JPH11506607A - Ｄｎａポリメラーゼ伸長アッセイ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 標識されたヌクレオチドと、繰り返されているヌクレオチド残基を含む５’領域に結合したオリゴヌクレオチド産物に相補的な３’領域を有する鋳型ＤＮＡとを利用した、オリゴヌクレオチド切断産物のＤＮＡポリメラーゼに触媒された伸長を有する、基質に作用して１本鎖のオリゴヌクレオチド産物を生じる酵素のアッセイ法を開発した。ＤＮＡポリメラーゼ伸長アッセイは、ゲル電気泳動分離を含まず、阻害剤候補の大量のスクリーニングを可能にする。本アッセイのその他の特徴は、基質切断反応が配列中の正確な位置でのみで生じることをモニターし、これによって非特異的な切断産物を区別し、産物の２００アトモルの量でも検出できるほど高感度である。

Description

【発明の詳細な説明】 ＤＮＡポリメラーゼ伸長アッセイ 発明の分野 本発明は１本鎖オリゴヌクレオチド産物を産生する様に作用する酵素、あるい はその様な酵素の阻害物質の存在を検出し定量化する新規の高感度アッセイに関 する。発明の背景 ポリヌクレオチドを基質として利用する酵素は、多くの生物ならびにウィルス の生化学機能の基礎をなしている。この様な酵素群には、例えばエンドヌクレア ーゼ、エクソヌクレアーゼ、及びリボザイムが含まれる。酵素の多くは基質に作 用して１本鎖のオリゴヌクレオチド産物を産生する。例えば、インフルエンザウ ィルスエンドヌクレアーゼはキャップ化宿主細胞転写体を５’末端から１０から １３塩基の長さに切断する。配列特異的ＲＮＡエンドヌクレアーゼ、例えば、高 等動物に見られる、ＵｐＮｐダイマーのＲＮＡ３’１本鎖領域をＵＵならびにＵ Ａ配列を優先的に切断する、２−５Ａ−依存型ＲＮａｓｅが知られている。さら にリボザイムは１本鎖ＲＮＡを特定の認識配列で切断することが知られている。 これらの酵素の阻害剤あるいは活性化剤が、特にウィルス疾患に対して、治療 又は予防化合物の新しいクラスであろうと考えられているが、簡便なアッセイ系 がないため、このような化合物の同定は制約されてきた。 理想的な酵素アッセイ系は：ａ）処理能力が高く；ｂ）酵素が触媒した切断と 非特異的なヌクレオチドの切断を区別することができ；そしてｃ）高感度を有す るものでなければならない。これまで用いられてきた基質からのヌクレオチド切 断アッセイ（Ｐｌｏｔｃｈら．，１９８１ Ｃｅｌｌ ２３：８４７−８５８） は、産物から基質を分離するためのポリアクリルアミドゲル電気泳動の使用を含 み、多数の試料の処理には不便である。 発明の詳細な説明 本発明は、基質に作用して１本鎖オリゴヌクレオチド産物を産生する選択した 酵素について特異的な、新規な正確で高感度の迅速なアッセイに関する。本発明 は、オリゴヌクレオチド基質に作用して１本鎖のオリゴヌクレオチド産物を産生 する酵素、あるいはそのような酵素の阻害剤のいずれかを含むと考えられる試料 の酵素活性を検出する方法を含み、 ａ）オリゴヌクレオチド基質を１本鎖オリゴヌクレオチド産 物を産生する活性が測定される試料に加え、 ｂ）１本鎖のオリゴヌクレオチド産物を鋳型ＤＮＡとハイブリダズさせ、該鋳 型ＤＮＡは、実質的にオリゴヌクレオチド産物に相補的である第１セグメントと この第１セグメントに接続している鋳型５’−伸長領域とから成り、該伸長領域 はハイブリダイゼーション条件下でＲＮＡ：ＤＮＡヘテロ２本鎖体あるいはＤＮ Ａ：ＤＮＡ２本鎖体を形成する少なくとも一つのヌクレオチドを含むものであり 、 ｃ）該鋳型ＤＮＡの第２セグメントに相補的な標識されたモノヌクレオチドを 加え、 ｄ）ＤＮＡポリメラーゼが標識されたモノヌクレオチドをオリゴヌクレオチド 産物の３’−末端に付加して標識されたポリメラーゼ産物を産生する反応を触媒 できるような条件下にて、前記ヘテロ２本鎖体あるいは２本鎖体にＤＮＡポリメ ラーゼを加え、及び ｅ）試料の酵素活性量の測定として、標識されたポリメラーゼ産物の量を測定 することを含む。 本発明の更なる実施態様は、エンドヌクレアーゼがオリゴヌクレオチド基質を 切断して切断産物を生じる部位を決定する方 法であって、 ａ）鋳型ＤＮＡ試料を調製し、このＤＮＡは、切断産物に推定上相補的であり 、かつ切断産物と同一の長さである第１の３’−セグメントを有し、さらに少な くとも１ヌクレオチドを含む５’−伸長領域を有するものであり、 ｂ）ＲＮＡ：ＤＮＡヘテロ２本鎖体あるいはＤＮＡ：ＤＮＡ２本鎖体を形成さ せるハイブリダイゼーション条件下に、試料に切断産物を加え、 ｃ）５’−伸長領域に相補的である標識されたモノヌクレオチドを試料に加え 、 ｄ）該鋳型ＤＮＡの３’−セグメントが切断産物に相補的であり、また切断産 物と同一の長さである場合に、標識されたヌクレオチドが切断産物の３’−末端 に付加させるポリメラーゼ反応が生起する条件下にて、試料にＤＮＡポリメラー ゼを加え、及び ｅ）ステップｄ）で反応が起きたかどうかを決定することを含む。 本発明によれば、解析する試料には、オリゴヌクレオチド基質（ＤＮＡあるい はＲＮＡ）に作用して１本鎖のオリゴヌクレ オチド産物を産生する未知量の酵素を含んでいよう。この様な酵素の例としては 、ＤＮＡあるいはＲＮＡエンドヌクレアーゼを含む様々なエンドヌクレアーゼと リボザイムがある。特に好ましい酵素はウィルス由来のエンドヌクレアーゼとリ ボザイムである。 本発明の一つの実施態様において、試料中の酵素量を定量することができよう 。他の一つの実施態様では、試料は既知量の酵素とその阻害活性が測定されるべ き物質を含んでいよう。標識されたポリメラーゼ産物の量と阻害剤を含まない対 照試料から得られる標識されたポリメラーゼ産物量とを比較し、試料中に存在す る阻害活性の量を測定することができる。 本発明の別の観点では、このアッセイは、酵素が基質を切断する位置を容易に 決定するために使用することができる。アッセイのこの実施態様では、少なくと も１つ、それぞれ異なる長さを有し、それぞれ５’−伸長領域を有する、好まし くは一連の鋳型ＤＮＡが作成される。エンドヌクレアーゼ切断産物が加えられる 。鋳型ＤＮＡ伸長領域が、切断産物に相補的であり、かつ同一の長さの場合には 、鋳型ＤＮＡ伸長領域はハイブリダイズし、ポリメラーゼ付加反応が起こる。鋳 型伸長領域が切断 産物と同じ長さでなく、切断産物の３’−ＯＨが重合を開始できない場合には、 ポリメラーゼ反応は起きない。 本発明の別の実施態様では、エンドヌクレアーゼでなしにリボザイム活性が本 アッセイにより測定される。 存在する標識されたポリメラーゼ産物量を測定するために、いずれの検出法も 利用できよう。好ましい方法は、標識されたポリメラーゼ産物と過剰の標識され たモノヌクレオチドを標識されたポリメラーゼ産物を捕獲する濾紙に通し、この 濾紙上に捕獲された標識されたポリメラーゼ産物量を測定するものである。 図面の簡単な説明 図１は本発明のＤＮＡポリメラーゼ伸長アッセイを示す流れ図である。 図２は２０％アクリルアミド８Ｍ尿素ポリアクリアミドゲルのリンイメージャ ースキャンの写真であり、ポリメラーゼにより触媒された伸長反応に対するプラ イマーの長さと温度の影響を示している。１９とラベルされたレーンは、ＡＩＭ Ｖ基質の配列（５’−ＧＵＵＵＵＵＡＵＵＵＵＵＡＡＵＵＵＵＣ−３’）（配列 番号：１）を有する、非キャップ化ＲＮＡプライマー（１ ９ｎｔ）である；１４−６とラベルされたレーンは、表示の長さだけの、１９ｎ ｔプライマーの３’欠損により生じたＲＮＡプライマーに相当する。βとラベル されたレーンは、β−グロビンｍＲＮＡの５’側から得た１３ｎｔのＲＮＡ（５ ’−ＡＣＡＣＵＵＧＣＵＵＵＵＧ−３’）（配列番号：２）である。Ｄとラベル されたレーンは、ＡＩＭＶプライマー配列（５’−ＧＴＴＴＴＴＡＴＴＴＴＴＡ −３’）（配列番号：３）を有する１３ｎｔＤＮＡである。 図３はＤＮＡポリメラーゼ増幅の線型応答を示すグラフである。反応は実施例 ２記載の方法で行った。点を結んだ直線は直線最小自乗法で相関係数０．９９９ ９であった。 図４は実施例１記載のインフルエンザエンドヌクレアーゼ切断断物のポリメラ ーゼの触媒による伸長を示すゲルである。 定義 本明細書ならびに請求の範囲では次の定義を適用する： 「ｎｔ」はヌクレオチドの略語である。 「ＡＩＭＶ」はアルファルファモザイクウィルスの略語である。 「実質的に相補的」とは用いる実験条件下においてプラマ イ−の３’領域が鋳型ＤＮＡとハイブリダイズし、形成された２本鎖のＤＮＡが ＤＮＡポリメラーゼの基質と成り得るのに十分な相補性がある状態を意味する。 「実質的に相補的」とは、さらに、２本鎖体を形成するのに充分な相補性と、該 ２本鎖体の融解温度が溶液系の凍結点よりも高くなるのに十分な安定性とを有す ることを、必要とする。基質がＲＮＡである場合には、「実質的に相補的」とは 、ＲＮＡプライマーの３’領域が鋳型ＤＮＡとハイブリダイズしてヘテロ２本鎖 がＤＮＡポリメラーゼの基質と成り得るように十分に相補的であることを意味す る。さらにヘテロ２本鎖体が形成されるのに十分な相補性があり、その融解点が 溶液系の凍結点よりも高くなるのに十分な安定性を有することを意味する。 「オリゴヌクレオチド」とは少なくとも２ヌクレオチドの長さのものである。 「実質的な繰り返し」とは、オリゴヌクレオチドが少なくとも８０％の同一塩 基からなり、好ましくは少なくとも９０％の同一塩基からなり、さらに好ましく は少なくとも９５％の同一塩基からなることを意味する。 「ＡＩＭＶから誘導される」とは、オリゴヌクレオチドが少 なくとも８０％以上がＡＩＭＶ４ＲＮＡの５’−末端に相同であり、インフルエ ンザエンドヌクレアーゼの基質として作用すること、すなわちインフルエンザエ ンドヌクレアーゼで切断されうることを意味する。 「リボザイム」とは蛋白以外のＲＮＡより成る酵素の型を意味する。 「酵素」とは、分子が蛋白質か否かに関わらず、触媒作用を有する各種の生物 分子を含むことを意味しており、特にリボザイムを含む。 基質は、ＤＮＡあるいはＲＮＡのいずれのであっても、酵素が作用し１本鎖の オリゴヌクレオチド産物を生ずるものである任意のオリゴヌクレオチド基質であ り得る。基質は、酵素がその型の基質を必要とすれば、例えば５’−ｃａｐによ り、修飾されていれもよい。キャップ化オリゴヌクレオチド産物はこれと共に出 願され、またここに引用として取り込むＵ．Ｓ．Ｓ．Ｎ． （代理人事件整 理番号１９４０６）に記載された方法で作成できる。実施態様の一つは、アッセ イでインフルエンザエンドヌクレアーゼで切断される５’−キャップ化ＲＮＡを 使用する。５’−キャップ化ＲＮＡ前駆体は上記のＵ．Ｓ．Ｓ． Ｎ． （代理人事件整理番号１９４０６）に記載された５’−３リン酸を含 む１９ｎｔＲＮＡを作る方法により作成できる。次にこれを、ここに引用して取 り込むＵ．Ｓ．Ｓ．Ｎ． 、 日出願（代理人事件整理番号１９３９３） に記載された様にして、グアニリルトランスフェラーゼで処理する。グアニリル トランスフェラーゼは公知であり、市販品、例えば、ワクシニアウィルスグラニ リルトランスフェラーゼがＢｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅｓｅａｃｈ Ｌａｂｏｒａｔ ｏｉｒｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ．より、購入できる。１９ｎｔ５ ’−キャップ化ＲＮＡ基質が得られ、インフルエンザエンドヌクレアーゼで切断 され、１３ｎｔの産物を生成する。好ましくは、エンドヌクレアーゼ基質は、こ れまでにインフルエンザエンドヌクレアーゼの基質でありヌクレオチドＡ１３の 位置で切断されることが示されている、ＡＩＭＶ４ＲＮＡの５’−末端に由来す るものである。 もう一つの好ましい態様は、酵素が、ハンマーヘッドリボザイム、ヘアーピン リボザイムあるいはグループＩイントロン型リボザイムの様なリボザイムであり 、基質がＲＮＡ分子である。リボザイムは一般に機能するために２価イオンの存 在が必要で あり、これらがアッセイ反応混合液中に存在することが重要である。選択した特 定のリボザイムに依存して、活性に必要な重要な公知のイオンにはＺｎ⁺²、Ｍｎ⁺² 、Ｍｇ⁺²、あるいはＣａ⁺²の様な２価の金属陽イオンが含まれる。それからオ リゴヌクレオチド基質を該陽イオン存在下にリボザイムで切断する。 その後、オリゴヌクレオチド産物はＤＮＡポリメラーゼにより触媒される伸長 反応のプライマーとして用いられる。ポリメラーゼ伸長反応を進めるためには、 鋳型ＤＮＡが必要である。鋳型ＤＮＡは２つの部分より成る分子で、オリゴヌク レオチド産物に実質的に相補的である３’−領域を含んでいて、鋳型５’−伸長 領域に結合している。理論的には、この５’−伸長領域は所望のいずれのヌクレ オチドからも作ることができるが、実質的に繰り返されているヌクレオチドであ ることが望ましく、この伸長領域にあるヌクレオチドが、正確な位置で切断され る産物の特異性を得るために、３’−相補的領域に存在しないことが望ましい。 最も好適な態様においては、５’−伸長領域は繰り返されているヌクレオチドか ら作成される。５’−伸長領域が実質的に繰り返されているヌクレオチドから作 成されていない場合には、非特異産物に比べ正しい切断産物のシグナルが 増幅されるように充分に長くない限り、アッセイに特異性の問題が生じよう。 伸長領域の長さについては、特に限定はなく、短い場合には１ヌクレオチドで あり、長い場合には存在する合成法で可能な限りの長さである（５０ヌクレオチ ドかそれ以上）。好適な実施態様では、５’−伸長領域の長さは少なくとも１ヌ クレオチド以上であり、好ましくは約１０ヌクレオチドである。すなわち、鋳型 伸長領域はポリ−ｄＣ、ポリ−ｄＧ、ポリ−ｄＡあるいはポリ−ｄＴ域であるこ とが好ましい。本発明の好ましい実施態様の１つでは、鋳型伸長領域が１０ｎｔ の長さをもつポリ−ｄＣである。 ＤＮＡポリメラーゼにより触媒される伸長反応の間、オリゴヌクレオチド産物 は鋳型ＤＮＡ伸長領域に存在するヌクレオチドに相補的な標識ヌクレオチドによ って長さを延ばす。例えば、鋳型伸長領域が１０残基のポリ−Ｃの場合、オリゴ ヌクレオチド産物は標識されたポリ−Ｇ配列により１０塩基伸長する。ヌクレオ チドの標識には、産物の伸長反応域に取り込まれる、蛍光あるいは吸光標識体の 様なヌクレオチドアッセイの分野で通常使用されるいずれのタイプの標識体でも 利用でき、放射性標 識体の使用が好ましい。好適な実施態様では、産物の伸長領域はポリ−α−３２ Ｐ標識ｄＧＭＰである（図１に示す様に）。 さらに、ポリメラーゼにより触媒される、鋳型の３’−ＯＨからの伸長を防ぐ ために、プライマーの３’−ＯＨはブロックすることが好ましい。ブロッキング 剤としては様々なものが知られており、また適していて、コルジセピン（３’− デオキシアデノシン）やその他の３’−ＯＨを持たない３’−部分が含まれる。 本発明の実施態様の１つでは、３’−ＯＨは（３−アミノ−２−ヒドロキシ）− プロポキシフォスフォリルでブロックされる。本発明の別の実施態様では、３’ −ＯＨは３’−３’−Ａ−５’結合の導入でブロックされる。プライマーの３’ −ＯＨをブロックせずに本発明のアッセイを実行することも可能であるが、３’ −ＯＨ端のブロックはバックグランドシグナルを防ぎ、アッセイの感度を上げる のに役立つ。 様々なＤＮＡポリメラーゼ酵素が知られており、本発明のＤＮＡポリメラーゼ 反応段階に使用することができる。酵素の基質がＲＮＡである実施態様では、試 験管内の突然変異誘導により３’から５’へのエクソヌクレアーゼ活性が消失し た変異体であるバクテリオファージＴ７のＤＮＡポリメラーゼ（Ｔａｂ ｏｒら．，１９８９ Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ ２６４：６４ ｎ２が好適なＤＮＡポリメラーゼである。本ポリメラーゼが好適なのは、プライ マーとしてオリゴリボヌクレオチドを利用でき、複製の忠実度が高く、３’から ５’への「校正」活性がないからである。 使用する標識体のタイプに依存して、適当ないずれかの方法で、標識されたハ イリブリッドポリメラーゼ産物を検出する。一般には、この工程には標識された モノクレオチドを標識されたハイブリッドポリメラーゼ産物から分離する工程を 含んでいる。好適な実施態様では、検出は試料混合液（アッセイのこの時点では 標識されたハイブリッドポリメラーゼ産物と過剰の標識されたモノヌクレオチド が含まれている）をナイロン膜を用いて濾過して行う。取り込まれなかった標識 されたモノヌクレオチドは膜を通過するのに対して、標識されたハイブリッドポ リメラーゼ反応産物は膜に捕獲される。標識体が放射性標識体の場合には、濾過 膜に結合した放射活性量をリンイメージャーあるはプレート測定用シンチレイシ ョンカウンターを用いて定量できる。 本アッセイは、電気泳動の工程を含まず、９６ウエルのマイクロタイタープレ ート様式で測定ができる点で、従来の技術と異なる有利な点を有する。本発明の アッセイの別の重要な有利な点は、配列中の正確な位置で起きた基質切断反応だ けをモニターし、従って非特異的な切断産物を区別出来ることである。さらに重 要な点は、本アッセイが典型的な切断反応で生じる産物の２００アトモル（２× １０^-16ｍｏｌｅｓ）を検出できるほどの感度を有していることである。 本発明の好適な実施態様のアッセイの特異性は、鋳型ＤＮＡを選択し、高い忠 実性を持つＴ７ ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎａｓ 条件では、基質の９０％以上は切断されないが、未切断のＲＮＡ基質は３’端が 鋳型と塩基対を形成できないことから、重合反応のプライマーとして機能せず、 したがってアッセイの特異性に干渉することはない。さらに、酵素切断部位以外 の異なる部位で切断された非特異切断産物は伸長しない。これらの短い（あるい は長い）配列は鋳型とはハイブリダイズするが、重合反応にはヌクレオチドの存 在が必要であり、反応混合液中にはこれが存在していないためにＤＮＡポリメラ ーゼによる伸長 は起きない。 ポリメラーゼ伸長反応はプライマーの鋳型ＤＮＡへのハイブリダイゼーション に依存している。したがって、鋳型ＤＮＡへのプライマーの効果的なハイブリダ イゼーションのためには、ポリメラーゼ伸長反応はプライマー：鋳型複合体の融 解温度より少なくとも１０℃低い温度で好適に遂行される。典型的な好適な反応 温度は融解温度が鋳型複合体の場合で１４℃のプライマーで０℃である。 図２にはポリメラーゼに触媒される伸長反応の特異性と温度の効果を示した。 インフルエンザエンドヌクレアーゼアッセイでは、切断されて１３ｎｔのＲＮＡ になるキャップ化ＡＩＭＶＲＮＡ基質を用いた。様々な長さと配列を有する合成 の非キャップ化ＲＮＡとＤＮＡプライマーを鋳型ＤＮＡとハイブリダイズさせ、 ポリメラーゼとα³²Ｐ−ｄＧＴＰを用いて伸長した。反応を０℃で行った場合、 効果的な伸長がおきたプライマーは１３ｎｔ ＡＩＭＶ ＲＮＡと、ＤＮＡ中の それに対応する配列だけであった。不完全な伸長産物はゲル上に観察されるが、 反応条件を最適化することで最も強いシグナルのバンドが完全なプライマー伸長 例と一致する様になる。最も強いバンドの上 にある薄いバンドが１塩基付加されたものに一致する。平滑端ＤＮＡの３’−Ｏ Ｈ末端に１塩基を付加する反応を触媒するＤＮＡポリメラーゼは幾つか知られて いる（Ｃｌａｒｋ，１９８８ Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１６；９６７７ −９６８６）。おそらく同様の活性は本例で使用したＳｅｑｕｅｎａｓ を含むレーンの強度が低いバンドは１４ｎｔリボヌクレオチド中に存在した微量 の汚染１３ｎｔ ＲＮＡであろう。全長１９ｎｔのプライマー、１３ｎｔより短 いＡＩＭＶプライマー、あるいはβグロビン転写体の５’末端に由来する非相同 的な１３ｎｔ ＲＮＡ（５’−ＡＣＡＣＵＵＧＣＵＵＵＵＧ−３’）（配列番号 ：２）を用いた場合には伸長産物は観察されなかった。 を選択的に伸長し、未切断のＡＩＭＶ基質に一致する配列あるいはより短い非特 異的切断産物を識別する。Ｓｅｑｕｅｎａｓ ＡＩＭＶプライマーの不正確な伸長を防ぐことは注目に値する。 本発明によれば、ポリメラーゼ伸長反応はナイロン膜の濾過を利用して簡便に モニターできる。記載した条件下では、伸長 した産物の定量的結合が観察され、取り込まれていないα³²Ｐ−ｄＧＴＰのうち の極少量（０．０００３％未満）だけがナイロン膜上に捕獲されている。大量の スクリーニングのためには、濾過工程は９６ウエルマニフォールドを用いて行う ことができ、フィルターに結合した放射活性はリンイメージャー装置あるいはマ イクロプレートシンチレーションカウンターのいずれかで定量測定できる。図３ にはナイロン膜濾過及びリンイメージャーの検出を使用した、１３ｎｔ ＡＩＭ Ｖ ＲＮＡプライマーの伸長に関して感度及び線型応答を示す。反応液２０μｌ 中約２００ｐＭのプライマー濃度までの良好な直線性が観察された。典型的なア ッセイ条件下では基質の約１０％が変換し、４０ｐＭの産物に相当するポリメラ ーゼ伸長反応産物とハイブリダイズすることに注意。この量は直線域ならびにア ッセイの検出限界範囲内にある。 プライマーにから独立したバックグランドの反応は図２の全てのレーンで主要 な伸長産物の上にくる薄いバンドとして現れ、図３では０でないｙ軸切片として 示されている。鋳型がない状態では、前記のバックグランドシグナルは無くなり 、後者の切片値は極めて小さな値となることから、両者の間に相関性があ ることが示唆される。バックグランドのシグナルはインフルエ は関係している。すなわち、バックグランドはＳｅｑｕｅｎａ みに依存している。３’−ＯＨ基がアミノリンカー部分でブロックされていない 鋳型を利用した時により高いバックグランドシグナルが観察されたことは、反応 には遊離３’−ＯＨが必要であることを示唆している。バックグランドシグナル は、アミノリンカーでブロックされた鋳型をｄｄＡＴＰとターミナルデオキシヌ クレオチジルトランスフェラーゼで処理することでさらに小さくでき、このこと から鋳型内に不純物が含む遊離３’−ＯＨが存在していることが示唆される。 インフルエンザエンドヌクレアーゼ／ポリメラーゼの共役した伸長反応につい て明確に特徴付けするために、ｍ⁷Ｇ³²ｐ−標識したＡＩＭＶ基質を用いて一連 の反応を遂行し、ゲル電気泳動により分析した。図４に、コア蛋白がない状態で は、ＡＩＭＶ基質は長さ１９ｎｔに相当するバンドとして移動することが示され た。基質をインフルエンザコア蛋白と反応させると主要切断産物とそれより短い マイナー産物が得られた。主要産物 はＡｌ３の位置で切断された物に一致する。この産物はＧＴＰと反応させると伸 長する。同様の結果は全長のＡＩＭＶ ＲＮＡ４を用いた例ですでに報告されて いる（Ｐｌｏｔｃｈら．，１９８９ Ｃｅｌｌ ２３：８４７−８５８）。１０ 倍過剰の未標識の非キャップ化ＡＩＭＶ基質を加えても切断の程度には ＴＰと反応させても、インフルエンザコア蛋白がないと伸長反応は起きない。コ ア蛋白により基質を切断して、ポリメラーゼ伸長を行うと、基質バンドの上に薄 いバンドが出現する。このバンドは１３ｎｔ産物に１０ｄＧ残基が付加されたも のに相当 は伸長しない。逆に、切断後８０℃で１分間反応させた本試料では、近定量的伸 長が観察される。切断産物の解離は極めて遅いようで、加熱工程がインフルエン ザエンドヌクレアーゼ複合体を変性して結合産物を放出させる。図２に見られる 様なポリメラーゼ伸長産物の上にある薄いバンドは、平滑端を持つ伸長したプラ イマー：鋳型２本鎖体に過剰のｄＧ残基が付加されたものに相当する。切断反応 だけの場合には、ポリメラーゼ伸長アッセイは１０倍過剰な未標識の非キャップ 化ＡＩＭＶ基質の 存在には影響を受けない。最後のレーンでは、１４ｎｔの相補的領域を含む２４ ｎｔの鋳型が１３ｎｔの相補的鋳型の代わりに加えられている。特異的切断産物 は本試料では伸長せず、このことから主要産物はＡ１３位置で切断されるのであ って、Ａ１４位置ではないことが認識される。 ＤＮＡポリメラーゼ伸長アッセイを、すでにゲルによるアッセイで我々により 同定されている阻害剤（４−［Ｎ−ベンゼン−スルフォニル−３−（４−クロロ ベンジル）ピペリジン−３−イル］−２，４−ジオキソブタン酸）を用い、イン フルエンザエンドヌクレアーゼ阻害剤の検出に関して評価した。この化合物は最 近インフルエンザエンドヌクレアーゼの阻害剤として報告された４−置換２，４ −ジオキソブタン酸に類似している（Ｔｏｍａｓｓｉｎｉら．，１９９４ Ａｎ ｔｉＭｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．３８：２８２７−２８ ３７）。本化合物を用いたエンドヌクレアーゼの阻害の力価測定は、同一条件下 でゲルを利用したアッセイと本発明によるＤＮＡポリメラーゼ伸長アッセイを用 いて行った。３ｎＭから１０μＭまでの範囲で得られたデータを単純双曲線阻害 モデルに当てはめて決定したＩＣ⁵⁰値は、ゲルアッセイでは２６０±６ ０ｎＭであり、ＤＮＡポリメラーゼ伸長アッセイでは２２０±５０ｎＭであった 。誤差範囲内で、本化合物の強さは両アッセイで同一であったことから、ＤＮＡ ポリメラーゼ伸長アッセイは正確にインフルエンザエンドヌクレアーゼの阻害を モニターしていることが示された。 本発明の別の観点は、ＤＮＡポリメラーゼ伸長アッセイにより、キャップ化構 造を持つ基質の切断位置を決定する簡便な方法を提供することである。過去にお いては、エンドヌクレアーゼの切断部位はアルカリ消化法やＲＮａｓｅによる消 化と電気泳動によって配列ラダーを作成し行った。アルカリ消化法ではキャップ 化構造中のｍ７Ｇ残基のアルカリ加水分解に対する不安定性に起因する不確定さ の問題があり、ＲＮａｓｅ法についてはＲＮａｓｅの作用による３’−リン酸化 された配列の電気泳動の移動速度が、エンドヌクレアーゼにより作られたリン酸 化されていない３’−ＯＨ末端をもつものに比べて早いという問題があった。こ れに対して、本発明のＤＮＡポリメラーゼ伸長アッセイを利用すると、予想され る切断産物に対応する相補的領域と鋳型を利用して触媒された伸長反応とを比較 することで簡便に切断部位を同定することができる。図４には本発明のこの 観点について示しており、１３ｎｔの相補的領域を有する鋳型は基質として作用 しているが１４ｎｔの相補的鋳型は作用していない。 本発明の伸長アッセイの他の既存法に比べて主な有利な点は問題のオリゴヌク レオチド産物を、重合を開始しないその他のヌクレオチドの存在下で検出できる ことである。すなわち、問題の反応の正確な測定が複雑な、不純な標本でさえ可 能である。このことはリボザイムを介した切断反応をモニタリングする上で特に 有用である。 以下の限定されない実施例は本発明をよりわかりやすくする。 実施例 一般的実験方法 ：オリゴ−デオキシリボヌクレオチドならびにキャップ化オリゴ −リボヌクレオチドはＭｉｄｌａｎｄ Ｃｅｒｔｉｆｉｅｄ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｍｉｄｌａｎｄ，ＴＸ）により合成され、陰イオン交換ＨＰＬ Ｃで精製された。３リン酸化オリゴヌクレオチドは、ここに引用して取り込む係 属中の特許出願 、（代理人事件整理番号１９４０６，本願と併願）に記載 の方法にて合成しキャップ化した。１９ｎｔの基質オリゴ−リボヌクレオチドの 配列は５’−ｐｐ ｐ−Ｇ（２’−ＯＭｅ）ＵＵＵＵＵＡＵＵＵＵＵＡＡＵＵＵＵＣ−３’（配列番 号：１）である。１４，１３，１２，１０ならびに６ｎｔの長さの基質の５’− 領域に相当する３’−トランケートリボヌクレオチドを合成した。特記しない限 り実験には５’−ビオチン−ＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＴＡＡＡＡＡＴＡＡＡＡＡＣ −アミノ−３’（配列番号：４）の配列を有する２３ｎｔの鋳型を使用した。こ こで５’−ビオチンはＮ−ビオチニル−６−アミノヘキシルオキシフォスフォリ ル部分であり、３’−アミノは３−アミノ−２−ヒドロキシ−プロポキシフォス フォリルである。幾つかの実験では次の配列の２４ｎｔの鋳型を使用した：５’ −ビオチン−ＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＴＴＡＡＡＡＡＴＡＡＡＡＡＣ−アミノ−３ ’（配列番号：５）。α−³²Ｐ−ｄＧＴＰ（３０００Ｃｉ／ｍｍｏｌｅ）はＤｕ ｐｏｎｔ ＮＥＮより得た。未標識のｄＧＴＰはＰｈａｒｍａｃｉ ｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ， ＯＨ）より得た。 特記しないかぎり、ポリメラーゼ伸長反応には１ｎＭのプラ と５００ｎＭのｄＧＴＰが含まれ、記載した温度で２時間反応した。反応物は２ ０％ポリアクリルアミド８Ｍ尿素ゲルで解析した。 実施例１ 切断反応とＤＮＡポリメラーゼ反応 インフルエンザ切断反応は１００ｍＭトリス［ヒドロキシメチル］アミノメタ ン（Ｔｒｉｓ），ｐＨ８．０、５０ｍＭＫＣ１、０．２５ｍＭＭｇＣｌ₂、５ｍ Ｍジチオスレイトール（ＤＴＴ）、４％（ｖ／ｖ）ジメチルスルフォオキシド（ ＤＭＳＯ）、をＤＥＰＣ処理した水に加えた緩衝液中で２５℃で行った。ポリメ ラーゼ伸長反応もＭｇＣｌ₂濃度が１０ｍＭに、ＤＭＳＯ濃度が９％にそれぞれ 増加した以外は同じである緩衝液中で行った。末端標識したプライマーを使用す る伸長反応には５００ｎＭのｄＧＴＰを用い、未標識のプライマーについては５ ０ｎＭのα−³²Ｐ−ｄＧＴＰと４５０ｎＭの混合液を使用した。特記しない限り 、伸長反応は０℃で行った。阻害測定については、化合物４−［Ｎ−ベンゼンス ルフォニル−３−（４−クロロベンジル）ピペラジン−３−イル］−２，４−ジ オキソ−酪酸とインフルエンザコア蛋白を１０分間前反応した。切断反応 は０．４ｎＭの未標識（ゲルアッセイ）あるいは末端標識（ＤＮＡポリメラーゼ 伸長アッセイ）基質を１５μＬの用量の０．７５μＬのインフルエンザコア蛋白 を含む反応液を加えて開始し、１０分間２５℃で反応した。ＤＮＡポリメラーゼ 伸長アッセイについては、伸長反応は５０ｎＭの、２０μＬのＳｅｑｕ 液中で１８時間０℃で実施した。 反応の解析は、８Ｍの尿素を含む２０％ポリアクリルアミドゲル電気泳動か、 ９６ウエル型マニフォールド（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ａｎｄ Ｓｃｈｕｅｌｌ ，Ｋｅｅｎｅ，ＮＨ）中の った。濾過の場合には、試料を２５０ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ８．０の２００μＬで 希釈し、この２００μＬを５ＸＳＳＣ（０．７５ＭＮａＣｌ、７５ｍＭクエン酸 ナトリウム、ｐＨ７．０）で平衡化した膜上にのせてすぐに濾過した。各ウエル は２００μＬの５ＸＳＳＣで５回洗浄してから、フィルターをマニフォールドよ り取りのぞき、１００ｍｌの５ＸＳＳＣで３回洗浄した。 ゲルを可視化し、フィルターは製造元が供給するＩｍａｇｅ ｏｌｅｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，Ｃ ｄ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｍｅｒｉｄｅｎ，ＣＴ）マイクロプレートシンチ レイションカウンターで行った。 実施例２ リボザイム切断向けＤＮＡポリメラーゼ伸長アッセイ 動的反応を、ここに引用して取り込むＦｅｄｏｒとＵｈｌｅｎｂｅｃｋの方法 、１９９０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ ８７：１６６８ −１６７２，に従い、１ｎＭのリボザイムと１０ｍＭの２価金属イオンならびに ５０ｎＭのＲＮＡ基質濃縮を用いて実施する。ＤＮＡポリメラーゼ伸長反 ＴＰ、１００ｎＭ捕獲オリゴヌクレオチド／鋳型を用いて１８時間０℃で行う。 反応は上記方法により解析する。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 クウオー，ローレンス・シー アメリカ合衆国、ニユー・ジヤージー・ 07065、ローウエイ、イースト・リンカー ン・アベニユー・126 (72)発明者 オルセン，デイビツド・ビー アメリカ合衆国、ニユー・ジヤージー・ 07065、ローウエイ、イースト・リンカー ン・アベニユー・126

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． ａ）オリゴヌクレオチド基質を１本鎖オリゴヌクレオチド産物を産生する 活性を測定する試料に加える工程、 ｂ）１本鎖のオリゴヌクレオチド産物を鋳型ＤＮＡとハイブリダズさせる工程 、該鋳型ＤＮＡは実質的にオリゴヌクレオチド産物に相補的である第１セグメン トと、この第１セグメントに接続されている鋳型５’−伸長領域とから成り、該 伸長領域はハイブリダイゼーション条件下でＲＮＡ：ＤＮＡヘテロ２本鎖体また はＤＮＡ：ＤＮＡ２本鎖体を形成する少なくとも一つのヌクレオチドを含むもの であり、 ｃ）該鋳型ＤＮＡの５’伸長領域に相補的な標識されたモノヌクレオチドを加 える工程、 ｄ）ＤＮＡポリメラーゼが標識されたモノヌクレオチドをオリゴヌクレオチド 産物の３’−末端に付加して標識されたポリメララーゼ産物を産生する反応を触 媒できるような条件下にて、前記ヘテロ２本鎖体または２本鎖体にＤＮＡポリメ ラーゼを加える工程、および ｅ）標識された重合産物を測定して、試料の酵素活性量を測 定する工程 を含むオリゴヌクレオチド基質に作用して１本鎖のオリゴヌクレオチド産物を産 生する酵素の試料中の活性を検出する方法。 ２．試料がさらに該酵素の推定阻害剤を含む請求項１の方法。 ３．該酵素がエンドヌクレアーゼとリボザイムから成る群から選択される請求項 １に記載の方法。 ４．基質がＤＮＡ基質である請求項３に記載の方法。 ５．基質がＲＮＡ基質である請求項３に記載の方法。 ６．酵素がリボザイムであり、試料はさらに２価の陽イオンを含む請求項３に記 載の方法。 ７．鋳型伸長領域が少なくとも約１０ヌクレオチドの長さを有する請求項１に記 載の方法。 ８．鋳型伸長領域が実質的に繰り返されているヌクレオチドからなる請求項７に 記載の方法。 ９．標識されたモノヌクレオチドが放射性標識されている請求項１に記載の方法 。 １０．標識されたポリメラーゼ産物と過剰の標識されたモノヌクレオチドを含む 試料をフィルターを通過させてフィルター上に標識されたポリメラーゼ産物試料 を捕獲し、そのフィルター 上の放射標識の量を測定することで、標識されたポリメラーゼ産物の量を測定す る請求項９に記載の方法。 １１．フィルターがナイロンフィルターである請求項１０に記載の方法。 １２．アッセイされる試料がウィルス酵素の推定阻害剤が含まれる請求項１に記 載の方法。 １３．試料の酵素活性の量を、推定阻害剤が存在しない同一のウィルス酵素を含 む対照試料について測定した活性と比較する工程をさらに含む請求項１２に記載 の方法。 １４．アッセイされる試料がリボザイム活性の推定阻害剤を含む請求項１に記載 の方法。 １５．試料のリボザイム活性の量を、推定阻害剤が存在しない同一のリボザイム を含む対照試料について測定した活性と比較する工程をさらに含む請求項１４に 記載の方法。 １６． ａ）ＲＮＡエンドヌクレアーゼ基質を、その活性が測定されるエンドヌ クレアーゼと推定エンドヌクレアーゼ阻害剤を含む試料に加えてＲＮＡ産物を形 成させる工程、 ｂ）ＲＮＡ産物を鋳型ＤＮＡとハイブリダズさせる工程、該鋳型ＤＮＡは実質 的にＲＮＡ産物に相補的である第１３’− セグメントとこの第１セグメントの５’−末端に接続されている５’−伸長領域 から成り、該５’−伸長領域はハイブリダイゼーション条件下でＲＮＡ：ＤＮＡ ヘテロ２本鎖体を形成する実質的に繰り返されている少なくとも１０ヌクレオチ ドを含み、 ｃ）実質的に繰り返されているヌクレオチドに相補的な放射性標識されたモノ ヌクレオチドを加える工程、 ｄ）ＤＮＡポリメラーゼが放射性標識したモノヌクレオチドをＲＮＡ産物の３ ’−末端に付加する反応を触媒できる条件下にて、前記ヘテロ２本鎖体にＤＮＡ ポリメラーゼを加えて、放射性標識されたポリメラーゼ産物を産生する工程、 ｅ）試料をナイロンフィルターを通すことで放射性標識されたポリメラーゼ産 物と過剰の放射性標識されたモノヌクレオチドを含むサンプル濾過して、フィル ター上に放射性標識されたポリメラーゼ産物を捕獲する工程、および ｆ）フィルター上に捕獲された放射性標識されたポリメラーゼ産物の量を測定 し、エンドヌクレアーゼ阻害剤を含まない対照試料を測定して得た値と上記量と を比較する工程、 を含む資料のエンドヌクレアーゼ活性の検出法。 １７． ａ）リボザイム基質を、その活性が測定される、リボザイムと推定リボ ザイム阻害剤を含む試料に加えてＲＮＡ産物を生成させる工程、 ｂ）ＲＮＡ産物を鋳型ＤＮＡとハイブリダズさせる工程、該鋳型ＤＮＡは実質 的にＲＮＡ産物に相補的である第１３’−セグメントとこの第１セグメントの５ ’末端に接続されている５’−伸長領域から成り、該５’−伸長領域はハイブリ ダイゼーション条件下でＲＮＡ：ＤＮＡヘテロ２本鎖体を形成する実質的に繰り 返されている少なくとも１０ヌクレオチドを含み、 ｃ）実質的に繰り返されているヌクレオチドに相補的な放射性標識されたモノ ヌクレオチドを加える工程、 ｄ）ＤＮＡポリメラーゼが放射性標識されたモノヌクレオチドをＲＮＡ産物の ３’−末端に付加する反応を触媒できる条件下にて、前記ヘテロ２本鎖体にＤＮ Ａポリメラーゼを加えて、放射性標識されたポリメラーゼ産物を産生する工程、 ｅ）試料をナイロンフィルターを通すことで放射性標識されたポリメラーゼ産 物と過剰の放射性標識されたモノヌクレオチドを含むサンプル濾過して、フィル ター上に放射性標識されたポリメラーゼ産物を捕獲する工程、及び ｆ）フィルター上に捕獲された放射性標識されたポリメラーゼ産物の量を測定 し、リボザイム阻害剤を含まない対照試料を測定して得た値と上記量とを比較す る工程、 を含む試料のリボザイム活性の検出法。 １８． ａ）ＤＮＡが第１３’セグメントと切断産物に相補的と考えられかつ切 断産物と同一の長さであると考えられる５’−伸長領域を有し、少なくとも一つ のヌクレオチドを有する鋳型ＤＮＡ試料を少なくとも一つ調製する工程、 ｂ）ハイブリダイゼーション条件下に試料に切断産物を加えて、ＲＮＡ：ＤＮ Ａヘテロ２本鎖体あるいはＤＮＡ：ＤＮＡ２本鎖構造体を形成させる工程、 ｃ）５’−伸長領域に相補的である標識されたモノヌクレオチドを試料に加え る工程、 ｄ）鋳型ＤＮＡの５’−セグメントが切断産物に相補的でありかつまた切断産 物と同一の長さである場合に、標識されたモノヌクレオチドが切断産物の３’− 末端に付加するポリメラーゼ反応が生起する条件下にて、試料にＤＮＡポリメラ ーゼを加える工程、および ｅ）ステップｄ）で反応が起きたかどうかを測定する工程、 を含むヌクレアーゼがオリゴヌクレオチド基質を切断して切断産物を生じる部位 を決定する方法。 １９．各試料が異なる長さの複数の鋳型ＤＮＡ試料を第１工程で調製する請求項 １８に記載の方法。