DE69616705T2

DE69616705T2 - Wiederverwendbare Flaschenabdeckkappe

Info

Publication number: DE69616705T2
Application number: DE69616705T
Authority: DE
Inventors: Susan L. Barker; John M. Janson; John J. Kayal
Original assignee: Becton Dickinson and Co
Current assignee: Becton Dickinson and Co
Priority date: 1995-09-08
Filing date: 1996-08-23
Publication date: 2002-08-01
Anticipated expiration: 2016-08-24
Also published as: DE69616705D1; EP0761813B1; JPH09107948A; AU718368B2; AU6441896A; JP4049836B2; US5595907A; EP0761813A2; EP0761813A3

Description

Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung zur Zellkulturherstellung und insbesondere eine Anordnung aus einem Gefäß und einem Verschluß mit einer Einrichtung zum Variieren der Gasdiffusion in das und aus dem Gefäß.
Üblicherweise werden Zellen unter Bedingungen gezüchtet, unter denen die Wasserstoffionenkonzentration (pH, der negative Logarithmus der Wasserstoffionenkonzentration), die Temperatur, die Feuchtigkeit, die Osmolarität und die Konzentration bestimmter Ionen innerhalb relativ enger Grenzen geregelt werden.
Gefäße, die in derartigen Gewebekultursystemen verwendet werden, bestehen üblicherweise aus Kunststoff und weisen Verschlüsse auf. Derartige Gefäße und Verschlüsse sind in den US-Patenten 4 289 248, 4 387 822, 4 770 308 und 5 047 347 dargestellt.
Bei typischen Kultursystemen wird der pH-Wert nahe physiologischer Level gehalten, indem ein Puffersystem in dem Zellkulturfluid in Verbindung mit einem Inkubator verwendet wird, in welchen Kohlendioxid (CO&sub2;) mit einer Rate eingeleitet wird, die ausreicht, eine Konzentration in der Inkubatoratmosphäre von ungefähr 5 bis 7 Volumenprozent beizubehalten. Das CO&sub2; reagiert mit Wasser zur Bildung einer schwachen Säure und einer Karbonsäure, die ihrerseits mit dem Puffersystem zusammenwirkt, um den pH-Wert nahe physiologischen Werten zu halten. Das Eintreten des CO&sub2; vom Inkubator in das Gewebekulturgefäß erfolgt im allgemeinen unter Verwendung eines Verschlusses auf dem Gefäß, beispielsweise einer lose sitzenden Kappe, eines Stopfens oder einer Kappe mit einer durchlässigen Membran (WO 88/01605). Das Gleichgewicht im Gefäß wird aufrecht erhalten, indem ein Gasaustausch mit dem Inneren des Gefäßes und der Atmosphäre des Inkubators ermöglicht wird, während die Sterilität gewahrt bleibt und Flüssigkeitsleckagen verhindert werden. Eine lose sitzende Kappe oder ein Stopfen wird entweder durch den Benutzer in geeignetem Maße teilweise geöffnet oder der Verschluß ist bereits derart ausgebildet.
Das Entnehmen des Gefäßes aus der kontrollierten Atmosphäre des Inkubators ist während des Züchtens und Kultivierens von Zeilen oftmals erforderlich. Die Gefäße werden üblicherweise zur Untersuchung und/oder Behandlung der Zellen und Kulturfluids entnommen. Es ist wichtig, daß der pH-Wert der Zellkultur auf dem gewünschten physiologischen Wertgehalten wird, während sich das Gefäß außerhalb des Inkubators befindet.
Es besteht ein spezieller Bedarf an einer verbesserten Verschlußanordnung für ein Kulturgefäß, die (1) ein schnelles und gleichmäßiges Gleichgewicht zwischen der Gefäßatmosphäre und dem Inkubator schafft; (2) ein Entnehmen des Kulturgefäßes aus der kontrollierten Atmosphäre des Inkubators für ausreichend lange Zeit ermöglicht, ohne die Zellkultur unerwünschten Veränderungen des pH-Werts des Systems auszusetzen; und (3) wiederverwendbar ist.
US-A-5 391496 offenbart eine Kulturgefäßanordnung gemäß dem Oberbegriff des Anspruchs 1. Die Anordnung weist ein Gefäß und eine mit einer gasdurchlässigen Membran versehene Kappe zum Schließen des Gefäßes auf. Ein entfernbarer Stopfen ist an der Kappe zum Sperren der Gasdiffusion in das und aus dem Gefäß angebracht. Der Stopfen ist mit einer einstückig angeformten Hängelasche ausgebildet.
Eine einstückige Kappe für ein Rohr ist in US-A-3 297 184 offenbart, welche einen zentralen Stopfenbereich, der das Abdichten des oberen Endes des Rohres vereinfacht, und innere Rippen aufweist, welche eine Regulierung des Ausmaßes der Abdichtung erlauben.
US-A-4 136 796 offenbart einen belüfteten Verschluß mit einem entfernbaren Stopfen, der an seiner Basis eine gasdurchlässige Membran aufweist. Der Stopfen ist mit einem Außengewinde, das in ein Innengewinde des inneren Flanschs der Kappe zusammengreift, einem sich radial erstreckenden Deckel, der mit der Oberseite der Kappe zum Abdichten der Verbindung und zum Verhindern eines zu weiten Einschraubens des Stopfens in die Kappe, und Löchern zum auslassen von Gasen in die Umgebung versehen.
Es ist die Aufgabe der Erfindung, eine alternative Kulturgefäßanordnung mit einer Einrichtung zum Variieren der Gasdiffusionsrate in das und aus dem Gefäß zu schaffen.
Die erfindungsgemäße Kulturgefäßanordnung ist durch Anspruch 1 definiert. Die vorliegende Erfindung ist ein Gefäß mit einer Kammer, einer Öffnung, einem Verschluß oder einer anderen mit der Öffnung in Verbindung stehenden Einrichtung, einer Einrichtung zum Ermöglichen der Gasdiffusion in das und aus dem Gefäß, und einer Einrichtung zum Sperren der Gasdiffusion. Höchst vorzugsweise dichtet der Verschluß das Gefäß ab.
Vorzugsweise handelt es sich bei dem Gefäß um einen Kolben, eine Walzenflasche, ein Rohr, einen Schleuderkolben, einen Bioreaktor mit Rührern oder ein beliebiges Gefäß, das einen Gasaustausch erfordert. Höchst vorzugsweise handelt es sich bei dem Gefäß um einen Kolben oder eine Walzenflasche.
Ferner ist mit der Kappe eine Einrichtung zum Sperren der gasdurchlässigen Membran ohne Stören der Abdichtung zwischen Verschluß und Gefäß verbunden. Der Stopfen ist entfernbar an dem Verschluß angebracht, um die Membran von der Atmosphäre zu trennen oder mit dieser in Kontakt treten zu lassen.
Höchst vorzugsweise besteht der Stopfen aus Kunststoff und weist eine Einrichtung auf, die dem Benutzer einen leichten Zugriff erlaubt.
Eine nahezu gasdichte Dichtung wird erreicht, wenn der Stopfen mit der Kappe verwendet wird. Der Stopfen kann vom oberen Ende der Kappe entfernt werden, um die Membran der Atmosphäre auszusetzen. Solange sich das Gefäß im Inkubator befindet, und der spezifische Kultivierungsvorgang erfordert, daß die gesamte Membran der Atmosphäre im Inkubator ausgesetzt ist, kann der Stopfen vom oberen Ende der Kappe entfernt werden, um die Membran der Atmosphäre auszusetzen. Der Stopfen kann zum Abdecken der Membran erneut aufgebracht werden, wenn das Gefäß aus der kontrollierten Atmosphäre des Inkubators entfernt wird, so daß das Gefäß für eine relativ lange Zeit außerhalb des Inkubators verbleiben kann. Durch Abdecken der Membran mit dem Stopfen wird somit ein wesentliches Entweichen von Gasen aus dem Gefäß verhindert und daher ergeben sich keine unerwünschten Veränderungen im pH-Wert der Kultur.
Das Abnehmen des Stopfens von der Kappe ermöglicht ein schnelles und gleichmäßiges Gleichgewicht zwischen der Atmosphäre im Gefäß und im Inkubator. Wenn der Stopfen jedoch abnehmbar an der Kappe angebracht ist, um die Membran zu sperren, ist das Gefäß ein geschlossenes System und das Eindringen mikrobieller Organismen in das Gefäß ist verhindert.
Der Stopfen kann bedruckt werden oder die Oberfläche des Stopfens kann derart beschaffen sein, daß zusätzliche Informationen handschriftlich auf dem Stopfen vermerkt werden können.
Der Stopfen beeinträchtigt nicht die Sterilität und begünstigt nicht eine Leckage in das Gefäß, wenn er abnehmbar an dem Verschluß angebracht ist. Ein weiterer Vorteil besteht darin, daß ein Gasaustausch ausschließlich durch die Membran erfolgt, ohne daß die Kappe des Gefäßes zerstört werden muß, wenn der Stopfen vom Verschluß entfernt wird.
Ein weiterer Vorteil der Verwendung des Stopfens ist, daß die Notwendigkeit einer Kappe ohne Membran entfällt.
Ein anderer Vorteil besteht darin, daß der Stopfen die Beständigkeit der Zellkulturbedingungen gewährleistet und ferner die Herstellung mehrerer Zellkulturen für eine Massenproduktion ermöglicht. Derartige Massenherstellungsanwendungen verwenden oftmals transformierte oder teilweise transformierte Zellen, die ein Übermaß an CO&sub2; und Milchsäure erzeugen, wenn sie in hoher Dichte gezüchtet werden, um erhebliche Mengen eines kommerziellen Bioprodukts zu erzeugen, beispielsweise Erythopoeitin (EPO) oder gewebeartige Plasminogenaktivatoren (t-PA). Bei derartigen Massenherstellungsanwendungen, bei denen mehrere Gefäße erforderlich sind, kann bei jedem Gefäß der Produktionslinie der Stopfen zur gleichen Zeit entfernt werden (wodurch die Notwendigkeit entfällt, die vorzusehende Belüftungsmenge zu bestimmen).
Weitere wichtige Vorteile sind, daß der Stopfen wiederverwendbar und wirtschaftlich herstellbar ist.

Beschreibung der Zeichnungen

Fig. 1 ist eine perspektivische Darstellung eines Kolbens mit einer Kappe und einem Stopfen.
Fig. 2 ist eine perspektivische Darstellung des Kolbens mit einer Kappe nach Fig. 1, wobei der Stopfen abnehmbar an der Oberseite der Kappe angebracht ist.
Fig. 3 ist ein Schnitt durch die Kappe und den Stopfen der Fig. 2 entlang der Linie 3-3.
Fig. 4 ist ein Schnitt durch die Kappe und den Stopfen der Fig. 2 entlang der Linie 4-4.
Fig. 5 zeigt eine Unteransicht der Kappe von Fig. 4 entlang der Linie 5-5.
Fig. 6 zeigt ein alternatives Ausführungsbeispiel der Erfindung zur Darstellung einer perspektivischen Ansicht einer Walzenflasche mit einer Kappe und einem Stopfen.
Fig. 7 zeigt eine perspektivische Ansicht der Walzenflasche mit einer Kappe nach Fig. 6 und einem abnehmbar an der Oberseite der Kappe angebrachten Stopfen.

Detaillierte Beschreibung

Zwar ist diese Erfindung durch Ausführungsbeispiele in zahlreichen unterschiedlichen Formen ausführbar, jedoch sind in den Zeichnungen und in der detaillierten Beschreibung die bevorzugten Ausführungsbeispiele dargestellt und beschrieben, wobei darauf hingewiesen sei, daß die vorliegende Offenbarung als beispielhaft für die Prinzipien der Erfindung und nicht als die Erfindung auf die dargestellten Ausführungsbeispiele einschränkend zu verstehen ist.
Die Fig. 1 und 2 zeigen ein Zellkulturgefäß 10, einen Kolben 12, eine Kappe 20 und einen Stopfen 22. Der Kolben besteht vorzugsweise aus stoßfestem Kunststoff oder Glas, der/das gasundurchlässig, optisch klar, nicht toxisch und gegenüber den zu kultivierenden Zellen inert ist.
Der Kolben 12 hat einen Körper 14, der eine Kammer 16 bildet, in der Material aufgenommen werden kann, bis es abgezogen oder ausgegeben wird. Es ist unerheblich, ob der Körper 14 aus einem faltbaren oder nicht faltbaren Material wie Metall, Kunststoff oder Glas besteht.
Wie in den Fig. 3 und 4 dargestellt weist der Kolben 12 einen Hals 18 auf, der zur Aufnahme eines Kappe 20 mit einem Gewinde versehen ist. Der Hals 18 ist einstückig mit dem Gefäß ausgebildet und bildet eine zylindrische Leitung, dessen eines Ende mit dem Gefäß einstückig ist, während das andere Ende eine Öffnung begrenzt, durch die die Zellen und Kulturfluids in den Körper des Kolbens eingeleitet werden können. Der Hals 18 und die Kappe 20 bilden eine aus einer Vielzahl bekannter Einrichtungen zum Einbringen von Materialien wie Säugetierzellen und Kulturfluids in den Körper 16. Wie allgemein bekannt wird die Kappe 20 von dem Hals 18 geschraubt, um eine Öffnung zu bilden, durch welche Zellen und Kulturfluids in den Kolben eingebracht werden können. Die Kappe wird anschließend wieder auf den Hals geschraubt, um den Kolben erneut zu versiegeln.
Wie in den Fig. 3, 4 und 5 dargestellt weist die Kappe 20 einen oberen Bereich 39, einen unteren Bereich 38 mit Anschlagleiste und eine ringförmige äußere Schürze 40 auf, die sich von der Oberseite zur unteren Anschlagleiste erstreckt. Die ringförmige äußere Schürze hat eine Außenwandfläche 42 und eine Innenwandfläche 44. Die Kappe 20 weist ferner einen inneren umgekehrten Schürzenbereich 46 auf, der sich vom oberen Bereich 39 zur Unterseite 48 erstreckt. Der umgekehrte ausgenommene Schürzenbereich bildet einen Kammerbereich 50 auf der Oberseite der Kappe. Die Innenwandfläche der ringförmigen äußeren Schürze und die innere umgekehrte Schürze sind voneinander beabstandet, um einen Ringraum 52 zu bilden. Die Kappe weist ferner eine Öffnung 54 im umgekehrten ausgenommenen Schürzenbereich auf der Oberseite auf. An der Öffnung ist eine gasdurchlässige Membran 56 vorgesehen.
Wie in den Fig. 3, 4 und 5 dargestellt hat der Stopfen 22 einen oberen Flansch 26 und eine untere Anschlagfläche 28, eine zylindrische Basis 24, die sich vom oberen Flansch zur unteren Anschlagfläche erstreckt. Die zylindrische Basis weist eine Außenwandfläche 30 und eine Innenwandfläche 32 auf. Der obere Flansch hat eine Oberseite 34 und eine Unterseite 35, die sämtlich einstückig ausgebildet sind. Unterhalb der Unterseite des oberen Flanschs und von der Unterseite 36 des oberen Flanschs 26 und der Außenwandfläche 30 der zylindrischen Basis 24 sind vier Ansätze 37 ausgebildet, die eine Presspassung von Stopfen und Kappe bewirken.
Der Stopfen kann aus gespritztem thermoplastischem Material bestehen. Repräsentative Materialien sind unter anderen Polyethylen, Polypropylen und Polyvinylchlorid.
Die gasdurchlässige Membran 56 kann aus jedem geeigneten gasdurchlässigen Material bestehen, solange es den freien Durchtritt von Gasen wie Sauerstoff und Kohlendioxid in den Körper 14 ermöglicht und den Durchtritt von Bakterien und Pilzen verhindert. Membranmaterialien schaffen adäquate Raten der Kohlendioxid- und Sauerstoffdurchlässigkeit, während sie das Durchlassen von Mikroorgansimen verhindern. Es sind mehrere gasdurchlässige Materialien mit geeigneter Porengröße, die zum freien Durchtritt von Sauerstoff und Kohlendioxid ausreichen und gleichzeitig das Durchlassen von Bakterien und Pilzen verhindern verfügbar, beispielsweise Polyethylen, Polycarbonatacryl- Copolymere und Polytetrafluorethylen.
Wie in Fig. 3 gezeigt nimmt bei entfernbar an der Kappe 20 angebrachtem Stopfen 22 der Kammerbereich 50 der Kappe die zylindrische Basis 24 des Stopfens auf. Der Stopfen wird in den Kammerbereich gedrückt und eine weitere Bewegung des Stopfens nach innen wird durch den Reibkontakt zwischen der Basis des Stopfens und den Seiten des Kammerbereichs begrenzt. Wenn es erwünscht ist, den Stopfen aus der Kappe zu entfernen, wird der Kolben in einer Hand gehalten, die Hängeöse wird mit zwei Fingern der anderen Hand ergriffen und der Kolben und der Stopfen werden relativ zueinander entgegengesetzt gedreht und ohne Schwierigkeiten axial aus dem Kammerbereich gezogen. Es ist ersichtlich, daß der Stopfen unzählige Male in die Kappe eingesetzt und entfernt werden kann, so daß der Stopfen für längere Zeit wiederverwendbar ist.
Im Gebrauch ist der Stopfen 22 an der Kappe 20 angebracht, wenn der Kolben sich außerhalb der kontrollierten Atmosphäre des Inkubators befindet. Wenn der Kolben 12 in der kontrollierten Atmosphäre des Inkubators angeordnet ist, wird der Stopfen entfernt, um einen Austausch zwischen den Gasen in der Inkubatoratmosphäre und dem Körper 14 für ein schnelles und gleichmäßiges Gleichgewicht zu ermöglichen.
Die Erfindung nach den Fig. 6 und 7 weist zahlreiche Elemente auf, die im wesentlichen identisch mit den Elementen der Fig. 1-4 sind. Daher sind ähnliche Elemente mit ähnlichen Funktionen mit zu den Fig. 1-5 identischen Bezugszeichen versehen, mit der Ausnahme, daß das Suffix "a" zur Kennzeichnung der ähnlichen Elemente in der Fig. 6 und 7 verwendet wird.
Die Walzenflasche 70, die Kappe 20a und der Stopfen 22a der Fig. 6 und 7 stellen ein alternatives Ausführungsbeispiel eines Kulturgefäßsystems dar, das in der kontrollierten Atmosphäre eines Inkubators für das Erreichen eines schnellen und gleichmäßigen Ausgleichs zwischen den Gasen im Inkubator und im Gefäß verwendbar ist.
Zwar kann das erfindungsgemäße Gefäß in Zellkultursystemen, bei denen eine Gasdurchlässigkeit des Gefäßes erwünscht ist, andere Verwendungsmöglichkeiten haben, jedoch ist die vorliegende Erfindung besonders zur Verwendung in Inkubatoren mit konstanter Kohlendioxidatmosphäre geeignet, in der es erwünscht ist, den Austausch von Gasen im Körper des Gefäßes zu ermöglichen.

Claims

1. Kulturgefäßanordnung zum Züchten von Zellkulturen in Inkubatoren, mit:

- einem Gefäß (10) mit einer Kammer (16) und einem mit der Kammer verbundenen Hals (18), der eine Öffnung zum Einführen von Zellen und Kulturfluiden in die Kammer aufweist;

- einer Kappe (20) mit einem oberen Bereich (39), einem unteren Bereich (38), einer äußeren Ringschürze (40), die sich vom oberen Bereich zum unteren Bereich erstreckt und eine Außen- (42) und eine Innenwandfläche (44) aufweist, einem inneren umgekehrten Schürzenteil (46), der von der Innenfläche (44) der äußeren Ringschürze (40) umgeben ist und sich von dem oberen Bereich (39) zum unteren Bereich (38) erstreckt, einem Ringraum (52) zwischen der Innenfläche der äußeren Ringschürze und dem umgekehrten Schürzenteil (46), einem Kompartmentteil (50) im oberen Bereich, das durch den umgekehrten Schürzenteil begrenzt ist, und einer Öffnung (54) in dem oberen Bereich, die durch den von dem Kompartmentteil (50) umgebenen umgekehrten Schürzenteil begrenzt ist, und einer gasdurchlässigen Membran (56), die an der Öffnung (54) zum Ermöglichen des Diffundierens von Gas in das und aus dem Gefäß angebracht ist, und

- einem lösbar an der Kappe (20) angebrachten Stopfen (22) zum Sperren der Gasdiffusion in das und aus dem Gefäß (10), dadurch gekennzeichnet, daß

- daß der Stopfen (22) einen oberen Flansch (26) aufweist, der einstückig an einer zylindrischen Basis (24) angeformt ist, mit Ansätzen (37), die sich unter dem oberen Flansch und von der Unterseite (36) des oberen Flanschs (26) und der Außenwandfläche (30) aus erstrecken, wobei die Ansätze (37) eine Presspassung zwischen dem Stopfen (22) und der Kappe (20) bewirken.

2. Anordnung nach Anspruch 1, bei der die Kappe (20) mittels eines passenden Gewindebereichs an der Kappe lösbar an einem Gewindebereich am Hals angebracht ist, um eine Schraubbefestigung der Kappe am Hals zu schaffen.

3. Anordnung nach Anspruch 1, bei der das Gefäß (10) eine Flasche oder eine Walzenflasche ist.

4. Anordnung nach einem der Ansprüche 1-3, bei der die zylindrische Basis (24) des Stopfens (22) lösbar an dem Kompartmentteil (50) der Kappe (20) angebracht ist, wodurch das Diffundieren von Gas in das und aus dem Gefäß verhindert ist.

5. Anordnung nach Anspruch 4, bei der der Stopfen (22) von dem Kompartmentteil (50) der Kappe (20) durch Drehen des Gefäßes (10) und des Stopfens (22) relativ zueinander in jeweils eine Richtung und durch axiales Ziehen des Stopfens aus dem Kompartmentteil (50) gelöst wird.

6. Anordnung nach Anspruch 1, bei der der Verschluß eine Kappe oder ein Stopfen ist.

7. Anordnung nach Anspruch 1, bei der die Einrichtung zum Ermöglichen des Diffundierens von Gas in das und aus dem Gefäß eine gasdurchlässige Membran ist.

8. Anordnung nach Anspruch 7, bei der die zylindrische Basis des Stopfens lösbar an dem Kompartmentteil der Kappe angebracht ist, wodurch das Diffundieren von Gas in das und aus dem Gefäß verhindert ist.

9. Anordnung nach Anspruch 8, bei der der Stopfen von dem Kompartmentteil der Kappe durch Drehen des Gefäßes und des Stopfens relativ zueinander in jeweils eine Richtung und durch axiales Ziehen des Stopfens aus dem Kompartmentteil gelöst wird.