängert. Ähnliche Resultate wurden bereits bei Verwendung der AIMV-RNA 4 vollständiger Länge mitgeteilt (Plotch et al., 1989, Cell 23: 847-858). Die Zugabe eines 10fachen Überschusses an unmarkiertem AIMV- Substrat ohne Cap beeinflußt das Ausmaß der Spaltung nicht. Die Inkubation von Substrat mit Sequenase®, Matrize und dGTP führt zu keinerlei Verlängerung in Abwesenheit von Influenza-Kernprotein. Die Spaltung von Substrat durch Kernprotein, gefolgt von Polymerase-Verlängerung, führt zum Auftreten einer schwachen Bande oberhalb der Substratbande. Diese Bande entspricht der Addition von 10 dG-Resten zu dem 13-nt-Produkt. Man beachte, daß in dieser Probe die Hauptmenge des Spaltprodukts nicht durch Sequenase® verlängert wird. Im Gegensatz dazu wird in der Probe, die nach der Spaltung eine Minute lang bei 80ºC inkubiert wird, eine nahezu quantitative Verlängerung beobachtet. Die Dissoziation des Spaltprodukts ist wahrscheinlich ziemlich Langsam und der Erwärmungsschritt mag dazu dienen, das gebundene Produkt durch Denaturierung des Influenza- Endonuklease-Komplexes freizusetzen. Eine schwache Bande, die oberhalb des Polymerase-Verlängerungsprodukts beobachtet wird, entspricht wahrscheinlich einer Addition eines zusätzlichen dG-Rests zu dem glattendigen verlängerten Primer/Matrize- Duplex, wie in Fig. 2 beobachtet wurde. Wie im Falle der Spaltreaktion allein wird der Polymerase-Verlängerungsassay durch die Anwesenheit eines 10fachen Überschusses an unmarkiertem ungecapptem AIMV-Substrat nicht beeinflußt. In der letzten Spur wurde die 24-nt-Matrize, die einen komplementären Bereich von 14 nt enthält, anstelle der komplementären 13-nt-Matrize zugegeben. Das spezifische Spaltprodukt wird in dieser Probe nicht verlängert, welches bestätigt, daß das Hauptprodukt einer Spaltung bei A13 und nicht A14 entspricht.
Der DNA-Polymerase-Verlängerungsassay wurde zum Nachweis von Influenza-Endonuklease-Inhibitoren validiert durch Verwendung des Inhibitors, (4-[N-Benzolsulfonyl-3-(4- chlorbenzyl)piperidin-3-yl]-2,4-dioxobutansäure), den wir zuvor unter Verwendung des gelbasierten Assays identifizierten. Diese Verbindung ist ähnlich den 4-substituierten 2,4- Dioxobutansäuren, die kürzlich als Inhibitoren der Influenza-Endonuklease beschrieben wurden (Tomassini et al., 1994, AntiMicrob. Agents Chemother. 38: 2827-2837). Titrationen der Inhibierung der Endonuklease durch diese Verbindung wurden unter Verwendung eines gelbasierten Assays und des DNA-Polymerase-Verlängerungsassays dieser Erfindung unter denselben Versuchsbedingungen durchgeführt. Die IC&sub5;&sub0;-Werte, welche durch Anpassen der über einen Bereich von 3 nM bis 10 uM erhaltenen Daten an ein einfaches hyperbolisches Inhibierungsmodell bestimmt wurden, sind 260 ± 60 nM für den Gel-Assay und 220 ± 50 nM für den DNA-Polymerase-Verlängerungsassay. Innerhalb des Versuchsfehlers ist die Wirksamkeit dieser Verbindung in beiden Assays gleich, was anzeigt, daß der DNA-Polymerase- Verlängerungsassay die Inhibierung der Influenza-Endonuklease genau mißt.
In einem weiteren Aspekt dieser Erfindung liefert der DNA-Polymerase-Verlängerungsassay ein bequemes Verfahren zur Bestimmung der Spaltposition von gecappten Substraten. In der Vergangenheit wurde die Stelle der Spaltung durch eine Endonuklease durch die Erzeugung von Sequenzleitern mit alkalischer Verdauung oder durch Verdauung mit RNasen und Elektrophorese bestimmt. Das erstere Verfahren leidet unter Zweideutigkeiten, die sich aus der Labilität des m7G-Rests in der Cap-Struktur gegenüber alkalischer Hydrolyse ergeben, und das letztere unter der schnelleren elektrophoretischen Mobilität der durch RNasen erzeugten 3'-phosphorylierten Sequenzen im Verhältnis zu den unphosphorylierten 3'-OH-Enden, welche durch die Endonuklease erzeugt werden. Im Gegensatz dazu kann die Spaltstelle bei Verwendung des DNA-Polymerase-Verlängerungsassays dieser Erfindung eindeutig festgelegt werden, indem die katalysierten Verlängerungsreaktionen unter Verwendung von Matrizen mit komplementären Bereichen, die den erwarteten Spaltprodukten entsprechen, verglichen werden. Fig. 4 illustriert diesen Aspekt der Erfindung, wobei die Matrize mit einem komplementären Bereich von 13 nt als Substrat dient, während die komplementäre Matrize mit 14 nt dies nicht tut.
Ein weiterer Hauptvorteil des Verlängerungsassays dieser Erfindung gegenüber bestehenden Methodologien besteht darin, daß das Oligonukleotid-Produkt von Interesse in Gegenwart anderer Nukleotide nachgewiesen werden kann, vorausgesetzt, daß sie nicht als Primer einer Polymerisation dienen. So können präzise Messungen der Reaktion von Interesse sogar in komplexen, unreinen Präparationen durchgeführt werden. Dies ist besonders hilfreich bei der Überwachung von ribozym-vermittelten Spaltreaktionen.
Die folgenden, nicht beschränkenden Beispiele sind zur besseren Erläuterung der Erfindung angegeben.

BEISPIELE

Allgemeine experimentelle Methoden. Oligodesoxyribonukleotide und ungecappte Oligoribonukleotide wurden von Midland Certified Reagent Company (Midland, TX) synthetisiert und durch Anionenaustausch-HPLC gereinigt. Triphosphorylierte Oligonukleotide wurden synthetisiert und mit einem Cap versehen. Die Sequenz des Substrat-Oligoribonukleotids von 19 nt ist 5'-ppp-G(2'-OMe)UUUUUAUUUUUAAUUIJUC-3' (SEQ-ID-NR. 1). 3'-verkürzte Ribonukleotide wurden ebenfalls synthetisiert, welche dem 5'-Bereich des Substrats mit Längen von 14, 13, 12, 10 und 6 nt entsprechen. Soweit nicht anders angegeben, wurde eine 23-nt-Matrize mit der Sequenz: 5'-Biotin-CCCCCCCCCCTAAAAATAAAAAC-Amino-3' (SEQ-ID-NR. 4) in allen Experimenten eingesetzt, wobei das 5'-Biotin eine N-Biotinyl-6- aminohexyloxyphosphoryl-Gruppierung ist und das 3'-Amino 3-Amino-2-hydroxypropoxyphosphoryl ist. Für einige Experimente wurde eine 24-nt-Matrize mit der Sequenz: 5'-Biotin- CCCCCCCCCCTTAAAAATAAAAAC-Amino-3' (SEQ-ID-NR. 5) eingesetzt. α-³²P-dGTP (3000 Ci/mMol) wurde von Dupont NEN erhalten. Unmarkiertes dGTP wurde von Pharmacia erhalten. Sequenase® Version 2.0 wurde von United States Biochemicals (Cleveland, OH) erhalten.
Soweit nicht anders angegeben, enthielten die Polymerase-Verlängerungsreaktionen 1 nM Primer, 50 nM Matrize, 500 nM Sequenase® und 500 nM dGTP und wurden 2 Stunden lang bei der angegebenen Temperatur durchgeführt. Die Reaktionen wurden auf 20% Polyacrylamid/8 M-Harnstoffgelen analysiert.

BEISPIEL 1

Spaltreaktionen und DNA-Polymerase-Reaktionen

Influenza-Spaltreaktionen wurden bei 25ºC in einem Puffer, enthaltend 100 mM Tris[hydroxymethyl]aminomethan (Tris), pH 8,0, 50 mM KCl, 0,25 mM MgCl&sub2;, 5 mM Dithiothreit (DTT), 4% (Vol/Vol.) Dimethylsulfoxid (DMSO), in DEPC-behandeltem Wasser durchgeführt. Polymerase-Verlängerungsreaktionen wurden im selben Puffer durchgeführt, mit Ausnahme dessen, daß die MgCl&sub2;-Konzentration auf 10 mM erhöht wurde und die DMSO- Konzentration auf 9%. 500 nM dGTP wurden in Verlängerungsreaktionen bei Verwendung von endmarkierten Primern eingesetzt und eine Mischung von 50 nM α-³²P-dGTP und 450 nM unmarkiertem dGTP wurde mit unmarkierten Primern eingesetzt. Soweit nicht anders angegeben, wurden die Verlängerungsreaktionen bei 0ºC durchgeführt. Für die Inhibierungsmessungen wurde die Verbindung 4-[N-Benzolsulfonyl-3-(4-chlorbenzyl)piperidin-3-yl]- 2,4-dioxobutansäure mit Influenza-Kernprotein 10 Minuten lang vorinkubiert. Die Spaltreaktionen wurden durch Zugabe von 0,4 nM unmarkiertem (Gel-Assay) oder endmarkiertem (DNA-Polymerase-Verlängerungsassay) Substrat in einer Reaktion mit einem Volumen von 15 ul, enthaltend 0,75 ul Influenza-Kernprotein, initiiert und 10 Minuten lang bei 25ºC ablaufen gelassen. Für den DNA-Polymerase-Verlängerungsassay wurde die Verlängerungsreaktion in einem 20-ul-Volumen, enthaltend 50 nM Sequenase®, 500 nM dGTP, 50 nM Matrize, 18 Stunden lang bei 0ºC durchgeführt.
Die Reaktionen wurden entweder mittels Elektrophorese in 20%igen Polyacrylamidgelen, enthaltend 8 M Harnstoff, oder mittels Filtration durch Nytran®-Membranen mit Poren von 0,2 um in einem 96-Mulden-Kollektor (Schleicher und Schuell, Keene, NH) analysiert. Zur Filtration wurden die Proben mit 200 ul 250 mM EDTA, pH 8,0, verdünnt und 200 ul wurden auf die Membran, äquilibriert in 5X SSC (0,75 M NaCl, 75 mM Natriumcitrat, pH 7,0) aufgetragen und sofort filtriert. Jede Mulde wurde fünfmal mit 200 ul 5X SSC gewaschen und der Filter von dem Kollektor entfernt, dreimal in 100 ml 5X SSC gewaschen.
Die Gele wurden sichtbar gemacht und die Filter unter Verwendung eines Phosphorimager® (Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA) mit der Imagequant®-Software, die vom Hersteller bereitgestellt wurde, quantifiziert. In einigen Experimenten wurden die Nytran®-Filter ebenfalls unter Verwendung eines TopCount® (Packard Instruments, Meriden, CT)- Mikroplatten-Szintillationszählers mit Flexifilter®-Kits und Mikroscint® O-Szintillationsflüssigkeit quantifiziert.

BEISPIEL 2

DNA-Polymerase-Verlängerungsassay für die Ribozym-Spaltung

Kinetische Reaktionen werden nach dem Verfahren von Fedor und Uhlenbeck 1990, Proc. Natl. Acad. Sci USA 87: 1668-1672, unter Verwendung von Ribozymkonzentrationen von 1 nM, 10 mM zweiwertigem Metallion und RNA-Substrat-Konzentrationen von 50 n M durchgeführt. Die DNA-Polymerase-Verlängerungsreaktion wird unter Verwendung von 50 nM Sequenase®, 500 nM markiertem dATP, 100 nM Einfang-Oligonukleotid/Matrize 18 Stunden lang bei 0ºC durchgeführt. Die Reaktionen werden nach den oben beschriebenen Verfahren analysiert.

SEQUENZVERZEICHNIS

(1) ALLGEMEINE INFORMATION:

(i) ANMELDER: MERCK & CO., INC.
Cole, James L.
Olsen, David B.
Kuo, Lawrence C.
(ii) TITEL DER ERFINDUNG: DNA-POLYMERASE-VERLÄNGERÜNGSASSAY
(iii) ANZAHL DER SEQUENZEN: 5
(iv) KORRESPONDENZADRESSE:
(A) ADRESSAT: Ms. Joanne J. Giesser
(B) STRASSE: 126 E. Lincloln Avenue, P.O. Box 2000-0907
(C) STADT: Rahway
(D) STAAT: New Jersey
(E) LAND: USA
(F) PLZ: 07065
(v) COMPUTERLESBARE FORM:
(A) MEDIUM TYP: Diskette
(B) COMPUTER: IBM PC-kompatibel
(C) BETRIEBSSYSTEM: PC-DOSIMS-DOS
(D) SOFTWARE: PatentIn Release #1.0, Version #1.30
(vi) GEGENWÄRTIGE ANMELDUNGSDATEN:
(A) ANMELDUNGSNUMMER:
(B) EINREICHUNGSDATUM:
(C) KLASSIFIZIERUNG:
(viii) ANWAL/VERTRETER-INFORMATION:
(A) NAME: Giesser, Joanne M.
(B) ZULASSUNGSNUMMER: 32,838
(C) REFERENZ/AKTENZEICHEN: 19393 PCT
(ix) TELEKOMMUNIKATIONSINFORMATION:
(A) TELEFON: (908)-594-3046
(B) TELEFAX: (908)-594-4720

(2) INFORMATION FÜR SEQ-ID-NR. 1:

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 19 Basenpaare
(B) TYP: Nukleinsäure
(C) STRÄNGIGKEIT: einzelsträngig
(D) TOPOLOGIE: linear
(iii) HYPOTHETISCH: Nein
(iv) ANTI-SENSE: Nein

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ-ID-NR. 1:

GUUUUUAUUU UUAAUUUUC 19

(2) INFORMATION FÜR SEQ-ID-NR. 2:

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 13 Basenpaare
(B) TYP: Nukleinsäure
(C) STRÄNGIGKEIT: einzelsträngig
(D) TOPOLOGIE: linear
(iii) HYPOTHETISCH: Nein
(iv) ANTI-SENSE: Nein

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ-ID-NR. 2:

ACACUUGCUU UUG 13

(2) INFORMATION FÜR SEQ-ID-NR. 3:

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 13 Basenpaare
(B) TYP: Nukleinsäure
(C) STRÄNGIGKEIT: einzelsträngig
(D) TOPOLOGIE: linear
(iii) HYPOTHETISCH: Nein
(v) ANTI-SENSE: Nein

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ-ID-NR. 3:

GTTTTTATTT TTA 13

(2) INFORMATION FÜR SEQ-ID-NR. 4:

(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKEN:
(A) LÄNGE: 23 Basenpaare
(B) TYP: Nukleinsäure
(C) STRÄNGIGKEIT: einzelsträngig
(D) TOPOLOGIE: linear
(iii) HYPOTHETISCH: Nein
(iv) ANTI-SENSE: Nein

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ-ID-NR. 4:

CCCCCCCCCC TAAAAAATAAA AAC 23

(2) INFORMATION FÜR SEQ-ID-NR. 5:

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 24 Basenpaare
(B) TYP: Nukleinsäure
(C) STRÄNGIGKEIT: einzelsträngig
(D) TOPOLOGIE: linear
(iii) HYPOTHETISCH: Nein
(iv) ANTI-SENSE: Nein

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ-ID-NR. 5:

CCCCCCCCCC TTAAAAATAA AAAC 24

Claims

1. Verfahren zur Messung der Enzymaktivität einer Probe, wobei das Enzym auf ein Oligonukleotid-Substrat einwirkt, um ein einzelsträngiges Oligonukleotid-Produkt zu erzeugen, umfassend:

a) Zugeben des Oligonukleotid-Substrats zu der zu untersuchenden Probe, um das Oligonukleotid-Produkt zu erzeugen;

b) Hybridisieren des Oligonukleotid-Produkts mit einer DNA-Matrize, welche DNA- Matrize einen ersten Abschnitt, der im wesentlichen komplementär zu dem Oligonukleotid-Produkt ist, und einen Matrizen-5'-Verlängerungsbereich, der mit dem ersten Abschnitt verknüpft ist, wobei der 5'-Verlängerungsbereich mindestens ein Nukleotid umfaßt, umfaßt, unter Hybridisierungsbedingungen zur Bildung einer RNA:DNA-Heteroduplex- oder einer DNA:DNA-Duplex-Struktur;

c) Zugeben eines markierten Mononukleotids, welches komplementär zu dem 5'- Verlängerungsbereich der DNA-Matrize ist;

d) Zugeben einer DNA-Polymerase zu der Heteroduplex- oder Duplex-Struktur unter Bedingungen, welche es der DNA-Polymerase ermöglichen, die Addition des markierten Mononukleotids zu dem 3'-Ende des Oligonukleotid-Produkts zu katalysieren, um ein markiertes Polymeraseprodukt zu erzeugen; und

e) Messen der Menge an markiertem Polymeraseprodukt als Maß der Menge an Enzymaktivität der Probe.

2. Verfahren nach Anspruch 1, worin das Enzym eine Endonuklease ist.

3. Verfahren nach Anspruch 2, worin das Substrat ein DNA-Substrat ist.

4. Verfahren nach Anspruch 2, worin das Substrat ein RNA-Substrat ist.

5. Verfahren nach Anspruch 1, worin das Enzym ein Ribozym ist und die Probe ferner ein zweiwertiges Kation umfaßt.

6. Verfahren nach Anspruch 1, worin der Verlängerungsbereich der Matrize eine Länge von mindestens etwa 10 Nukleotiden aufweist.

7. Verfahren nach Anspruch 6, worin der Verlängerungsbereich der Matrize im wesentlichen wiederholte Nukleotide umfaßt.

8. Verfahren nach Anspruch 1, worin die markierten Mononukleotide radioaktiv markiert sind.

9. Verfahren nach Anspruch 8, worin die Menge des markierten Polymeraseprodukts gemessen wird, indem die Probe, welche markiertes Polymeraseprodukt und überschüssiges markiertes Mononukleotid umfaßt, durch einen Filter geleitet wird, so daß das markierte Polymeraseprodukt auf dem Filter abgefangen wird, und die Menge der auf dem Filter befindlichen radioaktiven Markierung gemessen wird.

10. Verfahren nach Anspruch 9, worin der Filter ein Nylonfilter ist.

11. Verfahren nach Anspruch 1, worin die zu untersuchende Probe einen mutmaßlichen Inhibitor des Enzyms enthält.

12. Verfahren nach Anspruch 11, welches ferner den Vergleich der Menge an Enzymaktivität der Probe mit der Aktivität, die für eine Kontrollprobe, umfassend dasselbe Enzym, das nicht in Gegenwart eines mutmaßlichen Inhibitors vorliegt, bestimmt wurde, umfaßt.

13. Verfahren nach Anspruch 5, worin die zu untersuchende Probe einen mutmaßlichen Inhibitor von Ribozym-Aktivität enthält.

14. Verfahren nach Anspruch 13, welches ferner den Vergleich der Menge an Ribozym- Aktivität der Probe mit der Aktivität, die für eine Kontrollprobe, umfassend dasselbe Ribozym, das nicht in Gegenwart eines mutmaßlichen Inhibitors vorliegt, bestimmt wurde, umfaßt.

15. Verfahren nach Anspruch 1, worin das Enzym eine RNA-Endonuklease ist und die Probe ferner einen mutmaßlichen Inhibitor der Endonuklease umfaßt, das Oligonukleotid-Substrat ein RNA-Molekül ist,

der 5'-Verlängerungsbereich mindestens 10 im wesentlichen wiederholte Nukleotide umfaßt,

das markierte Nukleotid radioaktiv markiert und komplementär zu den mindestens 10 im wesentlichen wiederholten Nukleotiden ist,

das markierte Polymeraseprodukt ein radioaktiv markiertes Polymeraseprodukt ist, welches die radioktive Markierung umfaßt,

und worin der Schritt (e) umfaßt

(i) Filtrieren der Probe, die das radioaktiv markierte Polymeraseprodukt und überschüssiges radioaktiv markiertes Mononukleotid umfaßt, durch Leiten der Probe durch einen Nylonfilter, so daß das radioaktiv markierte Polymeraseprodukt von dem Filter abgefangen wird; und

(ii) Messen der Menge an radioaktiv markiertem Polymeraseprodukt, die auf dem Filter abgefangen wurde, und Vergleichen dieser Menge mit derjenigen Menge, welche erhalten wird, wenn kein Endonuklease-Inhibitor in einer Kontrollprobe vorhanden ist:

16. Verfahren nach Anspruch 1, worin das Enzym ein Ribozym ist und die Probe ferner einen mutmaßlichen Inhibitor des Ribozyms umfaßt,

das Oligonukleotid-Substrat ein RNA-Molekül ist,

die Probe zweiwertige Kationen für die Ribozym-Aktivität umfaßt und worin der Schritt (e) umfaßt

(ii) Messen der Menge an radioaktiv markiertem Polymeraseprodukt, die auf dem Filter abgefangen wurde, und Vergleichen dieser Menge mit derjenigen Menge, welche erhalten wird, wenn kein Ribozym-Inhibitor in einer Kontrollprobe vorhanden ist.

17. Verfahren zur Bestimmung der Stelle, an der eine Nuklease ein Oligonukleotid- Substrat spaltet, um ein einzelsträngiges Spaltprodukt zu erzeugen, umfassend:

a) Zurverfügungstellen von mindestens einer DNA-Matrize für eine Probe, wobei die DNA- Matrize einen ersten 3'-Abschnitt und einen 5'-Verlängerungsbereich umfaßt, unter der Voraussetzung, daß der 3'-Abschnitt für komplementär zu dem und von derselben Länge wie das Spaltprodukt erachtet wird und der 5'-Verlängerungsbereich mindestens ein Nukleotid umfaßt;

b) Zugeben von Spaltprodukt zu der Probe unter Hybridisierungsbedingungen zur Bildung einer RNA:DNA-Heteroduplex- oder DNA-DNA-Duplex-Struktur;

c) Zugeben eines markierten Mononukleotids, welches komplementär zu dem 5'-Verlängerungsbereich ist, zu der Probe;

d) Zugeben einer DNA-Polymerase unter Bedingungen, die das Stattfinden einer Polymerasereaktion erlauben, zu der Probe, wobei das markierte Mononukleotid dem 3'-Ende des Spaltprodukts hinzugefügt wird, falls der 5'- Abschnitt der DNA-Matrize komplementär zu dem und von derselben Länge wie das Spaltprodukt ist; und

e) Feststellen, ob die Reaktion von Schritt (d) stattfindet.

18. Verfahren nach Anspruch 17, worin eine Mehrzahl von DNA-Matrizen der Probe in Schritt (a) zur Verfügung gestellt wird, wobei die Mehrzahl von DNA-Matrizen jeweils den 5'-Verlängerungsbereich und einen zweiten 3'-Abschnitt umfasst, wobei sich der zweite 3'-Abschnitt in der Länge von dem ersten 3'-Abschnitt unterscheidet.