KR20240062104A - 교모세포종 약물내성 극복을 위한 테모졸로마이드 유사 항암제 - Google Patents

교모세포종 약물내성 극복을 위한 테모졸로마이드 유사 항암제 Download PDF

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KR20240062104A
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김종승
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안주성
김일화
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고려대학교 산학협력단
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Abstract

본 발명은 하기 [화학식 1]로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염에 관한 것이다:
[화학식 1]

상기 [화학식 1]에서, n은 1 내지 30의 정수이다.

Description

교모세포종 약물내성 극복을 위한 테모졸로마이드 유사 항암제{Temozolomide analog anticancer drug for overcoming drug resistance in glioblastoma}
본 발명은 교모세포종 약물내성 극복을 위한 테모졸로마이드 유사 항암제에 관한 것이다.
교모세포종(Glioblastoma, GBM)은 미국에서 신경교종(glioma)의 대부분을 차지하며, 조직학적으로 두 번째로 빈번하게 발생하고, 5년 생존률이 5%에 불과한 뇌 및 중추신경계에서 가장 빈번한 악성 종양이다. 한국에서, 교모세포종은 전체 뇌 및 CNS 원암종의 151%를 차지하며, 전체 신경교종의 344%를 차지하는 가장 흔한 뇌상피종이다. 현재까지 교모세포종의 치료는 수술, 방사선 치료, 화학요법등이 있으나, 치료제에 대한 내성, 비정상적으로 활성화된 신호 전달 경로의 반복적 발생, 치료제의 효율적 전달의 어려움, 그리고 개개인의 종양 간의 현저한 공간적, 시간적 비균일성으로 인해 어려운 실정이다.
교모세포종 1차 치료제로 이용되고 있는 테모졸로마이드(Temozolomide, TMZ)는 경구용 소분자 DNA 알킬화 치료제로서, 생리적 pH 하 C-4에서 가수분해 공격에 의해 불안정한 5-(3-메틸트리아젠-1yl)-이미다졸-4-카복사미드(MTIC)를 생성하며, 상기 MTIC는 짧은 시간내에 5-아미노이미다졸-4-카복사마이드(AIC)와 반응성이 높은 메틸 다이아조늄 이온으로 빠르게 전환된다. 이어서, 상기 메틸 다이아조늄 양이온은 DNA 퓨린 잔기를 메틸화하여 O6-메틸구아닌(O6-MeG), N7-메틸구아닌(N7-MeG), N3-메틸아데닌(N3-MeA)을 형성한다. TMZ의 세포독성은 DNA에서 O6-MeG의 형성을 통해 매개되며, 결과적으로, 단일 가닥 및 이중 가닥 DNA의 절단을 유도하여 세포사멸을 일으킨다.
그러나 불행하게도, 특정 GBM 환자들은 TMZ 치료에 저항력이 있는 것으로 알려져 있다. O6-메틸구아닌-DNA 메틸전달효소(MGMT)의 과발현은 TMZ에 대한 저항의 주된 공급원으로, 상기 MGMT는 발암물질로부터 정상세포를 보호할 뿐만 아니라 TMZ와 같은 화학요법 알킬화 치료제로부터 암세포를 보호하는 것으로 알려져있다.
따라서, MGMT 억제제는 TMZ 저항을 극복하기 위한 필수적인 항암 치료 방법이 될 수 있으며, O6-[4-브로모테닐]-구아닌(O6-BTG, 로메구아트립)은 강력한 MGMT 억제제로 종양 세포에 대한 TMZ에 대한 민감성 효과가 다양한 연구에서 입증된바 있다.
전술한 기술적 배경하에서 본 발명자들은 TMZ 내성을 극복할 수 있는 치료제에 대해 예의 연구한 결과, 교모세포종 치료제인 테모졸로마이드(TMZ)의 에스터 아날로그와 MGMT 억제제인 로메구아트립이 연결된 구조를 갖는 신규 화합물(Lo-TMZ)을 합성하였으며, 상기 화합물이 산성 조건에서 안정하며, 종래 치료제에 비해 뇌혈관장벽 투과율이 현저하게 향상될 뿐만 아니라, MGMT (+) 세포에서 현저하게 향상된 세포 독성을 갖는다는 점을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
Davis, M. E., Glioblastoma: Overview of Disease and Treatment. Clin J Oncol Nurs 2016, 20 (5 Suppl), S2-8. Zhang, J.; Stevens, M. F.; Bradshaw, T. D., Temozolomide: mechanisms of action, repair and resistance. Curr Mol Pharmacol 2012, 5 (1), 102-14.
본 발명에서는 교모세포종에서 발생하는 MGMT에 의해 유도된 TMZ 내성을 극복하면서 동시에 치료 효과를 얻을 수 있는 항암제를 제공하고자 한다.
본 발명은 상기 과제를 해결하기 위하여, 하기 [화학식 1]로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 제공한다:
[화학식 1]
상기 [화학식 1]에서, n은 1 내지 30의 정수이다.
또한, 본 발명은 상기 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 특징 및 이점들은 첨부도면에 의거한 다음의 상세한 설명으로 더욱 명백해질 것이다.
이에 앞서 본 명세서 및 청구범위에 사용된 용어나 단어는 통상적이고 사전적인 의미로 해석되어서는 아니되며, 발명자가 그 자신의 발명을 가장 최선의 방법으로 설명하기 위해 용어의 개념을 적절하게 정의할 수 있다는 원칙에 입각하여 본 발명의 기술적 사상에 부합하는 의미와 개념으로 해석되어야만 한다.
본 발명에 따르면, 산성 조건에서 안정하며, 종래 치료제에 비해 뇌혈관장벽 투과율이 현저하게 향상될 뿐만 아니라, MGMT (+) 세포에서 현저하게 향상된 세포 독성을 갖는 화합물을 제공할 수 있다.
도 1은 본 발명의 [화학식 1]로 표시되는 화합물 Lo-TMZ의, Phosphate Buffered Saline (PBS) (10 mM), pH = 7.4, 37℃ 조건에서 12시간 동안의 가수분해 안정성 변화를 확인한 결과를 나타낸 것으로, (A)는 TMZ의 흡광 변화, (B)는 Lo-TMZ의 흡광 변화, (C)는 Lomeguatrib의 흡광 변화, (D)는 TMZ + Lomeguatrib의 흡광 변화를 나타낸 것이다.
도 2는 Lo-TMZ의 Phosphate Buffered Saline (PBS) (10 mM), pH = 6.2, 37℃ 조건에서 12시간 동안의 가수분해 안정성 변화를 확인한 결과를 나타낸 것으로, (A)는 TMZ의 흡광 변화, (B)는 Lo-TMZ의 흡광 변화, (C)는 Lomeguatrib의 흡광 변화, (D)는 TMZ + Lomeguatrib의 흡광 변화를 나타낸 것이다.
도 3의 (A)는 도 1의 결과를 바탕으로 TMZ와 Lo-TMZ의 배양 시간의 함수로서 정규화된 흡광도(A/A0)로부터 도출한 지수적 붕괴 곡선을 나타내고, (B)는 (A)의 결과를 바타으로 반감기를 요약한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 Lo-TMZ의 Log P, Log D와 같은 물리화학적 성질을 확인한 결과로, (A)는 Lo-TMZ의 pH 1부터 12까지의 흡광도 스펙트럼을 나타낸 것이고, (B)는 (A)의 330 nm 파장에서의 pH 의존적 흡광도를 나타내며, (C)는 산에 대한 일반 방정식 Log D = Log P - Log [1 + 10^((pH-pKa))]을 사용하여 계산된 Log D 값을 나타내며, (D)는 TMZ 및 Lo-TMZ의 뇌혈관장벽 투과성 선택 규칙을 요약한 결과를 나타낸 것이다.
도 5의 (A)는 TMZ 및 Lo-TMZ의 뇌혈관장벽 투과도를 Parallel Artificial Membrane Permeability Assay (PAMPA)-BBB assay kit를 사용하여 측정한 값을 나타낸 것이고, (B)는 이를 요약한 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 Lo-TMZ + Guanosine (50μM)의 시간 의존적 1H NMR 스펙트럼 변화를 나타낸 것이다. 이때 용액은 37°C에서 12시간 동안 D2O에서 배양되었다.
도 7은 U87MG 및 T98G 세포에서 MGMT 및 β-액틴의 단백질 발현 수준을 나타낸 것이다.
도 8의 (A)는 500 μM TMZ (1% DMSO) 처리 후 0 h, 24 h, 48 h, 96 h이 지남에 따른 U87MG 세포의 형태변화를 나타낸 것이고, (B)는 500 μM TMZ (1% DMSO) 처리 후 0 h, 24 h, 48 h, 96 h이 지남에 따른 T98G 세포의 형태변화를 나타낸 것이다.
도 9는 세포생존 특성을 분석하기 위해 U87MG와 T98G 세포를 96시간 동안 TMZ, Lo-TMZ, Lomeguatrib 및 TMZ + Lomeguatrib를 각각 처리한 결과로서, (A)는 TMZ를 다양한 농도로 처리한 (50~1000 μM) U87MG 및 T98G GBM 세포의 세포 생존력 측정 결과를 나타내고, (B)는 Lo-TMZ를 다양한 농도로 처리한 (10~200 μM) U87MG 및 T98G GBM 세포의 세포 생존력 측정 결과를 나타내며, (C)는 Lomeguatrib을 다양한 농도로 처리한 (10~200 μM) U87MG 및 T98G GBM 세포의 세포 생존력 측정 결과를 나타내고, (D)는 TMZ + Lomeguatrib을 다양한 농도로 처리한 (10~200 μM) U87MG 및 T98G GBM 세포의 세포 생존력 측정 결과를 나타내며, (E)는 이를 바탕으로 U87MG과 T98G 세포에서의 IC50 값을 도출한 결과를 나타낸 것이다.
도 10은 교모세포종에서 발생하는 MGMT에 의해 유도된 TMZ 내성을 극복하면서 동시에 치료 효과를 얻을 수 있는 본 발명에 따른 화합물 Lo-TMZ의 작용양식(MoA)을 나타낸 모식도이다.
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명에서는 종래 치료제에 비해 뇌혈관장벽 투과율이 현저하게 향상될 뿐만 아니라, MGMT (+) 세포에서 현저하게 향상된 세포 독성을 갖는, 교모세포종 치료제인 테모졸로마이드(TMZ)의 에스터 아날로그와 MGMT 억제제인 로메구아트립이 연결된 구조를 갖는 신규 화합물(Lo-TMZ)을 제공하고자 한다.
따라서, 본 발명은 하기 [화학식 1]로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 제공한다:
[화학식 1]
상기 [화학식 1]에서, n은 1 내지 30의 정수일 수 있고, 바람직하게는 1 내지 10의 정수(실시예에서 n은 2)일 수 있다
본 발명에 따르면, 상기 화합물은 O6-메틸구아닌-DNA 메틸전달효소(MGMT) 발현을 억제하는 것을 특징으로 할 수 있다(도 10).
본 발명에 따르면, 상기 화합물은 상기 화합물은 세포 내에서 분해되어 5-아미노이미다졸-4-카복사마이드(AIC)를 방출하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명은 또한, 상기 [화학식 1]로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
이때, 상기 암은 O6-메틸구아닌-DNA 메틸전달효소(MGMT)가 과발현된 것이라면 모두 가능하며, 바람직하게는 교모세포종일 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 약학 조성물은 암 질환의 예방 또는 치료용으로 알려진 다른 약물과 함께 복합 제제의 형태로 투여되거나, 또는 담체, 희석제, 보조제 및 안정화제 등과 같은 기타 성분을 포함할 수도 있다.
또한, 본 발명에 따른 조성물의 형태는 투여하고자 하는 모드에 따라서 다양하게 선택될 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니지만, 예를 들어 정제, 환약, 분말, 캡슐, 겔, 연고, 유체 또는 현탁액 등의 고상, 반고상 또는 액상의 투약 형태일 수 있고, 정확한 투약량의 단독 투여에 적절한 단위 투약 형태로 투여될 수 있으며, 경구 또는 비경구로 투여할 수 있고, 비경구 투여인 경우에는 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입 등으로 투여할 수 있다.
또한, 상기 조성물은 인간 투여를 위한 약학 조성물을 제형화하는데 일반적으로 사용되는 수성-기제 운반제로 정의되는 약학적으로 허용 가능한 담체, 희석제, 보조제, 안정화제를 원하는 제형에 의존하여 포함할 수 있다.
담체 (carrier)라 함은 세포 또는 조직 내로 화합물의 부가를 용이하게 하는 물질을 의미하고, 예를 들어, 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 탄수화물류 화합물 (예: 락토스, 아밀로스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 셀룰로스, 등), 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 염 용액, 알코올, 아라비아고무, 식물성 기름 (예: 옥수수 기름, 목화 종자유, 두유, 올리브유, 코코넛유), 폴리에틸렌 글리콜, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시 벤조에이트, 프로필히드록시 벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 희석제(diluent)라 함은 대상 화합물의 생물학적 활성 형태를 안정화시킬 뿐만 아니라, 화합물을 용해시키는 물에서 희석되는 물질로 정의되는 것으로 예를 들어, 희석제로는 증류수, 생리 식염수, 링거액, 포도당 용액, 및 행크스(Hank's) 용액 등일 수 있다. 안정화제는 단백질, 당질, 완충제 및 그 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 또한, 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 이러한 담체, 희석제, 보조제 및 안정화제 등과 같은 기타 성분의 유효량은 성분의 용해성, 생물학적 활성 등으로 환산하여 약학적으로 허용 가능한 제형을 획득하는데 유효한 양이다.
[실시예]
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
실험 방법
화합물 합성
하기 합성경로에 따라 본 발명에 따른 [화학식 1]로 표시되는 화합물(Lo-TMZ)을 합성하였다.
[합성경로]
화합물 1의 합성
1,4 Diazabicyclo[2.2.2]octane (DABCO) (7.94 g, 70.8 mmol, 3 eq)을 DMSO (80 mL)에 2-amino-6-chloropurine (4.00 g, 23.6 mmol, 1 eq) 용액에 넣고 상온에서 24시간 동안 교반하였다. 침전된 흰색은 여과로 수집되고 diethyl ether로 세척되었다. 고체는 DCM (200 mL)에서 1시간 동안 교반하였다. 용액을 여과하고 DCM으로 3회 세척한 후 진공 하에서 건조하여 고체 화합물 1 (6.26 g, 94%)을 수득하였다.
1H NMR (500 MHz, D2O_salt); 8.17 (s, 1H), 4.32 - 3.78 (m, 8H), 3.61 - 3.11 (m, 8H).
13C NMR (125 MHz, D2O_salt); 159.11, 158.20, 151.35, 143.76, 117.08, 53.54, 44.37.
MS (ESI): m/z calcd. for C11H16N7 +: 246.15, found: 246.25 [M]+
화합물 2의 합성
Temozolomide(250 mg, 1.29 mmol, 1 eq)를 2 mL의 황산에서 교반하였다. 상기 혼합물에 15°C 미만의 얼음욕조에서 2 mL 물에 sodium nitrite (324 mg, 4.64 mmol, 3.6 eq)가 들어있는 혼합물을 한 방울씩 첨가한 후, 상온에서 24시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물에 얼음물(5 mL)을 넣고 얼음욕조에서 1시간 동안 냉각하였다. 흰색 침전 고체를 여과하여 수집하여 흰색의 고체 화합물 2 (134 mg, 53%)를 수득하였다.
1H NMR (500 MHz, DMSO-d6); 13.30 (s, 1H), 8.81 (s, 1H), 3.87 (s, 4H).
13C NMR (125 MHz, DMSO-d6); 162.28, 139.53, 136.91, 129.52, 128.27, 36.75.
MS (ESI): m/z calcd. for C6H5N5O3: 195.04, found: 302.05 [M+ C4H10O3H]+
화합물 3의 합성
메탄올(50 mL)에 4-bromothiophene-2-carbaldehyde (2.00 g, 10.5 mmol, 1 eq)의 얼음 냉각 용액에 NaBH4 (792 mg, 20.9 mmol, 2 eq)를 첨가하였다. 생성된 혼합물을 30분 동안 가열하여 환류시켰다. 주변 온도로 냉각한 후 회전식 증발기에서 메탄올을 증발시켰다. 그리고 나서, 물을 혼합물에 첨가했다. 생성된 혼합물은 ethyl acetate/brine으로 추출되었다. 상기 유기층을 무수 sodium sulfate로 건조시킨 후 회전식 증발기에 농축한 후 컬럼 크로마토그래피(ethyl acetate/hexanes = 1:9)로 정제하여 화합물 3 (1.83 g)을 90% 수율로 수득하였다.
1H NMR (500 MHz, CDCl3); 7.12 (d, J = 1.5 Hz, 1H), 6.94 - 6.75 (m, 1H), 4.63 (d, J = 5.0 Hz, 2H), 3.85 (t, J = 5.1 Hz, 1H).
13C NMR (125 MHz, CDCl3); 145.82, 127.37, 122.36, 109.12, 59.25.
MS (ESI): m/z calcd. for C5H5BrOS: 191.92, found: 325.95 [M+(CH3OH)3(H2O)2]+
화합물 4의 합성
DMSO(10 mL)의 sodium hydride (213 mg, 8.89 mmol, 0.75 eq) 용액에 DMSO(15 mL)에 용해된 화합물 1 (2.29 g, 11.9 mmol, 1 eq)을 한 방울씩 첨가하여 1시간 동안 교반하였다. 상기 용액에 화합물 3를 첨가하고 상온에서 24시간 교반하였다. 그 후, 물 (20 mL)을 혼합물에 첨가하고 glacial acetic acid으로 중화시켰다. 반응이 완료된 후, 생성된 혼합물을 ethyl acetate/brine으로 추출하였다. 상기 유기층을 무수 sodium sulfate로 건조하고 회전식 증발기에 농축한 후 컬럼 크로마토그래피(5% MeOH/DCM)로 정제하여 화합물 4 (751 mg, 78%)를 수득하였다.
1H NMR (500 MHz, DMSO-d6); 12.50 (s, 1H), 7.84 (s, 1H), 7.70 (d, J = 1.5 Hz, 1H), 7.35 (d, J = 1.5 Hz, 1H), 6.35 (s, 2H), 5.63 (s, 2H).
13C NMR (125 MHz, DMSO-d6); 159.90, 159.48, 155.98, 141.17, 138.65, 131.26, 125.62, 113.83, 108.49, 61.01.
MS (ESI): m/z calcd. for C10H8BrN5OS: 324.96, found: 325.95 [M-H]-
화합물 5의 합성
화합물 4 (751mg, 2.30mmol, 1eq)와 potassium carbonate (636mg, 4.60mmol, 2eq)을 DMF (15mL)에 용해하였다. 이 반응 혼합물에 3-bromo-1-propanol (320mg, 2.30mmol, 1eq)을 첨가하였다. 실온에서 30분간 교반한 후 70℃에서 가열하여 밤새 교반한다. 반응이 완료된 후, 생성된 혼합물을ethyl acetate/brine으로 추출하였다. 상기 유기층을 무수 sodium sulfate로 건조하고 회전식 증발기에 농축한 후 컬럼 크로마토그래피 (3% MeOH/DCM)로 정제하여 화합물 5 (261 mg)을 30% 수율로 수득하였다.
1H NMR (500 MHz, DMSO-d6); 7.60 (s, 1H), 7.20 (d, J = 1.4 Hz, 1H), 7.13 - 7.11 (m, 1H), 5.65 (s, 2H), 5.02 (s, 2H), 4.43 - 4.06 (m, 3H), 3.58 - 3.38 (m, 2H), 1.95 (dt, J = 11.6, 5.9 Hz, 2H).
13C NMR (125 MHz, DMSO-d6); 159.87, 159.72, 155.04, 141.06, 140.75, 131.37, 125.70, 114.03, 108.49, 61.04, 58.06, 40.40, 32.70.
MS (ESI): m/z calcd. for C13H14BrN5O2S: 383.01, found: 438.05 [M+(H2O)3H]+
Lo- TMZ의 합성
화합물 2 (147mg, 0.755mmol, 1eq)와 1-[Bis(dimethylamino)methylene]-1H-1,2,3-triazolo[4,5-b]pyridinium 3-Oxide Hexafluorophosphate (HATU) (344mg, 0.906mmol, 1.2eq)을 DMF에 용해하였다. 혼합물을 0℃에서 10분간 교반하였다. 이 용액에 N, N-Diisopropylethylamine (DIPEA) (293mg, 2.26mmol, 3eq)을 첨가하고 15분간 교반하였다. 그 후, 상온에서 화합물 5 (290 mg, 0.755 mmol, 1.1 eq)를 첨가하였다. 그리고 하룻밤동안 용액을 교반하였다. 반응이 완료된 후, 생성된 혼합물을 ethyl acetate/brine으로 추출하였다. 유기층은 무수 sodium sulfate로 건조하고 회전 증발기에 농축한 후 PLC(5% MeOH/DCM)로 정제하여 화합물 Lo-TMZ를 수득하였다(31 mg, 수율 7.3%).
1H NMR (500 MHz, DMSO-d6); 8.48 (s, 1H), 7.73 (s, 1H), 7.20 (d, J = 1.5 Hz, 1H), 7.16 - 7.07 (m, 1H), 5.64 (d, J = 0.5 Hz, 2H), 4.97 (s, 2H), 4.49 (t, J = 5.9 Hz, 2H), 4.34 (t, J = 6.6 Hz, 2H), 4.07 (s, 4H), 2.46 - 2.27 (m, 2H).
13C NMR (125 MHz, DMSO-d6); 160.18, 160.12, 158.93, 154.44, 140.10, 139.82, 138.48, 135.86, 130.85, 128.74, 124.08, 115.60, 109.14, 62.29, 61.74, 53.43, 40.50, 36.73, 28.77.
MS (ESI): m/z calcd. for C19H17BrN10O4S: 560.03, found: 561.05 [M+H]+
UV/ Vis를 통한 TMZ , Lo- TMZ , Lomeguatrib 및 TMZ + Lomeguatrib의 가수분해 안정성 측정
TMZ, Lo-TMZ, Lomeguatrib 및 TMZ + Lomeguatrib의 안정성을 UV/Vis 분광법으로 2가지 다른 pH 조건(6.2 및 7.4)에서 조사하였다. 모든 UV-vis 흡수 스펙트럼은 Jasco V-750 분광 광도계(일본 도쿄)를 사용하여 얻었다. Lo-TMZ 및 기타 화합물의 5 mM 표준원액(stock solution)을 DMSO로 제조하였다. 이러한 표준원액들은 pH 6.2 및 pH 7.4 PBS 용액에서 50 μM으로 희석하였다. 흡광도는 서로 다른 시간 간격(0, 0.5, 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 6, 12 h)으로 측정하였다. 정규화된 흡광도(A/A0)는 흡광도의 감소에 의해 시간의 함수로 플롯되었으며, TMZ와 Lo-TMZ의 반감기는 곡선을 피팅시켜 결정하였다.
Lo- TMZ의 pH 의존적 흡광도
Lo-TMZ (50μM)의 흡광도는 다양한 pH 조건 (pH = 1-12)에서 기록하였다. pH는 NaOH 또는 HCl로 조절하였으며, 비선형 pKa 피팅으로 330 nm에서의 pH 의존적 흡광도를 얻었다.
1 H NMR 분광학적 연구
Lo-TMZ의 메틸화 능력을 나타내기 위해 D2O(pH = 7.4)를 이용하여 1H NMR 실험을 수행하였다. Lo-TMZ와 Guanosine은 d6-DMSO (10 mM)에 용해시켰다. Lo-TMZ와 Guanosine의 당량 몰 혼합물을 D2O(50μM)로 희석하고, 서로 다른 시간 간격(0, 1, 3, 6, 12시간)으로 스펙트럼을 수집하였다. 1H NMR 스펙트럼은 500 MHz NMR 분광기(Bruker)를 사용하여 얻었다.
Parallel Artificial Membrane Permeability Assay (PAMPA)-BBB 검사
PAMPA-BBB 검사는 제조업체의 지침에 따라 수행되었다 (BioAssay Systems, Hayward, CA, USA). 간단하게 dodecane의 4% lecithin 용액과 DMSO의 TMZ 및 Lo-TMZ의 10 mM 표준원액을 준비하였다. PBS에서 TMZ, Lo-TMZ 및 투과율 조절을 각각 500 μM로 희석하였으며, Acceptor plate 내의 웰에 300 μL PBS를 첨가하였다. Donor plate가 여전히 트레이에 있는 상태에서, 5 μL 4% lecithin 용액을 donor plate의 웰 막에 직접 첨가하였다. 그 후, 각 500 μM TMZ, Lo-TMZ 및 대조군 200 μL를 donor plate에 추가하였다. Donor plate를 조심스럽게 acceptor plate 웰에 넣고 37℃에서 24시간 동안 배양했다. 24시간 후, donor plate를 제거하고 분석을 위해 acceptor plate 웰에 있는 액체를 수집했다. 다음으로, 각 시험 화합물 및 대조군에 대한 200 μM 평형 표준이 작성되었다. 이러한 용액은 PBS에서 20μM 희석되었다. 흡광도는 UV/Vis 분광법으로 측정하여 투과율(Pe, 10-6 cm/s)을 측정하였다.
세포 배양
두 개의 교모세포종 세포주인 U87MG와 T98G 세포를 100 mm 배양 접시에서 배양하고 37℃, 5% CO2의 가습 대기에서 유지하였다. 두 세포주는 DMEM에서 배양하였으며, 10%의 태아 소 혈청과 1%의 페니실린 및 스트렙토마이신이 함유되었다. 배양 접시가 70% 이상에 도달했을 때, 0.05%의 트립신-EDTA를 사용하여 배양을 실시하고 2~3일마다 새로운 세포 배양 접시에 세포를 심었다.
웨스턴 블랏
단백질 수준에서 U87MG 및 T98G 세포에서 MGMT 발현은 웨스턴 블랏 분석을 통해 확인하였다. 간단하게, 세포가 60 mm 배양 접시에서 80-90%에 도달했을 때 샘플링하였다. 세포 단백질을 추출하기 위해 protease inhibitor cocktail을 1% 함유한 radioimmunoprecipitation assay (RIPA) lysis buffer를 사용하여 세포를 2시간 동안 분해하여 아이스박스에서 30분마다 볼텍싱하였다. 13,000 RPM, 4℃에서 1시간 동안 원심분리 후 Pierce BCA 단백질 분석 키트(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)를 사용한 총 단백질 정량화를 진행하였다. 그런 다음 12% sodium dodecyl sulfate poly-acrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) gel에 샘플을 로딩하였다. 분리된 단백질 밴드를 polyvinylidene difluoride (PVDF) membranes (Merck Millipore)으로 옮기고, 상온에서 5% skim milk로 블라킹하였다. 그 후, membrane을 MGMT 항체(Cell Signaling Technology; #58121, 1:1000), β-액틴(Santa Cruz Biotechnology; SC-47778, 1:1000)으로 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다. TBS-T로 3회 세척한 후, membrane은 anti-rabbit horseradish peroxidase (HRP)-conjugated secondary antibodies (Santa Cruz Biotechnology; 1:3,000)와 anti-mouse horseradish peroxidase (HRP)-conjugated secondary antibodies (GeneTex, Irvine, CA, USA; 1:3,000)로 12시간 동안 상온에서 인큐베이션하였다. 면역반응성 단백질 밴드를 검출하기 위해 제조사의 지침에 따라 강화된 chemiluminescence 시약(Luminate, Merk Millipore)을 사용하였고, LAS 4000 mini (GE Healthcare, Tokyo, Japan) 이미징 시스템을 사용하여 시각화하였다.
세포독성 분석
U87MG와 T98G 교모세포종 세포주 모두에서 TMZ, Lo-TMZ, Lomeguatrib 및 TMZ + Lomeguatrib에 대한 IC50 값을 결정하기 위해 96웰 플레이트에 각각 2.0 x 103, 1.0 x 103 cells/well을 시딩하였다. 이 세포들을 24시간 동안 벽에 붙이고 각 농도의 화합물로 처리되어 96시간 동안 배양하였다. 배지를 제거한 후 각 웰을 PBS로 세척하였다. 세포독성 분석은 살아있는 세포의 미토콘드리아에서 NAD(P)H를 검출하기 위해 WST-8 분석을 사용하여 수행하였다. WST 용액을 셀이 있는 플레이트에 넣고 2시간 동안 배양한 후 마이크로 플레이트 리더를 사용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.
결과 및 고찰
Lo- TMZ의 합성
본 발명에 따른 [화학식 1]로 표시되는 화합물(Lo-TMZ)은 상기 [합성 경로]에 따른 절차를 통해 합성하였다. 화합물 1은 1,4-diazabicyclo[2.2.2]octane (DABCO)과의 직접 반응에 의해 합성되었고, 화합물 2는 TMZ의 아마이드를 카르복실산으로 가수분해하여 합성하였다. 화합물 3은 NaBH4를 사용하여 알데하이드를 1차 알코올로 환원시켜 합성하였다. 그런 다음, 화합물 1과 화합물 3을 sodium hydride과의 SN2 반응에 의해 결합하였다. 그 후, potassium carbonate을 염기로 하여 SN2 반응을 통해 3-bromo-1-propanol과 반응하여 화합물 5를 얻었다. 마지막으로 화합물 2와 화합물 5를 1-[Bis(dimethylamino)methylene]-1H-1,2,3-triazolo[4,5-b] pyridinium 3-Oxide Hexafluorophosphate (HATU)와 에스터 커플링 반응으로 결합시켜 Lo-TMZ를 합성하였다. 모든 합성된 중간 생성물과 산물은 1H/13C 핵자기공명 (nuclear magnetic resonance, NMR)과 전기분무 이온화 질량 분석(electrospray ionization mass spectrometry)을 통해 확인하였다.
UV-vis 흡수 스펙트럼을 통한 가수분해 안정성
두 가지 서로 다른 pH 조건(6.2 및 7.4)에서 TMZ, Lo-TMZ, Lomeguatrib 및 TMZ + Lomeguatrib의 가수분해 안정성을 UV-vis spectroscopy로 모니터링하였다. TMZ는 산성 pH 조건에서 안정하다는 것은 잘 알려져 있으며, pH가 7보다 클 경우 methyl diazonium을 생성하기 위한 비활성 중간체인 MTIC로 빠르게 가수분해될 수 있다. MTIC의 반감기는 약 3분이기 때문에 수용액에서는 검출할 수 없다. 따라서 MTIC는 UV/vis 분광법에 의해 검출될 수 있는 AIC로 분해된다. 인산염 완충액(PBS, 10 mM, pH = 7.4)에서 TMZ의 UV 스펙트럼은 TMZ가 저하됨에 따라 330 nm에서 흡수가 감소하였고, 266 nm에서 부산물 AIC의 새로운 흡수 피크가 나타났다(도 1A). Lo-TMZ 및 TMZ + Lomeguatrib의 흡수 스펙트럼은 각각 TMZ 및 Lomeguatrib에 해당하는 330 및 282-286 nm에서 흡수 밴드를 보였으며, 게다가, 330 nm에서의 세기는 12시간 후에 감소하고 이후 거의 사라졌다. 동시에 269~274 nm에서의 흡광도는 AIC 정점의 출현에 의해 증가하였다(도 1B, 1C). 이러한 결과를 통해, Lo-TMZ가 TMZ와 lomeguatrib을 포함하며 TMZ와 마찬가지로 AIC를 방출한다는 것을 확인하였고, 또한, 인산염 완충액(PBS, 10 mM, pH = 6.2)에서의 UV 스펙트럼을 통해 Lo-TMZ가 산성 조건에서도 안정한 것을 확인하였다(도 2).
TMZ 및 Lo-TMZ의 반감기
TMZ와 Lo-TMZ의 배양 시간의 함수로서 정규화된 흡광도(A/A0)를 그려 지수적 붕괴 곡선을 얻어 도 3A에 나타내고, 반감기 값은 도 3B에 나타내었다. 2018년, Svec 등은 TMZ의 C8 위치에서 치환된 것이 가수분해 부위인 C4로 직접 전달되어 결과적으로 가수분해 안정성에 영향을 미친다고 보고한바 있다. 에스터 유도체는 TMZ과 비교하여 유사한 반감기를 나타내었으며, Lo-TMZ의 분해율은 TMZ와 유사한 것으로 나타난바, Lo-TMZ가 TMZ와 유사한 안정성을 나타냄을 확인하엿다.
물리적 화학적 특성: Log P 및 Log D
Lo-TMZ의 친유성을 입증하기 위해 분할 계수(Log P)와 분포 계수(Log D) 값을 계산하였다. 친유성은 생물학적 막을 뚫고 목표에 도달하는 약물의 효율성을 확인하기 위한 약물 개발에서 중요한 매개 변수이다. Log P는 화합물의 물리화학적 특성을 측정하기 위해 널리 사용되는 측정값이며, 리핀스키의 "5의 법칙"의 구성 요소이다. Log P 값은 중성 형태의 화합물 분할 상수를 나타내며, Log D는 임의의 pH에서 중성 및 이온화된 형태의 화합물 분할 계수를 나타낸다. Log D 값을 계산하기 위해 다양한 pH 조건(pH = 1-12)에서의 Lo-TMZ의 UV 흡수 스펙트럼과 비선형 pKa 피팅으로 330 nm에서의 pH 의존적 흡광도를 수득하였고(도 4A, 4B), 이를 통해 Lo-TMZ가 pH 7.4에서 중립 형태를 유지하고 있음을 확인하였다. Log D 값은 산에 대한 일반 방정식 Log D = Log P - Log [1 + 10^((pH-pKa))]을 사용하여 계산하고 그 결과를 도 4C에 나타내었고, Lo-TMZ 특성을 뇌혈관 장벽 투과성 선택 규칙과 비교한 결과는 도 4D에 나타내었다. 상기 결과를 통해, Lo-TMZ의 Log P 및 Log D 값이 TMZ와 비교하여 이상적인 범위에 더 적합함을 확인하였다.
Parallel Artificial Permeability Assay(PAMPA) 분석 결과
Lo-TMZ의 뇌혈관장벽 투과성을 확인하기 위하여 Parallel Artificial Permeability Assay(PAMPA)-BBB 분석을 실시하고, 그 결과를 하기 도 5A, 5B에 나타내었다. 그 결과, 본 발명의 화합물 Lo-TMZ는 TMZ보다 약 40배 높은 뇌혈관장벽 투과성을 나타내었는바, 뇌혈관장벽 투과율이 현저하게 향상됨을 확인하였다.
Lo-TMZ의 메틸화 능력을 위한 1 H NMR 분광학적 연구
Lo-TMZ의 메틸화 능력을 확인하기 위해 1H NMR 실험을 수행하였다. 10 mM의 Lo-TMZ 표준원액과 guanosine을 DMSO-d6로 제조하였으며, Lo-TMZ와 guanosine의 등가 몰 혼합물을 D2O (50 μM)로 희석하고, 스펙트럼을 다른 시간 간격 (0, 1, 3, 6, 12 h)으로 수집하였다.
분석 결과, TMZ 부분은 가수분해로 인해 Ha (8.3-8.5 ppm)와 Hb (3.9-4.1 ppm) 신호가 사라지고, 이와 동시에 새로운 메틸픽 (3.2 ppm)이 나타났으며, 시간이 지남에 따라 강도가 증가하는 것으로 나타났다(도 6). 이러한 결과는 guanosine이 Lo-TMZ의 TMZ 부분이 분해되면서 메틸화되었음을 시사한다.
In vitro 실험: 웨스턴 블랏
MGMT의 과잉 발현은 TMZ 내성의 주요 공급원인바, 웨스턴 블랏 실험을 수행하여 U87MG 및 T98G 교모세포종 세포에서 MGMT 발현 수준을 측정하고 그 결과를 도 7에 나타내었다.
측정 결과, 하우스키핑 단백질 β-actin과 비교하여, T98G 세포에서는 MGMT의 발현이 높았고, U87MG 세포에서는 MGMT 단백질 발현이 검출되지 않았다. 이러한 결과를 통해, U87MG와 T98G 세포가 각각 MGMT(-)와 MGMT(+) 세포주임을 확인하였다.
In vitro 실험: 세포 형태 이미지
배양 시간을 결정하기 위해 최대 96시간 동안 500μM TMZ로 세포를 처리하고, 24시간마다 형광현미경으로 시간 의존적 세포 형태 변화 이미지를 수득하고 이를 도 8에 나타내었다.
도 8의 결과를 통해 TMZ의 명백한 독성은 96시간 이후에 나타나는 것을 확인하였으며, 이러한 결과로부터, 세포 독성 분석시 배양 시간을 96시간으로 설정하였다.
In vitro 실험: 세포 독성 분석
세포 독성 분석을 위해 U87MG와 T98G 세포를 TMZ, Lo-TMZ, Lomeguatrib 및 TMZ + Lomeguatrib의 농도를 증가시켜 96시간 동안 처리하여 세포 독성을 평가하였고, 그 결과를 도 9에 나타내었다.
도 9에서와 같이, MGMT 매개 TMZ 내성으로 인해 T98G 세포 (MGMT (+))에서 TMZ의 IC50 값 (IC50 = 446.5 μM)이 U87MG 세포 (MGMT (-))에서보다 훨씬 높게 나타났다(IC50 = 47.19 μM). 반면 Lo-TMZ (IC50 = 30.74μM)는 T98G 세포에서 TMZ (IC50 = 446.5μM) 대비 14.5배 감소한 IC50 값을 나타내었다. 이러한 결과를 통해, 본 발명의 화합물 Lo-TMZ가 MGMT (+) T98G 세포에서 현저하게 향상된 세포 독성을 나타냄을 확인하였다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시형태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (6)

  1. 하기 [화학식 1]로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염:
    [화학식 1]

    상기 [화학식 1]에서, n은 1 내지 30의 정수이다.
  2. 제1항에 있어서,
    O6-메틸구아닌-DNA 메틸전달효소(MGMT) 발현을 억제하는 것을 특징으로 하는, 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 화합물은 세포 내에서 분해되어 5-아미노이미다졸-4-카복사마이드(AIC)를 방출하는 것을 특징으로 하는, 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염.
  4. 제1항에 따른 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 암은 O6-메틸구아닌-DNA 메틸전달효소(MGMT)가 과발현된 것을 특징으로 하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 암은 교모세포종인 것을 특징으로 하는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물.
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Non-Patent Citations (2)

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Davis, M. E., Glioblastoma: Overview of Disease and Treatment. Clin J Oncol Nurs 2016, 20 (5 Suppl), S2-8.
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