DE69516866T2

DE69516866T2 - Stereochemische wortmanninderivate

Info

Publication number: DE69516866T2
Application number: DE69516866T
Authority: DE
Inventors: Lawrence Camillo Creemer; Herbert Andrew Kirst
Original assignee: Eli Lilly and Co
Current assignee: Eli Lilly and Co
Priority date: 1994-07-01
Filing date: 1995-06-30
Publication date: 2000-10-05
Anticipated expiration: 2015-07-01
Also published as: EP0762879B1; ZA955466B; JPH10502373A; ES2145915T3; US5480906A; CA2193963A1; AU2959995A; DE69516866D1; EP0762879A4; ATE192649T1; WO1996001108A1; EP0762879A1

Description

Wortmannin ist ein bekannter starker Inhibitor der Phosphatidylinositol-3-kinase (PI-3-Kinase) und wurde zur Verwendung als potentielles Antikrebsmittel vorgeschlagen. Wortmannin ist eine natürlich vorkommende Verbindung, die aus Kulturbrühen des Pilzes Penicillium wortmannin isoliert wurde und die folgende Grundstruktur aufweist
Eines der Nachteile von Wortmannin ist dessen Toxizität für lebende Kreaturen. Sogar in geringen Dosen war Wortmannin in reiner Form oft für Labortiere letal. Versuche zur Synthese von Derivaten von Wortmannin waren bisher problematisch.
Das Journal of Biological Chemistry, Band 268 Seite 25846-56 (1993) beschreibt die Verwendung von Wortmannin und eines 11-Hydroxyderivats als Inhibitoren der PI-3 Kinase.
Die vorliegende Erfindung liefert Wortmanninverbindungen, die eine erhöhte Stärke der PI-3 Kinasehemmung aufweisen und eine mögliche Verwendung als Antikrebsmittel haben. Die erfindungsgemäßen Verbindungen umfassen 11-substituierte, 17-substituierte und 11,17-disubstituierte Wortmanninderivate. Im allgemeinen umfassen die Derivate Ester an der Position 11 als Grundsubstitutionsgruppen, aber andere ähnliche Verbindungen zeigen ohne Zweifel eine ähnliche Aktivität. Die allgemeine Formel für die erfindungsgemäßen Verbindungen ist
worin
R&sub1; für oder OR&sub3; steht,
R&sub2; für oder OR&sub3; steht,
jedes R&sub3; einzeln für Wasserstoff, Arylacyl, C&sub3;-C&sub8; Acyl oder substituiertes Acyl steht, und
R&sub2; nicht für steht, falls R&sub1; für oder OH steht.
Die vorliegende Erfindung liefert auch pharmazetische Formulierungen, die die Verbindung in Kombination mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger, Hilfsstoff oder Verdünnungsmittel enthalten. Sie liefert auch die Verwendung von Verbindungen als PI-3 Kinaseinhibitoren, beispielsweise als Antikrebsmittel.
Der Ausdruck "Acyl" steht für eine Alkylgruppe, die an eine Carbonylgruppe gebunden ist. Typische Acylgruppen sind unter anderem C&sub2;-C&sub8; Acylgruppen, wie Acetyl, Propionyl, Butyryl, Valeryl, Isovaleryl und Caprolyl.
Der Ausdruck "C&sub3;-C&sub8; Acyl" steht für eine C&sub2;-C&sub7; Alkylgruppe, die an eine Carbonylgruppe gebunden ist. Typische C&sub3;-C&sub8; Acylgruppen sind unter anderem Propionyl, Butyryl, Valeryl, Isovaleryl und Caprolyl.
Der Ausdruck " substituiertes Acyl" steht für eine substituierte Alkylgruppe, die an eine Carbonylgruppe gebunden ist. Beispiele für Substituenten, die in einer substituierten Alkylgruppe vorkommen, sind Halogenatome, beispielsweise Chlor, Aminogruppen, beispielsweise Dimethylamino, und Alkylidengruppen, wie Methyliden. Typische substituierte Acylgruppen sind unter anderem C&sub2;-C&sub8; Acylgruppen, wie N,N-Dimethylaminopropionyl, Acryloyl und Chloracetyl.
Der Ausdruck "Arylacyl" steht für eine Aryl- oder substituierte Arylgruppe, die an eine Acylgruppe gebunden ist.
Der Ausdruck "Aryl" steht für einen aromatischen Rest, wie Phenyl, und mehrkernige aromatische Reste, wie Naphthyl, Fluorenyl, Anthracyl und Phenanthryl. Der Ausdruck "substituiertes Aryl" steht für eine Arylgruppe, die mit einem oder mehreren Resten substituiert ist, welche aus der Gruppe ausgewählt sind, die besteht aus Halogen, Hydroxy, Cyano, Nitro, C&sub1;-C&sub6; Alkyl, C&sub1;-C&sub4; Alkoxy, Carboxy, Acetyl, Formyl, Carboxymethyl, Hydroxymethyl, Amino, Aminoethyl oder Trifluormethyl. Beispiele für substituierte Arylgruppen sind unter anderem 4-Methylphenyl, 2-Methylphenyl, 4-Methoxyphenyl, 4-(i-Propyl)phenyl, 4-Cyclopentylphenyl, 4-(1,1,4,4,-Tetramethylbutyl)phenyl, 4-Acetylphenyl, 4-Trifluormethylphenyl, 4-Chlorphenyl, 2-Bromphenyl, 3-Iodphenyl, 6-Bromnaphthyl, 3,4-Methylendioxyphenyl, Indenyl, 1,2,3,4-Tetrahydronaphthyl und 1,2,4,4-Tetramethyl-1,2,3,4- tetrahydronaphthyl. Ein typischer Vertreter für eine "Arylacylgruppe" ist Phenylacetyl.
Während alle Verbindungen der Formel (I) eine Fähigkeit zur Hemmung der PI-3-Kinasewirkung aufweisen dürften, sind bestimmte Verbindungen bevorzugt. Die bevorzugten Verbindungen haben die allgemeine Formel:
worin
R&sub1; für oder OR&sub3; steht,
R&sub2; für oder OR&sub3; steht, und
R&sub3; für Wasserstoff, C&sub3;-C&sub8; Acyl oder substituiertes Acyl steht.
In den am meisten bevorzugten Verbindungen der Gruppe der bevorzugten Verbindungen steht R&sub1; für O-C&sub3;-C&sub8; Acyl oder O-substituiertes C&sub2;-C&sub8; Acyl, und R&sub2; steht für oder OH, wobei alle Verbindungen aus Wortmannin mittels Verfahren hergestellt werden, die später im Detail beschrieben werden. Es ist verständlich, daß diese Verfahren nur beispielhaft sind und für Erklärungszwecke aufgeführt werden und nicht als Einschränkung der Erfindung auf die hierin beschriebenen Schritte und bestimmten Verbindungen gesehen werden.
11-Desacetylderivate von Wortmannin werden zuerst durch in der Technik gut bekannte Verfahren gemäß dem folgenden Schema I hergestellt. Schema I
In dem allgemeinen Schema wird Wortmannin (o) in einem Lösemittel suspendiert und mit einem Amin unter Bildung einer Verbindung (b) mit offenem Ring umgesetzt. Die Verbindung (b) zeigt im allgemeinen keine signifikante Aktivität als PI-3 Kinaseinhibitor (HK&sub5;&sub0; > 10 ng/ml). Die Verbindung (k) wird aus Verbindung (b) durch die Umsetzung mit einem tertiären Amin und einem Acryloylhalogenid und anschließend Dimethylamin und einer erneuten Bildung des Furanrings mit einer starken Säure im Lösemittel hergestellt. Die Verbindung (f) wird durch die Umsetzung der Verbindung (b) mit einer starken Säure in Gegenwart eines Lösemittels hergestellt. Die Reinigung der Verbindungen (k) und (f) wird durch gut bekannte Verfahren ausgeführt.
Die Verbindung (f) zeigt bei 10 ng/ml eine 50% Hemmung gegenüber der PI-3 Kinase. Die am meisten bevorzugten Verbindungen werden direkt oder indirekt aus der Verbindung (f) gemäß dem folgenden Schema II hergestellt: Schema II Schema IIa Schema IIb Schema IIc
Gemäß dem obigen Schema werden die bevorzugten Verbindungen (g), (h) und (i) direkt aus der Verbindung (f) durch die Umsetzung mit dem entsprechenden Säureanhydrid unter Bildung der 11-substituierten Wortmanninester hergestellt. Das Isovalerylderivat (iA) wird aus der Verbindung (f) durch die Umsetzung mit einem Isovalerylhalogenid hergestellt. Die Verbindung (c) wird durch Umsetzung der Verbindung (f) mit einem Oxidationsmittel unter Bildung des 11-Oxyderivats hergestellt. Die Verbindung (d) wird durch Reduktion der 17-Oxygruppe der Verbindung (f) zu einer Hydroxygruppe hergestellt.
Die Verbindung (n) wird durch Umsetzung der Verbindung (f) mit einem Phenylacetoxyhalogenid hergestellt. Die Verbindung (l) wird durch Umsetzung der Verbindung (f) mit einem Chloracetylhalogenid und die Verbindung (m) durch Umsetzung der Verbindung (f) mit einem Acyloxylhalogenid hergestellt.
Schließlich wird die Verbindung (e) durch die Reduktion der Verbindung (g) gebildet und die Verbindung (e) kann dann mit einem Säureanhydrid unter Bildung der Verbindung (j) umgesetzt werden. Eine detaillierte Beschreibung der oben beschriebenen Verfahren wird in der Beschreibung später geliefert.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch die Verwendung der Verbindungen als Inhibitoren der PI-3 Kinase. Um die Aktivität der erfindungsgemäßen Verbindungen zu zeigen, werden die folgenden Experimente durchgeführt:

Reinigung der Phosphatidylinositol-3-kinase

Die PI-3 Kinase kann durch mehrere Verfahren hergestellt werden. In einem Verfahren wird die PI-3 Kinase aus konfluenten Swiss 3T3 Zellen hergestellt, die man von der American Type Culture Collection, Rockville, MD erhält. Vor der Reinigung der PI-3 Kinase werden die Zellen in einer Stammkultur in Dulbecco's Modified Eagles Medium (DMEM, Sigma, St. Louis, MO) gehalten, das mit 10% fetalem Kälberserum versetzt ist, und werden mittels 0,25% Trypsin und 0,02% Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) passagiert. 24 · 10&sup6; Zellen auf vier 100 mm Kulturplatten werden mit 10 ml Hanks Balanced Salt Solution (ISS, Sigma) pH 7,4 gewaschen und die Zellen werden für eine Stunde in DMEM ohne fetalem Kälberserum gelassen, bevor sie für 15 Minuten mit 100 ng/ml des rekombinanten humanen BB Homodimers des von Blutplättchen stammenden Wachstumsfaktors (PDGF, Genzym Cambridge, MA) stimuliert werden. Das Medium wird angesaugt und die Zellen werden mit 10 ml HBSS gewaschen, bevor sie mit 3 ml 137 mM NaCl und 20 mM Tris (pH 8,0) lysiert werden, worin 1 mM MgCl&sub2;, 10% Glycerin, 1% Triton X-100 (Rohm und Haas, Philadelphia, PA), 2 ug/ml Leupeptin, 2 ug/ml Aprotonin, 1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) und 1 mM Natriumorthovanadat enthalten sind. Die Zellen werden von der Oberfläche der Platte abgekratzt und bei 6000 · g für 10 Minuten zentrifugiert. Der Überstand wird mit 50 ul gewaschenen IgG2bk Antiphosphotyrosinantikörperkügelchen (Upstate Biotechnology Inc., Lake Placid, NY) in 1,5 ml Röhrchen gemischt. Die Röhrchen werden verschlossen und für 2 Stunden bei 4ºC gerollt und die Kügelchen werden zweimal mit 1 ml HBSS gewaschen, worin 2 ug/ml Leupeptin, 4 ug/ml Aprotonin, 1 mM PMSF, 200 uM Adenosin und 1 mM Natriumorthovanadat enthalten sind. Die am Tyrosin phosphorylierte PI-3 Kinase wird von den Kügelchen mit 200 ul/Röhrchen 10 mM Tris (pH 7,5), 2 M NaCl, 1 mM EDTA, 200 uM Adenosin und 10 mM Natriumphenylphosphat eluiert.
In einem weiteren bevorzugten Verfahren wird die PI-3 Kinase aus Rinderhirn präpariert. Zwei Rinderhirne (Naßgewicht etwa 900 g) werden vom lokalen Schlachthaus innerhalb von Minuten nach dem Schlachten erhalten, auf Eis gepackt und innerhalb von einer Stunde homogenisiert. Die Gehirne werden vom überschüssigen Fett und Blutgefäßen befreit und dann mittels eines Tekmar Tissuemizer (Cincinnati, OH) bei 4ºC in 20 mM Tris (pH 8,3) homogenisiert, worin 250 mlvi Sacchharose, 6 mM β-Mercaptoethanol, 1 ug/ml Leupeptin, 1 ug/ml Pepstatin A, 0,4 mM PMSF und 1 mlvi MgCl&sub2; enthalten sind.
Nach der Zentrifugation für 60 Minuten bei 10000 · g wird der pH des Überstands (etwa 1200 ml) durch die tropfenweise Zugabe von 1 M Essigsäure bei 4ºC auf 5,75 verringert. Nach dem Rühren für weitere 15 Minuten bei 4ºC wird die Lösung für 60 Minuten bei 13500 · g zentrifugiert. Der Überstand wird verworfen. Die Pellets werden in Puffer A resuspendiert (20 mM Tris, pH 8,3, worin 6 mM β-Mercaptoethanol, 0,1 mM Ethylenglycolbis(β-aminoethylether)-N,N,N',N'-tetraessigsäure (EGTA), 1 ug/ml Leupeptin, 1 ug/ml Pepstatin A und 1 mM MgCl&sub2; enthalten sind) und auf eine Fast Flow Q Sepharose Säule (300 ml) mit einer Flußrate von 5 ml/min bei 4ºC aufgetragen. Nach dem Beladen wird die Säule mit 3 Volumina Puffer A gewaschen, worin 0,1 M KCl enthalten sind, und die Kinase wird dann mit einem linearen Gradienten von Puffer A/0,1 M KCl bis Puffer A/0,6 M KCl bei 3 ml/min über 7 Volumina eluiert.
Die Fraktionen werden mittels 10 ul der Fraktion und Phosphatidylinositol als Substrat wie unten beschrieben auf PI-3 Kinaseaktivität getestet. Die PI-4 Kinase eluiert im Durchlauf, die PI-3 Kinase eluiert bei etwa 0,3 M KCl. Der PI-3 Kinasepool wird einer 40% Ammoniumsulfatfällung unterzogen. Nach der Zentrifugation (60 Minuten bei 13500 · g) werden die Pellets in Puffer B (10 mM Kaliumphosphat, pH 7,4, worin 6 mM β- Mercaptoethanol, 1 ug/ml Leupeptin, 1 ug/ml Pepstatin A und 1 mM MgCl&sub2; enthalten sind) resuspendiert und auf eine 50 ml Hydroxylapatitsäule (Calbiochem, Inc. La Jolla, CA) mit 2,5 ml/Minute aufgetragen. Die Säule wird mit 150 ml Puffer B gewaschen, bis die A&sub2;&sub8;&sub0; Grundlinie 0 erreicht und dann wird die Kinase mit einem linearen Gradienten mit 10-320 mlvi KH&sub2;PO&sub4; bei 1 ml/Minute über 450 Minuten eluiert.
Die aktiven Fraktionen werden vereinigt und dann mit 3 ml/Minute auf eine Mono S Säule (8 ml) (Pharmacia, Inc., Piscataway, NJ) aufgetragen, die in Puffer C äquilibriert ist (50 mM MES, pH 6,2, worin 6 mM β-Mercaptoethanol, 0,1 mM EGTA, 1 ug/ml Leupeptin, 1 ug/ml Pepstatin A und 1 mM MgCl&sub2; enthalten sind). Die PI-3 Kinase wird mit einem linearen Gradienten von 0-0,4 M KCl in Puffer C über 120 Minuten eluiert. Beim Testen der Fraktionen werden routinemäßig zwei Pools der PI-3 Kinaseaktivität gefunden. Die Hauptmenge der Aktivität findet man im Durchlauf, während 20% der Aktivität im Gradienten eluiert werden. Obwohl das Material im Gradienten eine beträchtliche PI-4 Kinaseaktivität aufweist, ist im wesentlichen keine PI-4 Kinaseaktivität mit der PI-3 Kinase assoziiert, die im Durchfluß eluiert. Daher wird der Mono S Durchfluß durch Tangentialflußfiltration auf einer Mini-Ultrasette Omega 50 K Membran (Filtron, Inc., Northborough, MA) konzentriert und in Puffer C verdünnt, um die Leitfähigkeit zu verringern. Das Material wird dann erneut auf die Mono S Säule mittels der obigen Bedingungen aufgetragen. Die PI-3 Kinase bleibt während des Waschschritts an die Säule gebunden und eluiert im Gradienten. Man erhält zwei Pools der Phosphatidylinositolkinaseaktivität im Gradienten, wobei jede auf PI-3 Kinase und PI-4 Kinaseaktivität getestet wird. Der Pool I enthält 95% PI-3 Kinaseaktivität (und 5 % PI-4 Kinase) während Pool II vorwiegend PI-4 Kinaseaktivität enthält.
Der Pool I von der Mono S Säule wird mit Puffer A verdünnt und auf Mono Q (1 ml) verdünnt und mit einem Gradienten von 0-0,4 M KCl in Puffer A eluiert. Der schließliche Pool wird auf PI-3 Kinase- und PI-4 Kinaseaktivität getestet. Das Endprodukt enthält mehr als 99% PI-3 Kinaseaktivität.

Test der gereinigten PI-3 Kinaseaktivität

Die PI-3 Kinaseaktivität wird, wie vorher von W. F. Matter et al., Biochemical and Biophysical Research Communications, 186, 624-631 (1992) beschrieben, gemessen. Die Inhibitorkandidaten werden anfänglich in DMSO gelöst und dann zehnfach mit 50 mM HEPES Puffer pH 7,5 verdünnt, worin 15 mM MgCl&sub2; und 1 mM EGTA enthalten sind. Zehn Mikroliter dieser Lösung werden mit gereinigter PI-3 Kinase aus dem Rinderhirn (9 ul) und Phosphatidylinositol inkubiert (5 ul einer 2 mg/ml Stammlösung in 50 mM HEPES Puffer, pH 7,5, worin 1 mlvi EGTA enthalten sind). Das schließliche Reaktionsgemisch enthält 0,1-5 ng/ml Inhibitor und 3% DMSO (V : V). Diese DMSO Konzentration hat keinen Effekt auf die PI-3 Kinaseaktivität, wobei Kontrollreaktionsgemische 3% DMSO (V : V) ohne Inhibitor enthalten. Die Reaktanden werden 10 Minuten bei Umgebungstemperatur vorinkubiert und dann wird die Enzymreaktion bei der Zugabe von 1 ul [γ-³²P]-ATP gestartet (2 mCi/ml, 500 uM Stammlösung, 0,08 mCi/ml, 20 uM Endkonzentration, Dupont New England Nuclear, Boston, MA). Die Reaktion kann für 10 Minuten bei Umgebungstemperatur mit häufigem Mischen ablaufen, wonach die Reaktion durch die Zugabe von 40 ul 1 N HCl gestoppt wird. Die Lipide werden durch die Zugabe von 80 ul CHCl&sub3; : MeOH (1 : 1, V : V) extrahiert. Die Proben werden gemischt und zentrifugiert und die untere organische Phase wird auf eine Silicagel-DC-Platte (EM Science, Gibbstown, NJ) aufgetragen, die in CHCl&sub3; : MeOH : H&sub2;O : NH&sub4;OH (45 : 35 : 8,5 : 1,5, V : V) entwickelt wird. Die Platten werden getrocknet und die Kinasereaktion wird durch Autoradiographie sichtbargemacht. Die Phosphatidylinositol-3-monophosphatregion wird von der Platte abgekratzt und mittels Flüssigscintillationsspetrometrie mit ReadyProtein (Beckman Instruments, Inc., Fullerton, CA) als Scintillationscocktail quantifiziert. Das Maß der Hemmung für Wortmannin und Analoga wird als Prozentsatz der [³²P]- Zählungen pro Minute verglichen zur Kontrolle bestimmt.
Alternativ dazu werden die Produkte der PI-3 Kinasereaktion durch HPLC bestätigt, die von M. Whitman, Nature 332: 644-646 (1988) diskutiert wird. Die Phospholipide werden in Methylaminreagenz deacyliert und mittels einer Whatman Partisphere SAX Anionenaustauschchromatographie aufgetrennt, wie dies vorher von K. R. Auger, Cell, 57: 167-175 (1989) beschrieben wurde. Es wird ein Radiomatic Model A-140 Flo-One/Beta Online Radioaktivitätsdetektor verwendet, um die deacylierten [³²P]-Enzymprodukte zu verfolgen, wobei deacyliertes [³H]PI-4-Monophosphat als interner Standard zugegeben wird.
Auf der Grundlage dieser Experimente werden die folgenden HK&sub5;&sub0; Werte für die Hemmung der PI-3 Kinase erhalten.

Verbindung HK&sub5;&sub0; (ng/ml)

b > 10
c 1,6
d > 10
e 0,38
f 10
g 0,6
h 0,4
i(iA) 1,2(1,16)
j 56,5
k 8,6
l 1,3
m 0,95
n 1,53
Wie in der obigen Tabelle ersichtlich ist, zeigen die erfindungsgemäßen Verbindungen eine sehr starke Aktivität als hemmende Mittel der PI-3 Kinase. Da die PI-3 Kinaseaktivität mit der Bildung und dem Wachstum von verschiedenen Tumoren in Verbindung gebracht wurde, sowohl benignen als auch malignen, können die erfindungsgemäßen Verbindungen auch eine Brauchbarkeit als Antitumormittel haben.
Die vorliegende Erfindung liefert auch pharmazeutische Formulierungen, die die obigen Verbindungen und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger, Hilfsstoff oder Verdünnungsmittel enthalten. Es werden die folgenden Formulierungen betrachtet (Wirkstoff bezieht sich auf eine der erfindungsgemäßen Wortmanninverbindungen):

Formulierung 1

Hartgelatinekapseln werden unter Verwendung folgender Inhaltsstoffe hergestellt:

Menge

(mg/Kapsel)

Wirkstoff 250
Stärke, getrocknet 200
Magnesiumstearat 10
Gesamt 460 mg

Formulierung 2

Eine Tablette wird unter Verwendung der folgenden Inhaltsstoffe hergestellt:

Menge

(mg/Kapsel)

Wirkstoff 250
mikrokristalline Cellulose 400
pyrogen hergestelltes Siliciumdioxid 10
Stearinsäure 5
Gesamt 665 mg
Die Bestandteile werden vermischt und unter Bildung von Tabletten gepreßt, wobei jede 665 mg wiegt.

Formulierung 3

Eine Aerosollösung, die die folgenden Bestandteile enthält, wird hergestellt:

Gewicht

Wirkstoff 0,25
Ethanol 29,75
Propellant 22 (Chlordifluormethan) 70,00
Gesamt 100,00
Der Wirkstoff wird mit Ethanol gemischt und das Gemisch wird zu einem Teil Propellant 22 gegeben, auf -30ºC abgekühlt und in ein Abfüllgerät gegeben. Die erforderliche Menge wird anschließend in einen Edelstahlbehälter gefüllt und mit dem Rest des Propellants verdünnt. Die Ventileinheiten werden anschließend am Behälter angebracht.

Formulierung 4

Tabletten, die jeweils 60 mg des Wirkstoffs enthalten, werden folgendermaßen hergestellt:
Wirkstoff 60 mg
Stärke 45 mg
Mikrokristalline Cellulose 35 mg
Polyvinylpyrrolidon (als 10% Lösung in Wasser) 4 mg
Natriumcarboxymethylstärke 4,5 mg
Magnesiumstearat 0,5 mg
Talkum 1 mg
Gesamt 150 mg
Der Wirkstoff, die Stärke und die Cellulose werden durch ein Nr. 45 Mesh U. S. Sieb gegeben und sorgfältig vermischt. Die wäßrige Lösung, die Polyvinylpyrrolidon enthält, wird mit dem entstehenden Pulver vermischt und das Gemisch wird anschließend durch ein Nr. 14 Mesh U. S. Sieb gegeben. Die so hergestellten Granula werden bei 50ºC getrocknet und durch ein Nr. 18 Mesh U. S. Sieb gegeben. Die Natriumcarboxymethylstärke, das Magnesiumstearat und das Talkum werden, nachdem sie vorher durch ein Nr. 60 Mesh U. S. Sieb gegeben wurden, zu den Granula gegeben und nach dem Mischen in einer Tablettenmaschine unter Bildung von Tabletten gepreßt, die jeweils 150 mg wiegen.

Formulierung 5

Kapseln, die jeweils 80 mg des Wirkstoffs enthalten, werden folgendermaßen hergestellt:
Wirkstoff 80 mg
Stärke 59 mg
Mikrokristalline Cellulose 59 mg
Magnesiumstearat 2 mg
Gesamt 200 mg
Der Wirkstoff, die Cellulose, die Stärke und das Magnesiumstearat werden gemischt, durch ein Nr. 45 Mesh U. S. Sieb gegeben und in Hartgelatinekapseln in 200 mg Mengen abgefüllt.

Formulierung 6

Zäpfchen, die jeweils 225 mg des Wirkstoffs enthalten, werden folgendermaßen hergestellt:
Wirkstoff 225 mg
Gesättigte Fettsäureglyceride 2000 mg
Gesamt 2 225 mg
Der Wirkstoff wird durch ein Nr. 60 Mesh U. S. Sieb gegeben und in den gesättigten Fettsäureglyceriden suspendiert, die vorher bei möglichst geringer Hitze geschmolzen werden. Das Gemisch wird anschließend in eine Zäpfchenform mit einer nominalen Kapazität von 2 g gegossen und abgekühlt.

Formulierung 7

Suspensionen, die jeweils 50 mg des Wirkstoffs pro 5 ml Dosis enthalten, werden folgendermaßen hergestellt:
Wirkstoff 50 mg
Natriumcarboxymethylcellulose 50 mg
Sirup 1,25 ml
Benzoesäurelösung 0,10 ml
Geschmacksstoff q. v.
Farbstoff q. v.
Gereinigtes Wasser auf gesamt 5 ml
Der Wirkstoff wird durch ein Nr. 45 Mesh U. S. Sieb gegeben und mit Natriumcarboxymethylcellulose und Sirup vermischt, um eine glatte Paste zu erhalten. Die Benzoesäurelösung, der Geschmacksstoff und der Farbstoff werden mit einem Anteil Wasser vermischt, und unter Rühren zugegeben. Anschließend wird ausreichend Wasser zugegeben, um das erforderliche Volumen zu erhalten.

Formulierung 8

Eine intravenöse Formulierung kann folgendermaßen hergestellt werden:
Wirkstoff 100 mg
Isotonische Kochsalzlösung 1000 ml

Beispiel 1

Herstellung von Verbindung (b)

Zu einer Lösung aus 12,13 g Wortmannin in 700 ml Methanol werden 70 ml Diethylamin gegeben. Dieses Gemisch wird für 22 Stunden bei Raumtemperatur gerührt und dann unter verringertem Druck bei Raumtemperatur unter Bildung der Verbindung (b) mit offenem Ring eingedampft.

Vergleichsbeispiel 2

Herstellung von 11-Desacetylwortmannin (Verbindung (f))

Nach der Eindampfung wird der rohe Feststoff von (b) in 900 ml Dioxan gelöst, wonach eine Zugabe von 240 ml 1 N HCl erfolgt und für weitere 19 Stunden gerührt wird. Das Gemisch wird unter vernngertem Druck konzentriert, dann mit Wasser verdünnt und die wäßrige Phase wird mit Dichlormethan extrahiert. Das Dichlormethan wird über Natriumsulfat getrocknet und bei Raumtemperatur unter vernngertem Druck unter Bildung von 12,2 g roher Verbindung (f) verdampft. Diese rohe Verbindung wird durch Chromatographie auf Silicagel gereinigt, wobei mit 25% Hexan in Ethylacetat eluiert wird. 7,35 g (67% Ausbeute) der Titelverbindung werden als gelbes Glas erhalten.
Analyse für C&sub2;&sub1;H&sub2;&sub2;O&sub7;:
Berechnet: C 65,28, H 5,74
Gefunden: C 65,54, H 5,81

Beispiel 3

Herstellung von 11-Dimethylaminopropionyldesacetyl-Wortmannin

Eine Lösung aus 252,9 mg der Verbindung (b) in 10 ml wasserfreiem Dichlormethan wird mit 480 ul Diisopropylethylamin gefolgt von 223 ul Acryloylchlorid versetzt und für 3 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Das Lösemittel wird unter verringertem Druck unter Bildung eines klebrigen orangen Feststoffs verdampft. Dieses Rohmaterial wird in einem Eis/Acetonbad auf 5ºC abgekühlt. Eiskaltes Dimethylamin (5 ml) wird zum Gemisch gegeben und bei -5ºC für 1,25 Stunden gerührt. Das Gemisch kann sich auf Raumtemperatur erwärmen und das Dimethylamin wird abdestilliert. Der Rückstand wird durch Chromatographie auf Silicagel abgetrennt, wobei mit 10% Methanol in Dichlormethan und dann 20% Methanol in Dichlormethan in einem Einstufengradienten eluiert wird. Es werden zwei UV aktive Produkte isoliert und das Produkt mit dem geringeren Rf Wert wird in 11 ml Dioxan und 2,3 ml 1 N HCl gelöst und das Gemisch wird für 20 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Das Gemisch wird mit Ethylacetat verdünnt und mit gesättigtem Natriumhydrogencarbonat gewaschen. Die organischen Phasen werden abgetrennt und vereinigt, dann mit Kochsalzlösung gewaschen, mit Natriumsulfat getrocknet und bei Raumtemperatur unter verringertem Druck eingedampft. Das Rohprodukt wird durch Chromatographie auf Silicagel gereinigt, wobei mit 7% Methanol in Dichlormethan eluiert wird. 37,4 mg der Titelverbindung (14% Ausbeute) werden als helloranger Feststoff isoliert.

Beispiel 4

Herstellung von 11-Propionyldesacetyl-Wortmannin

Eine Lösung aus 483,6 mg der Verbindung (f) in 25 ml Pyridin wird mit 680 ul Propionsäureanhydrid versetzt und das Gemisch wird bei Raumtemperatur für 26 Stunden gerührt. Das Gemisch wird bei Raumtemperatur unter verringertem Druck eingedampft und der Rückstand durch Chromatographie auf Silicagel gereinigt, wobei mit 50% Hexan in Ethylacetat eluiert wird. Dies ergibt 512,8 mg der Titelverbindung (Ausbeute 93%) als nicht ganz weißen Feststoff.
Analyse für C&sub2;&sub4;H&sub2;&sub6;O&sub8;:
Berechnet: C 65,15, H 5,92
Gefunden C 65,07, H 5,96.

Beispiel 5

Herstellung von 11,17-Desacetyldihydro-Wortmannin

100 mg der Verbindung (f) werden mit 250 ul 1 M Boran in 3,5 ml wasserfreiem Tetrahydrofuran unter einer Stickstoffatmosphäre umgesetzt, 250 ul 1 M Boran werden zugegeben und das Gemisch wird bei 0ºC für 2,5 Stunden gerührt. Die Umsetzung wird durch die Zugabe von 1 ml Wasser bei 0ºC gestoppt, dann kann sie sich auf Raumtemperatur erwärmen, wird dann mit Wasser verdünnt und mit Ethylacetat extrahiert. Das Ethylacetat wird mit Kochsalzlösung gewaschen, mit Natriumsulfat getrocknet und dann unter Bildung von 65,8 mg der Titelverbindung (65% Ausbeute) als weißer Feststoff gewaschen und gereinigt.

Beispiel 6

Herstellung von 11-Propionyl-17-acetyldesacetyldihydro-Wortmannin

Zu einer Lösung aus 104,9 mg der in Beispiel 13 hergestellten Verbindung (e) in 5 ml Pyridin werden 95 ul Essigsäureanhydrid gegeben. Das Gemisch wird für 27 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Das Gemisch wird dann eingedampft und der Rückstand wird durch Chromatographie auf Silicagel gereinigt, wobei mit 40% Ethylacetat in Hexan unter Bildung von 89,9 mg der Titelverbindung (Ausbeute 77%) als weißer Feststoff eluiert wird.
Analyse für C&sub2;&sub6;H&sub3;&sub0;O&sub9;:
Berechnet: C 64,19, H 6,22
Gefunden C 64,43, H 6,31.
Die in den Beispielen 7-14 hergestellten Verbindungen werden alle direkt aus der Verbindung (f) hergestellt (11-Desaceytl-Wortmannin).

Beispiel 7

Herstellung von 11-Phenylacetyldesacetyl-Wortmannin

Zu einer Lösung aus 100,2 mg der Verbindung (f) in 8 ml wasserfreiem Dichlormethan werden 150 ul Diisopropylethylamin gefolgt von 120 ul Phenylacetylchlorid gegeben und das Gemisch wird für 23 Stunden gerührt. Das Gemisch wird mit Dichlormethan verdünnt und mit gesättigtem Natriumhydrogencarbonat gewaschen. Das Dichlormethan wird mit Kochsalzlösung gewaschen, mit Natriumsulfat getrocknet und unter vernngertem Druck unter Bildung von 214,6 mg Rohprodukt eingedampft, das durch Chromatographie auf Silicagel gereinigt wird, wobei mit 50% Hexan in Ethylacetat eluiert wird. 81,4 mg der Titelverbindung (Ausbeute 62%) werden als hellgelbes Glas gewonnen.

Beispiel 8

Herstellung von 11-Acrylyldesacetyl-Wortmannin

476,7 mg der Verbindung (f) werden mit Acryloylchlorid umgesetzt, wie dies in Beispiel 7 beschrieben ist und wie beschrieben unter Bildung von 470 mg der Titelverbindung (Ausbeute 87%) als hellgelber Feststoff gereinigt.
Analyse für C&sub2;&sub4;H&sub2;&sub4;O&sub8;:
Berechnet: C 65,45, H 5,49
Gefunden C 65,19, H 5,70.

Beispiel 9

Herstellung von 11-Chloracetyldesacetyl-Wortmannin

442,8 mg der Verbindung (f) werden mit Chloracetylchlorid umgesetzt, wie dies in Beispiel 7 beschrieben ist. Nach dem Waschen und Reinigen erhält man 200,1 mg der Titelverbindung (Ausbeute 38%) als hellgelben Feststoff.
Analyse für C&sub2;&sub3;H&sub2;&sub3;O&sub8;Cl
Berechnet: C 59,68, H 5,01
Gefunden C 59,66, H 5,06.

Beispiel 10

Herstellung von 11-Isovaleryldesacetyl-Wortmannin

479,9 mg der Verbindung (f) werden mit Isovaleriansäurechlorid wie in Beispiel 7 beschrieben umgesetzt. Nach dem Waschen und Reinigen erhält man 350,3 mg der Titelverbindung (Ausbeute 60%) als hellorangen Feststoff.

Beispiel 11

Herstellung von 11-Valeryldesacetyl-Wortmannin

454,1 mg der Verbindung (f) werden mit Valeriansäureanhydrid wie in Beispiel 4 beschrieben umgesetzt und dann unter Bildung von 517,7 mg der Titelverbindung (Ausbeute 93%) als weißer Feststoff gereinigt.
Analyse für C&sub2;&sub6;H&sub3;&sub0;O&sub8;:
Berechnet: C 66,37, H 6,43
Gefunden C 66,53, H 6,60.

Beispiel 12

Herstellung von 11-Butyryldesacetyl-Wortmannin

457,5 mg der Verbindung (f) werden mit Butanylanhydrid umgesetzt, wie dies in Beispiel 4 beschrieben ist und dann unter Bildung von 486,6 mg der Titelverbindung (Ausbeute 90%) als weißer Feststoff gereinigt.
Analyse für C&sub2;&sub5;H&sub2;&sub8;O&sub8;:
Berechnet: C 65,78, H 6,18
Gefunden C 65,52, H 6,38.

Beispiel 13

Herstellung von 11-Propionyl-17-hydroxydesacetyldihydro-Wortmannin

Zu einer eiskalten Lösung aus 345 mg der im obigen Beispiel 4 hergestellten Verbindung (g) in 3,5 ml wasserfreiem Tetrahydrofuran werden unter einer Stickstoffatmosphäre 250 ul 1 M Boran gegeben und das Gemisch wird bei 0ºC für 2,5 Stunden gerührt. Die Reaktion wird durch die Zugabe von 1 ml Wasser bei 0ºC gestoppt, kann sich dann auf Raumtemperatur erwärmen, wird mit Wasser verdünnt und mit Ethylacetat extrahiert. Das Ethylacetat wird mit Kochsalzlösung gewaschen, mit Natriumsulfat getrocknet und wie oben beschrieben unter Bildung von 309,9 mg der Titelverbindung (Ausbeute 89%) als hellgelber Feststoff gereinigt.
Analyse für C&sub2;&sub4;H&sub2;&sub8;O&sub8;:
Berechnet: C 64,85, H 6,35
Gefunden C 64, 65, H 6,38.
Andere Verbindungen der allgemeinen Formel (I) können unter Verwendung eines der oben beschriebenen Verfahren und einer Modifizierung des Verfahrens auf eine gut bekannte Weise hergestellt werden. Es ist voraussehbar, daß ein Fachmann leicht jede der Verbindungen der Formel (I) herstellen kann, indem er einfach eines der obigen allgemeinen Schemata befolgt.

Claims

1. Verbindung der Formel

worin

R&sub1; für oder OR&sub3; steht,

R&sub2; für oder OR&sub3; steht,

jedes R&sub3; einzeln steht für Wasserstoff; C&sub3;-C&sub5; Acyl, wobei das C&sub3;-C&sub8; Acyl eine C&sub2;-C&sub7; Alkylgruppe ist, die an eine Carbonylgruppe gebunden ist, wobei die C&sub2;-C&sub7; Alkylgruppe wahlweise substituiert ist mit Halogenatomen, Aminogruppen und Alkylidengruppen, oder

Arylacyl, wobei das Arylacyl ein Aryl oder eine substituierte Arylgruppe ist, die an eine Acylgruppe gebunden ist und die Arylgruppe Phenyl, Naphthyl, Fluorenyl, Anthracyl oder Phenanthryl ist, das wahlweise substituiert ist mit einem oder mehreren Resten, die ausgewählt sind aus der Gruppe, welche besteht aus Halogen, Hydroxy, Cyano, Nitro, C&sub1;-C&sub6; Alkyl, C&sub1;-C&sub4; Alkoxy, Carboxy, Acetyl, Formyl, Carboxymethyl, Hydroxymethyl, Amino, Aminoethyl oder Trifluormethyl, und

R&sub2; nicht für steht, falls R&sub1; für oder OH steht.

2. Verbindung nach Anspruch 1, worin

R&sub1; für O-Acyl steht und

R&sub2; für steht.

3. Verbindung nach Anspruch 1, worin R&sub1; für OR&sub3; steht.

4. Verbindung nach Anspruch 3, worin R&sub3; für C&sub3;-C&sub8; Acyl oder substituiertes Acyl steht.

5. Verbindung nach Anspruch 1 mit der allgemeinen Formel

worin R&sub1; für O-C&sub3;-C&sub8;-Acyl oder O-substituiertes C&sub2;-C&sub8; Acyl steht und

R&sub2; für # oder OH steht.

6. Verbindung nach Anspruch 5, worin R&sub1; für O-C&sub3;-C&sub8; Acyl steht.

7. Verbindung nach Anspruch 1 der Formel

8. Verbindung nach Anspruch 1 der Formel

9. Verbindung nach Anspruch 1 der Formel

10. Verbindung nach Anspruch 1 der Formel

11. Verbindung nach Anspruch 1 der Formel

12. Verbindung nach Anspruch 1 der Formel

13. Verbindung nach Anspruch 1 der Formel

14. Verbindung nach Anspruch 1 der Formel

15. Verbindung nach Anspruch 1 der Formel

16. Verbindung nach Anspruch 1 der Formel

17. Pharmazeutische Formulierung, die eine wirksame Menge der Verbindung nach Anspruch 1 und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger, Verdünnungsmittel oder Hilfsstoff enthält.

18. Verwendung einer Verbindung nach Anspruch 1 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Verwendung als PI-3 Kinaseinhibitor.

19. Verwendung einer Verbindung nach Anspruch 1 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Krebs.