DE69535376T2

DE69535376T2 - Expressionsvektor des alphavirus

Info

Publication number: DE69535376T2
Application number: DE69535376T
Authority: DE
Inventors: Mathilda SJÖBERG; Maarit Suomalainen; Henrik Garoff
Original assignee: Bioption AB
Current assignee: Bioption AB
Priority date: 1994-05-18
Filing date: 1995-05-17
Publication date: 2007-11-08
Anticipated expiration: 2015-05-18
Also published as: FI964577A0; JPH10500017A; SE9401709D0; US6692750B1; FI964577A; JP3786956B2; EP0760000A1; US6224879B1; AU2582695A; DE69535376D1; ATE352633T1; AU698976B2; WO1995031565A1; CA2188421A1; EP0760000B1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft im allgemeinen Polynucleotidmoleküle und deren Verwendung zur Herstellung von gewünschten Produkten nach deren Einführung in menschliche oder tierische Zellen.
Spezifischer gesagt, betrifft die vorliegende Erfindung Alphavirus-Expressionsvektoren umfassend zumindest einen Teil eines Alphavirus-Genoms und eine heterologe RNA, welche stromabwärts von einer Alphavirus-Basensequenz eingeführt ist, die eine translationsfördernde Aktivität besitzt. Solche Vektoren können verwendet werden, um nach Einbringen des Vektors in eukaryontische Zellen in der Zellkultur oder in einem lebenden Körper erhöhte Spiegel der Expression von DNA oder cDNA zu erzielen, die ein gewünschtes Produkt codiert und komplementär zu der heterologen RNA ist.
Die modernen Techniken der Molekularbiologie haben viele vollkommen unvorhergesehene Möglichkeiten für die pharmazeutische und biotechnologische Industrie eröffnet. Zum Beispiel ist es heute möglich jedes Gen (sobald es identifiziert ist) als DNA- (oder cDNA)-Molekül zu clonieren und es in prokaryontischen und/oder eukaryontischen Zellen zu exprimieren. Dies hat die Herstellung des entsprechenden Proteins in vitro zur therapeutischen Verwendung und/oder prophylaktischen Verwendung zum Beispiel als einen Impfstoff erleichtert. Kürzlich wurden die Möglichkeiten der Technologie der Genexpression auch auf die in vivo-Verwendung in ganzen Tieren und sogar in Menschen ausgeweitet. Beispielhaft für diese kürzliche Entwicklung ist die menschliche Gentherapie ⁽¹⁾ und genetische Immunisierung ⁽²⁾. Um ein fremdes Gen in Zellen in vivo oder in vitro zu exprimieren, wird das Gensegment oder die entsprechende cDNA, welche die codierenden Sequenzen umfassen, für gewöhnlich in einen sogenannten Expressionsvektor eingeführt. Dieser Vektor stellt alle Elemente bereit, die für die Transkription und Translation des Gens oder dessen cDNA innerhalb der Zelle notwendig sind. Heutzutage existieren sehr effiziente Expressionsvektoren für bakterielle und Hefezellen. Dies ist jedoch für tierische wie Säugerzellen nicht der Fall. Dies erzeugt ein großes Problem, wenn ein Protein mit Säuger-spezifischen Modifizierungen für einen therapeutischen Zweck oder zur Vorbeugung von Erkrankungen oder in Fällen, wo Expression in ganzen Organismen, zum Beispiel im lebenden Körper eines Tieres oder Menschen erforderlich ist, hergestellt und isoliert werden soll. Deshalb besteht, sehr allgemein gesagt, eine große Nachfrage für neue Expressionsvektoren zur Verwendung in tierischen, zum Beispiel Säugerzellen, wobei die Vektoren

(i) eine gesteigerte Effizienz der Proteinexpression,
(ii) eine verbreiterte Wirtszell-Spezifität und
(iii) eine gesteigerte Sicherheit besitzen.

Kürzlich wurde eine vollkommen neue Art von DNA-Expressionsvektoren zur Verwendung in tierischen, zum Beispiel Säugerzellen, entwickelt. Diese Vektoren basieren auf dem Alphavirus-Genom.
Alphavirus ist eine Gattung, die zur Familie der Togaviridae gehört und in ein Nucleocapsid eingeschlossene und von einer Hülle, die virale Spike-Proteine enthält, umgebene einzelsträngige RNA-Genome positiver Polarität besitzt.
Die Alphavirus-Gattung umfasst unter anderem das Sindbis-Virus, das Semliki-Forest-Virus (SFV), das Ross-River-Virus und das Venezuelan-, Western- und Eastern-Equine-Enzephalitis-Virus, welche alle nah verwandt sind. Insbesondere die Sindbis- und Semliki-Forest-Viren wurden umfassend untersucht und der Lebenszyklus, Modus der Replikation etc. dieser Viren sind wohl bekannt und müssen somit hier nicht spezifisch diskutiert werden.
Alphaviren replizieren in tierischen Zellen sehr effizient, was sie als Vektoren für die Herstellung von Protein und Nucleinsäuren in solchen Zellen wertvoll macht.
Auf dem Sindbis-Virus basierende Expressionssysteme sind in US-A-5 091 309 und US-A-5 217 879 offenbart. Die Sindbis-Virus-Vektoren von US-A-5 091 309 umfassen aus der Sindbis-Defective-Interfering(DI)-RNA gewonnene RNA, die eine dorthinein eingefügte heterologe RNA besitzt. In US-A-5 217 879 werden selbstreplizierende und selbstverpackende rekombinante Sindbis-Virus-RNA-Moleküle offenbart, umfassend eine heterologe codierende Sequenz und wenigstens eine Sindbis-Virus-Verknüpfungsregion, die fähig ist, die Synthese der subgenomischen Messenger-RNA des Sindbis-Virus in einer Wirtszelle zu steuern. RNA-Transkripte werden in vitro durch Transkription von Sindbis-Virus-cDNA synthetisiert, welche in ein Plasmid unter der Kontrolle eines Promotors wie SP6 eingefügt worden ist.
Xiong et al., Science, Bd. 243 (1989): 1188–1191 ⁽³⁾, offenbaren ebenfalls ein auf dem Sindbis-Virus basierendes System der Genexpression. Von diesem System wird behauptet, dass es in einer großen Bandbreite von tierischen Zellen effizient ist. Expression des bakteriellen CAT(Chloramphenicolacetyltransferase)-Gens in Insekten-, Vogel- und Säugerzellen einschließlich menschlicher Zellen wird dort offenbart.
In Bio/Technology, Band 9 (1991): Seiten 1356–1361 ⁽⁴⁾, offenbaren Liljeström und Garoft Expressionsvektoren für tierische Zellen basierend auf dem SFV-Replikon. Wenn fremde DNA-Codierungssequenzen in diese Vektoren eingeführt werden, werden große Mengen fremden Proteins erhalten.
Gemäß WO 92/10578 wird ein RNA-Molekül bereitgestellt, welches aus einem Alphavirus-RNA-Genom abgeleitet ist und zur effizienten Infektion von tierischen Zellen fähig ist, wobei das RNA-Molekül die kompletten Alphavirus-RNA-Genomregionen umfasst, welche für die Replikation der Alphavirus-RNA essenziell sind und ferner eine exogene RNA-Sequenz umfasst, welche fähig ist, ihre Funktionen in der Wirtszelle zu exprimieren, wobei die exogene RNA-Sequenz in eine Region des RNA-Moleküls eingeführt ist, welche für dessen Replikation nicht essenziell ist. Gemäß WO 92/10578 können solche RNA-Moleküle durch jegliche Mittel der Transfektion oder durch Verpacken der RNA-Moleküle in infektiöse Alphavirus-Partikel zur späteren Infektion von tierischen Zellen in tierische Zellen übertragen werden. In beiden Fällen wird das transfizierte oder infizierte RNA-Molekül fähig sein, in der tierischen Zielzelle zu replizieren und die in das RNA-Molekül eingeführten exogenen RNA-Sequenzen zu exprimieren. Solche Moleküle und Strategien zu ihrer Expression in der Zelle können als Impfstoff oder als Strategien zur Impfung verwendet werden, um einer) Infektion oder Krebs vorzubeugen oder zu behandeln. In dieser Quelle wurde SFV verwendet, um Alphaviren zu veranschaulichen.
Von den vorstehend erwähnten, auf dem Alphavirus-Genom basierenden Expressionsvektoren wurde gezeigt, dass sie eine größere Effizienz der Proteinexpression fördern als frühere Protein-Expressionssysteme in Säugern. Von ihnen wurde auch gezeigt, dass sie in fast allen höheren eukaryontischen Zellarten funktionieren. Weiterhin wurden sie mit hochstringenten Sicherheitsmerkmalen ergänzt, um eine Ausbreitung des Virus zu verhindern ⁽⁵⁾. Wichtige Proteine zur Verwendung bei der Vorbeugung von Krankheiten wie das HIV-Spike-Protein wurden mit diesem System hergestellt und von solchen Proteinen wurde gezeigt, dass sie eine eher nativere Struktur besitzen, als wenn sie in anderen Systemen hergestellt worden sind ⁽⁶⁾. Alphavirus-Vektoren wurden auch erfolgreich zur genetischen Immunisierung verwendet ⁽⁷⁾.
Die vorliegende Erfindung ist auf eine wesentliche und nicht vorhergesehene Verbesserung der Alphavirus-Expressionsvektoren gerichtet.
Spezifischer gesagt wurde gemäß der vorliegenden Erfindung herausgefunden, dass es Nucleotidbasensequenzen innerhalb des Alphavirus-Genoms gibt, welche eine translationsfördernde Aktivität besitzen. Im Vergleich zu den Expressionsniveaus von vorher bekannten Alphavirus-Vektoren wird das Niveau der Expression einer gewünschten Substanz, welche gemäß der vorliegenden Erfindung erhalten werden kann, etwa zehnfach erhöht.
Somit betrifft die vorliegende Erfindung allgemein die Expression einer heterologen DNA in eukaryontischen Zellen, Alphavirus-Vektoren umfassend wenigstens einen Teil des Alphavirus-Genoms, welcher verwendet wird, um Expression zu erzielen, die Vektoren ferner umfassend zu der heterologen DNA komplementäre RNA, welche im wesentlichen unmittelbar stromabwärts einer Nucleotidbasensequenz eingeführt ist, welche translationsfördernde Aktivität besitzt, wobei die translationsfördernde Basensequenz ein komplettes Alphavirus-Capsidgen oder einen 5'-Bereich davon umfasst, welcher eine Translationsaktivität bereitstellt, die 10-fach höher ist als die Translationsaktivität in Abwesenheit dieser translationsfördernden Basensequenz.
Gemäß der vorliegenden Erfindung umfassen solche Basensequenzen, welche translationsfördernde Aktivität besitzen (auch bezeichnet als translationale Enhancer) einen 5'-Bereich eines Alphavirus-Capsidgens oder das komplette Capsidgen. Geeigneterweise ist dieser translationale Enhancer für den Alphavirus-Vektor endogen. Es können jedoch zumindest gelegentlich auch exogene translationale Enhancer mit dem Ursprung in einer anderen Alphavirus-Spezies verwendet werden.
Somit betrifft die vorliegende Erfindung auch ein selbstreplizierendes und transkriptionsfähiges rekombinantes Alphavirus-RNA-Molekül umfassend (i) zumindest einen Teil eines Alphavirus-RNA-Genoms und (ii) heterologe RNA, die einen Stoff mit biologische Aktivität codiert, wobei die RNA sich stromabwärts befindet von einer Alphavirus-Basensequenz mit translationsfördernder Aktivität, wobei die translationsfördernde Basensequenz ein vollständiges Alphavirus-Capsidgen oder einen 5'-Bereich davon umfasst, welcher eine Translationsaktivität bereitstellt, die 10-fach höher ist als die Translationsaktivität in Abwesenheit dieser translationsfördernden Basensequenz.
Eine geeignete erfindungsgemäße Ausführungsform betrifft Expressionsvektoren, welche auf dem Genom des Semliki-Forest-Virus (SFV) basieren. Das vollständige SFV-Capsidgen codiert 267 Aminosäurereste und umfasst somit 801 Basen.
Für SFV wurde herausgefunden, dass eine translationsfördernde Aktivität in den ersten 102 Basen dieses Capsidgens liegt, wobei diese Aktivität eine Proteinproduktion auf einem Niveau von etwa 85 % des Wildtyp-Capsid-Proteins hervorruft. Dies ist eine etwa 10-fache Steigerung im Vergleich zu den vorher bekannten SFV-Vektoren.
Eine Sequenz des Gens, welche die ersten 81 Basen umfasst, ruft ebenfalls ein erhöhtes Niveau der Expression hervor, jedoch in einem geringeren Ausmaß.
Somit umfasst der vorliegende translationale SFV-Enhancer wenigstens die ersten 81 Basen und bevorzugt wenigstens die ersten 102 Basen des Capsidgens und höchstens 801 Basen, das heißt eine Basensequenz, die dem kompletten Capsidgen entspricht.
Die Sequenz des 5'-Abschnitts des SFV-Capsidgens umfassend die ersten 102 Basen, gelesen vom 5'- zum 3'-Ende ist
Modifikationen dieser Basensequenz (zum Beispiel Basendeletionen, -substitutionen und/oder -hinzufügungen), welche eine im wesentlichen erhaltene fördernde Aktivität haben, sind ebenfalls in der vorliegenden Erfindung eingeschlossen.
In den folgenden erläuternden Beispielen wurde das Vorliegen eines translationalen Enhancers für SFV gezeigt. Angesichts der Homologie zwischen verschiedenen Alphavirus-Spezies kann erwartet werden, dass ein ähnlicher Mechanismus der Translationsförderung in allen Alphaviren existiert. Da die Sequenz zwischen verschiedenen Alphaviren im 5'-Ende der C-Gen-Region jedoch beachtlich variiert, ist es am wahrscheinlichsten, dass einige Ähnlichkeiten in den Eigenschaften der Sekundär- und der Tertiärstruktur des RNA-Moleküls für die translationsfördernde Wirkung verantwortlich sind. Dies bedeutet, dass die genauen Sequenzen und wahrscheinlich auch die Länge der translationsfördernden Regionen zwischen verschiedenen Alphaviren variieren werden.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein DNA-Molekül, umfassend zu dem vorliegenden rekombinanten Alphavirus-RNA-Molekül komplementäre DNA-Sequenzen, wobei das DNA-Molekül auch DNA-Sequenzen, welche einen Promotor wie SP6 codieren, um das rekombinante RNA-Molekül in Zellen zu transkribieren, und zusätzliche DNA-Sequenzen, welche Merkmale codieren, die für ein Plasmidwachstum in E. coli erforderlich sind, umfassen kann.
Die vorliegenden Alphavirus-Vektoren, welche eine verbesserte Translationskapazität besitzen, können für die gleichen Zwecke verwendet werden wie die vorher bekannten Alphavirus-Vektoren. Somit sind sie wahrscheinlich sehr nützlich zur Herstellung von Substanzen, welche biologische Aktivität haben wie Proteine oder Polypeptide, in eukaryontischen Zellen insbesondere solchen aus Säugern, wobei die Substanzen für biotechnologische oder medizinische Zwecke verwendet werden können. Zum Beispiel kann die heterologe RNA günstigerweise ein Protein, Polypeptid oder Peptid codieren, welches eine therapeutische Aktivität oder eine prophylaktische, wie immunogene oder antigene, Aktivität besitzt. Eukaryontische Zellen, in denen eine Expression erzielt wird, können als Zellkulturen verfügbar sein oder einen Teil eines lebenden Organismus wie eines Tieres oder eines Menschen bilden. Die vorliegende Erfindung betrifft auch Zellen, welche mit dem vorliegenden rekombinanten RNA- oder DNA-Molekül transformiert sind, und Zelllinien, welche mit dem RNA- oder DNA-Molekül stabil transformiert sind.
Wie vorstehend ausgeführt, basieren die Alphavirus-Expressionsvektoren auf dem Alphavirus-Genom. Dieses besteht aus einem einzelsträngigen RNA-Molekül von positiver Polarität. In der infizierten Zelle dienen die 5' gelegenen 2/3 dieser RNA als eine mRNA für das virale, nicht strukturelle Polyprotein, welches co- und posttranslational in vier reife Proteine gespalten wird ^{(8, 9)}. Diese Proteine bilden den viralen Polymerase-Komplex, welcher die genomische RNA über ein Zwischenprodukt negativer Polarität repliziert ⁽¹⁰⁾. Dieses Zwischenprodukt dient auch als Matrize für die Synthese eines subgenomischen RNA-Moleküls, welches colinear mit dem 3' gelegenen 1/3 des viralen Genoms ist. Dieses subgenomische Transkript (auch bezeichnet als 26S mRNA) wird in das virale strukturelle Polyprotein translatiert. Die Prozessierung dieses Polyproteins wird durch das amino-terminale Capsid-(C-) Protein eingeleitet, welches sich autokatalytisch von der wachsenden Polyproteinkette abspaltet ^{(11,
12, 13, 14)}. Der verbleibende Anteil des strukturellen Polyproteins wird cotranslational in die Membran des endoplasmatischen Retikulums eingeführt und die Spike-Proteine p62 und E1 werden durch durch Signalpeptidase vermittelte Spaltungsereignisse freigesetzt ^{(15,
16, 17)}.
Die Alphavirus-Expressionsvektoren werden geeigneterweise aus einer modifizierten cDNA-Kopie des viralen Genoms aufgebaut, von welcher wenigstens ein Teil der das strukturelle Polyprotein codierenden Region entfernt und durch eine Clonierungsstelle ersetzt worden ist ^{(3, 4)}. Heterologe cDNA kann in diese Stelle eingeführt werden und das entsprechende rekombinante Alphavirus-Genom kann durch in vitro-Transkription hergestellt werden. Wenn es in Wirtszellen transfiziert wird, wird das rekombinante Genom in der Art des Wildtyps repliziert, da es sowohl die nicht-strukturelle codierende Region des Alphavirus und die 5'- und 3'-Replikationssignale enthält. Anstatt der strukturellen Proteine des Virus steuert die subgenomische RNA jedoch jetzt die Synthese der heterologen Proteine. Das Semliki-Forest-Virus-(SFV-) Expressionssystem ⁽⁴⁾ wurde auch um ein in vivo-Verpackungssystem ergänzt, wodurch rekombinante Genome nach Co-Transfektion mit einem Verpackungs-mangelnden Helfer-Genom, welches die viralen strukturellen Proteine bereitstellt ^{(4, 5)}, in infektiöse SFV-ähnliche Partikel verpackt werden können. Diese rekombinanten Partikel können verwendet werden, um Zellen entweder in vivo oder in vitro zu infizieren. Die Bandbreite der Wirtszellen der rekombinanten Partikel wird durch den Alphavirus-Spike bestimmt und ist deswegen sehr breit. Die infizierten Zellen werden rekombinante Genome und auch große Mengen des heterologen Proteins herstellen. Da jedoch durch die rekombinanten Genome keine strukturellen Proteine des Virus codiert werden, werden keine neuen Viruspartikel hergestellt werden und es gibt daher keine Ausbreitung des Virus.
Entsprechend ist eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung auf ein Verfahren zur Herstellung eines rekombinanten Alpha-Virus gerichtet, umfassend ein rekombinantes Alphavirus-RNA-Genom, welches von einer Wildtyp-Alphavirus-Hülle umgeben ist, wobei das RNA-Genom das vorliegende rekombinante RNA-Molekül umfasst, durch Co-Transformation, wie Co-Transfektion, von Zellen mit dem rekombinanten RNA-Genom und einer Helfer-RNA, welche die Expressionskapazität für strukturelle Proteine des Alphavirus enthält, und umfassend Codierungssequenzen für die strukturellen Proteine des Alphavirus, cis-wirkende Replikationssignale aber keine Enkapsidierungssignale und Inkubation der Zellen und Sammeln von infektiöse rekombinante Alphavirus-Partikel enthaltendem Medium.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch diese co-transformierten Zellen, welche die infektiösen Partikel herstellen, und die infektiösen Partikel an sich.
Wie vorstehend angedeutet, kann eine weite Bandbreite von Wirtszellen tierischer (einschließlich menschlicher) Herkunft gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Solche Wirtszellen können aus Vogel-, Säuger-, Amphibien-, Insekten- und Fischzellen ausgewählt werden. Beispielhaft für Säugerzellen sind menschliche, Affen-, Hamster-, Maus- und Schweinezellen. Geeignete Vogelzellen sind Hühnerzellen.
Weiterhin kann die vorliegende Erfindung sowohl in vitro als auch in vivo verwendet werden. Per Definition bedeutet in vitro ein Verfahren, welches außerhalb eines lebenden Organismus durchgeführt wird, im Gegensatz zu in vivo, was bedeutet, dass ein Verfahren innerhalb eines lebenden Organismus durchgeführt wird. Gemäß der vorliegenden Erfindung ist es beabsichtigt, dass "Transformation" im allgemeinen die Einführung von exogenen Polynucleotidsequenzen in das Innere einer Zelle, eukaryontisch oder prokaryontisch, bedeutet und die exogene Polynucleotidsequenz kann im Zytoplasma der Zelle, extrachromosomal (episomal) im Zellkern verbleiben oder sie kann stabil in das Genom der Zelle integriert werden.
Die Art der Transformation ist nicht entscheidend, es kann aber jedes Mittel, welches zurzeit bekannt ist oder welches in der Zukunft entwickelt werden könnte, entsprechend der Erfindung verwendet werden.
Eine weitere erfindungsgemäße Ausführungsform betrifft ein Verfahren zur Expression einer heterologen RNA-Sequenz, die einen biologisch aktiven Stoff codiert, umfassend die Infektion von Zellen in der Zellkultur oder in einem Tier oder einem menschlichen Individuum mit dem vorliegenden infektiösen rekombinanten Alphavirus-Partikeln.
Geeigneterweise wird eine solche Expression, wenn sie in einem Tier erzielt wird, keine für das Tier günstige Wirkung bewirken, aber das in dem Tier erzeugte Expressionsprodukt kann aus dem Tier gewonnen werden, zum Beispiel in einer Körperflüssigkeit wie Blut, Milch oder Aszites.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Arzneimittel, umfassend die vorliegende rekombinante RNA in einer physiologisch verabreichbaren Form. Solche Arzneimittel können die vorliegenden co-transformierten Zellen, welche infektiöse rekombinante Alphavirus-Partikel erzeugen, oder solche infektiöse Partikel selbst umfassen.
In dem folgenden experimentellen Teil wurde das Semliki-Forest-Virus (SFV) verwendet, um die vorliegende Erfindung zu veranschaulichen. Das vorher beschriebene SFV-Expressionssystem stellt drei verschiedene Plasmid-Vektoren (pSFV1–3) mit einer Clonierungsstelle für heterologe DNA in oder unmittelbar nach der 5' nicht-translatierten Leadersequenz der subgenomischen 26S-RNA bereit ⁽⁴⁾. In Beispiel 2 werden die Expressionsniveaus von einigen verschiedenen heterologen Proteinen bei Verwendung der früheren SFV-Vektoren und bei Verwendung eines neuen SFV-Vektors, in welchem der vollständige 26S-RNA-Leader zusammen mit dem vollständigen C-Protein-Gen dem heterologen Protein-Gen vorausgeht (= der SFVC-Vektor), verglichen. Es ist offensichtlich, dass heterologe Produkte von SFVC-Vektoren auf einem wesentlich höheren Niveau hergestellt werden, als von den früheren Vektoren und dass alle C-Fusionsproteine über die Autoprotease-Aktivität des C-Proteins in getrennte authentische Produkte gespalten wurden (2). Die Quantifizierung zeigt, dass ein etwa 10-facher Unterschied im Expressionsniveau vorliegt.
In Beispiel 3 haben wir E. coli-LacZ-(β-Galactosidase)-Genfusionen verwendet, um zu untersuchen, wo in dem C-Gen die verstärkende Wirkung liegt. Spezifisch wurden verschiedene Abschnitte des 5'-Teils des C-Gens an das zweite Codon des LacZ-Gens fusioniert. Die Expression dieser rekombinanten Konstrukte zeigt, dass sich der verstärkende Effekt innerhalb der ersten 102 Basen des C-Gens befindet.
In Beispiel 4 haben wir untersucht, ob sich die Wirkung auf der Ebene der RNA-Replikation oder Transkription auswirkt. Die Herstellung von genomischer RNA und subgenomischer RNA wurde in in Beispiel 3 beschriebenen hoch und niedrig produzierenden Varianten der LacZ-Rekombinanten verglichen. Es wurden keine Unterschiede in den RNA-Spiegeln gefunden und damit muss sich die verstärkende Wirkung des C-Gensegments auf der translationalen Ebene befinden. Dieser Abschnitt enthält am wahrscheinlichsten eine spezifische RNA-Struktur, die die translationale Initiation verstärkt.
Beschreibung der Zeichnungen
1
A. Überblick über rekombinante subgenomische RNA-Moleküle.
Gezeigt werden schematische Zeichnungen der subgenomischen RNA-Moleküle, welche in Zellen erzeugt werden, die mit in vitro-Transkripten der angezeigten Plasmide transfiziert worden sind. Man beachte, dass nur ein Teil der nicht-translatierten 5'-Leadersequenz in den pSFV1-Konstrukten vorhanden ist, wohingegen die gesamte Leadersequenz in den pSFV3-Konstrukten vorhanden ist ⁽⁴⁾.
B. Zahl der C-Protein-Aminosäure-Codons in Plasmiden der pSFVC'-Serie.
2
Die Anwesenheit des C-Gens verstärkt die Proteinerzeugung.
BHK-21, Zellen wurden mit RNA-Transkripten der folgenden Plasmide transfiziert; pSFV1-p62, pSFVC-p62, pSFV1-TR, pSFVC-TR, pSFV1-Pr65^gag, pSFVC-Pr65^gag, pSFV3-LacZ, pSFVC-LacZ, pSFVmSQL und pSFVC-Pr65^gag (jeweils Spuren 1–10). 8 Stunden nach der Transfektion wurden Zellen mit ³⁵S-Methionin 30 Minuten (Spuren 1–6) oder 15 Minuten (Spuren 7–10) puls-markiert und 15 Minuten verfolgt (Chase) (Spuren 1–10). Zellen wurden mit NP-40 (Spuren 1–6) oder mit SDS (Spuren 7–10) lysiert und Proben entsprechend 1,6 × 10⁵ Zellen wurden entweder mit Antikörpern gegen SFV E2 (Spuren 1–2), den Transferrinrezeptor (Spuren 3–4) oder gegen das Moloney-Murine-Leukemia-Virus (Spuren 5–6) inkubiert oder direkt mit dem Probenpuffer gemischt (Spuren 7–10) und durch SDS-PAGE unter reduzierenden Bedingungen gefolgt von einer Fluorographie untersucht.
3
Ein 102-fasen-Abschnitt aus dem C-Gen ist verantwortlich für die Verstärkung der Proteinexpression.
BHK-21-Zellen wurden mit RNA-Transkripten von pSFV3-LacZ, sechs Mitgliedern der SFVC'-LacZ-Serie und pSFVC-LacZ wie angegeben transfiziert. 8 Stunden nach der Transfektion wurden Zellen mit ³⁵S-Methionin 15 Minuten pulsmarkiert, 15 Minuten verfolgt und dann mit SDS lysiert. Proben der Zelllysate (entsprechend 1,2 × 10⁴) wurden mit dem Probenpuffer gemischt und durch SDS-PAGE unter reduzierenden Bedingungen untersucht. Die Menge von β-Galactosidase oder β-Galactosidase-Fusionsproteinen wurde wie in Beispiel 2 beschrieben quantifiziert und auf Unterschiede im Methionin-Gehalt hin korrigiert. Es wird die relative Rate der Proteinsynthese (ausgedrückt als Prozentsatz der SFVmSQL C-Proteinsynthese) gegen die Länge des variablen C'-Teils des C'-β-Galactosidase-Fusionsproteins gezeigt.
4
Die Verstärkung der Expression durch das 102 Basen lange C-Gen-Segment wird nicht durch gesteigerte Replikation oder Transkription vermittelt.
Zellen wurden mit RNA-Transkripten von pSFVmSQL (Spur 1), pSFVC'b7-LacZ (Spur 2), pSFV3-LacZ (Spur 3), pSFV1-Pr55^gag (Spur 5) oder mit Puffer alleine (Spur 4) transfiziert. Actinomycin D (1,0 μg/ml) wurde 2 Stunden nach der Transfektion hinzugefügt. 4 Stunden nach der Transfektion wurde ¹⁴C-Uridin hinzugefügt und die Zellen über 4 Stunden markiert. Die Gesamt-RNA wurde extrahiert und Proben entsprechend 1,4 × 10⁵ Zellen wurden auf einem Agarosegel unter denaturierenden Bedingungen untersucht. Es wird ein Autoradiogramm des getrockneten Gels gezeigt.
Beispiele
Beispiel 1
Darin beschreiben wir die Konstruktion von SFV-Vektoren mit heterologen Genen, welche entweder an den 26S-mRNA-Leader, an das 3'-Ende des vollständigen C-Gens oder an 5'-Abschnitte des C-Gens fusioniert sind. Alle Konstruktionen wurden unter Verwendung des vollständigen SFV-cDNA-Moleküls im Plasmid pSP 6-SFV 4 ⁽⁴⁾, welches bei der European Collection of Animal Cell Culture, Proton Down, Salisbury, Wiltshire, U.K.; Zugangsnummer 91112826 hinterlegt worden ist, durchgeführt. In 1 zeigen wir schematisch die codierenden Regionen der verschiedenen mRNA-Moleküle, welche von den verschiedenen Vektor-Konstrukten erzeugt werden. Die Vektor-Konstrukte sind:

(i) pSf-VC-p62, welches das Gen für die SFV-p62-Spike-Untereinheit als eine Wildtyp-Fusion mit dem C-Gen enthält. Dies wurde durch Ligierung des großen Spe I/Nsi I-Fragments (12 kBp) aus pSP6-SFV4 an das kleine Nsi I/Spe I-Fragment (2,6 kBp) eines pSP6-SFV4 konstruiert, worin zwei Stopp-Codons an Position 9866–9871 in pSP6-SFV4, in der Region, die den N-terminalen Teil von E1 codiert, durch zielgerichtete Mutagenese eingeführt wurden.
(ii) pSf-V1-p62, welches das Gen für die SFV-p62-Spike-Untereinheit fusioniert an die 5'-SFV-subgenomische-Region an Position 31 in der 26S-mRNA-Leadersequenz (SFV-1 Vektorvariante) enthält ⁽⁴⁾. Dies wurde durch Ligierung des großen Spe I/Nsi I-Fragments (11 kBp) aus pSP6-SFV4/ΔC an das kleine Nsi I/Spe I-Fragment (2,6 kBp) in (i) konstruiert. Das pSP6-SFV4/ΔC wurde aus pSP6-SFV4 durch eine Deletion des C-Gens konstruiert ⁽⁸⁾.
(iii) pSFV1-TR, welches das menschliche Transferrinrezeptor-Gen in einer Fusion mit der 5'-SVF-Subgenom-Region an Position 31 in der 26S-RNA-Leadersequenz enthält.
(iv) pSFVC-TR, welches das menschliche Transferrinrezeptor-Gen in einer Fusion mit dem 5'-SFV-Subgenom umfassend die vollständige 26S-RNA-Leadersequenz zusammen mit dem gesamten C-Gen enthält. Die genaue Fusion der C- und TR-Gene wurde durch PCR durchgeführt ^(19,
20). Die endständigen Primer, welche für die Amplifikation der fusionierten DNA verwendet wurden, waren: 5'CAACGGAAAAACGCAGCAGC 3' (der 5'-Ende-Primer) und 5'CTTTGCTGAGTTTAAATTCACG 3' (der 3'-Ende-Primer). Die verwendeten Fusionsprimer waren: 5'GATCTAGCTTGATCCATCATCCACTCTTCGGACCCCTCGGG 3' (C-Gen-Fragment-Primer) und 5'CCCGAGGGGTCCGAAGAGTGGATGATGGATCAAGCTAGATCAGC 3' (TR-Gen-Fragment-Primer). pSFVC-TR wurde durch Ligierung des 896-Bp Csp45I-Nde I-Fusion Fragments an das 10679-Bp Spe I-Csp45I-Fragment von pSFV-C ⁽¹⁸⁾ und das 2744-Bp Nde I-Spe I-Fragment von pSFV1-TR ⁽⁴⁾ konstruiert. Das 896-Bp Csp45I-Nde I-Fragment von pSFVC-TR, welches aus der PCR-Reaktion stammt, wurde durch Sequenzieren überprüft.
(v) pSFV1-Pr65^gag, welches das Gen für den Gag-Vorläufer des Moloney-Murine-Leukemia-Virus (M-MuLV) in einer Fusion mit der Region des 5'-SFV-Subgenoms an Position 31 in der 26S-mRNA-Leadersequenz enthält. Dies wurde durch Einführen eines 1770-Bp PstI-DraIII-Fragmentes aus pNCA (Colicelli, 1988), welches das Pr65^gag-Gen enthält, in pSFV1 über Subclonierungsschritte in pGEM-1 und pGEM-7Zf (+) (Promega) konstruiert. Die Subclonierungsschritte führten eine 5'-Bam HI- und eine 3'-Sma I-Stelle ein, welche das Pr65^gag-Gen flankieren. Die 5'-nicht-codierende M-MuLV-Sequenz wurde durch Ersetzten des 5' 177-Bp Bam HI-Pst I-Fragments mit einem synthetischen 135-Bp Bam HI-Pst I-Fragment, welches aus den zwei folgenden überlappenden Oligonucleotiden hergestellt wurde; (1) 5' ATTCTGATTGGATCCAGCACCATGGGCCAGACTGTTACCACTCCCTTA AGTTTGACCTTAGGTCACTGGAAAGATGTCGAGCGGATCGCTCACAAC CAG 3' und (2) 5' GGTTGGCCATTCTGCAGAGCAGAAGGTAACCCAACGTCTCTTCTTGAC ATCTACCGACTGGTTGTGAGCGATCCGCTCGACATCTTTCCAGTGACC TAA 3', deletiert.
(vi) pSFVC-Pr65^gag, welches das M-MuLV-gag-Vorläufer-Gen in einer Fusion mit der SFV-5'-Subgenom-Region, umfassend den vollständigen 26 S-RNA-Leader und das C-Gen, enthält. Dieses Plasmid wurde durch eine PCR-Fusion des C-Gens von SFV an das zweite Codon des Pr65^gag-Gens konstruiert. Die verwendeten Fusionsprimer waren: 5'GGGAGTGGTAACAGTCTGGCCCCACTCTTCGGACCCCTCGGG 3' (C-Gen-Fragment-Primer) und 5'CCCGAGGGGTCCGAAGAGTGGGGCCAGACTGTTACCACTCCC 3' (Pr65^gag-Gen-Fragment-Primer). Die endständigen Primer zur Amplifikation der fusionierten DNA waren: 5'CAACGGAAAAACGCAGCAGC 3' (der 5'-Ende-Primer) und 5'CAAGGCTTCCCAGGTCACG 3' (der 3'-Ende-Primer). Das pSFVC-Pr65^gag wurde dann durch Ligierung des 562-Bp Csp45I-Pst I-C-Pr65^gag-Fusionsfragments an das 10679-Bp Spe I-Csp45I aus pSFV-C ⁽¹⁸⁾ und das 2492-Bp Pst I-Spe I-Fragment von pSFV1-Pr65^gag konstruiert. Das 562-Bp Csp45I-Pst I-Fragment von pSFVC-Pr65^gag, welches aus der PCR-Reaktion stammt, wurde durch Sequenzieren überprüft.
(vii) pSFV3-LacZ, welches das LacZ-(β-Galactosidase)-Gen enthält, das die Aminosäurereste 2 – 1025 in einer Fusion mit der 5'-SFV-Subgenom-Region an Position 53 in der 26S-RNA nach der vollständigen nicht-translatierten Leadersequenz enthält. (SFV3-Vektor, ⁽⁴⁾.
(viii) pSFVC-Lacz, welches das LacZ-Gen wie vorstehend in einer Fusion mit der SFV-5'-Subgenom-Region enthält, umfassend die vollständige 26S-mRNA-Leadersequenz und das vollständige C-Gen. Dies wurde durch Einfügung des kleinen LacZ enthaltenden Bam HI-Fragments (3 kBp) aus pSFV3-LacZ in das pSFVC^{Bam HI} konstruiert. Das pSFVC_{Bam HI} enthält nur das C-Protein-Gen des strukturellen SFV-Genoms, direkt gefolgt von einer Bam HI-Stelle. Dieses Plasmid wurde durch Ligierung des großen Spe I-Csp45I-Fragments (10679-Bp) aus pSP6-SFV4 an ein durch PCR erzeugtes 440-Bp Csp45I-Bam HI-Fragment des 3'-Endes des C-Gens und das 874-Bp der Bam HI-Spe I-Fragment von pSFV1 konstruiert (Quelle: Liljeström & Garoff, Biotechnology 1991). In der PCR-Reaktion verwendete Primer waren: (1) 5'CAACGGAAAAACGCAGCAGC 3' (der 5'-Ende-Primer) und (2) 5'CTCAAGGAGTCATGGATCCCACTCTTCGGACCCCTCGGG 3' (der 3'-Ende-Primer).
(ix) pSFVC'-LacZ, welches das LacZ-Gen in einer Fusion mit der 5'-Subgenom-Region enthält, umfassend den vollständigen 26S-mRNA-Leader und einen 5'-Anteil des C-Gens. Dies wurde wie folgt konstruiert: serielle Deletionen in dem C-Protein-Gen von pSP6-SFV4 wurden durch limitierte Spaltung mit der Nuclease BaI 31, beginnend von der Csp45I-Stelle bei Position 7781, hergestellt. Die Enden wurden mit Klenow-Fragment und T4-DNA-Polymerase geglättet und an ein Gemisch von Bam HI-Verknüpfungseinheiten ligiert (8-, 10- und 12-mere; Promega, Madison, WI, USA). Die großen Spe I-Bam HI-Fragmente (annähernd 10,3 kBp) aus den Deletionsserien wurden an das kleine, das LacZ-Gen enthaltende Bam HI-Spe I-Fragment aus pSFV3-LacZ ligiert.
(x) pSFVmSQL, welches ein Kontrollplasmid ist und das vollständige SFV-Genom enthält. Es trägt Mutationen in der Region des strukturellen Gens, welche die Abspaltungsstelle für die Reifung von p62 spezifiziert. Wegen dieser Mutationen wird die p62-Untereinheit nicht zu E2 und E3 gespalten (21, 5).

Die detaillierten Protokolle für alle verwendeten molekularbiologischen Techniken sind in Molecular Cloning ⁽²²⁾ beschrieben.
Beispiel 2
Die Anwesenheit des C-Gens verstärkt die Protein-Produktion.
RNA wurde in vitro unter Verwendung der Plasmide pSFV1-p62, pSFVC-p62, pSFV1-TR, pSFVC-TR, pSFV1-Pr65^gag, pSFVC-Pr65^gag, pSFV1-LacZ, pSFVC- LacZ und pSFVmSQL als Matrizen synthetisiert. Diese wurden in BHK-21-Zellen transfiziert und 8 Stunden nach der Transfektion wurden die Zellen metabolisch mit ³⁵S-Methionin über 15 oder 30 Minuten wie in der Legende von 2 angegeben markiert. Die 2 zeigt das relative Niveau der Synthese des homologen p62-Proteins (Spuren 1 und 2), des Transferrinrezeptors (Spuren 3 und 4), des M-MuLV-^gag-Vorläufer-Proteins (Spuren 5, 6 und 10), des β-Galactosidase-Proteins (Spuren 7 und 8) wenn alleine (Spuren 1,3, 5 und 7) oder im Tandem mit dem C-Protein exprimiert (Spuren 2, 4, 6, 8 und 10). Die Synthesen der strukturellen SFV-Proteine (C, p62 und E1) werden in Spur 10 gezeigt. Es werden Immunpräzipitationen von Zelllysaten (Spuren 1–6) oder Proben von gesamten Zelllysaten (Spuren 7–10) gezeigt.
Wenn von auf pSFV1 basierenden, rekombinanten Genomen exprimiert, wurden SFV p62, TR und M-MuLV gag (jeweils Spuren 1,3 und 5) alle auf einem vergleichbar niedrigen Niveau synthetisiert. Wenn diese Proteine jedoch als C-Fusionsproteine exprimiert wurden, wurde eine dramatische Steigerung in ihren Expressionsniveaus erhalten (Spuren 2, 4 und 6). Quantifizierungen zeigten, dass die Steigerung für alle drei Proteine annähernd 10-fach war. Die autolytische Spaltung, welche das C-Protein vom strukturellen Polyprotein des Virus freisetzt, war offensichtlich auch in den künstlichen C-Pr65gag- und C-TR-Polyproteinen wirksam; es gab keine Anzeichen für langsam wandernde Polypeptide, welche ungespaltene Fusionsproteine darstellen könnten (Spuren 4 und 6).
In den auf pSFV1 basierenden Genomen ist nur der 5'-Teil der 26S-Leadersequenz vorhanden, während die von pSFVC abgeleiteten Subgenome den gesamten 5'-Leader enthalten. Deshalb zeigen die Ergebnisse an, dass der 3'-Teil der Leadersequenz oder die Anwesenheit der C-Sequenz das Expressionsniveau beeinflusst. Um herauszufinden, welche Region für die Verstärkung der Expression verantwortlich war, verglichen wir die Niveaus der Produktion von β-Galactosidase in Zellen, welche entweder mit dem SFV3-LacZ-Genom (welches die gesamte Leadersequenz enthält) (2, Spur 7) oder mit dem SFVC-LacZ-Genom (welches die gesamte Leadersequenz und die C-Gen-Sequenz enthält) (2, Spur 8) transfiziert worden waren. Das letztere Genom steuerte die Synthese eines ungespaltenen C-β-Galactosidase-Fusionsproteins (1263 Aminosäuren lang, annähernd 145 kD). Eine Quantifizierung zeigte, dass die Expression des C-β-Galactosidase-Fusionsproteins annähernd 8-fach höher als die Expression der β-Galactosidase aus dem SFV3-LacZ-Genom war. Diese Steigerung war so groß wie jene, die für SFV1 im Vergleich zu SFVC beobachtet wurde. Aus diesen Beobachtungen schließen wir, dass die Anwesenheit der C-Gen-Sequenz im Expressionsvektor einen starken positiven Effekt auf die durch SFV angetriebene Produktion hat. Der wahrscheinlichste Grund für die Hemmung der Spaltung in dem C-β-Galactosidase-Konstrukt ist ein Prolin-Rest an Position + 2, gezählt von der Stelle, welche durch die Capsid-Protease gespalten wird.
Um das Niveau der Proteinproduktion aus einem SFVC-Genom zu jenem von einem Wildtyp-artigen SFV-Genom in Beziehung zu setzen, verglichen wir die Menge an produzierten C-Protein in Zellen, welche mit in vitro-Transkripten von pSFVmSQL (2, Spur 9) transfiziert worden waren, mit den Mengen von C und Gag-Vorläufer in Zellen, welche mit SFVC-Pr65gag-RNA (2, Spur 10) transfiziert worden waren. Die Menge von C-Protein 8 Stunden nach der Transfektion war in den zwei Transfektionen nicht unterscheidbar. Weiterhin wurden Pr65gag- und SFV-Spike-Proteine auf vergleichbaren Niveaus produziert, was zeigt, dass die Einführung des C-Gens in den Expressionsvektor die Produktion von heterologen Proteinen auf ein Niveau steigerte, welches normalerweise für die strukturellen Proteine in einer Wildtyp-SFV-Infektion erhalten wird.
In diesem Beispiel wurden RNA-Transkription und -Transfektion wie folgt durchgeführt: RNA-Transkripte der mit Spe I linearisierten Plasmide wurden in vitro wie vorher beschrieben ⁽⁴⁾ synthetisiert und durch Elektroporation in BHK21-Zellen (American Type Culture Collection) transfiziert. Kurzgesagt wurden 8 × 10⁶ Zellen (suspendiert in 0,8 ml Ca²⁺/Mg²⁺-freiem PBS) mit in in vitro hergestellter RNA (20 μl des Transkriptionsgemisches) in einer 0,4-cm Elektroporationsküvette gemischt (Bio-Rad Laboratories AB, Solna, Schweden) und zwei aufeinander folgenden Pulsen bei 0,85 kV und 25 μF ausgesetzt (BioRad Gene Pulser, ohne die Pulse Controller Unit). Die Zellen wurden in 15 ml komplettem BHK-Medium bestehend aus BHK-21-Medium (Gibco), ergänzt mit 10 % (v/v) Tryptosephosphat-Bouillon (Gibco, Madison, WI, USA), 5 % (v/v) fötalem Kälberserum, 20 mM N-2-Hydroxyethylpiperazin-N'-2-ethansulphonsäure (HEPES) pH 7,3 suspendiert und auf 3,3 cm-Gewebekulturschalen (3 ml/Schale) ausplattiert und bei 37 °C inkubiert.
Die metabolische Markierung mit ³⁵S-Methionin wurde wie folgt durchgeführt: 8 Stunden nach der Transfektion wurden die Zellen zweimal mit PBS gespült, 1,0 ml Eagles Minimal Essential Medium, welchem Methionin fehlt, ergänzt mit 20 mM HEPES, wurde hinzugefügt und die Zellen 30 Minuten bei 37 °C inkubiert.
Das Medium wurde entfernt und 3,7 MBq (100 μCi) ³⁵S-Methionin in 1 ml des gleichen Mediums wurden hinzugefügt und die Zellen 15 oder 30 Minuten inkubiert (Puls). Das Markierungsmedium wurde entfernt und 1,0 ml EMEM ergänzt mit 20 mM HEPES wurden hinzugefügt und die Zellen weiter 15 oder 30 Minuten (Chase) inkubiert. Am Ende des Chase wurden die Zellen zweimal mit PBS gespült und in 0,30 ml von 10 mg/ml SDS oder 10 mg/ml Nonidet P40 (NP-40) Lysepuffer enthaltend 50 mM Tris-HCl, 0,15 M NaCl, und 2,0 mM EDTA, End-pH 7,6, solubilisiert. Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF; 0,2 mM), N-Ethylmaleimid (0,1 mM) und Pepstatin A (1 μg/ml) wurden dem Lysepuffer vor der Verwendung hinzugefügt. Zellen, welche mit dem SDS-Lysepuffer aufgebrochen worden waren, wurden 20 Minuten bei Raumtemperatur mit Ultraschall behandelt. Zellkerne von mit NP-40 lysierten Zellen wurden durch Zentrifugation sedimentiert (5 Min. bei 14000 × g).
Immunpräzipitationen wurden wie folgt durchgeführt: der Transferrinrezeptor wurde mit dem monoclonalen Anti-TR-Antikörper OKT9 (ein Geschenk von T. Ebel), der M-MuLV-gag-Vorläufer mit einem polyclonalen Anti-MuLV-Serum (HC 185; Quality Biotechnology Incorporated) und das p62 mit einem monoclonalen Anti-E2-Antikörper (UM 5.1; Boere et al. 1984) präzipitiert. Proben von SDS-Lysaten von mit ³⁵S-Methionin Zellen (100 μl) wurden 10-fach mit 10 mg/ml NP-40 Lysepuffer verdünnt und ein Überschuss des geeigneten Antikörpers wurde zusammen mit 40 μl Protein A-Sepharose-Aufschlämmung (Pharmacia, Uppsala, Schweden; 50 % w/v in 10 mM Tris-HCl, pH 7,5) hinzugefügt und die Proben wurden invertierend über 16 Stunden bei + 4 °C rotiert. Wenn ein Verknüpfen der Antikörper notwendig war, wurde auch Kaninchen-Anti-Maus-Immunglobulin (Dacopatts, Glostrup, Dänemark) hinzugefügt. Die Immunkomplexe wurden wie beschrieben gewaschen (Wahlberg und Garoft 1989) und für SDS-PAGE vorbereitet.
SDS-PAGE wurde wie folgt durchgeführt: gewaschene Immunkomplexe oder Proben von Zelllysaten wurden mit SDS-PAGE-Probenpuffer gemischt (die Endkonzentrationen ergebend; 0,15 M Tris-HCl, pH 8,8, 0,19 g/ml Glycerin, 31 mg/ml SDS, 3,8 mM EDTA, 0,77 mM Methionin, 0,15 mg/ml Bromphenolblau und 38,5 mM Dithiothreit), 3 Minuten auf 95 °C erhitzt, gekühlt und mit Iodacetamid alkyliert (Endkonzentration 0,10 M). Schließlich wurden die Proteine auf 11%igen Acrylamidgelen wie beschrieben aufgetrennt (Maizel 1971). Nach der Elektrophorese wurden die Gele in 10 % (v/v) Trichloressigsäure und 40 % (v/v) Methanol getaucht, 30 Minuten inkubiert und getrocknet. Gele, die radioaktiv markiertes Material enthielten, wurden zur Autoradiographie Kodac XAR-Filmen ausgesetzt.
Quantifizierungen wurden wie folgt durchgeführt: getrocknete Acrylamidgele, die radioaktiv markiertes Material enthielten, wurden einer Bas-III Image-Platte (Fuji Photo Film Corp.) ausgesetzt. Die Signale der Bildplatte wurden digitalisiert und die Menge der Radioaktivität in verschiedenen Teilen des getrockneten Gels wurde unter Verwendung des Fuji Bio-Image Analyze System Bas 2000 (Fuji Photo Film Corp.) untersucht.
Beispiel 3
Ein 102 Basen-Segment aus dem 5'-Abschnitt des C-Gens vermittelt die Verstärkung der Expression.
Als ein erster Schritt in der Aufklärung des Mechanismus der Verstärkung der Expression gingen wir die Frage an, ob die vollständige C-Gen-Sequenz oder nur ein Teil davon ausreichend war, um hohe Niveaus der Proteinproduktion zu fördern. Dazu wurden verschiedene Plasmide (C'-LacZ-Chimären), welche zunehmende Abschnitte des 5'-Teils des C-Gens (C') fusioniert an das β-Galactosidase-Gen enthielten, konstruiert (1). Diese Plasmide wurden als Matrizen für die RNA-Transkription in vitro verwendet, die RNAs wurden in BHK-21-Zellen transfiziert und die Zellen wurden 15 Minuten Puls-markiert und 15 Minuten wie in Beispiel 2 beschrieben verfolgt. Die Transfektionseffizienzen waren in allen Fällen wie durch eine Färbung auf β-Galactosidase in situ beurteilt höher als 95 %. Am Ende der Chaseperiode wurden die Zellen in SDS lysiert und Proben der Zelllysate wurden durch SDS-PAGE unter reduzierenden Bedingungen untersucht. Die Menge der mit den Fusionsproteinen assoziierten Radioaktivität wurde wie in Beispiel 2 beschrieben quantifiziert. Die 3 zeigt die Produktion der Fusionsproteine (ausgedrückt als Prozentsatz der C-Protein-Produktion von SFVmSQL) als eine Funktion der Zahl der aus dem C-Protein abgeleiteten Aminosäuren in dem Fusionsprotein. Die Proteinproduktion von den längeren Konstrukten (mehr als 34 aus dem C-Protein abgeleitete Aminosäurereste enthaltend) erreichte ein Niveau von 85 % der C-Protein-Produktion des Wildtyps. Dieses ist genau so hoch wie jenes, welches von dem in Beispiel 2 beschriebenen SFVC-LacZ-Konstrukt erhalten wurde. Die kürzeren (jeweils 16, 19 und 27 von dem C-Protein abgeleitete Aminosäurereste enthaltend) wurden auf einem beachtenswert geringeren Niveau produziert. Somit zeigen die Ergebnisse, dass ein 102 Basen langer Abschnitt des 5'-C-Gens (b 1) die gesteigerte Expression vermittelte.
In diesem Beispiel wurden RNA-Transkription, Transfektion, Markierung und SDS-PAGE wie in Beispiel 2 beschrieben durchgeführt. Die β-Galactosidase-Färbung von mit Methanol fixierten BHK-21-Zellen in Gewebekulturschalen wurde durchgeführt wie von Sanes ⁽²³⁾ beschrieben.
Beispiel 4
Verstärkung der Expression durch das 102 Basen lange C-Gen-Segment wird durch gesteigerte Translation vermittelt.
Die Tatsache, dass nur ein kurzer Abschnitt der C-Gen-Sequenzen für eine optimale Proteinproduktion benötigt wurde, macht es unwahrscheinlich, dass die Wirkung in trans vermittelt wird (das heißt durch die Polypeptidkette des Capsids). Ein cis-wirkender (das heißt RNA-vermittelter) Mechanismus, welcher die Effizienzen von entweder der Transkription oder Translation beeinflusst, scheint eine wahrscheinlichere Erklärung zu sein. Um zu bestimmen, ob das C-Gen-Segment die Spiegel der genomischen -und subgenomischen RNAs beeinflusste, wurden die intrazellulären Mengen dieser zwei RNA-Spezies in Zellen, welche entweder mit "stark" oder "gering" produzierenden Genomen transfiziert worden waren, gemessen.
Transfizierte Zellen wurden in der Anwesenheit von Actinomycin D gezüchtet, um jegliche verbleibende Wirtszell-RNA-Synthese zu unterdrücken. 4 Stunden nach der Transfektion wurde ¹⁴C-Uridin hinzugefügt und die Zellen wurden 4 Stunden inkubiert. Gesamt-RNA wurde aus den markierten Zellen präpariert und einer Elektrophorese durch 1,0%ige Agarosegele unter denaturierenden Bedingungen unterzogen. Die Gele wurden getrocknet und die Menge der Radioaktivität in verschiedenen Banden wurde wie in Beispiel 2 beschrieben quantifiziert. Die 4 zeigt eine Autoradiographie eines getrockneten Gels: Spur 1, SFV-mSQL; Spur 2, das stark produzierende SFVC'b7-LacZ; Spur 3, das gering produzierende pSFV3-LacZ; Spur 4, Scheintransfektion ohne RNA, und Spur 5, SFV1-Pr55^gag; welches die Codierungssequenz des Gag-Vorläufers des menschlichen Immunschwäche-Virus Typ I enthält. Die subgenomische RNA des SFV1-Pr55^gag-Genoms ist etwa 1500 Basen kürzer als jene des SFV-mSQL- und des SFVC-LacZ-Genoms, was die Identifizierung dieser Transkripte erleichtert. Es wurde herausgefunden, dass subgenomische RNAs in allen Transfektionen auf vergleichbaren Niveaus synthetisiert wurden. Quantifizierungen zeigten an, dass die Niveaus der Synthese höchstens um einen Faktor von zwei variierten und nicht mit dem Niveau der Proteinproduktion korrelierten. Noch wurden irgendwelche wesentlichen Unterschiede in den Niveaus der genomischen RNA nachgewiesen. Somit waren weder die Replikation noch die Transkription der verschiedenen Genome betroffen. Deshalb wird geschlossen, dass die gesteigerte Proteinproduktion eine Konsequenz der gesteigerten Effizienz der Translation ist.
In diesem Beispiel wurde ¹⁴C-Uridin-Markierung wie folgt durchgeführt: transfizierte Zellen wurden direkt ausplattiert und zwei Stunden bei 37 °C inkubiert. Dann wurden 1,0 μg/ml Actinomycin D dem Medium hinzugefügt und die Inkubation wurde über 2 Stunden fortgesetzt. 4 Stunden nach der Transfektion wurde das Medium entfernt, 75 kBq ¹⁴C-Uridin (2,1 GBq/mmol; NEC-167, Dupont) wurden in 1,5 ml komplettem BHK-Medium hinzugefügt und die Zellen wurden über 4 Stunden bei 37 °C inkubiert. Das Markierungs-Medium wurde entfernt und die Zellen durch Zugabe von 1,0 ml eines auf Phenol basierenden Nucleinsäure-Extraktionscocktails (Trizol ^TM; Gibco) lysiert.
Die RNA-Reinigung und denaturierende Agarosegel-Elektrophorese wurden wie folgt durchgeführt: Gesamt-RNA aus ¹⁴C-Uridin-markierten Zellen wurde mit dem Trizol ^TM-System wie durch den Hersteller beschrieben (Gibco) gereinigt und in 20 μl RNase-freiem H₂O aufgelöst. Proben wurden auf eine Formaldehyd-Agarosegel-Elektrophorese vorbereitet und die RNA wurde in einem 1,0%igen Seaplaque-Agarose(FMC Bioproducts, USA)-Gel wie beschrieben aufgetrennt (Sambrook 1989). Nach der Elektrophorese wurde das Gel in 10 % Trichloressigsäure getaucht, 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert und getrocknet. Die radioaktiv markierten RNA-Banden wurden durch Autoradiographie sichtbar gemacht und wie in Beispiel 2 beschrieben quantifiziert.
Literaturverzeichnis

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Sequenzprotokoll

Claims

Selbstreplizierendes und transkriptionsfähiges rekombinantes Alphavirus-RNA-Molekül, umfassend (i) zumindest einen Teil eines Alphavirus-RNA-Genoms und (ii) heterologe RNA, die einen Stoff mit biologischer Aktivität codiert, wobei die heterologe RNA sich stromabwärts befindet von und funktionell verknüpft ist mit einer Alphavirus-Basensequenz mit translationsfördernder Aktivität, wobei die translationsfördernde Basensequenz ein vollständiges Alphavirus-Capsidgen oder einen 5'-Bereich davon umfasst, welcher eine Translationsaktivität bereitstellt, die 10-fach höher ist als die Translationsaktivität in Abwesenheit dieser translationsfördernden Basensequenz.
Rekombinantes RNA-Molekül nach Anspruch 1, wobei das RNA-Molekül, nachdem es in Zellen eingebracht wurde, repliziert wird unter Verwendung von Alphavirus-Replikase, die durch den 5'-Bereich des Moleküls codiert wird, und durch den Alphavirus-Subgenom-Promotor in mRNA transkribiert wird, dadurch gekennzeichnet, dass die heterologe RNA in die Alphavirus-Subgenom-Region stromabwärts von der translationsfördernden Basensequenz eingeführt wird und dass das heterologe Genprodukt in den Zellen von der mRNA als ein Fusionsprodukt mit dem vollständigen Capsidprotein oder mit einem aminoterminalen Bereich des Capsidproteins exprimiert wird, der durch den 5'-Bereich des Gens codiert wird.
Rekombinantes RNA-Molekül nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Alphavirus Semliki-Forest-Virus ist.
Rekombinantes RNA-Molekül nach Anspruch 3, wobei die translationsfördernde Basensequenz die ersten 81 Basen des Capsidgens umfasst und die Sequenz ATGAATTACA TCCCTACGCA AACGTTTTAC GGCCGCCGGT GGCGCCCGCG CCCGGCGGCC CGTCCTTGGC CGTTGCAGGC C hat.
Rekombinantes RNA-Molekül nach Anspruch 3, wobei die translationsfördernde Basensequenz die ersten 102 Basen des Capsidgens umfasst und die Sequenz ATGAATTACA TCCCTACGCA AACGTTTTAC GGCCGCCGGT GGCGCCCGCG CCCGGCGGCC CGTCCTTGGC CGTTGCAGGC CACTCCGGTG GCTCCCGTCG TC hat.
Rekombinantes RNA-Molekül nach Anspruch 2, 3, 4 oder 5, das die heterologe RNA als ein Fusionsprodukt exprimiert, welches an seiner Fusionsstelle durch die autolytische Proteaseaktivität des Capsidproteins gespalten wird.
Rekombinantes RNA-Molekül nach einem der Ansprüche 1–6, wobei die heterologe RNA-Sequenz ein Protein oder ein Polypeptid codiert, das eine antigene Determinante umfasst, wobei das Protein oder Polypeptid immunogen oder antigen ist.
Rekombinantes RNA-Molekül nach einem der Ansprüche 1–6, wobei die heterologe RNA ein Protein oder ein Polypeptid mit therapeutischer Aktivität codiert.
DNA-Molekül welches komplementär zum rekombinanten RNA-Molekül nach einem der Ansprüche 1–8 ist.
DNA-Molekül nach Anspruch 9, welches ferner eine DNA-Sequenz umfasst, die einen Promotor zur Transkription des rekombinanten RNA-Moleküls in Zellen codiert, und ferner DNA-Sequenzen umfasst, die für die Plasmidreplikation in E. coli erforderlich sind.
DNA-Molekül nach Anspruch 10, wobei der Promotor SP6 ist.
Isolierte transformierte Zelle, umfassend ein rekombinates RNA- oder DNA-Molekül nach einem der vorangehenden Ansprüche.
Zelle nach Anspruch 12, welche eine tierische oder menschliche Zelle ist.
Zelllinie, umfassend Zellen nach Anspruch 12 oder 13, welche mit dem RNA- oder DNA-Molekül stabil transformiert sind.
Verfahren zur in vitro-Expression einer heterologen RNA-Sequenz, die einen biologisch aktiven Stoff codiert, umfassend das Transformieren der Zellen mit rekombinanter RNA nach einem der Ansprüche 1–9 oder rekombinanter DNA nach Anspruch 9, 10 oder 11 und das anschließende Züchten der transformierten Zellen unter Bedingungen, welche die Expression der heterologen RNA-Sequenz erlauben, wodurch das Expressionsprodukt der heterologen RNA-Sequenz exprimiert wird.
Verfahren nach Anspruch 15, wobei die Transformation durch Transfektion erreicht wird.
Verfahren nach Anspruch 15, wobei die Transformation durch Infektion von Zellen in Zellkultur erreicht wird.
Verfahren nach Anspruch 15, 16 oder 17, wobei die heterologe RNA ein Protein, Polypeptid oder Peptid mit therapeutischer oder prophylaktischer, wie immunogener oder antigener, Aktivität codiert.
Verfahren nach einem der Ansprüche 15–18, wobei das Expressionsprodukt aus den Zellen isoliert und gegebenenfalls gereinigt wird.
Verfahren zur in vivo-Expression einer heterologen RNA-Sequenz, die einen biologisch aktiven Stoff codiert, wobei das Verfahren umfasst: das Infizieren von Zellen in einem nicht-menschlichen Tier mit infektiösen rekombinanten Alphavirus-Partikeln umfassend ein Genom, das aus einem rekombinanten RNA-Molekül nach einem der Ansprüche 1–8 umgeben von einer Wildtyp-Alphavirus-Hülle besteht, wodurch die Expression der heterologen RNA-Sequenz in dem nicht-menschlichem Tier erzielt wird, und das anschließende Gewinnen des Expressionsprodukts durch Sammeln einer Körperflüssigkeit von dem Tier.
In vitro-Verfahren zur Herstellung eines rekombinanten Alphavirus, umfassend ein rekombinantes Alphavirus-RNA-Genom umgeben von einer Wildtyp-Alphavirus-Hülle, wobei das Verfahren umfasst: (i) Co-Transformation, wie Co-Transfektion, von Zellen mit dem rekombinanten RNA-Genom und mit einer Helfer-RNA, die Expressionskapazität von Alphavirus-Strukturproteinen aufweist und Codierungssequenzen für die Alphavirus-Strukturproteine, cis-wirkende Replikations-Signale aber keine Verkapselungs-Signale umfasst, (ii) Inkubieren der Zellen, und (iii) Sammeln von Medium, welches infektiöse rekombinante Alphavirus-Partikel enthält, dadurch gekennzeichnet, dass das rekombinante RNA-Genom das rekombinante RNA-Molekül nach einem der Ansprüche 1–8 umfasst.
Isolierte transformierte Zelle, umfassend ein rekombinantes RNA-Molekül nach einem der Ansprüche 1–8 und eine Helfer-RNA, die Expressionskapazität von Alphavirus-Strukturproteinen enthält und Codierungssequenzen für die Alphavirus-Strukturproteine, cis-wirkende Replikations-Signale aber keine Verkapselungs-Signale umfasst, wobei die Zelle infektiöse rekombinante Alphavirus-Partikel produzieren kann, die die von einer Wildtyp-Alphavirus-Hülle umgebenen rekombinante RNA umfassen.
Infektiöser rekombinanter Alphavirus-Partikel, umfassend ein Genom, das aus einem von einer Wildtyp-Alphavirus-Hülle umgebenen rekombinanten RNA-Molekül nach einem der Ansprüche 1–8 besteht.
Arzneimittel, umfassend die rekombinante RNA nach einem der Ansprüche 1–8 in einer physiologisch verabreichbaren Form.
Arzneimittel nach Anspruch 24, umfassend transformierte Zellen gemäß Anspruch 22.
Arzneimittel nach Anspruch 24, umfassend infektiöse Partikel gemäß Anspruch 23.
Verwendung der rekombinanten RNA nach einem der Ansprüche 1–8 für die Herstellung eines Arzneimittels gemäß Anspruch 24 zur Verwendung, um eine Expression der rekombinanten RNA in einem Tier oder menschlichen Individuum zu erzielen.