ES2378780T3 - Metabolitos de análogos de wortmanina y métodos de uso de los mismos - Google Patents

Abstract

Una composición farmacéutica que comprende una cantidad eficaz de un compuesto de la fórmula:**Fórmula** y uno de sus vehículos, diluyentes o excipientes farmacéuticamente aceptables.

Description

Metabolitos de analogos de wortmanina y metodos de uso de los mismos

ANTECEDENTES

La presente divulgaci6n se refiere a analogos de wortmanina y sus metabolitos, y tiene aplicaci6n en metodos para 5 usar estos derivados para inhibir la actividad de fosfotidilinositol-3-quinasa (PI-3-quinasa) y para tratar ciertos tumores malignos.

Las PI-3 quinasas son una familia de enzimas relacionadas que son capaces de fosforilar el grupo hidroxilo en la posici6n 3 del anillo de inositol del fosfatidilinositol. Estan ligadas a una lista diversa de funciones celulares, incluyendo el crecimiento, la proliferaci6n, la diferenciaci6n, la movilidad, la supervivencia celulares y el trafico 10 intracelular. Muchas de estas funciones se refieren a la capacidad de las PI-3 quinasas para activar la protefna quinasa B (Akt). La desactivaci6n farmacol6gica y genetica de la isoforma p110a de la PI-3 quinasa ha revelado que esta enzima es importante para la funci6n de celulas T, celulas B, celulas cebadas y neutr6filos. De ahf que se considere que p110a es una diana prometedora para farmacos que se dirigen a prevenir o tratar la inflamaci6n y la autoinmunidad y el rechazo de trasplantes. La evidencia reciente ha mostrado que el gen que codifica la isoforma 15 p110a de la PI-3 quinasa esta mutado en una gama de canceres humanos. Por ejemplo, la mutaci6n de p110a que conduce a la sobreexpresi6n de la quinasa se encuentra en el cancer de pulm6n humano. Tambien se encuentra que la actividad de PI-3 quinasa es elevada en canceres ovaricos, de cabeza y cuello, del tracto urinario, de colon y cervicales. Ademas, una fosfatasa (Ptdlns(3,4,5)P3) que antagoniza la actividad de PI-3 quinasa esta ausente o esta mutada en una variedad de canceres humanos, incluyendo canceres avanzados de pr6stata, endometriales, renales,

20 gliales, melanoma y pulmonares microcfticos. Asf, la inhibici6n de la actividad de PI-3 quinasa puede proporcionar una diana potencial para el tratamiento de ciertos canceres humanos.

La wortmanina es un compuesto presente en la naturaleza aislado de caldos de cultivo del hongo Penicillium Worlmannin que tiene la estructura basica mostrada en la Patente de EE. UU. N° 5.480.906. La wortmanina inhibe irreversiblemente Pl-3-quinasa a traves de la interacci6n covalente con una lisina especffica sobre la quinasa: Lys802 25 del bolsillo que se une a ATP del sitio catalftico de la isoforma p110a o Lys883 de la isoforma p110a. La mayorfa de las isoformas de PI-3 quinasa, tales como p110a, p110r, p110a y p110γ, por ejemplo, son inhibidas igualmente por la wortmanina. Sin embargo, la wortmanina demuestra toxicidad hepatica y hematol6gica, y es una molecula biol6gicamente inestable. Muestras almacenadas como soluciones acuosas bien a 37°C o bien a 0°C a pH neutro estan sometidas a descomposici6n por apertura hidrolftica del anillo de furano. Se ha mostrado que la electrofilia del

30 anillo de furano es fundamental para la actividad inhibidora de la wortmanina. La inhibici6n irreversible de Pl-3quinasa se produce mediante la formaci6n de una enamina despues del ataque de la lisina activa de la quinasa en el anillo de furano en la posici6n C(20) de la wortmanina. Asf, la descomposici6n de la wortmanina puede interferir con su actividad inhibidora sobre Pl-3 quinasas.

Analogos de wortmanina que presentan estabilidad biol6gica mejorada y toxicidad sistemica reducida pueden

35 proporcionar un tratamiento mejorado para el cancer y actuar como agentes antitumorales. De acuerdo con esto, lo que se necesita son analogos de wortmanina y sus metabolitos que presenten estabilidad biol6gica incrementada y toxicidad reducida.

W02007/008200 divulga metabolitos de PX-866, pero no sugiere que tales compuestos puedan formularse como una composici6n farmaceutica.

40 W0 2006/044453 divulga 17-hidroxi-PX-867.

W0 2003/024183 describe analogos de wortmanina que tienen un grupo ceto en la posici6n 17 para el uso en el tratamiento del cancer, y EP 658343 describe otros analogos de 17-hidroxi-wortmanina.

G: SUMARI0

La presente divulgaci6n se refiere a metabolitos de wortmanina y metabolitos de analogos de wortmanina y a su uso 45 para inhibir PI-3 quinasa, tratar y prevenir el crecimiento de tumores y tratar el cancer.

Una realizaci6n de la divulgaci6n proporciona un compuesto de estructura 10:

Una realizaci6n adicional de la divulgaci6n proporciona un compuesto de estructura 9:

0tra realizaci6n de la divulgaci6n proporciona utilidad para inhibir la actividad de PI-3 quinasa en mamfferos que

5 comprende administrar a un mamffero una cantidad eficaz del compuesto de estructura 10. Una realizaci6n adicional de la divulgaci6n proporciona utilidad para inhibir la actividad de PI-3 quinasa en mamfferos que comprende administrar a un mamffero una cantidad eficaz del compuesto de estructura 9.

0tra realizaci6n de la divulgaci6n proporciona un metodo para inhibir la actividad de PI-3 quinasa en una celula, que comprende poner en contacto la celula con el compuesto de estructura 10, con lo que el compuesto inhibe la PI-3

10 quinasa. Una realizaci6n adicional de la divulgaci6n proporciona un metodo para inhibir la actividad de PI-3 quinasa en una celula, que comprende poner en contacto la celula con el compuesto de estructura 9, con lo que el compuesto inhibe la PI-3 quinasa.

Puesto que la actividad de PI-3 quinasa puede ser un factor en ciertos tipos de canceres, la presente divulgaci6n tambien proporciona el uso de los compuestos como agentes antitumorales, agentes anticancerosos, y el uso de 15 composiciones farmaceuticas utiles para el tratamiento de tales tumores o canceres. Como tal, una realizaci6n adicional de la divulgaci6n proporciona el tratamiento del cancer, que comprende administrar a un sujeto una cantidad terapeuticamente eficaz del compuesto de estructura 10. El cancer tratado mediante el compuesto de estructura 10 puede ser cancer de colon. 0tra realizaci6n de la divulgaci6n proporciona utilidad en el tratamiento del cancer, que comprende administrar a un sujeto una cantidad terapeuticamente eficaz del compuesto de estructura 9.

20 El cancer tratado mediante el compuesto de estructura 9 puede ser cancer de colon.

Realizaciones de la divulgaci6n tambien proporcionan una composici6n farmaceutica que comprende una cantidad eficaz del compuesto de estructura 10, y uno de sus vehfculos, diluyentes o excipientes farmaceuticamente aceptables. Realizaciones adicionales de la divulgaci6n proporcionan una composici6n farmaceutica que comprende una cantidad eficaz del compuesto de estructura 9, y uno de sus vehfculos, diluyentes o excipientes

25 farmaceuticamente aceptables.

Los compuestos de la invenci6n pueden usarse para tratar la proliferaci6n de celulas tumorales o el crecimiento de celulas tumorales, comprendiendo administrar a un sujeto una cantidad eficaz de un compuesto de estructura 10 o de un compuesto de estructura 9.

H: BREVE DESCRIPCION DE L0S DIBUJ0S Para una mejor comprensi6n de la divulgaci6n y para mostrar como puede hacerse efectiva la misma, se hara referencia ahora a los dibujos adjuntos. Se subraya que los pormenores mostrados son solo a modo de ejemplo y solo con prop6sitos de un analisis ilustrativo de las realizaciones preferidas de la presente divulgaci6n, y se presentan debido a lo que se cree que es la descripci6n mas util y facilmente entendida de los principios y los aspectos conceptuales de la invenci6n. A este respecto, no se intentan mostrar detalles experimentales de la invenci6n con mas detalle del que es necesario para una comprensi6n fundamental de la invenci6n, la descripci6n tomada con los dibujos haciendo evidente para los expertos en la especialidad c6mo pueden encarnarse en la practica las varias formas de la invenci6n. En los dibujos adjuntos:

La FIG.� ilustra f6rmulas para estructuras de un analogo de wortmanina y metabolitos comparativos.

La FIG.� ilustra f6rmulas para estructuras de un analogos de wortmanina y metabolitos comparativos.

La FIG. 3 ilustra f6rmulas para estructuras del analogo de wortmanina PX-866 y metabolitos de acuerdo con la presente divulgaci6n.

La FIG. 4 ilustra la estabilidad relativa del analogo de wortmanina PX-866 cuando se almacena a una concentraci6n de 1 mg/ml durante 24 horas en diversos sistemas tamponadores.

La FIG. 5 ilustra un perfil de separaci6n de cromatograffa lfquida de resoluci6n ultraalta (UPLC) para PX-866 en metanol. Una inyecci6n de 2 ng de PX-866 (en 2 1l) se eluye como un pico a los 0,742 minutos que esta muy separado de la lfnea de referencia. La relaci6n de senal a ruido esta por encima de 10.000. La respuesta del detector estaba saturada y, por encima de 2,0 unidades de absorbancia, era a escala completa. La anchura del pico a la semialtura es < 2 segundos.

La FIG. 6A ilustra la absorbancia unica para PX-866 entre 300-340 nm. Las espectrograffas UV muestran un intervalo de absorbancia UV para PX-866 con un maximo de λ a 310 nm (parte superior), en comparaci6n con una matriz en blanco sin pico correspondiente (parte inferior).

La FIG. 68 ilustra un perfil de separaci6n de cromatograffa lfquida de alta resoluci6n (HPLC) para PX-866 segun se detecta a la longitud de onda maxima de 310 nm. Una inyecci6n de 5,3 nMol mostraba un tiempo de retenci6n para PX-866 de 8,68 min. No se observan picos por encima de la lfnea de referencia a ese tiempo de retenci6n para una inyecci6n de blanco.

La FIG.�6C ilustra la identificaci6n de metabolitos de PX-866 mediante un perfil de separaci6n de HPLC (detectado a 310 nm). Pueden identificarse cuatro metabolitos (M N° 1-4), despues de la terminaci6n de una incubaci6n de 60 minutos. El area del pico de absorbancia UV es la mayor para el metabolito N° 1 (tiempo de retenci6n del M N° 1 en la columna (TR) = 8,55 min) en comparaci6n con los picos de eluci6n previos, M N° 2 (TR = 6,86 min), M N° 3 (TR = 6,54 min), y el M N° 4 que se eluye posteriormente (TR = 9,47 min).

La FIG. 6D ilustra perfiles de espectros de masas de metabolitos de wortmanina identificados mediante la separaci6n por HPLC mostrada en la FIG.�6C. La m/z de los M N° 1-2 es 528,2690, M N° 3 es 528,2783 y M N° 4 es 468,2399 despues del analisis mediante cromatograffa de masas/espectrometrfa de masas de tiempo de vuelo (LC/MS-T0F).

La FIG. 7A ilustra la capacidad de dos metabolitos de un analogo de wortmanina (PX-866) de la presente divulgaci6n para inhibir la activaci6n dependiente del factor de crecimiento epidermico de Akt que se mide en celulas de cancer de colon HT-29. Se muestra una hibridaci6n western usando anticuerpos anti-fosfo-Ser473-Akt.

La FIG. 78 ilustra la capacidad de dos metabolitos de un analogo de wortmanina (PX-866) de la presente divulgaci6n para inhibir la activaci6n dependiente del factor de crecimiento epidermico de Akt que se mide en celulas de cancer de colon HT-29. Se muestran datos cuantificados procedentes de una exploraci6n densitometrica de la hibridaci6n western de la FIG. 7A expresados como una relaci6n de fosfo-Ser473-Akt a Akt total como un porcentaje frente al control sin farmaco: ( ) 17-hidroxi-PX-866 (PX-866-2) y (�) 11-desacetilado,17-hidroxi-PX-866 (PX-866-1).

La FIG. 8 ilustra la citotoxicidad de metabolitos de PX-866 (PX-866-1 y PX-866-2) de la presente divulgaci6n para celulas de cancer de colon HT-29: (�) PX-866; ( ) PX-866-2; (�) PX-866-1.

La FIG. 9A ilustra la inhibici6n de la senalizaci6n de PI-3 quinasa recombinante (p110a/p85a bovina recombinante) mediante PX-866 y sus metabolitos: (�) PX-866, (�) wortmanina, ( ) PX-866-2o(�) PX-866-1.

La FIG. 98 ilustra la inhibici6n de la senalizaci6n de PI-3 quinasa recombinante (p110a/p85a bovina recombinante)

mediante PX-866 y sus metabolitos: (�) PX-866, (�) wortmanina, ( ) PX-866-2o(�) PX-866-1.

I: DESCRIPCION DETALLADA

Antes de que se describan las composiciones y los metodos presentes, ha de entenderse que esta invenci6n no esta limitada a los procedimientos, las composiciones o las metodologfas particulares descritos, ya que estos pueden variar. Tambien ha de entenderse que la terminologfa usada en la descripci6n tiene el prop6sito de describir solamente las versiones o realizaciones particulares, y no esta destinada a limitar el alcance de la presente invenci6n que solo estara limitado por las reivindicaciones adjuntas.

Tambien debe apuntarse que, segun se usan en la presente memoria y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un", "uno(a)", y "el (la)" incluyen la referencia plural a menos que el contexto dicte claramente otra cosa. Asf, por ejemplo, la referencia a una "celula" es una referencia a una o mas celulas y sus equivalentes conocidos por los expertos en la especialidad, etc. A menos que se defina otra cosa, todos los terminos tecnicos y cientfficos usados en la presente memoria tienen los mismos significados que son entendidos comunmente por un experto normal en la especialidad. Aunque cualesquiera metodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en la presente memoria pueden usarse en la practica o las pruebas de las realizaciones de la presenta invenci6n, se describen ahora los metodos, dispositivos y materiales preferidos.

Segun se usa en la presente memoria, el termino "aproximadamente" significa mas o menos 10% del valor numerico del numero con el que se esta usando. Por lo tanto, aproximadamente 50% significa en el intervalo de 45%-55%. Puede considerarse que "opcional" u "opcionalmente" significa que la estructura, el episodio o la circunstancia descritos subsiguientemente pueden o no presentarse, y que la descripci6n incluye casos en los que los episodios se presentan y casos en los que no.

"Administrar", cuando se usa junto con un agente terapeutico, significa administrar un agente terapeutico sistemicamente o localmente, como directamente dentro de o sobre un tejido diana, o administrar un agente terapeutico a un paciente, con lo que el agente terapeutico impacta positivamente en el tejido al que se dirige. Asf, segun se usa en la presente memoria, el termino "administrar", cuando se usa junto con un analogo de wortmanina o su metabolito, puede incluir, pero no se limita a, proporcionar un analogo de wortmanina o su metabolito sistemicamente a un paciente mediante, p. ej., inyecci6n intravenosa, con lo que el agente terapeutico alcanza el tejido o las celulas diana. "Administrar" una composici6n puede realizarse mediante inyecci6n, administraci6n t6pica y administraci6n oral o mediante otros metodos solos o en combinaci6n con otras tecnicas conocidas. Tales tecnicas de combinaci6n incluyen calentamiento, radiaci6n y ultrasonidos.

El termino "animal", segun se usa en la presente memoria, incluye, pero no se limita a, seres humanos y vertebrados no humanos tales como animales salvajes, domesticos y de granja. Los terminos "paciente" y "sujeto" son intercambiables y puede considerarse que significan cualquier organismo vivo que pueda ser tratado con compuestos de la presente divulgaci6n. Como tales, los terminos "paciente" y "sujeto" pueden incluir, pero no se limitan a, cualquier mamffero no humano, cualquier primate o un ser humano.

El termino "inhibir" incluye la administraci6n de un compuesto de la presente divulgaci6n para evitar el comienzo de sfntomas, atenuar sfntomas o eliminar la enfermedad, afecci6n o trastorno.

Por "farmaceuticamente aceptable", se entiende que el vehfculo, diluyente o excipiente debe ser compatible con los otros ingredientes de la formulaci6n y no perjudicial para su receptor.

El termino "composici6n farmaceutica" significara una composici6n que comprende al menos un ingrediente activo, con lo que la composici6n es susceptible de investigaci6n con respecto a un resultado eficaz especificado en un mamffero (por ejemplo, sin limitaci6n, un ser human). Los expertos normales en la especialidad entenderan y apreciaran las tecnicas apropiadas para determinar si un ingrediente activo tiene un resultado eficaz deseado basandose en las necesidades del especialista.

Segun se usa en la presente memoria, el termino "agente terapeutico" significa un agente utilizado para tratar, combatir, atenuar, prevenir o mejorar una afecci6n o enfermedad de un paciente no deseada. En parte, las realizaciones de la presente divulgaci6n se dirigen al tratamiento del cancer o la disminuci6n en la proliferaci6n de celulas.

Una "cantidad terapeuticamente eficaz" o "cantidad eficaz", segun se usa en la presente memoria, se refiere a la cantidad de compuesto activo o agente farmaceutico que provoca una respuesta biol6gica o medicinal en un tejido, sistema, animal, individuo o ser humano que este siendo buscada por un investigador, veterinario, doctor en medicina u otro clfnico, que incluye una o mas de las siguientes: (1) prevenir la enfermedad; por ejemplo, prevenir una enfermedad, afecci6n o trastorno en un individuo que pueda estar predispuesto a la enfermedad, afecci6n o

trastorno pero que no experimenta o presenta ya la patologfa o sintomatologfa de la enfermedad, (2) inhibir la enfermedad; por ejemplo, inhibir una enfermedad, afecci6n o trastorno en un individuo que esta experimentando o presentando la patologfa o sintomatologfa de la enfermedad, afecci6n o trastorno (es decir, detener el desarrollo adicional de la patologfa y/o sintomatologfa), y (3) atenuar la enfermedad: por ejemplo, atenuar una enfermedad, afecci6n o trastorno en un individuo que esta experimentando o presentando la patologfa o sintomatologfa de la enfermedad, afecci6n o trastorno (es decir, invertir la patologfa y/o sintomatologfa). Como tal, un ejemplo no limitativo de una "cantidad terapeuticamente eficaz" o "cantidad eficaz" de una composici6n de la presente divulgaci6n puede usarse para inhibir, bloquear o invertir la activaci6n, migraci6n o proliferaci6n de celulas o para tratar eficazmente el cancer o atenuar los sfntomas del cancer.

La actividad contemplada por los presentes metodos incluye tratamiento terapeutico y/o profilactico medico, segun sea apropiado. La dosis especffica de un compuesto administrado de acuerdo con esta invenci6n para obtener efectos terapeuticos y/o profilacticos, por supuesto, estara determinada por las circunstancias particulares que rodeen el caso, incluyendo, por ejemplo, el compuesto administrado, la ruta de administraci6n y la afecci6n que se trate. Los compuestos son eficaces a lo largo de un amplio intervalo de dosificaci6n y, por ejemplo, las dosificaciones diarias estaran normalmente dentro del intervalo de 0,001 a 100 mg/kg, mas habitualmente en el intervalo de 0,01 a 1 mg/kg. Sin embargo, se entendera que la cantidad eficaz administrada sera determinada por el medico a la luz de las circunstancias pertinentes, incluyendo la afecci6n que ha de tratarse, la elecci6n del compuesto que ha de administrarse y la ruta de administraci6n elegida, y por lo tanto los intervalos de dosificaci6n anteriores no pretenden limitar de ningun modo el alcance de la invenci6n. Una cantidad terapeuticamente eficaz de compuesto de esta invenci6n es tfpicamente una cantidad tal que, cuando se administra en una composici6n de excipiente fisiol6gicamente tolerable, es suficiente para alcanzar una concentraci6n sistemica o concentraci6n local eficaz en el tejido.

Los terminos "tratar", "tratado" o "tratando", segun se usan en la presente memoria, se refieren tanto a tratamiento terapeutico como a medidas profilacticas o preventivas, en donde el objetivo es prevenir o frenar (aminorar) una afecci6n, trastorno o enfermedad fisiol6gicos no deseados, o para obtener resultados clfnicos beneficiosos o deseados. Para los prop6sitos de esta invenci6n, resultados clfnicos beneficiosos o deseados incluyen, pero no se limitan a, alivio de sfntomas; disminuci6n de la extensi6n de la afecci6n, trastorno o enfermedad; estabilizaci6n (es decir, no empeoramiento) del estado de la afecci6n, trastorno o enfermedad; retardo en el comienzo o frenado del avance de la afecci6n, trastorno o enfermedad; atenuaci6n del estado de la afecci6n, trastorno o enfermedad; y remisi6n (ya sea parcial o total), ya sea detectable o indetectable, o mejorfa o mejora de la afecci6n, trastorno o enfermedad. Tratamiento incluye provocar una respuesta clfnicamente significativa sin niveles excesivos de efectos secundarios. Tratamiento tambien incluye prolongar la supervivencia en comparaci6n con la supervivencia esperada si no se recibe tratamiento.

Realizaciones de la presente invenci6n proporcionan nuevos metabolitos de wortmanina y metabolitos de analogos de wortmanina asf como metodos para inhibir el cancer en un sujeto, comprendiendo administrar a un sujeto una cantidad farmaceuticamente eficaz de tales analogos de wortmanina y metabolitos de wortmanina y analogos de wortmanina.

0tras realizaciones de la presente invenci6n tambien proporcionan metodos para inhibir la actividad de Pl-3-quinasa en mamfferos mediante la administraci6n de una cantidad eficaz de uno de los compuestos de esta divulgaci6n. Puesto que la actividad de PI-3-quinasa es un factor en ciertos tipos de cancer, la invenci6n tambien proporciona el uso de los compuestos como agentes anticancerosos (antitumorales), y composiciones farmaceuticas que incluyen los compuestos en combinaci6n con vehfculos, excipientes o diluyentes farmaceuticamente aceptables.

La FIG.� ilustra f6rmulas comparativas para analogos de wortmanina ejemplares y sus metabolitos que pueden ser utiles de acuerdo con la presente invenci6n. La formulaci6n de analogos de wortmanina es muy conocida en la especialidad, como lo es el proceso de fermentaci6n. Un experto normal en la especialidad puede usar esquemas sinteticos y de sfntesis para formular compuestos de f6rmula 1, 2 o 3 en la FIG.�0, segun se muestra.

Formula�

en la que R1 y R2 son alquilo insaturado, alquilo saturado, alquilo no lineal, alquilo ramificado, alquilo sustituido o alquilo cfclico;

Formula�

en la que R1 y R2 son alquilo insaturado, alquilo saturado, alquilo no lineal, alquilo ramificado, alquilo sustituido o alquilo cfclico;

Formula3

10 en la que R1 y R2 son alquilo insaturado, alquilo saturado, alquilo no lineal, alquilo ramificado, alquilo sustituido o alquilo cfclico.

Compuestos comparativos adicionales tienen una estructura qufmica correspondiente a un compuesto seleccionado del grupo que consiste en los compuestos representados por las estructuras 4-7, segun se muestra en la FIG.��.

Estructura�4(wortmanina)

Estructura�5 (17-hidroxil-wortmanina)

Estructura�6 (PX-867)

Estructura�7 (17-hidroxil-PX-867)

Los compuestos de la presente divulgaci6n tienen una estructura qufmica correspondiente a un compuesto seleccionado del grupo que consiste en los compuestos representados por las estructuras 9-10, segun se muestra en la FIG.�3. El Compuesto 8 es comparativo.

Estructura�8 (PX-866)

Estructura�9 (11,17-dihidroxil-PX-866; PX-866-1)

Estructura�0� (17-hidroxil-PX-866; PX-866-2)

5 Los compuestos de la presente divulgaci6n tienen una estructura qufmica representada por las estructuras 9 o 10.

Esquemas de sfntesis ejemplares para los compuestos comparativos PX-866 (estructura 8 de la FIG. 3) pueden encontrarse en el Ejemplo 1; PX-867 (estructura 6 de la FIG. �) puede encontrarse en los Ejemplos 2 y 3; 17hidroxil-wortmanina (estructura 5 en la FIG. �) y 17-hidroxil-PX-867 (estructura 7 en la FIG. �) pueden encontrarse en el Ejemplo 3.

10 Segun se emplea en la presente memoria, "alquilo" se refiere a radicales hidrocarbonados que tienen de 1 a 20 atomos de carbono, preferiblemente desde 2 hasta 10 atomos de carbono. Puede considerarse que el termino "alquilo insaturado" indica que la estructura carbonada contiene dobles o triples enlaces, mientras que "alquilo saturado" se usa para indicar que la estructura carbonada contiene la maxima cantidad posible de hidr6genos: es decir, sin dobles enlaces o, en una cadena hidrocarbonada, cada atomo de carbono esta ligado a dos atomos de

15 hidr6geno.

El termino "alquilo sustituido" comprende grupos alquilo que tienen ademas uno o mas sustituyentes seleccionados de hidroxi, alcoxi (de un grupo alquilo inferior), mercapto (de un grupo alquilo inferior), cicloalquilo, cicloalquilo sustituido, heterociclo, heterociclo sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, ariloxi, ariloxi sustituido, hal6geno, trifluorometilo, ciano, nitro, nitrosotiol (-SN0), nitrato (es decir, ester de acido nitroso), nitrona,

20 nitrito (es decir, ester de acido nftrico), nitroglicerilo, S-nitrosocisteinilo, S-nitrosoglutationilo, oxima, Nhidroxilguanidinilo, amino, amido, -C(0)H, acilo, oxiacilo, carboxilo, carbamato, sulfonilo, sulfinilo, sulfonamida, sulfurilo y similares.

Segun se emplea en la presente memoria, "alquilo cfclico" se refiere a grupos que contienen anillos cfclicos, que contienen en el intervalo de aproximadamente 3 hasta 8 atomos de carbono y "alquilo cfclico sustituido" se refiere a

25 grupos alquilo cfclicos que tienen ademas uno o mas sustituyentes como los indicados anteriormente.

La producci6n biosintetica de wortmanina es muy conocida en la especialidad y los analogos se sintetizan a partir de wortmanina. La Patente de EE. UU. N° 5.480.906 describe esquemas sinteticos tfpicos. En general, la wortmanina se produce mediante la fermentaci6n de uno cualquiera de un numero de microorganismos tales como Talaromyces wortmannin, Penicillium wortmannin, Myrothecium roridium y Fusarium. Despues de la fermentaci6n, la wortmanina 30 se extrae y se purifica a traves de metodos conocidos. Preferiblemente, la wortmanina se sintetiza microbianamente y se afsla en forma sustancialmente pura a partir de un cultivo de fermentaci6n; uno de tales cultivos de

fermentaci6n se identifica como A24603.1.

Las cepas se cultivan bajo condiciones aer6bicas sumergidas en un medio de cultivo adecuado hasta que se produce una cantidad recuperable de wortmanina. La wortmanina puede recuperarse usando diversos procedimientos de aislamiento y purificaci6n conocidos en la especialidad.

El medio usado para hacer crecer el cultivo puede ser uno cualquiera de un numero de medios. Sin embargo, por economfa de producci6n, rendimiento 6ptimo y facilidad de aislamiento del producto, fuentes de carbono preferidas en la fermentaci6n a gran escala son glucosa y almid6n soluble tal como almid6n de mafz. Tambien pueden usarse maltosa, ribosa, xilosa, fructosa, galactosa, manosa, manitol, dextrina de patata, oleato de metilo, aceites tales como aceite de soja y similares.

Fuentes de nitr6geno preferidas son casefna hidrolizada con enzimas, y harina de semillas de algod6n, aunque tambien pueden usarse leche pepsinizada, harina de soja digerida, harina de pescado, licor de impregnaci6n de mafz, extracto de levadura, casefna hidrolizada con acido, extracto de ternero y similares.

Entre las sales inorganicas nutrientes que pueden incorporarse en los medios de cultivo estan las sales solubles habituales capaces de dar calcio, magnesio, sodio, amonio, cloruro, carbonato, sulfato, nitrato, zinc e iones similares. Elementos traza esenciales necesarios para el crecimiento y el desarrollo del organismo tambien deben incluirse en el medio de cultivo. Tales elementos traza estan presentes comunmente como impurezas en otros sustituyentes del medio en cantidades suficientes para cumplir los requisitos de crecimiento del organismo.

Para la producci6n de cantidades sustanciales de wortmanina, se prefiere la fermentaci6n aerobia sumergida en biorreactores agitados. Pequenas cantidades de wortmanina pueden obtenerse mediante cultivo en matraz removido. Debido al retraso de tiempo en la producci6n comunmente asociado con la inoculaci6n de grandes biorreactores con la forma de esporas del organismo, es preferible usar un in6culo vegetativo. El in6culo vegetativo se prepara al inocular un pequeno volumen de medio de cultivo con la forma de esporas o fragmentos miceliales del organismo para obtener un cultivo reciente que crece activamente del organismo. El medio del in6culo vegetativo puede ser el mismo que el usado para fermentaciones mayores, pero tambien son adecuados otros medios.

Despues de su producci6n, la wortmanina puede recuperarse del medio de fermentaci6n mediante metodos usados en la tecnica. La wortmanina producida durante la fermentaci6n del organismo A24603.1, por ejemplo, esta presente principalmente en el caldo.

Tfpicamente, la wortmanina puede recuperarse de la biomasa mediante una variedad de tecnicas. Una tecnica preferida implica filtrar todo el caldo de fermentaci6n con un filtro ceramico. El filtrado se eluye con un disolvente organico tal como acetato de etilo y se concentra. El concentrado se suspende en alcohol hasta que se produce la cristalizaci6n y la soluci6n se filtra, se lava y se seca. Para la confirmaci6n, el material cristalino se disuelve en un disolvente organico y se cromatograffa en un absorbente de gel de sflice en fase inversa (C8 o C18). Las fracciones se eluyen en un tamp6n organico-acuoso tal como acetonitrilo al 60%.

La wortmanina puede manipularse adicionalmente para llegar a los compuestos de la presente invenci6n. Aunque la sfntesis de analogos particulares de wortmanina se ilustra posteriormente, otros esquema sinteticos comunes en la especialidad permitiran a un experto normal en la especialidad sintetizar los compuestos de acuerdo con la presente invenci6n, y los esquemas sinteticos indicados en la presente memoria de ningun modo deben considerarse limitativos.

Para el tratamiento terapeutico de las indicaciones especificadas, las estructuras 9 y 10 que se muestran en la FIG. 3 pueden administrarse como tales, o pueden combinarse y formularse como composiciones farmaceuticas en forma de dosificaci6n unitaria para la administraci6n parenteral, transdermica, rectal, nasal, intravenosa local o, preferiblemente, la administraci6n oral. Tales composiciones farmaceuticas se preparan de un modo muy conocido en la especialidad y comprenden al menos un compuesto activo seleccionado de las estructuras 9 y 10 que se muestran en la FIG. 3, asociado con un vehfculo farmaceuticamente aceptable. El termino "compuesto activo", segun se usa a lo largo de esta memoria descriptiva, se refiere a al menos un compuesto seleccionado de las estructuras 4-9 y 10 que se muestran en la FIG.�3 o sus sales farmaceuticamente aceptables.

Asf, una realizaci6n de la divulgaci6n proporciona una composici6n farmaceutica que comprende una cantidad eficaz del compuesto de estructura 9 o 10, que se muestra en la FIG. 3, y uno de sus vehfculos, diluyentes o excipientes farmaceuticamente aceptables.

En tal composici6n, el compuesto activo se conoce como el "ingrediente activo". Al elaborar las composiciones, el ingrediente activo se mezclara habitualmente con un vehfculo, o se diluira mediante un vehfculo, o se envolvera con un vehfculo que puede estar en la forma de una capsula, bolsita, papel u otro recipiente. Cuando el vehfculo sirve

como un diluyente, puede ser un material s6lido, semis6lido o lfquido que actua como un portador, excipiente o medio para el ingrediente activo. Asf, la composici6n puede estar en la forma de comprimidos, pfldoras, polvos, pastillas para chupar, bolsitas, cachets, elixires, emulsiones, soluciones, jarabes, suspensiones, capsulas de gelatina blandas y duras, soluciones inyectables esteriles y polvos envasados esteriles.

Algunos ejemplos de vehfculos, excipientes y diluyentes adecuados incluyen lactosa, dextrosa, sacarosa, sorbitol. manitol, almidones, goma arabiga, fosfato calcico, alginatos, silicato calcico, celulosa microcristalina, polivinilpirrolidona, celulosa, tragacanto, gelatina, jarabe, metilcelulosa, hidroxibenzoatos de metilo y propilo, talco, estearato magnesico, agua y aceite mineral. Las composiciones pueden incluir adicionalmente agentes lubricantes, agentes humectantes, agentes emulsionantes y de suspensi6n, agentes conservantes, agentes edulcorantes y agentes saborizantes. Las composiciones pueden formularse a fin de proporcionar una liberaci6n rapida, sostenida o retardada del ingrediente activo despues de la administraci6n al paciente al emplear procedimientos muy conocidos en la especialidad.

Para la administraci6n oral, un compuesto puede mezclarse con vehfculos y diluyentes, moldearse en comprimidos o envolverse en capsulas de gelatina. Alternativamente, las mezclas pueden disolverse en lfquidos tales como soluci6n acuosa de glucosa al 10%, soluci6n salina isot6nica, agua esteril o similares, y administrarse intravenosamente o mediante inyecci6n.

El aporte local de cantidades inhibidoras de un compuesto activo para el tratamiento del cancer puede ser mediante una variedad de tecnicas que administran el compuesto en o cerca de la zona proliferativa. Los ejemplos de tecnicas de aporte local no pretenden ser limitativos, sino ser ilustrativos de las tecnicas disponibles. Ejemplos incluyen cateteres de aporte local, vehfculos especfficos para una zona, implantes, inyecci6n directa o aplicaciones directas. El aporte local mediante un cateter permite la administraci6n de un agente farmaceutico directamente a la zona proliferativa.

El aporte local mediante un implante describe la colocaci6n quirurgica de una matriz que contiene el agente farmaceutico en la lesi6n proliferativa. La matriz implantada libera el agente farmaceutico mediante difusi6n, reacci6n qufmica o activadores del disolvente.

0tro ejemplo es el aporte de un agente farmaceutico mediante selladura endoluminal polimerica. Esta tecnica usa un cateter para aplicar un implante polimerico a la superficie interior de la luz. El agente farmaceutico incorporado en el implante de polfmero biodegradable se libera de ese modo en la zona quirurgica. Se describe en el documento PCT W0 90/01969 (Schindler, 23 de agosto de 1989).

Un ejemplo final de aporte local mediante un implante es mediante inyecci6n directa de vesfculas o microparticulados en la zona proliferativa. Estos microparticulados pueden estar compuestos por sustancias tales como protefnas, lfpidos, carbohidratos o polfmeros sinteticos. Estos microparticulados tienen el agente farmaceutico incorporado en toda la micropartfcula o sobre la micropartfcula como un revestimiento. Sistemas de aporte que incorporan microparticulados se describen en Lange, Science 249:1527-1533 (1990) y Mathiowitz et al., J. App. Poly. Sci., 26:809 (1981).

El aporte local mediante vehfculos especfficos para una zona describe ligar el agente farmaceutico a un vehfculo que dirigira el farmaco a la lesi6n proliferativa. Ejemplos de esta tecnica de aporte incluyen el uso de vehfculos tales como un ligando de protefna o un anticuerpo monoclonal.

El aporte local mediante aplicaci6n directa incluye el uso de aplicaciones t6picas. Un ejemplo de un aporte local mediante aplicaci6n directa es aplicar el agente farmaceutico al tumor arterial o el area que queda despues de la resecci6n del tumor.

La proliferaci6n de celulas puede depender de la ruta de senalizaci6n de Pl-3 quinasa-Akt-mT0R. Ademas, la senalizaci6n a traves de PI-3 quinasa y Akt parece inhibir la apoptosis. La capacidad de los analogos de wortmanina y sus metabolitos para inhibir Pl-3 quinasa y mT0R puede expresarse como la dosis que provoca 50% de inhibici6n (lC50). La inhibici6n del crecimiento de celulas de cancer de mama MCF-7 humanas se midi6 a lo largo de 4 dfas usando el ensayo de MTT, y los resultados se expresan como la dosis que provoca 50% de inhibici6n (IC50). El ensayo de MTT es un ensayo colorimetrico estandar para medir la proliferaci6n celular (crecimiento celular). Se usa universalmente para determinar la citotoxicidad de agentes medicinales potenciales y otros materiales t6xicos. El MTT (bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio) amarillo se reduce hasta formazano purpura en la mitocondria de celulas vivas. Esta reducci6n tiene lugar solo cuando las enzimas reductasa mitocondriales son activas, y por lo tanto la conversi6n esta directamente relacionada con el numero de celulas viables (vivas). A grupos de 3 ratones C57BL6 se les administr6 wortmanina en dosis de 1, 2 o 3 mg/kg o los analogos en 1, 3, 9 o 18 mg/kg mediante la ruta intraperitoneal diariamente durante 4 dfas. Los animales fueron sacrificados 24 horas despues de la ultima dosis y se determinaron los conteos sangufneos y la qufmica serica diferenciales. Las principales toxicidades

observadas eran toxicidad hepatica y linfocitopenia con conteos de gl6bulos rojos disminuidos y glucosa serica incrementada a dosis superiores. Las toxicidades se miden a la dosis tolerada maxima o la dosis mas alta probada. La toxicidad hepatica se mide como el incremento porcentual medio en ALT y AST sericas expresado con relaci6n a la wortmanina como 1,0. La alanina aminotranferasa (ALT) y la aspartato aminotransferasa (AST) son enzimas situadas en celulas hepaticas que se fugan a la circulaci6n general cuando las celulas hepaticas se lesionan. La linfocitopenia se expresa como la disminuci6n porcentual en los conteos de linfocitos con relaci6n a la wortmanina como 1,0. Una toxicidad hepatica baja y una toxicidad para linfocitos alta como un sustituto para la inhibici6n del crecimiento de celulas tumorales es la caracterfstica deseable.

Basandose en los resultados de estos estudios (Tabla 0), la wortmanina y los analogos de wortmanina son inhibidores de PI-3 quinasa y se observa que inhiben el crecimiento celular y la supervivencia celular. Por otra parte, estos inhibidores de PI-3 quinasa de wortmanina tambien inhiben la respuesta inflamatoria local, especialmente en el caso de un implante bioprotesico, lo que puede ser un factor favorable para el injerto a largo plazo u otro implante bioprotesico. En principio, los analogos de wortmanina pueden ser agentes ideales para inducir un bloqueo temporal de la ruta de PI-3 quinasa-Akt-mT0R.

Tabla�0: Actividad y toxicidad in vivo para wortmanina y analogos de wortmanina

Wortmanina

2,5 0,3 0,1 8,9 1,0 1,0

PX-86

20 0,5 >3 2,2 2,2 0,3

PX-867

20 1,1 >3 0,5 2,4 0,3

Tambien se ha observado en estudios farmacocineticos como los indicados en la Solicitud de EE. UU. N° de Serie 11/178.553, titulada "Wortmannin Analogs and Methods and Methods of Using the Same Combination with Chemotherapeutic Agents", presentada el 11 de julio de 2005, que los niveles en sangre de PX-866 y PX-867 despues de la administraci6n oral son bajos. Tanto PX-866 como PX-867 pueden ser mas eficaces a dosis orales inferiores que cuando se administran intravenosamente. Aunque sin querer limitarse por una teorfa, se establece como hip6tesis que este efecto es atribuible a metabolitos de PX-866 y PX-867 activos y potencialmente mas potentes. Realizaciones de la presente divulgaci6n proporcionan nuevos metabolitos de wortmanina y metabolitos de los analogos de wortmanina y su uso como inhibidores de PI-3 quinasa. Realizaciones adicionales de la divulgaci6n proporcionan el uso de estos nuevos metabolitos como agentes anticancerosos y antitumorales.

Se ha observado en la presente memoria que estos metabolitos demuestran actividades inhibidoras contra PI-3 quinasas que pueden ser similares a o inferiores que las de la wortmanina (vease el Ejemplo 7). La capacidad de los metabolitos de analogos de wortmanina para inhibir la activaci6n dependiente del factor de crecimiento epidermico de Akt se midi6 en celulas de cancer de colon HT-29 mediante hibridaci6n por transferencia western usando anticuerpo anti-fosfo-Ser413-Akt (FIG.�7A). La cuantificaci6n de las transferencias para dar la relaci6n de fosfo-Ser473-Akt a Akt total se muestra en la FIG.�78. La concentraci6n inhibidora al 50% (lC50) calculada para 17-hidroxi-PX-866 ( ) era 40 nM y para 11-desacetilado,17-hidroxi-PX-866 (�) era mayor de 70 nM. Bajo las mismas condiciones de ensayo, la IC50 para PX-866 precursor era 27 nM (no mostrado). Asf, el 17-hidroxi-PX-866 (PX-866-2) tiene la misma actividad inhibidora de fosfo-Ser473-Akt celular que PX-866, mientras que el 11-desacetilado,17-hidroxi-PX-866 (PX866-1) es mucho menos activo.

La citotoxicidad de los metabolitos de analogos de wortmanina se muestra en la FIG. 8. Celulas de cancer de colon humano HT-29 se hicieron crecer en la modificaci6n de Dulbecco del medio de Eagle (DMEM) con suero de ternero fetal al 10% hasta 25% de confluencia, a continuaci6n se hicieron crecer durante 3 dfas mas en medio reciente que contiene (�)PX-866, ( ) PX-866-2(�) PX-866-1. Los compuestos se anadieron desde una soluci6n de reserva de 10 mg/ml en etanol. El numero de celulas se determin6 despues de 3 dfas mediante citometrfa de flujo usando un cit6metro de flujo Guava EasyCyte Plus (Guava Technologies). Los resultados se expresan como el numero de celulas al final del ensayo como porcentaje del valor de control sin farmaco. Los valores son la media de 3 determinaciones y las barras son la desviaci6n estandar. La concentraci6n inhibidora del crecimiento al 50% (IC50) para PX-866 era 4,0 1M, para PX-866-1 era 4,5 1M y para PX-866-2 era mayor de 50 1M. Asf, el PX-866-2 tiene la misma actividad inhibidora del crecimiento celular que PX-866 pero PX-866-1 es mucho menos activo.

La inhibici6n de PI-3 quinasa recombinante mediante PX-866 y sus metabolitos se muestra en la FIG.�9. La actividad de PI-3 quinasa se midi6 mediante la fosforilaci6n dependiente de [32P1V-ATP de fosfatidilinositol segun se describi6 previamente (lhle et al. (2005) Mol. Cancer Ther. 4(9): 1349-1357). La FIG. 9A muestra resultados del ensayo usando p110a/p85a bovina recombinante (Jena Bioscience, Jena, Alemania) y la FIG. 98 muestra resultados del ensayo usando p110a/p85a humana recombinante (Upstate, Charlottesville, VA). La inhibici6n se midi6 usando (�) PX-866, (�) wortmanina, ( ) PX-866-2 o (�) PX-866-1. Los resultados muestran que PX-866-2 es tan activo como PX-866 o wortmanina para inhibir las isoformas p110a y p110a de PI-3 quinasas pero el PX-866-1 era considerablemente menos activo.

Asf, una realizaci6n de la divulgaci6n proporciona un compuesto para el uso en la inhibici6n de la actividad de PI-3 quinasa en mamfferos, en la que se administra una cantidad eficaz de un compuesto de estructura 9 o 10, segun se muestran en la FIG.�3.

0tra realizaci6n de la divulgaci6n proporciona un compuesto para el uso en la inhibici6n de la actividad de PI-3 quinasa en una celula, en la que un compuesto de estructura 9 o 10, segun se muestran en la FIG. 3, se pone en contacto con la celula, con lo que el compuesto inhibe la PI-3 quinasa.

Puesto que la actividad de PI-3 quinasa puede ser un factor en ciertos tipos de canceres, la presente divulgaci6n tambien proporciona el uso de los compuestos como agentes antitumorales, agentes anticancerosos, y composiciones farmaceuticas utiles para el tratamiento de tales tumores o canceres. Canceres tratables mediante los compuestos de esta divulgaci6n pueden incluir, pero no se limitan a , cancer de mama, cancer de pulm6n, cancer de cabeza y cuello, cancer de cerebro, cancer abdominal, cancer de colon, cancer colorrectal, cancer esofagico, cancer gastrointestinal, glioma, cancer de hfgado, cancer de lengua, neuroblastoma, osteosarcoma, cancer ovarico, cancer pancreatico, cancer renal, cancer de pr6stata, retinoblastoma, tumor de Wilm, mieloma multiple, cancer de piel, linfoma y cancer hematico. Una realizaci6n de la divulgaci6n proporciona un compuesto para el uso en el tratamiento del cancer, en la que se administra una cantidad terapeuticamente eficaz de un compuesto de estructura 9 o 10, segun se muestran en la FIG. 3. En una realizaci6n preferida, el cancer tratado mediante el compuesto de estructura 9 o 10 es cancer de colon.

Realizaciones de la divulgaci6n tambien proporcionan el uso de una composici6n farmaceutica para tratar la proliferaci6n de celulas tumorales o el crecimiento de celulas tumorales al administrar a un mamffero una composici6n farmaceutica que contiene un compuesto de estructura 9 o 10, segun se muestran en la FIG.�3.

Realizaciones de la divulgaci6n tambien proporcionan un compuesto para usar en el tratamiento de la proliferaci6n de celulas tumorales o el crecimiento de celulas tumorales, en el que se administra una cantidad eficaz de un compuesto de estructura 9 o 10, segun se ilustran en la FIG.�3.

En algunos aspectos de la invenci6n, los compuestos de la presente divulgaci6n son derivados denominados profarmacos. La expresi6n "profarmaco" indica un derivado de un farmaco de acci6n directa conocido, derivado que tiene caracterfsticas de aporte y valor terapeutico mejorados en comparaci6n con el farmaco y se transforma en el farmaco activo mediante un proceso enzimatico o qufmico.

Cuando se produce cualquier variable mas de una vez en cualquier constituyente o en cualquiera de los compuestos citados para cualquiera de las f6rmulas anteriores, su definici6n en cada presencia es independiente de su definici6n en cualquier otra presencia. Ademas, son permisibles combinaciones de sustituyentes y/o variables solo si tales combinaciones dan como resultado compuestos estables.

Se entiende que la presente invenci6n abarca el uso de estereois6meros, diastereois6meros e is6meros 6pticos de los compuestos de la presente invenci6n, asf como sus mezclas. Adicionalmente, se entiende que los estereois6meros, diastereois6meros e is6meros 6pticos de los compuestos de la presente invenci6n y sus mezclas estan dentro del alcance de la invenci6n. A modo de ejemplo no limitativo, la mezcla puede ser un racemato o la mezcla puede comprender proporciones desiguales de un estereois6mero particular sobre el otro. Adicionalmente, los compuestos de la presente invenci6n pueden proporcionarse como estereois6meros, diastereois6meros e is6meros 6pticos sustancialmente puros.

En otro aspecto de la invenci6n, los compuestos pueden proporcionarse en la forma de una sal aceptable ( es decir, una sal farmaceuticamente aceptable). Las sales pueden proporcionarse para uso farmaceutico, o como un producto intermedio al preparar la forma farmaceuticamente deseada del compuesto. Por ejemplo, una sal que puede considerarse que es aceptable es la sal por adici6n de acido de hidrocloruro. Por ejemplo, el ion cloruro puede estar presente como un ion conjugado para compuestos que tienen cadenas laterales cati6nicas. Las sales por adici6n de acido de hidrocloruro a menudo son sales aceptables cuando el agente farmaceuticamente activo tiene un grupo amina que puede protonarse.

Por ejemplo, en algunos aspectos, la invenci6n se dirige a una composici6n farmaceutica que comprende un compuesto, segun se define anteriormente, y un vehfculo o diluyente farmaceuticamente aceptable, o una cantidad eficaz de una composici6n farmaceutica que comprende un compuesto segun se define anteriormente.

Los compuestos de la presente invenci6n pueden administrarse de modo convencional mediante cualquier ruta en la que sean activos. La administraci6n puede ser sistemica, t6pica u oral. Por ejemplo, la administraci6n puede ser, pero no se limita a, rutas parenteral, subcutanea, intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, transdermica, oral, bucal u ocular, o intravaginalmente, mediante inhalaci6n, mediante inyecciones de dep6sito, o mediante implantes. Asf, los modos de administraci6n para los compuestos de la presente invenci6n (bien solos o bien en combinaci6n con otros productos farmaceuticos) pueden ser, pero no se limitan a, sublingual, inyectable (incluyendo formas de acci6n corta, dep6sito, implante y pella inyectadas subcutaneamente o intramuscularmente) o mediante el uso de cremas vaginales, supositorios, pesarios, anillos vaginales, supositorios rectales, dispositivos intrauterinos y formas transdermicas tales como parches y cremas.

Los modos especfficos de administraci6n dependeran de la indicaci6n. La selecci6n de la ruta especffica de administraci6n y el regimen de dosificaci6n ha de ser ajustada o valorada por el clfnico de acuerdo con metodos conocidos por el clfnico a fin de obtener la respuesta clfnica 6ptima. La cantidad de compuesto que ha de administrarse es aquella cantidad que es terapeuticamente eficaz. La dosificaci6n que ha de administrarse dependera de las caracterfsticas del sujeto que se trate, p. ej., el animal particular tratado, la edad, el peso, la salud, los tipos de tratamiento simultaneo, si lo hay, y la frecuencia de los tratamientos, y puede ser facilmente determinada por un experto en la tecnica (p. ej., por el clfnico).

Las composiciones farmaceuticas que contienen los compuestos de la presente invenci6n y un vehfculo adecuado pueden ser formas de dosificaci6n s6lidas que incluyen, pero no se limitan a, comprimidos, capsulas, bolsitas, pellas, pfldoras, polvos y granulos; formas de dosificaci6n t6picas que incluyen, pero no se limitan a, soluciones, polvos, emulsiones fluidas, suspensiones fluidas, semis6lidos, pomadas, pastas, cremas, geles y gelatinas, y espumas; y formas de dosificaci6n parenterales que incluyen, pero no se limitan a, soluciones, suspensiones, emulsiones y polvo seco; que comprenden una cantidad eficaz de un polfmero o copolfmero de la presente invenci6n. Tambien se sabe en la especialidad que los ingredientes activos pueden estar contenidos en tales composiciones con diluyentes, cargas, desintegrantes, aglutinantes, lubricantes, tensioactivos, portadores hidr6fobos, portadores solubles en agua, emulsionantes, tampones, humectantes, hidratantes, solubilizantes, conservantes y similares farmaceuticamente aceptables. Los medios y los metodos para la administraci6n son conocidos en la especialidad y el especialista puede referirse a diversas referencias farmacol6gicas como gufa. Por ejemplo, pueden consultarse Modern Pharmaceulics, Banker & Rhodes, Marcel Dekker, Inc. (1979); y Goodman & Gilman's The Pharmaceulical Basis of Therapeulics, 6a Edici6n, MacMillan Publishing Co., Nueva York (1980).

Los compuestos de la presente invenci6n pueden formularse para administraci6n parenteral mediante inyecci6n, p. ej., mediante inyecci6n de bolo o infusi6n continua. Los compuestos pueden administrarse mediante infusi6n continua subcutaneamente a lo largo de un perfodo de aproximadamente 15 minutos a aproximadamente 24 horas. Las composiciones para inyecci6n pueden presentarse en forma de dosificaci6n unitaria, p. ej., en ampollas o en recipientes de multiples dosis, con un conservante anadido. Las composiciones pueden tomar formas tales como suspensiones, soluciones o emulsiones en portadores oleosos o acuosos, y pueden contener agentes de formulaci6n tales como agentes de suspensi6n, estabilizantes y/o dispersantes.

Para la administraci6n oral, los compuestos pueden formularse facilmente al combinar estos compuestos con vehfculos farmaceuticamente aceptables muy conocidos en la especialidad. Tales vehfculos permiten que los compuestos de la invenci6n se formulen como comprimidos, pfldoras, grageas, capsulas, lfquidos, geles, jarabes, lechadas, suspensiones y similares, para la ingesti6n oral por un paciente que ha de ser tratado. Las preparaciones farmaceuticas para uso oral pueden obtenerse al anadir un excipiente s6lido, triturar opcionalmente la mezcla resultante, y procesar la mezcla de granulos, despues de anadir sustancias auxiliares adecuadas, si se desea, para obtener comprimidos o nucleos de gragea. Excipientes adecuados incluyen, pero no se limitan a, cargas tales como azucares, incluyendo, pero no limitados a, lactosa, sacarosa, manitol y sorbitol; preparaciones de celulosa tales como, pero no limitadas a, almid6n de mafz, almid6n de trigo, almid6n de arroz, almid6n de patata, gelatina, goma de tragacanto, metilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, carboximetilcelulosa s6dica y polivinilpirrolidona (PVP). Si se desea, pueden anadirse agentes desintegrantes, tales como, pero no limitados a, la polivinilpirrolidona reticulada, agar o acido algfnico o una de sus sales tales como alginato s6dico.

Los nucleos de gragea pueden proveerse de revestimientos adecuados. Con este prop6sito, pueden usarse soluciones de azucar concentradas, que opcionalmente pueden contener goma arabiga, talco, polivinilpirrolidona, gel de carbopol, polietilenglicol y/o di6xido de titanio, soluciones de laca y disolventes o mezclas de disolventes adecuados. Pueden anadirse colorantes o pigmentos a los comprimidos o revestimientos de grageas para identificaci6n o para caracterizar diferentes combinaciones de dosis de compuesto activo.

Preparaciones farmaceuticas que pueden usarse oralmente incluyen, pero no se limitan a, capsulas de dos piezas 14

hechas de gelatina, asf como capsulas blandas selladas hechas de gelatina y un plastificante, tal como glicerol o sorbitol. Las capsulas de dos piezas pueden contener los ingredientes mezclados con una carga tal como, p. ej., lactosa, aglutinantes tales como, p. ej., almidones, y/o lubricantes tales como, p. ej., talco o estearato magnesico y, opcionalmente, estabilizantes. En las capsulas blandas, los compuestos activos pueden disolverse o suspenderse en lfquidos adecuados, tales como aceites grasos, parafina lfquida o polietilenglicoles lfquidos. Ademas, pueden anadirse estabilizantes. Todas las composiciones para administraci6n oral deben estar en dosificaciones adecuadas para tal administraci6n.

Para tal administraci6n bucal, las composiciones pueden tomar la forma de, p. ej., comprimidos o pastillas para chupar formulados de modo convencional.

Para la administraci6n mediante inhalaci6n, los compuestos para el uso de acuerdo con la presente invenci6n se aportan convenientemente en la forma de una presentaci6n en espray de aerosol desde envases presurizados o un nebulizador, con el uso de un propelente adecuado, p. ej., diclorodifluorometano, triclorofluorometano, diclorotetrafluoroetano, di6xido de carbono u otro gas adecuado. En el caso de un aerosol presurizado, la unidad de dosificaci6n puede determinarse al proporcionar una valvula para aportar una cantidad medida. Pueden formularse capsulas y cartuchos de, p. ej., gelatina para el uso en un inhalador o insuflador, que contienen una mezcla en polvo del compuesto y una base en polvo adecuada tal como lactosa o almid6n.

Los compuestos de la presente invenci6n tambien pueden formularse en composiciones rectales tales como supositorios o enemas de retenci6n, p. ej., que contienen bases de supositorio convencionales tales como mantequilla de cacao u otros gliceridos.

Ademas de las composiciones descritas previamente, los compuestos de la presente invenci6n tambien pueden formularse como una preparaci6n de dep6sito. Tales composiciones de acci6n prolongada pueden administrarse mediante implantaci6n (por ejemplo subcutaneamente o intramuscularmente) o mediante inyecci6n intramuscular.

Las inyecciones de dep6sito pueden administrarse a intervalos de aproximadamente 1 a aproximadamente 6 meses

o mayores. Asf, por ejemplo, los compuestos pueden formularse con materiales polimericos o hidr6fobos adecuados (por ejemplo como una emulsi6n en un aceite aceptable) o resinas de intercambio i6nico, o como derivados poco solubles, por ejemplo, como una sal poco soluble.

En la administraci6n transdermica, los compuestos de la presente invenci6n, por ejemplo, pueden aplicarse a un emplasto, o pueden aplicarse mediante sistemas terapeuticos transdermicos que consiguientemente se aplican al organismo.

Las composiciones farmaceuticas de los compuestos tambien pueden comprender soportes o excipientes en fase s6lida o de gel adecuados. Ejemplos de tales vehfculos o excipientes incluyen, pero no se limitan a, carbonato calcico, fosfato calcico, diversos azucares, almidones, derivados de celulosa, gelatina y polfmeros tales como, p. ej., polietilenglicoles.

Los compuestos de la presente invenci6n tambien pueden administrarse en combinaci6n con otros ingredientes activos, tales como, por ejemplo, adyuvantes, inhibidores de proteasas u otros farmacos o compuestos compatibles, donde se observa que tal combinaci6n es deseable o ventajosa para alcanzar los efectos deseados de los metodos descritos en la presente memoria.

Esta invenci6n y realizaciones que ilustran el metodo y los materiales usados pueden comprenderse adicionalmente mediante referencia a los siguientes ejemplos no limitativos.

Ejemplos

EJEMPLO�0 -C0MPARATIV0

Este ejemplo ilustra una realizaci6n de un metodo para producir PX-866: Ester 4-dialilaminometilen-6-hidroxi-1-ametoximetil-10r,13r-dimetil-3,7,17-trioxo-1,3,4,7,10,11r,12,13,14a,15,16,17-dodecahidro-2-oxaciclopena[a1fenantren-11-flico de acido acetico.

A una soluci6n de wortmanina (10,7 mg, 25,0 1mol) en CH2Cl2 (125 1l) se anadi6 una soluci6n de reserva 0,2 M recientemente preparada de dialilamina (138 1l, 27,5 1mol) en CH2Cl2. La mezcla de reacci6n se agit6 a temperatura ambiente durante 1 h. El disolvente y la amina en exceso se retiraron a vacfo y el producto se purific6 a traves de cromatograffa sobre Si02 (hexanos:acetato de etilo 1:9) para dar PX-866 (9,0 mg, 17 1mol, 68%) como un aceite naranja. El producto se analiz6 mediante varios metodos experimentales y se mostr6 que era de la estructura correcta y de alta pureza como: [aD1 -630 (c 0,0015, CH2Cl2, 23°C); IR (KBr) 3391, 1743, 1695, 1685, 1622, 1569,

1222, 1111, 1100 cm-1; 0H NMR a 8,20 (s, 1H), 6,81 (s, 1H), 6,06 (dd, 1H, J=7,4, 4,8 Hz), 5,85 (s an, 1H), 5,62 (an, 1H), 5,44-5,04 (m, 4H), 4,48 (dd, 1H, J=7,2, 1,9 Hz), 4,05-3,60 (m, 4H), 3,26 (s, 3H), 3,27-3,20 (m, 1H), 3,16 (dd, 1H, J=10,9, 7,2 Hz), 3,00-2,90 (m, 2H), 2,59 (dd, 1H, J=19,4, 8,6 Hz), 2,40 (dd, 1H, J=14,4, 7,7 Hz), 2,35-2,07 (m, 2H), 2,07 (s, 3H), 1,83 (dd, 1H, J=14,4, 4,7 Hz), 1,54 (s, 3H), 0,86 (s, 3H); 03C NMR a 217,0, 178,5, 169,6, 164,8, 156,3, 151,5, 139,0, 136,9, 132,2, 131,3, 127,7 (2 C), 119,2, 89,0, 81,9, 73,1, 67,6, 59,1, 50,9 (2 C), 48,9, 42,3, 42,2, 37,5, 36,0, 24,6, 22,2, 20,8, 16,1; MS (EI) m/z (intensidad rel.) 525 (M+, 11), 466 (17), 391 (15), 350 (14), 323 (13), 266 (17), 239 (17), 60 (100); HRMS (EI) calculado para C29H35N08 525,2363, encontrado 525,2386.

EJEMPLO�� -C0MPARATIV0

Este ejemplo ilustra una realizaci6n de un metodo para producir PX-867: Ester 6-hidroxi-1a-metoximetil-10r,13rdimetil-3,7,17-trioxo-4-pirrolidin-1-il-metilen-1,3,4,7,10,11r,12,13,14a,15,16,17-dodecahidro-2-oxaciclopenta[a1fenantrenflico de acido acetico.

A una soluci6n de wortmanina (30,0 mg, 70,0 1mol) en CH2Cl2 (200 1l) se anadi6 pirrolidina (7,0 1l, 84 1mol) en CH2Cl2. La mezcla de reacci6n se agit6 a temperatura ambiente durante 1 h. El disolvente y el tiol en exceso se retiraron a vacfo y el producto se purific6 mediante cromatograffa sobre Si02 (hexanos/acetato de etilo 9:1, a continuaci6n 1:1) para dar PX-867 (30,0 mg, 60,6 1mol, 86%) como un aceite naranja. El producto se analiz6 mediante varios metodos experimentales y se observ6 que era de la estructura correcta y de alta pureza como: [aD1 -390 (c 0,0073, CH2Cl2, 23°C); IR (KBr) 3337, 1740, 1684, 1617,1570, 1261, 1221, 1099, 1018 cm-1; 0H NMR a 8,29 (s, 1H). 6,72 (s, 1H), 6,07 (dd, 1H, J=6,9, 4,8 Hz), 4,47 (dd, 1H, J=7,0, 1,9 Hz), 3,80-3,70 (m, 2H), 3,25 (s, 3H), 3,253,14 (m, 2H), 3,02-2,90 (m, 2H), 2,69 (s an, 1H), 2,58 (dd, 1H, J=19,1, 8,4 Hz), 2,39 (dd, 1H, J=14,6, 7,8 Hz), 2,322,08 (m, 2H), 2,06 (s, 3H), 1,99-1,95 (m, 5H), 1,84 (dd, 1H, J=14,5., 4,2 Hz), 1,56 (s, 3H), 0,86 (s, 3H); 03C NMR a 217,5, 178,9, 169,9, 164,9, 153,9, 151,3, 137,6, 137,1, 129,2, 89,4, 82,1, 73,3, 67,7, 59,3, 55,2, 49,2 (2 C), 42,6, 42,4, 37,8, 36,3, 25,6 (2 C), 24,5, 22,4, 21,0, 16,3; MS (El) m/z (intensidad rel.) 499 (M+, 1), 439 (2), 365 (7), 167 (35), 149 (100); HRMS (EI) calculado para C27H33N08 499,2206, encontrado 499,2191.

EJEMPLO�3 -C0MPARATIV0

Este ejemplo ilustra una realizaci6n de un metodo para producir PX-867 y sus metabolitos. La wortmanina (4) se obtuvo de Synexa Life Sciences Company para la sfntesis de PX-867. El analisis por HPLC de esta wortmanina mostraba una impureza mas polar. La cromatograffa en capa fina (TLC) de la muestra se desarroll6 usando acetato de etilo como el diluyente para visualizar la impureza mas polar. La impureza polar se caracteriz6 usando espectroscopfa de NMR de alta resoluci6n y se mostraba que era 17r-hidroxi-wortmanina (5 posteriormente).

La wortmanina (4) pura obtenida despues de la TLC se convirti6 en PX-867 (6) de acuerdo con el Esquema 1: una soluci6n de pirrolidina en diclorometano se anade a una soluci6n de wortmanina en diclorometano. Se obtuvo PX867 (6) en forma pura y rendimiento muy alto (-95%). Mientras que el PX-867 obtenido a partir de ciertos lotes de wortmanina no requerfa una purificaci6n adicional, algunos lotes mostraban que todavfa quedaban trazas de pirrolidina, incluso despues de mantener el compuesto bajo vacfo durante la noche. La purificaci6n de PX-867 (6) se consegufa mediante cromatograffa en columna por gravedad sobre gel de sflice usando acetato de etilo como un eluyente.

presi6n reducida y el residuo se cromatografi6 sobre gel de sflice. La eluci6n con Et0Ac daba 1,12 g (2,24 mmol, 99%) de PX-867 como un s6lido naranja con rendimiento cuantitativo. El espectro de 1H-NMR del compuesto estaba de acuerdo con los datos espectrales previamente presentados, un ejemplo de los cuales se lista en el Ejemplo 2.

La impureza mas polar caracterizada como 17r-hidroxi-wortmanina (5) (10 mg) se convirti6 en 7 mediante un procedimiento similar al descrito anteriormente para PX-867 y segun se representa en el Esquema �. El espectro de 1H-NMR esta conforme con la estructura of 7 (17r- hidroxi-PX-867).

esquema�

EJEMPLO�4 -C0MPARATIV0

Este ejemplo ilustra el desarrollo y la validaci6n de un metodo analftico de HPLC sensible para la determinaci6n cuantitativa de PX-866, a altas concentraciones, en soluciones tamponadoras que han de usarse para estudios de estabilidad. Este metodo se us6 para determinar la estabilidad global de PX-866 en una variedad de sistemas tamponadores usados para la administraci6n de farmacos en estudios preclfnicos. El prop6sito era determinar la estabilidad relativa de PX-866 durante un perfodo de 24 horas para cada una de estas soluciones.

Se usaron tecnicas de HPLC con detecci6n UV/Vis para el analisis de las muestras de estabilidad de PX-866. Polvo de PX-866 se disolvi6 en metanol al 100% hasta una concentraci6n final de 10 mg/ml. Esta soluci6n se us6 como una reserva para elaborar las diversas soluciones tamponadoras de prueba que han de analizarse. La reserva, en cada caso, se diluy6 1:10 hasta una concentraci6n de almacenamiento final de 1 mg/ml, con dextrosa al 5% para inyecci6n (DSW), agua esteril para inyecci6n (SW), cloruro s6dico al 0,9% para inyecci6n (NS), etanol absoluto (Et0H) y tamp6n de fosfato s6dico (NaH2P04). Antes del analisis, los tampones de prueba se diluyeron adicionalmente 1:100, hasta una concentraci6n analftica final de 10 1g/ml, con acido f6rmico al 0,2%:metanol 50:50

v:v. 50 1l de cada muestra se inyectaron a continuaci6n en el sistema de HPLC (Alliance 2695 Separation Module, Waters, Milford, MA; vease la Tabla � para los parametros de HPLC) para analisis. Las muestras de prueba de 2 horas y 24 horas se almacenaron, no diluidas, a 4°C antes del analisis, mientras que las muestras de 0 horas se cuantificaron inmediatamente despues de la diluci6n.

Los resultados encontrados en la FIG. 4 indican la estabilidad diferencial del tamp6n durante el perfodo de observaci6n de 24 horas. Estos datos demuestran una rapida degradaci6n de PX-866 en dos de las soluciones tamponadoras. En 2 horas, tanto el tamp6n de fosfato s6dico 20 mM (>60% restante) como el DSW (>80% restante)

demuestran perdidas de farmaco inadecuadas. PX-866 era razonablemente estable en NS, SW y Et0H, mostrando <10% de degradaci6n despues de 2 horas de almacenamiento. De 2 a 24 horas, el farmaco mantenfa una estabilidad relativa, independientemente del sistema tamponador empleado.

Tabla��: Parametros de HPLC

LC

Waters 2695 Separation Module (Alliance)

Detector

Waters 2487 Dual Absorbance a 254 nm

Columna analftica

Waters Symmetry C8, 3,5 1m, 4,6 x 150 mm

Fase M6vil

acido f6rmico al 0,2%:metanol 25:75

Caudal

Isocratico; 0,6 ml/min a 134 bar (1950 psi)

Tiempo de Retenci6n

22,4 minutos

Ademas, se examin6 la capacidad de una nueva tecnica, UPLC, para cuantificar rapidamente PX-866 en soluciones tamponadoras. Estos sistemas pueden trabajar a contrapresiones de > 1.034 bar (15.000 psi), permitiendo caudales muy altos (> 10 ml/min) con resoluci6n y sensibilidad incrementadas, el uso de volumenes de muestra mfnimos y tiempos de desarrollo analfticos de < 1 minuto. La FIG. 5 muestra un cromatograma ejemplar para PX-866 en disolventes organicos a una concentraci6n de 1 1g/ml. Una inyecci6n de 2 1I (2 ng en la columna) se realiz6 usando un gradientes de acetonitrilo:agua y una columna C18 en un sistema de UPLC con detecci6n por serie de fotodiodos (Waters Acquity, Milford, MA) dando el perfil cromatografico representado en la FIG. 5. Los datos sugieren que los metodos de UPLC pueden detectar cantidades muy pequenas de PX-866 y otros analogos de wortmanina y sus metabolitos, y pueden ser utiles en el estudio de la farmacologfa preclfnica de estos compuestos.

EJEMPLO�5

Este ejemplo ilustra la determinaci6n del metabolismo de PX-866 in vitro en microsomas hepaticos de rat6n, rata, perro y ser humano y la identificaci6n y el analisis estructural de los metabolitos de PX-866 encontrados en los mismos.

Se determin6 que una longitud de onda de absorbancia UV unica para PX-866 estaba entre 300-340 nm (vease la FIG. 6A) y esta longitud de onda (310 nm) se us6 para la identificaci6n UV de metabolitos de los analogos de wortmanina. El analisis por HLPC de PX-866 mostraba un solo pico que se elufa a los 8,68 minutos (vease la FIG. 68). Fracciones S9 de murido capaces de soportar reacciones metab6licas de fase I, fase II y fase I/II se mezclaron con 100 nMol de PX-866. Los metabolitos generados en estas reacciones se identificaron mediante desarrollos de HPLC, usando una longitud de onda de 310 nm (vease la FIG. 6C). Los picos que representan metabolitos se identificaron al comparar los perfiles de HPLC (a 310 nm) en cromatogramas a partir de tiempos de reacci6n de 0 min y 60 min. El analisis espectral de masas (MS) correspondiente de estos picos, usando MS de tiempo de vuelo cuadripolar, permitfa que se determinara la masa exacta de los metabolitos (vease la FIG. 6D). Se us6 el software Metabolynx (Waters-MicroMass, Milford, MA) para interpretar los espectros.

Los experimentos dirigidos a determinar si el metabolismo de Fase II subsiguiente de PX-866 daba como resultado la formaci6n adicional de un glucor6nido o productos de sulfataci6n y los experimentos en Fase I/II combinados producfan un patr6n de eluci6n de LC y espectros de MS similares a los observados en los experimentos de metabolismo de Fase I solos (datos no mostrados). Estos resultados negativos sugieren que solo se formaban metabolitos tipo Fase I. Se identific6 el M N° 1 como un producto de reducci6n que lo mas probablemente es una reducci6n de carbonilo no microsomal de una cetona en un alcohol secundario, segun se describe en estudios de metabolismo previos. Ademas, M N° 2-3 eran los mismos productos de reducci6n, sin embargo, la alteraci6n en el tiempo de retenci6n puede indicar que la molecula sufre reducci6n en zonas distintas a las observadas con el M N°

1. M N° 4 es lo mas probablemente un producto de degradaci6n de PX-866. La NMR confirmaba las estructuras de metabolitos de PX-866 de PX-866-1 (M N° 2) y PX-866-2 (M N° 1) que se muestran en la FIG.�3.

EJEMPLO�6

Este ejemplo ilustra un metodo para la determinaci6n de la extensi6n de uni6n de protefna plasmatica PX-866, in vitro, en plasma de rat6n, rata, perro y ser humano usando ultracentrifugaci6n. Se prepar6 plasma humano, canino, de rata y de rat6n al anadir PX-866 para alcanzar las siguientes concentraciones finales: 0 ng/ml, 250 ng/ml, 500 ng/m y 1000 ng/ml. Se us6 una ultracentrffuga Beckman 0ptima MAX y un rotor TLA 120.2 para centrifugar las muestras a 1.000.000 x g durante 2 horas para separar el plasma en tres capas distintas (protefnica, acuosa y lipoprotefnica). Se extrajo PX-866 de cada uno de estos componentes mediante precipitaci6n de protefnas usando

5 una relaci6n 3:1 de metanol enfriado con hielo al volumen de cada capa de componente aislada. La concentraci6n de farmaco dentro de cada componente se compar6 a continuaci6n con la concentraci6n en plasma de referencia para determinar el porcentaje de farmaco libre dentro del plasma.

EJEMPLO�7

Este ejemplo ilustra un metodo para el ensayo de la inhibici6n de Akt celular en celulas de cancer de colon HT-29:

10 celulas de cancer de colon humanas HT-29 se expusieron a la modificaci6n de Dulbecco del medio de Eagle (DMEM) sin suero durante 16 horas y a continuaci6n se expusieron en DMEM libre de suero bien a 11desacetilado,17-hidroxi-PX-866 (PX-866-1) o bien a 17-hidroxi-PX-866 (PX-866-2) a partir de soluciones de reserva de 1 mg/ml en etanol a concentraciones de 10, 25, 50 y 75 nM durante 4 horas. A continuaci6n, las celulas se estimularon con factor de crecimiento epidermico (EGF) a 50 ng/ml durante 20 minutos. Las celulas se sometieron a

15 lisis y las protefnas se separaron en una SDS-PAGE y se transfirieron a nitrocelulosa. La fosfor-Ser473-Akt y la Akt total se detectaron mediante transferencia western con anticuerpos procedentes de Cell Signaling Technology (Beverly, MA). Una transferencia western ejemplar para los metabolitos del analogo de wortmanina PX-866 se muestra en la FIG. 7A. Las transferencias se cuantificaron mediante densitometrfa y los datos se expresan como la relaci6n de fosfo-Ser473-Akt a Akt total expresados como un porcentaje del valor de control sin farmaco que se

20 muestra en la FIG.�78: ( ) PX-866-2 y (�) PX-866. La concentraci6n inhibidora calculada a 50% (lC50) para PX-8662 era 40 nM y para PX-866-1 era mayor de 70 nM. Bajo las mismas condiciones de ensayo, la IC50 para PX-866 precursor era 27 nM (no mostrado). Asf, PX-866-2 tiene la misma actividad inhibidora de fosfo-Ser473-Akt celular que PX-866, mientras que el PX-866-1 es mucho menos activo.

Aunque la presente invenci6n se ha descrito con detalle considerable con referencia a ciertas de sus realizaciones

25 preferidas, son posibles otras versiones. Por lo tanto, el espfritu y el alcance de las reivindicaciones adjuntas no deben limitarse a la descripci6n y las versiones preferidas contenidas dentro de esta memoria descriptiva.

Claims (10)

1. REIVINDICACIONES

   1. Una composici6n farmaceutica que comprende una cantidad eficaz de un compuesto de la f6rmula:

   y uno de sus vehfculos, diluyentes o excipientes farmaceuticamente aceptables.
2. 2. Una composici6n de acuerdo con la reivindicaci6n 1, en la que dicho compuesto es de la f6rmula:

   10 3. Una composici6n de acuerdo con la reivindicaci6n 1, en la que dicho compuesto es de la f6rmula
3. 4. Una composici6n de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, para el uso en el tratamiento del cancer.
4. 5. La composici6n para el uso en el tratamiento del cancer de acuerdo con la reivindicaci6n 4, en la que el cancer es 5 cancer de colon.

5. 6.

   Una composici6n de acuerdo con la reivindicaci6n 2, para el uso en el tratamiento del cancer al inhibir la actividad de PI-3 quinasa en mamfferos.

6. 7.

   Una composici6n de acuerdo con la reivindicaci6n 2, para el uso en el tratamiento del cancer al inhibir la actividad de PI-3 quinasa en una celula.

   10 8. Una composici6n de acuerdo con la reivindicaci6n 2, para el uso en el tratamiento de la proliferaci6n de celulas tumorales o el crecimiento de celulas tumorales.

7. 9.

   Una composici6n de acuerdo con la reivindicaci6n 3, para el uso en el tratamiento del cancer.

8. 10.

   La composici6n para el uso en el tratamiento del cancer de acuerdo con la reivindicaci6n 9, en la que el cancer es cancer de colon.

   15 11. Una composici6n de acuerdo con la reivindicaci6n 3, para el uso en el tratamiento del cancer al inhibir la actividad de PI-3 quinasa en mamfferos.
9. 12. Una composici6n de acuerdo con la reivindicaci6n 3, para el uso en el tratamiento del cancer al inhibir la actividad de PI-3 quinasa en una celula.
10. 13. Una composici6n de acuerdo con la reivindicaci6n 3, para el uso en el tratamiento de la proliferaci6n de celulas 20 tumorales o el crecimiento de celulas tumorales.