DE69605556T2

DE69605556T2 - Ascorbyl-phosphorylcholesterol

Info

Publication number: DE69605556T2
Application number: DE69605556T
Authority: DE
Inventors: Ptchelintsev Dmitri
Original assignee: Avon Products Inc
Current assignee: Avon Products Inc
Priority date: 1996-05-14
Filing date: 1996-05-14
Publication date: 2000-06-15
Anticipated expiration: 2016-05-15
Also published as: JPH11511728A; BR9608158A; WO1997042960A1; EP0843554B1; JP3240580B2; DE69605556D1; ATE187333T1; AU6377096A; EP0843554A4; CA2195185A1; CA2195185C; EP0843554A1; ES2142073T3

Description

Gebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft topisch angewendete Formulierungen, umfassend ein neuartiges Derivat der L-Ascorbinsäure, das stabil, auf einfache Weise in kosmetisch akzeptable Bindemittel integrierbar und enzymatisch bioreversibel in seine Bestandteile ist. Beispielhafte Derivate umfassen 3'-(L-Ascorbyl-2-Phosphoryl)-Cholesterol und 3'-(L-Ascorbyl-3- Phosphoryl)-Cholesterol und Salze von diesen.

Fachlicher Hintergrund

Die Verwendung von L-Ascorbinsäure als Antioxidans in Nahrungsmittelzubereitungen ist bekannt. Beispielsweise beschreibt Steinhart, Pro- and Antioxidative Effect of Ascorbic Acid on L-Tryptophan in the System Fe³&spplus; /Ascorbic Acid/O&sub2;, J. Agric. Food Chem., Vol. 41, Seiten 2275-2277 (1993) die Verwendung von L-Ascorbinsäure als Antioxidans, das seine Funktion in Nahrungsmitteln durch Entfernung der freien Radikale und rascher Eigenoxidation ausübt.
Ähnlicherweise zeigt freie L-Ascorbinsäure in topisch angewendeten Präparaten schwache Stabilität und eine Tendenz zum Zerfallen infolge teilweise oxidativen und nicht-oxidativen Abbaus. Die abgebaute Ascorbinsäure verliert an Aktivität, und das Wirtsprodukt büßt an ästhetischer Qualität ein, indem es eine für kommerziell verwendete Kosmetik inakzeptable braune Farbe annimmt.
Obwohl Cholesterol, vor allem bei Aufnahme mit der Nahrung, als ungesund betrachtet wird, sind die Vorteile des nicht mit L-Ascorbinsäure verbundenen Cholesterols für die Hautschutzwiederherstellung bekannt. Beispielsweise beschreibt Menon, Structural Basis for the Barrier Abnormality Following Inhibition of HMG CoA Reductase in Murine Epidermis, J. Invest. Dermatol., Vol. 98, Seiten 209-219 (1992), Mängel, die im Hautschutzwiederherstellungsmechanismus festgestellt wurden, wenn die Cholesterolsynthese durch Abwärtsregulierung von HMG CoA-Reductase gehemmt ist.
Das mechanische Mischen von L-Ascorbinsäure und Cholesterol nach gegenwärtig verfügbaren Methoden ergibt ein Produkt, das ebenfalls wegen des unbewältigten Problems der L-Ascorbinsäure-Instabilität instabil ist. So beschreibt beispielsweise US-Patent Nr. 4,939,128 in Spalte 3, Zeilen 21-22, Ascorbinsäure in Verbindung mit einer Cholestanylgruppe. Die auffällige Abwesenheit von Cholesterol und die spezifische Erwähnung einer Cholestanylgruppe bedeutet eine Anerkennung noch vor der gegenwärtigen Offenlegung, dass konjugierte Verbindungen von L-Ascorbinsäure und Cholesterol weder praktikabel noch wünschenswert waren.
Es wurden auch Versuche unternommen, Ascorbinsäure mit einer glycyrrhetischen Gruppe zu konjugieren, wie beschrieben im Europäischen Patent Nr. 0503582; und mit einer Tocopherylgruppe, wie angezeigt in US- Patent Nr. 3,151,127. Die US-Patent Nr. 4,564 und 5,306,713 offenbaren ebenfalls Tocopherylascorbylphosphat als Antioxidans mit der folgenden Struktur.
Sakamoto, Measurment Method of Efficiency of Antidandruff Cosmetics and Development of the New Active Commercial Product, IFSCC, Yokohama, Vol. B206, Seiten 823-864 (1993), beschreibt die Verwendung von mit L- Ascorbinsäure gekoppeltem Tocopheryl. Das gekoppelte Tocopheryl ist ein antioxidierendes Konservierungsmittel für die Ascorbylgruppe, aber die Verwendung des Ascorbyl-Tocopheryl als Haut-Therapeutikum ist fragwürdig, weil Tocopheryl - zum Unterschied von Cholesterol - für die Haut kein natürliches Substrat ist.
Erforderlich ist ein Verfahren zur kovalenten und bioreversiblen Koppelung von Cholesterol an L-Ascorbinsäure. Das gekoppelte Molekül sollte stabil sein, damit die volle funktionale Aktivität auch nach einer Entkoppelung durch natürlich vorkommende Säure-Phosphatasen in der Haut erhalten bleibt. Die vorteilhaften Eigenschaften der L-Ascorbinsäure wären gewährleistet, einschließlich erhöhter Kollagenproduktion und Hautaufhellung, kombiniert mit den Vorteilen freigesetzten Cholesterols für höhere Elastizität, Widerstandsfähigkeit, Tonus und Feuchtigkeitserhaltung der Haut.

Ziele der Erfindung

Es ist ein Ziel der vorliegenden Erfindung, eine stabile Zusammensetzung mit mehreren Hautpflegevorteilen zu schaffen, umfassend ein Derivat der L-Ascorbinsäure, das stabil, leicht in kosmetischen Bindemitteln einbringbar und in freie Ascorbinsäure und einen sicheren Cholesterolbestandteil enzymatisch bioreversibel ist. Das oben erwähnte Derivat wird ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus 3'-(L-Ascorbyl-2- Phosphoryl)-Cholesterol, 3'-(L-Ascorbyl-3-Phosphoryl)-Cholesterol und Salzen von diesen.
Es ist ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung, stabile kosmetische Formulierungen mit einer verlängerten Haltbarkeit zu schaffen, welche die oben genannten Bestandteile enthalten.
Diese und andere Ziele werden aus der unten gegebenen Offenbarung ersichtlich.

Zusammenfassung der Erfindung

Die oben genannten Ziele werden erreicht durch die in den unabhängigen Patentansprüchen beschriebenen Methoden. Die beanspruchten Verbindungen stellen eine neuartige Auswahl unter einer Mehrzahl von Verbindungen dar, die in US-A-5 508 275 offenbart sind. Beispielhafte Verbindungen umfassen funktionale oder strukturale Homologe von 3'-(L-Ascorbyl-2-Phosphoryl)-Cholesterol (Formel I), wie beispielsweise 3'- (L-Ascorbyl-3-Phosphoryl)-Cholesterol (Formel II). Beide Formeln sind unten dargestellt. Formel I Formel II
Das konjugierte 3'-(L-Ascorbyl-2-Phosphoryl)-Cholesterol (Formel I) wurde bereitet durch Auflösen von Cholesterol bei -10ºC in trockenem Diethylether (getrocknet mit 4A Molekularsieben), in dem 1,0 Äquivalent Triethylamin als Basis enthalten war. Phosphor(V)-oxidchlorid (1,0 Äquivalent) wurde hinzugefügt, um Cholesterylphosphordichloridat zu schaffen.
Der Schmelzpunkt des Cholesterylphosphordichloridats wurde gemessen bei 121-122ºC, und eine Infrarotanalyse (KBr-Pressling) ergab eine Absorption P=O bei 1298 Wellenlänge und Absorption F'-O-C bei 1019 Wellenlänge ohne Hydroxylabsorption. Cholesterylphosphordichloridat wurde anschließend 3 Stunden lang bei Raumtemperatur mit 5,6-Isopropyliden-L- Ascorbinsäure in Tetrahydrofuran, enthaltend 1,0 Äquivalent Triethylamin, zur Reaktion gebracht. Diese Reaktion ergab eine Mischung aus Cholesteryl 5,6 Isopropy-liden-2-Phosphorchloridat L-Ascorbinsäure und deren Isomer Cholesteryl 5,6-Isopropyliden-3-Phosphorchloridat L-Ascorbinsäure.
Dann wurde die isomere Mischung in einer wässrigen THF-Lösung hydrolysiert und mehrere Stunden bei Raumtemperatur mit Amberlyst-15 aufgerührt, einem stark sauren Schwefelsäure-Ionenaustauschharz. Anschließend wurden THF und Wasser entfernt, und das Endprodukt, 3'-(L- Ascorbyl-2-Phosphoryl)-Cholesterol, wurde mit Ethylacetat extrahiert und mit einem KOH-Äquivalent neutralisiert. Die resultierende Lösung wurde lyophilisiert, um die Monokaliumsalzform zu erhalten.
Dieses neuartige Verfahren ermöglicht die kovalente und bioreversible Kopplung von Cholesterol mit L-Ascorbinsäure, resultierend in der Stabilisierung von Ascorbinsäure sowie erhöhter Bioverfügbarkeit für Ascorbinsäure und Cholesterol. In den Ascorbyl-Phosphoryl-Cholesterol- Verbindungen der vorliegenden Erfindung wird die konjugierte Ascorbinsäure resistent gegen das Zerfallen. Die Cholesterylgruppe dient als Trägeranteil und erleichtert die Bereitstellung polarer Ascorbinsäure durch die nichtpolare, äußerste Schutzschicht der Haut (d. h. das stratum corneum) und erhöht die Bioverfügbarkeit der Ascorbinsäure in der topischen Anwendung.
Natürliche Enzyme, wie in der Haut vorhandene Phosphatasen, spalten graduell die Phosphatbindung zwischen Cholesterol und Ascorbinsäure, woraus eine nachhaltige Freisetzung freier L-Ascorbinsäure und Cholesterols in das stratum corneum folgt. Das freigesetzte Cholesterol ist ein natürliches Substrat für die Haut und ergänzt das ansonsten vom Körper produzierte. Topisch angewendetes Cholesterol verbessert die Elastizität, den Tonus und den Widerstand gegen Austrocknen. Die topisch angewendeten Formulierungen der vorliegenden Erfindung umfassen entweder 3'-(L- Ascorbyl-2-Phosphoryl)-Cholesterol oder 3'-(L-Ascorbyl-3-Phosphoryl)- Cholesterol. Außerdem werden Ammonium-, Calcium-, Lithium-, Kalium- oder Natriumsalze dieser Verbindungen leicht in kosmetisch akzeptable Bindemittel integriert. Ein Salz mit einem organischen Amin, wie Ethanolamin, bietet ebenfalls die von dieser Erfindung beabsichtigten Vorteile.
Geeignete Bindemittel umfassen herkömmliche Lotions, Cremes oder Gele. Ein Lotions-Ausführungsbeispiel kann etwa 0,1 bis etwa 20% 3'-(L- Ascorbyl-2-Phosphoryl)-Cholesterol oder 3'-(L-Ascorbyl-3-Phosphoryl)- Cholesterol, etwa 0,5 bis etwa 6,0% Glycerin, etwa 2,0 bis etwa 8,0% Propylenglykol-Dicaprylat/Dicarpat, etwa 1,8 bis etwa 4,0% Peg 40 Stearat, etwa 1,0 bis etwa 2,5% Steareth-2, etwa 0,25 bis etwa 0,7% Xanthengummi, etwa 0,25 bis etwa 0,7% Hydroxyethylcellulose, etwa 0,15 bis etwa 0,2% Dinatrium-EDTE und etwa 0,20 bis etwa 0,25% Methyl-Paraben umfassen, wobei sämtliche Anteile als Gewichtsprozente zu verstehen sind.
Ein Creme-Ausführungsbeispiel kann etwa 0,1 bis etwa 20,0% 3'-(L- Ascorbyl-2-Phosphoryl)-Cholesterol oder 3'-(L-Ascorbyl-3-Phosphoryl)- Cholesterol, etwa 0,5 bis etwa 4,0% Glycerin, etwa 2,0 bis etwa 6,0% Propylenglycol-Dicaprylat/Dicaprat, etwa 1,8 bis etwa 3,0% Steareth-20, etwa 0,8 bis etwa 2,0% Steareth-2, etwa 0,25 bis etwa 0,6% Xanthengummi, etwa 0,25 bis etwa 0,6% Hydroxyethylcellulose, etwa 1,0 bis etwa 2,5% Cetylalkohol, etwa 0,9 bis etwa 3,5% Glycerol-Monostearat und etwa 0,15 bis etwa 0,2% Dinatrium-EDTE umfassen.
Ein Gel-Ausführungsbeispiel kann etwa 0,1 bis etwa 20,0% 3'-(L- Ascorbyl-2-Phosphoryl)-Cholesterol oder 3'-(L-Ascorbyl-3-Phosphoryl)- Cholesterol, etwa 0,15 bis etwa 0,2% Dinatrium-EDTE, etwa 2,0 bis etwa 6,0% Propylenglycol, etwa 0,4 bis etwa 1,5% Hydroxyethylcellulose und etwa 0,20 bis etwa 0,25% Methyl-Paraben umfassen.
Der pH-Wert dieser Formulierungen kann mit ausreichenden Mengen Ammoniumhydroxid, Calciumhydroxid, Lithiumhydroxid, Kaliumhydroxid, Natriumhydroxid, Ethanolamin, Diethanolamin oder Harnstoff auf physiologisch akzeptable Werte angepasst werden.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung

Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung werden im allgemeinen synthetisiert durch (i) Reaktion von Cholesterol mit einem halogenphosphorelatierenden Mittel, (ii) Kopplung des resultierenden Produkts mit 5,6-Hydroxyl-geschützter L-Ascorbinsäure, (iii) Hydrolysierung des Produkts mit Wassers, (iv) Ablösen der Schutzgruppe mit einem sauren Harz und (v) Reinigung des Produkts mit Lyophilisierung und Rekristallisierung. Das Derivat ist stabil in Lösung, zeigt antioxidantische Aktivität und stimuliert die Produktion von Kollagen in Fibroblasten.

BEISPIEL 1

Bereitung von Phosphodiestersäure und ihrem Monokaliumsalz

Cholesterylphosphodichloridat wurde nach folgendem Verfahren synthetisiert. Ein 250 ml zweihalsiger Rundkolben 19/22 ST wurde für die Reaktion ausgewählt. Er enthielt einen Serumaufsatz (mit Stickstoffeinlassnadel), einen Rührstab und einen 19/22 zu 24/40 ST Erweiterungsadapter mit einem 24/40 ST 125 ml Tropftrichter, der mit einem Seitenarm versehen war. Dieser Apparat wurde flammgetrocknet und unter Stickstoff gekühlt. Der Tropftrichter wurde mit 4,64 Gramm (12 mmol) Sigma 99+% Cholesterol, 75 ml Ether (getrocknet über aktivierten 4A- Molekularsieben) und 1,214 Gramm (12 mmol, 1,672 ml) trockenem (über KOH) Triethylamin befüllt.
Der Kolben wurde mit 28 ml trockenem Ether und 1,84 Gramm (12 mmol, 1,118 ml) Phosphor(V)-Oxidchlorid befüllt und in einem Eis/Methanolbad (-10ºC) gekühlt. Tropfenweise wurde 20 bis 30 Minuten lang mit hoher Geschwindigkeit Ether hinzugefügt, welches das Cholesterol- Triethylamin enthielt. Die Lösung wurde auf Raumtemperatur erwärmt und 2,5 Stunden lang aufgerührt.
Ausgefällte Feststoffe wurden durch einen Büchner-Trichter abgefiltert und bei gründlichem Aufrühren dreimal in Wasser gewaschen. Durch den Büchner-Trichter wurde Luft zugeführt, bis das gesamte Ether im Filtrat verdampft war. Der ausgefällte Feststoff wurde dann durch Filterung durch einen zweiten Büchner-Trichter entfernt, und Cholesterylphosphodichloridat wurde in einem Vakuum-Exsikkator über Phosphorpentoxid getrocknet. Dieses Experiment ergab 3,90 Gramm (65%) Feststoff erster Ernte, Schmelzpunkt 121-122ºC und 1,74 Gramm (29%) Material zweiter Ernte, Schmelzpunkt 117- 118ºC. Die IR-Analyse (KBr-Pressling) zeigte (C-H) eine Absorption bei 2947 Wellenlänge, (= C-H) Absorption bei 2878 Wellenlänge, (C=C) Absorption bei 1466 Wellenlänge, (P=O) Absorption bei 1298 Wellenlänge und (P-O-C) Absorption bei 1019 Wellenlänge.
Ascorbincholesterylphosphordiesterchloridat wurde nach dem unten beschriebenen Verfahren synthetisiert.
Ein 50 ml dreihalsiger Rundkolben 19/22 ST, versehen mit einem Rührstab, Serumaufsatz, Stickstoffeinlassnadel und 50 ml Tropftrichter wurde für dieses Experiment ausgewählt. Diese Vorrichtung wurde flammgetrocknet und unter Stickstoff gekühlt. Der Tropftrichter wurde mit 503 mg (1 mmol) Cholesterylphosphordichloridat (Schmelzpunkt 122ºC) und 15 ml trockenem THF befüllt; die Mischung wurde in einem Eis/Methanolbad gekühlt (-10ºC). Zu der gekühlten Mischung wurden 216 mg (1 mmol) Sigma 5,6- Isopropyliden-L-Ascorbinsäure, 15 ml trockenes THF und 0,14 ml (101 mg, 1 mmol) trockenes (KOH) Triethylamin hinzugefügt, Nach der Zugabe wurde die Mischung auf Raumtemperatur erwärmt und 3 Stunden lang aufgerührt.
Eine TLC-Analyse (25% Methanol/Toluen) zeigte den Abschluss der Reaktion an. Sie ergab zudem, dass das Produkt eine Mischung von 2-0 und 3-0-Regioisomeren war. Das ausgefällte Triethylaminhydrochlorid wurde mittels Filtration durch Faltenfilterpapier entfernt. Das THF wurde durch Rotationsverdampfung entfernt, um 0,66 Gramm (97%) rohes, kristallines Ascorbincholesterylphosphodiesterchloridat zu ergeben.
Ascorbincholesterylphosphodiestersäure wurde mittels folgendem Verfahren hergestellt. Das rohe Ascorbincholesterylphosphodiesterchloridat (6,76 Gramm, 9,9 mmol) in 60 ml THF wurde kombiniert mit 30 ml Wasser und 20 Gramm nassem Amberlyst-15, das dreimal in Wasser gespült worden war. Die resultierende Mischung wurde bei Raumtemperatur 55 Stunden lang heftig aufgerührt. Amberlyst-15 wurde durch Filtration durch Faltenfilterpapier entfernt und einmal mit 20 ml 1 : 1 THF/Wasser gespült. Der Großteil des THF wurde in einem Stickstoffstrom entfernt, um 53 ml einer dicken, wolkigen, wässrigen Suspension zu erhalten.
Dreiundfünfzig (53) ml THF wurden der Suspension hinzugefügt, um 106 ml 1 : 1 THF/Wasser-Lösung von Roh-Phosphodiestersäure zu ergeben, die nahezu klar war. Die Phosphodiestersäure wurde gereinigt durch Zugabe der 1 : 1 THF/Wasser-Lösung zu einer Säule von C-18 Umkehrphasen-Kieselgel (472 Gramm) und Elution mit 1 : 1 THF/Wasser. THF wurde in einem Stickstoffstrom entfernt, um 215 ml gereinigte Phosphodiestersäure in wässriger Suspension zu ergeben. Der projektierte Gesamtertrag waren 1,74 Gramm (28%), und der tatsächlich isolierte Ertrag betrug 1,84 Gramm (30%). Die Umkehrphasen-HPLC-Analyse (Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie) zeigte einen Reinheitsgrad von 90% an.
Ascorbincholesterylphosphodiester-Dihydrogenmonokaliumsalz wurde hergestellt durch zunächst Behandlung einer 1% wässrigen Lösung der zweibasigen Säure mit einem Äquivalent einer standardisierten Kaliumhydroxidlösung und anschließender Lyophilisierung. Die zweibasige Phosphodiestersäure (579 mg, 0,927 mmol) wurde in 57,9 ml Wasser gelöst und mit 9,44 ml von 0,0986 N Kaliumhydroxidlösung (0,931 mmol) behandelt. Die neutralisierte Lösung wurde dann lyophilisiert, um Wasser zu entfernen und 603 mg (98%) Monokaliumsalz als flaumig-weißen Feststoff zu ergeben.

BEISPIEL 2

Reinigung durch Umkehrphasen-C-18-Chromatographie

Umkehrphasen-C-18-Kieselgel wurde bereitet auf einer 1-kg-Skala nach Evans, Chromatographia, Vol. 13, Seiten 5-10 (1980). Die Reinigung der Phosphodiestersäure auf ein Niveau von 90% wurde erreicht bei einer Belastung von 90 : 1 unter Verwendung von 1 : 1 THF/Wasser, gefolgt von THF- Entfernung in einem Stickstoffstrom und Wasserentfernung durch Lyophilisierung. Die Untersuchung anderer Lösemittelsysteme durch Umkehrphasen-Dünnschicht-Chromatographie weist gutes Potential auf, (i) den Reinheitsgrad zu erhöhen, (ii) ein wirksames Trennungsmedium zu identifizieren, das durch Rotationsverdampfung entfernt werden könnte, und (iii) die Verwendung einer niedrigeren Belastung zu ermöglichen. Da das Umkehrphasen-C-18-Kieselgel wiederverwendbar ist, hat das Verfahren gutes Potential für eine Reinigung bis zu 1000 Gramm.
Geeignete Lösemittelsysteme umfassen THF/Methanol, THF/Ethanol, THF/Isopropanol, Dioxan/Methanol, Dioxan/Ethanol, Dioxan/Isopropanol, Ether/Methanol, Ether/Ethanol, Ether/Isopropanol, Ethylacetat/Methanol, Ethylacetat/Ethanol, Ethylacetat/Isopropanol, Methylenchlorid/Ethanol, Methylenchlorid/Methanol, Methylenchlorid/Isopropanol, DME/Methanol, DME/Ethanol und DME/Isopropanol.
Die Konjugation mit Cholesterol konvertiert die polare Ascorbinsäure in eine nichtpolare lipophile Ascorbylgruppe, die sich leicht durch das stratum corneum absorbieren lässt. Nach Durchdringung des stratum corneum ist die absorbierte Verbindung in der Lage, darunterliegende Fibroblasten zu beeinflussen. Die Vorteile von bioreversierter Ascorbinsäure und Cholesterol wurden weiter oben erklärt. Doch überraschenderweise stimuliert die konjugierte Verbindung selbst die Kollagensynthese, welche die Integrität, Elastizität und Flexibilität der Haut erhöht. Weitere Details werden in Beispiel 3 gegeben.

BEISPIEL 3

Fibroblaststudien

Dieses Beispiel ist die Zusammenfassung einer Studie, in der die Fähigkeit von 3'-(L-Ascorbyl-2-Phosphoryl)-Cholesterol zur Stimulierung der Kollagenproduktion in kultivierten menschlichen Haut-Fibroblasten nachgewiesen wurde. Ein in der Fachwelt anerkannter [³H]-Proline- Incorporation-Versuch wurde mit unterschiedlichen Dosierungen von 3'-(L- Ascorbyl-2-Phosphoryl)-Cholesterol durchgeführt. Juva, Anal. Biochem., VOI. 15, Seiten 77-83 (1966); Booth, Biochim. Biophys. Acta, Vol. 675, Seiten 117- 122 (1981).
Die Fibroblasten wurden über insgesamt 48 Stunden mit 0 ug/ml, 11,3 ug/ml, 22,5 ug/ml und 45 ug/ml 3'-(L-Ascorbyl-2-Phosphoryl)-Cholesterol inkubiert. Nach den ersten 24 Stunden wurde [³H]-markiertes Prolin zu der Kultur hinzugefügt. Anschließend an die zweite 24-Stunden-Periode wurden die Zellen geerntet und für den Kollagen-Biosyntheseversuch zubereitet.
Proteaseinhibitoren wurden hinzugefügt, um den Zerfall von Kollagen und anderer Proteine zu verhindern. Die Zellschicht wurde in eine Lösung mit 0,4 M NaCl und 0,01 M Tris (pH 7,5) geschabt. Die Extrakte wurden beschallt, um die Zellmembranen zu lösen. Getrennte Volumina der zellhaltigen Lösung (je 1 ml) wurden über Nacht gegen verschiedene Änderungen von deionisiertem Wasser dialysiert. Das Retentat wurde von der Dialyse entfernt und in 6 N Chlorwasserstoffsäure bei 120ºC über Nacht hydrolysiert. Der Versuch wurde unter Verwendung eines Oxidationsprozesses mit 2 M Chloramin-T ausgeführt. Proben wurden für Radioaktivzählungen analysiert, welche die Menge des neu synthetisierten [³H]-Hydroxyprolin repräsentieren - ein Index für neue Kollagensynthese:
Es wurde festgestellt, dass 3'-(L-Ascorbyl-2-Phosphoryl)-Cholesterol die Produktion von neuem Kollagen durch Fibroblasten der menschlichen Haut auf dosisabhängige Weise erhöhte, wie in der folgenden Grafik dargestellt. ³II-Prolin-Integration
Konzentration von 3-(I-Ascorbyl-2-Phosphoryl)-Cholesterol (ug/ml)

Claims

1. Topisch angewendete Formulierung, umfassend ein geeignetes topisch angewendetes Bindemittel und eine Verbindung, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus 3'-(L-Ascorbyl-2-Phosphoryl)-Cholesterol, 3'-(L- Ascorbyl-3-Phosphoryl)-Cholesterol und Salzen von diesen.

2. Topisch angewendete Formulierung gemäß Anspruch 1, wobei das Salz ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Salzen von Ammonium, Calcium, Lithium, Kalium, Natrium und einem organischen Amin.

3. Topisch angewendete Formulierung gemäß Anspruch 1, wobei das Bindemittel ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einer Lotion, einer Creme und einem Gel.

4. Topisch angewendete Formulierung, umfassend:

(a) etwa 0,1 bis etwa 20,0% einer Verbindung, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus 3'-(L-Ascorbyl-2-Phosphoryl)-Cholesterol und 3'-(L-Ascorbyl-3-Phosphoryl)-Cholesterol;

(b) etwa 0,5 bis etwa 6,0% Glycerin;

(c) etwa 2,0 bis etwa 8,0% Propylenglycol-Dicaprylat/Dicaprat;

(d) etwa 1,8 bis etwa 4,0% Peg 40 Stearat;

(e) etwa 1,0 bis etwa 2,5% Steareth-2;

(f) etwa 0,25 bis etwa 0,7% Xanthengummi;

(g) etwa 0,25 bis etwa 0,7% Hydroxyethylcellulose;

(h) etwa 0,15 bis etwa 0,2% Dinatrium-EDTE; und

(i) etwa 0,20 bis etwa 0,25% Methyl-Paraben.

5. Topisch angewendete Formulierung gemäß Anspruch 4, wobei der pH- Wert der Formulierung mit ausreichenden Mengen einer Verbindung, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Ammoniumhydroxid, Calciumhydroxid, Lithiumhydroxid, Kaliumhydroxid, Natriumhydroxid, Ethanolamin, Diethanolamin und Harnstoff, auf physiologisch akzeptable Werte eingestellt ist.

6. Topisch angewendete Formulierung, umfassend:

(b) etwa 0,5 bis etwa 4,0% Glycerin;

(c) etwa 2,0 bis etwa 6,0% Propylenglycol-Dicaprylat/Dicaprat;

(d) etwa 1,8 bis etwa 3,0% Steareth-20;

(e) etwa 0,8 bis etwa 2,0% Steareth-2;

(f) etwa 0,25 bis etwa 0,6% Xanthengummi;

(g) etwa 0,25 bis etwa 0,6% Hydroxyethylcellullose;

(h) etwa 1,0 bis etwa 2,5% Cetylalkohol;

(i) etwa 0,9 bis etwa 3,5% Glycerol-Monostearat; und

(j) etwa 0,15 bis etwa 0,2% Dinatrium-EDTE.

7. Topisch angewendete Formulierung gemäß Anspruch 6, wobei der pH- Wert der Formulierung mit ausreichenden Mengen einer Verbindung, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Ammoniumhydroxid, Calciumhydroxid, Lithiumhydroxid, Kaliumhydroxid, Natriumhydroxid, Ethanolamin, Diethanolamin und Harnstoff, auf physiologisch akzeptable Werte eingestellt ist.

8. Topisch angewendete Formulierung, umfassend:

(b) etwa 0,15 bis etwa 0,2% Dinatrium-EDTE;

(c) etwa 2,0 bis etwa 6,0% Propylenglycol;

(d) etwa 0,4 bis etwa 1, 5% Hydroxyethylcellulose; und

(e) etwa 0,20 bis etwa 0,25% Methyl-Paraben.

9. Topisch angewendete Formulierung gemäß Anspruch 8, wobei der pH- Wert der Formulierung mit ausreichenden Mengen einer Verbindung, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Ammoniumhydroxid, Calciumhydroxid, Lithiumhydroxid, Kaliumhydroxid, Natriumhydroxid und Ethanolamin auf physiologisch akzeptable Werte eingestellt wird.