DE69509417T2 - Herstellungsverfahren des Enzyms 7beta-(4-carboxy-butanamido)-cephalosporanischen Säureacylase - Google Patents
Herstellungsverfahren des Enzyms 7beta-(4-carboxy-butanamido)-cephalosporanischen SäureacylaseInfo
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Description
- Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung großer Mengen von 7-(4-carboxybutanamid)-Cephalosporansäure-Acylase ("GA") Enzym, welches Verfahren besteht im Anzüchten eines rekombinanten Escherichia coli K12 Stammes unter geeigneten Kulturbedingungen, und der anschließenden Extraktion des Enzyms aus der gewonnenen Kultur. Die Herstellung des Enzyms wird kontrolliert mittels eines bestimmten Expressionssystems, welches mit Hilfe von Corn Steep Liquor (einer wässerigen Getreidelösung), einem extrem kostengünstigen Bestandteil des Kulturmediums, induziert werden kann. Des weiteren wird vor allem ein E. coli K12 Derivat eingesetzt, welches in den EEC-Bestimmungen als "sicher" eingestuft wird.
- Das Enzym wird verwandt in der enzymatischen Aufbereitung von 7-Amino-Cephalosporansäure, ausgehend von 7-(4- carboxybutanamid)- Cephalosporansäure.
- Zur Durchführung der Erfindung war insbesondere notwendig: Isolieren eines genetischen Codes für 7-(4- carboxybutanamid)- Cephalosporansäure-Acylase Enzym von Pseudomonas sp. 146H9 (NCIMB40474) und SY77-1(Ferm2410) mit Hilfe von rekombinanten DNA-Verfahren;
- Klonen des besagten Gens in einen Escherichia coli K12 Mikroorganismus, welcher als "sicher" klassifiziert ist (Klasse P1);
- Herstellen großer Mengen des Enzyms mittels Fermentation von besagtem E. coli Stamm;
- Extrahieren und Immobilisieren des Enzyms für die enzymatische Aufbereitung von 7-Aminocephalosporansäure und von 7-(4- carboxybutanamid)-Cephalosporansäure.
- In der Natur gibt es einige Mikroorganismen, welche 7-(4- carboxybutanamid)-Cephalosporansäure-Acylase (GA) bilden können. Es wurde festgestellt, daß dieses Phänomen besonders in folgenden Veröffentlichungen beschrieben ist: Pseudomonas spp. (Shibuya Y. et al (1981) Agr. Biol. Chem. 45, 1561; Matsuda A. et al. (1985) J. Bacteriol. 163, 1222; Matsuda A. et al. (1987) J. Bacteriol. 169, 5815; Aramori I. et al. J. Ferm. & Bioeng. 72, 227 (1991)).
- Die Durchführung eines jeden industriellen Prozesses zur Herstellung des GA-Enzyms ist durch das niedrige Produktivitätsniveau der oben genannten Mikroorganismen (3-4 U/l) erschwert.
- Ein erfolgreiches Verfahren, welches zu einer deutlichen Produktionssteigerung des GA-Enzyms führt, besteht in der Verwendung von rekombinanten DNA Verfahren. In der Praxis kann mit Hilfe dieses Verfahrens das kodierende Gen des GA-Enzyms vom produzierenden Mikroorganismus isoliert werden, um dann in einen E. coli-Stamm, in welchem seine Expression von einem starken Promotor kontrolliert wird, transferiert zu werden. Mit Hilfe eines solchen Verfahrens modifizierten Croux et al. (EP 0 469 919 A2) einen E. coli-K12-Stamm und nach dessen Züchtung auf einem geeigneten Kulturmedium, erhielten sie einen deutlichen Ertragsanstieg, wobei ein Produktionsniveau von 3000 U/L erreicht wurde. Leider handelt es sich bei dem von ihnen verwandten Mikroorganismus um einen wilden Typ ohne Repressoren, weshalb die Enzymproduktion unter Einsatz von Induktoren weder reguliert noch kontrolliert werden kann.
- Aufgrund der oben genannten Gründe, sind die von Croux et al. verwandten Mikroorganismen laut EEC Richtlinien in Klasse P3 eingestuft, für welche erhebliche Einschränkungen vorgesehen sind.
- Ein weiteres Beispiel für verbesserte Herstellungsbedingungen von Mikroorganismen, welche durch die Verwendung von rekombinanten DNA-Verfahren erreicht werden, ist in der EP 0504 798 A1 (10,000 U/L) beschrieben.
- In diesem Fall wird ein E. coli-K12-Derivat verwendet, welches als "sicher" eingestuft wird und zur Klasse P2 gehört, und deshalb nicht den oben erwähnten Beschränkungen unterliegt. Das besagte E. coli-Derivat enthält Repressoren, welche die Produktion von enzymatischen Reaktionen verhindern, solange kein geeigneter Induktor vorhanden ist.
- Das einzige Beispiel von einem in der Fachliteratur erwähnten Induktor ist IPTG (Isopropyl BD-thioglactopyranoside), eine extrem kostspielige Substanz.
- Der betreffende Antragsteller erzielte nun einen unerwarteten Erfolg, indem er ein GA Expressionssystem herausfand, welches durch den Einsatz einer extrem kostengünstigen Substanz induziert werden kann, namentlich mit wässeriger Getreidelösung, welche auch ein Bestandteil des Kulturmediums ist.
- Durch das besagte System können große Mengen von Enzymen hergestellt werden, selbst wenn, wie bei den Wirt-Organismen mit Expressionssystem, ein bestimmtes Derivat von E. coli K12 verwendet wird, welches als ein ganz sicheres (Klasse P1) von den EEC Richtlinien eingestuft ist.
- Deshalb betrifft vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung großer Mengen von 7-(4-carboxybutanamid)- Cephalosporansäure Acylase (GA) Enzym, welches Verfahren das Züchten eines E. coli - Stammes auf einem geeigneten Nährboden für Kulturen, der die Acylase Kodierungs-Sequenz enthält, und anschließend das Herauslösen des Enzyms aus der resultierenden Kultur umfaßt, dadurch gekennzeichnet, daß für die Züchtung Corn Steep Liquor (wässerige Getreidelösung) benutzt wird, und daß als Herstellungs-Mikroorganismus ein E. coli- Stamm verwendet wird, welcher ausgewählt ist aus NCIMB40560, NCIMB40559, NCIMB40592 und NCIMB40593.
- Um ein solch außerordentlich produktives E. coli-Derivat zu erhalten, mußte ein Verfahren entwickelt werden, welches folgende Schritte enthält:
- (a) Andauern gesamter DNA eines Mikroorganismus, welche die Sequenz-Kodierung für GA-Enzym enthält und Herstellen einer Bakteriophage DNA-Bibliothek;
- (b) Infizieren des E. coli mit den Phagen der Bibliothek;
- (c) Identifizieren einer Menge von E. coli Klonen, welche einen Anteil von Acylase-Sequenz enthält, mittels Einsatz von gereinigtem Antiserum, welches speziell gegen die betreffende Acylase gerichtet ist;
- (d) Aussieben von E. coli-Klonen, welche die gesamte Acylase- Sequenz enthalten, durch Hybridisation mittels Sonde, welche eine Teilsequenz des Acylase-Gens enthält und Bestimmung deren enzymatischen Reaktion;
- (e) Isolieren des Plasmids, Kennzeichnen des notwendigen DNA-Bereiches für die GA Synthese, und dessen Einführen in einen sehr präzisen Expressions-Vektor des E. coli;
- (f) Modifizieren des sehr präzisen Expressions-Vektors, um zu verhindern, daß bei der Herstellung von β-Lactamase Stamm-Plasmid aufgenommen wird.
- (g) Optimieren des Wachstums von Expressions-Plasmid, welches E. coli enthält, mittels batch-Fermentation und sog. fed-batch-Fermentation, wobei verschiedene Carbon- und Nitrogenquellen verwendet werden.
- Als Spender der DNA wurden die Pseudomonas-Stämme 146H9 (NCIMB40474) und SY77-1 (Ferm2410) verwendet. Diese können nur kleine Mengen vom GA-Enzym (jeweils 3 U/l und 4 U/l) produzieren.
- Chromosomale DNA wurde extrahiert, gereinigt und teilweise mit Restriktionsenzymen aufgeschlossen. Die auf diese Weise erhaltenen DNA-Fragmente wurden an ihren Endgliedern behandelt und wurden dann in einen Bakteriophagen-lambdaZAII- Vektor (Stratagene) eingeführt. Rekombinante Phagen wurden mit E. coli Zellen beschichtet, um eine Pseudomonas 146H9 (NCIMB40474) und SY77-1 (Ferm2410) Bakteriophage lambda lambdaZAPII Gen-Bibliothek zu erzeugen.
- Um die Bibliotheken, welche aus der Genome tragenden DNA aus Pseudomonas-Stämmen gebildet wurden, zu sieben, wurden Antikörper vorbereitet, welche die Fähigkeit besitzen das GA- Enzym gemäß folgender Vorgehensweise zuerkennen:
- Das von Pseudomonas-Stamm 146H9 produzierte GA-Enzym wurde zuerst gereinigt und dann Kaninchen injiziert. Dann wurde GA- spezifisches Antiserum gewonnen, dessen Sensitivität sich für das Sieben der Bibliothek als optimal erwies (nachdem dieses Antiserum im Verhältnis von 200-1000x verdünnt wurde, kann es immer noch insbesondere 10-100 Pg vom GA Enzym erkennen, welches auf einem Nitrocellulose-Papierfilter gesprenkelt ist.
- Die positive Reaktion zwischen dem Antikörper und dem Enzym wurde durch das Hinzufügen von E. coli-zellularem Lysat zur Versuchsprobe, nicht verändert. Das Antiserum gegen GA vom Pseudomonas 146H9 Stamm (NCIMB40474) kann auch gereinigte GA vom Pseudomonas-Stamm-SY77-1 (Ferm2410) erkennen.
- Auf diese Weise wurden Teilsequenzen der GA-DNA isoliert. Nachdem die besagten Sequenzen gekennzeichnet wurden und als Sonden zur Sondierung besagter Gen-Bibliotheken verwendet wurden, konnten mittels dieser Sequenzen vollständige GA- Sequenzen isoliert werden.
- Die Existenz von Acylase-Genen in der Bibliothek, welche mit der DNA vom Pseudomonas-Stamm-146H9 (NCIMB40474) und SY77-1 (Ferm 2410) erzeugt wurden, wurde durch zwei verschiedene Vorgehensweisen nochmals bestätigt:
- (1) Messen der Acylaseaktivität von transformierten Kolonien mittels HPLC oder colorimetrischer Verfahren [Matsuda A. et al. (1985) J. Bacteriol. 163, 1222; Matsuda A. et al. (1987) J. Bacteriol. 169; Aramori I et al. J. Ferm. & Bioeng. 72, (1991)].
- (2) Kreuzung mit oligonucleotiden Sonden, welche den schon bekannten Sequenzen vom Acylase-Gen strukturell ähnlich sind und deshalb die Eigenschaft besitzen, Plasmide, welche die betreffenden Gene (EP 0 504 798 A1)enthalten, zu erkennen.
- Diejenigen E. coli - Zellen, welche die Plasmide mit den identifizierten Sequenzen enthalten, zeigten Acylase- Aktivität.
- Diejenigen DNA-Fragmente, welche GA-Gene enthielten, wurden dann durch Entfernen jeglicher anhängender DNA, welche keine Enzyme codiert, begrenzt.
- Die resultierenden Fragmente wurden dann in einen Expressions-Vektor von E. coli geklont und wurden dann mittels eines stark induzierenden Promotors kontrolliert.
- Mittels Promotor-Induktion konnte eine Acylase-Aktivität, sowohl volumetrisch als auch spezifisch, erzielt werden, welche größer war als diejenige der Spender-Pseudomonas-146H9- (NCIMB40474) und SY77-1-(Ferm2410)-Stämme.
- Um die GA-Gene im E. coli zu isolieren, wurden die Vektoren lambdaZAP II und pBluescript SK+/-(Stratagene) benutzt.
- Um das Fusionsprotein β-Galactosidase-GA in einer Gen- Bibliothek von sowohl Bakteriophage und von Kolonien mit Plasmiden auszudrücken, können ebenso solche Vektoren wie lambdagt11, lambdagt22 oder Plasmide, wie die pUC Serie, oder sogar noch andere Vektoren mit Expressionsmodulen zur Protein-Fusion benutzt werden.
- Im folgenden wird eine detaillierte Beschreibung vom Klonen der Acylase Gene gegeben.
- Chromosomale DNA von Spender-Stämmen wurde teilweise mit einem regelmäßig spaltenden Restriktionsenzym aufgeschlossen und die entstehenden Fragmente wurden nach ihrer Länge ausgewählt; die Fragmente, welche in eine gewünschte Längenkategorie fielen, wurden mit DNA modifizierenden Enzymen, wie etwa Nuclease (Bal31), behandelt, um zufällige terminale Enden zu erzeugen, und DNA Polymerase (Klenow-Fragment), um besagte terminale Enden zu füllen. Danach wurden diese Fragmente mit Bindegliedern versehen, welche aus mittels T4-DNA-Ligase phosphorylierten Oligonucleotiden bestehen. Die auf diese Weise behandelten Fragmente wurden dann gespaltet mit einem Restriktionsenzym (welches die Bindeglied-Sequenz spaltet) und wurden dann von den nicht gebundenen Bindegliedern durch Gelfiltration abgetrennt. Der DNA-Vektor (ein Bakteriophage im Falle einer Phagen-Gen-Bibliothek oder ein Plasmid im Falle einer Plasmid-Gen-Bibliothek) wurde ebenso mit einem Restriktionsenzym aufgeschlossen, welches auf terminale Enden der DNA Komplementär-Sequenzen zu den schon auf den terminalen Enden der modifizierten Spender-DNA bestehenden erzeugt.
- Sowohl der Vektor als auch die so erhaltenen Fragmente wurden dann mittels T4-DNA-Ligase verbunden. Die rekombinanten Vektoren, welche durch die Einführung von einem oder mehreren DNA-Fragmenten von Spender-Mikroorganismen in die Vektoren entstehen, kann verwendet werden um einen geeigneten Mikroorganismus, wie etwa E. coli XL1-Blue, mittels eines Infektions weges (Phagen-Gen-Bibliothek) oder mit Hilfe eines konventionellen Transformationsverfahrens, wie in Maniatis, T et al. (1989) Molecular Cloning beschrieben, zu transformieren: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, U.S.A. (Plasmid-Gen-Bibliothek).
- Die Gen-Bibliothek wird plattiert und induziert, um die Fusions-Proteine auszudrücken. Auf den Platten werden dann nacheinander Nitrocellulose-Membranen eingesetzt, um die erzeugten Proteine zu binden. Die Membranen werden dann mittels eines Immuntestes geprüft, indem sie einem spezifischen Antiserum für GA (in einer geeigneten Dilution) ausgesetzt werden, wodurch zu erkennen ist, welcher Plaque oder welche Kolonie eine GA-Teilsequenz enthält. Ist der gewünschte Vektor lokalisiert, wird eine Restriktionskarte von der Einlage zubereitet.
- Unter weiterer Benutzung der oben beschriebenen Gen- Bibliothek wird ihre DNA analysiert, nachdem sie zu einer Nitrocellulose-Membran mittels des "plaque or colony lifting" (Plaque- oder Kolonie-Hervorhebung)- Verfahrens [Maniatis, T et al. (1989)] transferiert wurde.
- Als nächstes kommt die DNA-DNA Hybridisierung zum Einsatz: die gekennzeichnete Sonde (durch konventionelle Verfahren mittels des "Boehringer Non-Radioactive Labelling Kit"), dargestellt durch ein Fragment, welches sich in der Nähe des β- galactosidasischen Teils des Fusionsproteins befindet, kann die Gegenwart des Gens, welches dem GA-Enzym in der Gen- Bibliothek entspricht, beweisen.
- Wird die DNA-DNA Hybridisierung unter günstigen Bedingungen durchgeführt, verbindet sich die GA-spezifische Sonde nur mit den rekombinanten Vektoren, welche entweder einen Teil oder den Gencode in voller Länge enthalten.
- Die auf diese Art und Weise lokalisierten Plaques oder Kolonien wurden dann getestet hinsichtlich ihrer Fähigkeit GA zu erzeugen und eine Restriktionskarte von der Einlage wurde zubereitet. Das DNA-Fragment wurde dann auf eine Mindestlänge begrenzt, welche notwendig ist für die Acylase-Aktivitäts- Synthese und wurde dann einer E. coli-Wirtszelle zugeführt.
- Wenn die Restriktionskarte von der Einlage definiert ist, können Tilgungen auf dem DNA Fragment mittels Restriktionsenzymen oder DNA-Nucleasen, durchgeführt werden, um die GA-Gen- Position genauer zu definieren.
- Die Restriktionskarte wurde bestimmt mittels verschiedener Restriktionsenzyme, und die Acylase-Aktivität wurde quantifiziert mit Hilfe von konventionellen spectralphotometrischen oder HPLC-Verfahren.
- Das GA-Expressionsniveau in E. coli wurde durch schon bekannte konventionelle gentechnologische Verfahren begünstigt. Gemäß eines dieser Verfahren, kam das betreffende Gen unter die Kontrolle von E. coli-Sequenzen, wie Placuvs, Ptac, Ptrc, Ptrp, PphoA, Plpp, PL, PR, Plambda&sub1;&sub0;, oder andere für Gen- Expression in E. coli eingesetzte Promotoren.
- In unserem Falle wurde der rekombinante Vektor, welcher das GA-Gen enthält, mit verschiedenen Restriktionsenzymen aufgeschlossen. Die resultierenden DNA-Fragmente wurden mit Hilfe von T4-DNA-Ligase an Plasmide, wie etwa pBR322, pBluescript, pUC18, pACYC184, gebunden, oder an andere Plasmide, welche zuvor mit Restriktionsenzymen aufgeschlossen wurden, und welche Stellen aufweisen, die mit den Fragmenten, welche sie enthalten sollen, kompatibel sind. Die resultierenden rekombinanten Vektoren wurden dann mittels Transformation in einen E. coli-Stamm, wie XL1 Blue, eingeführt. Solche GA- produzierende Transformanten, können erkannt werden, indem die Acylase-Aktivität ihrer zellularen Extrakte gemessen wird. Die Position des Galgens auf dem DNA-Fragment wurde mittels der Restriktionskarte des rekombinanten Vektors bestimmt. Das Fragment, welches das Gen enthält, wird passend begrenzt und dann in ein Plasmid, mit einer Ptac-Promotor- Sequenz [de Boer, H et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA80: 21], z. B., pKK223-3 oder pDR540, oder eine Ptrc- Promotor-Sequenz, wie etwa pKK233-2 und pTrc99A (Pharmacia), eingeführt. Ein rekombinanter Vektor mit GA-Gen, welches sich unter der Kontrolle von Ptac-Promotor befindet, wurde verwendet, um E. coli XL1 Blue-Zellen zu transformieren, und GA- Aktivität wurde gemäß obiger Beschreibung geprüft.
- Auf diese Art und Weise erhielt man E. coli-Stämme, welche weitaus mehr GA produzieren können, als E. coli-Stämme, welche die einzigen aus Pseudomonas 146H9 (NCIMB40474) und SY77-1 (Ferm2410) gewonnenen GA-Gene enthalten. Der in diesem Schritt erzielte hohe Produktionsertrag ist zurückzuführen auf den Einsatz von spezifischen Promotor-Sequenzen für E. coli, welche ein hohes Expressionsniveau des Gens bestimmen. Tatsächlich hat das GA-Gen einen eigenen Promotor, welcher zwar in Pseudomonas, aber nicht in E. coli gut funktioniert; wenn es deshalb in diesem Wirt angesiedelt wird, zeigt das besagte Gene nur ein geringes Expressionsniveau. Eine Änderung des Promotors führt zu einer deutlichen Verbesserung des Verfahrens der vorliegenden Erfindung.
- Bei den E. coli-Stämmen, welche für das hohe Expressionsniveau der GA-Gene von Pseudomonas 146H9 (NCIMB40474) und SY77-1 (Ferm2410) verwendet wurden, kann es sich z. B. um XL1 Blue, JM105, W3110, DH1 und so weiter handeln.
- Das Ampicillin-resistente Gen, welches im pKK223-3 Vektor (verantwortlich für die Produktion Von β-Lactamase aus Plasmid) enthalten ist, kann ersetzt werden durch Gene, kodiert für Tetracyclin-, Chloramphenicol-, Kanamycin-, Streptomycin- Resistenz, oder durch andere Gene, welche eine Antibiotika- Resistenz aufweisen.
- Die Produktion von GA wird durchgeführt, indem die rekombinanten E. coli-Stämme entweder in einem Erlenmeyer-Kolben oder in Fermentoren, welche einen geeigneten Nährboden enthalten, geschüttelt werden.
- Die Fermentationszeit kann zwischen 12 und 90 Stunden liegen. Der Nährboden besteht aus einer Kohlenstoffquelle, wie zum Beispiel Glucose, Lactose, Sucrose, Glycerol, Fructose, Melasse, pflanzlichen Ölen, und so weiter; einer Quelle von Nitrogen/Vitaminen, wie etwa, Hefeextrakt, Fleischextrakt, Sojabohnenmehl, Erdnußmehl, Corn Steep Liquor (wässerige Getreidelösung), und so weiter, und aus Mineralsalzen.
- Die Wachstumstemperatur beträgt 18-37ºC, und der pH-Wert der Flüssigkeit beträgt 5-9.
- Die Stabilität der Plasmide während der Fermentation, welche einer gewisse Anzahl von Generationen bedürfen, kann durch Zugabe von Antibiotika aufrecht erhalten werden. Beobachtungen haben gezeigt, daß die GA-Produktion durch das sogenannte "fed-batch" - Verfahren verbessert werden kann.
- Ein solches Verfahren umfaßt die Züchtung des rekombinanten E. coli-Stammes auf einem Nährboden auf Getreidebasis bis ein Gleichgewichtsstadium, erreicht durch entsprechend langsames Wachstum, erreicht ist, und das anschließende Erreichen eines großen Wachstums, durch Hinzufügen einer Kohlenstoffquelle, wie etwa Glucose oder Glycerol.
- Die Produktion von GA mit solchen E. coli-Stämmen mit lacIq Genotyp, wie JN105 oder XL1 Blue, oder mit auf demselben Expressions-Plasmid vorhandenen laCIq, wird induziert mittels Zugabe von teuren Substanzen zur Fermentationslösung, wie et wa IPTG (Isopropyl β D-thiogalactopyranosid; EP-0 504 798 A1). IPTG verursacht die Depression der E. coli-Promotoren, welche vom Lac Gen (Placuvs, Ptac, Ptrc) gewonnen wurden.
- Diese erforderliche und kostspielige Induktion kann vermieden werden, wenn Corn Steep Liquor in der Fermentationslösung in einer Konzentration von 1-20% Volumen/Volumen (v/v) verwendet wird.
- Somit besteht ein überraschendes Ergebnis der vorliegenden Erfindung in der Möglichkeit, das GA-Gen, unter der Kontrolle von Ptac-Promotor, in einen E. coli lacIq -Stamm mittels eines kostengünstigen Nährbodenbestandteils zu induzieren.
- Zudem bewahrt die Gegenwart von wässeriger Getreidelösung die Stabilität des Plasmids und die Expression des GA-Enzyms während der Fermentation. Getreidelösung verhält sich auch wie ein Induktor, wenn das Plasmid mit starker Expression, welches den aus dem Lac-Gen (z. B., Placuvs, Ptac, Ptrc) gewonnenen E. coli - Promotor enthält, innerhalb der Zellen der E. coli-Stämme mit Lac-Genotyp, wie W3110, (ATCC27325) oder DH1 enthalten ist.
- In solchen Fällen, wurden jedoch Probleme bezüglich der Plasmid-Stabilität, und folglich bezüglich der GA-Gen-Expression, beobachtet.
- Die Produktion von GA-Enzymen mittels Fermentationsprozeß, welcher die Verwendung eines rekombinanten Mikroorganismus erfordert, unterliegt EEC-Richtlinien.
- In diesen Richtlinien wird der Wirt-Mikroorganismus gemäß drei Parametern eingeteilt: Schaden-Faktor, Expressions- Faktor und Zugangs-Faktor.
- Der Schaden-Faktor sagt etwas über die Natur des vom rekombinanten Mikroorganismus erhaltenen Produktes aus: z. B. GA wird ein Wert von 10&supmin;&sup9; zugemessen, denn dieses Enzym besteht aus einem chemisch aktiven Molekül, welches Lebewesen keinen Schaden zufügt.
- Der Expressions-Faktor ist 1, wenn die Expression für rekombinante GA-Produktion maximal ist. Schließlich hängt der Zugangs-Faktor vom E. coli-Stamm und vom verwendeten Plasmid-Typ ab.
- Den E. coli-Stämmen vom wilden Typ, welche die Fähigkeit besitzen im menschlichen Darm zu wachsen, wird der Zugangs- Faktor 1 zugemessen; jenen E. coli-Stämmen, welche aus K12- Stamm (zum Beispiel W3110) ohne schwächende Mutationseigenschaften entstehen, wird der Zugangs-Faktor 10&supmin;³ zugemessen; und schließlich wird jenen Stämmen, die zwar von E. coli-K12 herkommen, jedoch geschwächt sind, wie XL1 Blue, JM105, DHI, und so weiter, mit einem Zugangsfaktor 10&supmin;&sup6; klassifiziert.
- Das Produkt dieser drei Faktoren wird dazu verwendet, um die genetisch modifizierten Mikroorganismen in die sogenannten "Containment Catagories" (Eindämmungskategorien) einzuteilen. In unserem Fall beträgt die Produktion von GA, wobei ein Plasmid mit starker Expression in den drei Typen von E. coli wie oben beschrieben verwendet wurden, jeweils 10&supmin;&sup9;, 10&supmin;¹², 10&supmin;¹&sup5;, welchen "Containment Catagories" von 0, 1 und 2 entsprechen ("Null" bedeutet, daß keine Beschränkungen notwendig sind bei der Benutzung dieser Mikroorganismen in Fermentierungsprozessen auf industriellem Niveau; eine "2" bedeutet, daß umgekehrt strenge Beschränkungen eingehalten werden müssen).
- Das mittels rekombinantem Mikroorganismus produzierte GA kann regeneriert werden, nachdem die Zellen durch Zentrifugieren von der Kulturlösung getrennt worden sind.
- Die Zellen werden dann aufgebrochen mittels konventioneller Methoden wie Beschallung, osmotischem Schock, Druck, enzymatischer Lyse (Lysozyme), und so weiter, und GA-Enzym wird von dem zellularen Extrakt mittels Fällungsreaktion, chromatographischer Verfahren und Verwendung von Membranen gereinigt.
- Mit Hilfe eines einfachen Ammonium-Sulfat-Gradienten (30-55%) und einer schwachen anionischen Austausch-Chromatographie (DEAE-Sephacel, Pharmacia), wurde festgestellt, daß diejenigen Enzyme, wie Esterase oder β-Lactamase (welche das Substrat und das durch GA katalysierte Reaktionsprodukt zerstören oder modifizieren können) von solchen Fragmenten, welche GA enthalten, vollständig entfernt werden können.
- Der hierdurch entstehende Vorteil besteht darin, daß das so erhaltene Enzym einen Reinheitsgrad aufweist, welcher hoch genug ist, um unbeweglich gemacht werden zu können, ohne die Notwendigkeit für den Einsatz von E. coli-Stämmen, welche nicht die Fähigkeit besitzen, Esterase oder β-Lactamase zu produzieren, oder ohne die Notwendigkeit für den Ersatz ihrer Ampicillin-Resistenz durch Resistenz gegen andere Antibiotika.
- Die teilweise gereinigten und konzentrierten enzymatischen Extrakte können immobilisiert werden, indem sie dazu veranlaßt werden, mit geeigneten inaktiven Unterstützungen (wie etwa Eupergit C) zu reagieren.
- Das immobilisierte Enzym wird zyklisch verwendet, um GL-7ACA- Lösungen zu transformieren und 7ACA gemäß gängiger Verfahren zu isolieren.
- Die folgenden Beispiele dienen der detaillierteren Illustration des Prozesses der vorliegenden Erfindung und sollten nicht als eine begrenzte Zusammenfassung, wie es in den Ansprüchen im Anhang dargestellt ist, derselben Erfindung verstanden werden.
- Das GA-Enzym von Pseudomonas-146H9-(NCIMB40474)-Zellen wurde mittels konventioneller Methoden bis zur Homogenität gereinigt. Antikörper-Vorbereitung und Testen ist ein konventionelles immunologisches Verfahren. Die gesamten Reinigungsprozesse wurden unter 5ºC durchgeführt, wenn nicht anders spezifiziert. GA-Aktivität wurde nach der Balasingham-Methode, modifiziert für 7ACA anstatt 6APA (Balasingham, K. et al. Biochin. Biophys. Acta (1972), 276 : 250) gemessen; 1U ist die Enzymmenge, welche notwendig ist, um 1 umol 7-Amino- Cephalosporan-Säure während 1 Minute bei 37ºC und in Anwesenheit eines optimalen pH-Wertes von 7-11 zu produzieren.
- a. Die Zellen werden aus der Fermentierungslösung durch kontinuierliches Zentrifugieren bei 12000 g gesammelt. Die Zellkügelchen werden bei - 20ºC aufbewahrt; 100 g der gefrorenen Zellkügelchen werden in 300 ml Start- Puffer (50 mM Tris. Cl, 0.1 M NaCl; pH 8,0) suspendiert und diese Suspension wird beschallt (Sechs Behandlungen von jeweils 5 Minuten mit 200 W, mit Kühlung zwischen den Behandlungen) bis eine vollständige Teilung der Zellen erreicht ist. Nicht aufgelöste Kügelchen und Trümmer werden durch Zentrifugieren bei 25000 g während 45 Minuten entfernt.
- Zellfreiem Extrakt, c. f. e. (cell-free extract), wird festes Ammoniumsulfat zugefügt, welches mittels eines magnetischen Rührgerätes und bei 0ºC gerührt wird. Der pH- Wert wird mit NH40H bei 8.0 gehalten.
- Der Niederschlag, welcher sich innerhalb einer Stunde während der Zufuhr der Salzmenge, welche eine Lösung mit einem Sättigungsgrad von 30% bestimmt, bildet, wird bei 4000 g 45 Minuten lang bei 0ºC zentrifugiert. Dann werden, wie oben beschrieben, dem Überstand weitere Mengen von festem Ammoniumsulfat zugefügt, bis eine Lösung mit einem Sättigungsgrad von 55% erreicht ist.
- Nach einer Stunde Rühren bei 0ºC wird der Niederschlag mit Hilfe des Zentrifugierens (siehe oben) gesammelt, in frischer Start-Puffer-Lösung aufgelöst und gegen denselben Puffer dialysiert.
- Das Dialysat, welches das in dem oben beschriebenen Schritt b erhaltene GA-Enzym enthält, wurde auf einer DEAE-Sephacel-Säule [500 · 32 mm I. D. 200 ml Volumen], welche kurz zuvor mit Start-Puffer äquilibriert wurde, angewendet. Nach der Reinigung der Säule mit 100 ml Start-Puffer-Lösung, wurde das GA-Enzym mit einem linearen NaCl-Gradienten (0.1-35 M, 400 ml in jedem Container) in 50 mN Tris. Cl, pH 8.0 ausgewaschen; die Durchflußrate während des Reinigungsprozesses betrug 40 ml/Stunde; Mengen von 20 ml wurden gesammelt. Die Mengen, welche GA enthielten, wurden dann zusammengelegt, mittels Ultrafiltration auf 100 ml konzentriert und gegen 50 mN Tris. Cl 0.1M NaCl pH 8.8 (Q-Start-Puffer) dialysiert.
- Das Dialysat, welches das in dem oben beschriebenen Schritt erhaltene GA-Enzym enthält, wurde auf einer Q-Sepharose-Schnell-Fluß-Säule [500 · 32 mm I. D., = 200ml], welche zuvor mit Q-Start-Puffer ausgeglichen wurde, angewendet. Nach der Reinigung der Säule mit 100 ml Q-Start-Puffer, wurde das GA-Enzym mit Hilfe eines linearen NaCl-Gradienten (0.1-0.35M, 400 ml in jedem Container) in 50 mN Tris. Cl pH-8.8 ausgewaschen; während eines jeden Reinigungsschrittes betrug die Durchflußrate durch die Säule 20 ml/Stunde, wobei Mengen von 10 ml pro Schritt gesammelt wurden. Die Mengen, welche GA enthielten, wurden dann zusammengelegt, mittels Ultra-Filtration auf ein Endvolumen von 15 ml konzentriert, und gegen 10 mM Natriumphosphat pH 7, Ammoniumsulfat mit einem Sättigungsgrad von 30% (HIC Start-Puffer) dialysiert.
- Das Dialysat, welches das in dem oben beschriebenen Schritt erhaltene GA-Enzym enthält, wurde auf einer Octyl-Sepharose-CL4B-Säule [500 · 16 mm (I. D.); V = 30 ml], welche zuvor mit HIC-Start-Puffer äquilibriert wurde, angewendet. Nach der Reinigung der Säule mit 30 ml HIC- Start-Puffer, wurde das GA-Enzym gleichzeitig mit linearem Gradienten mit gesättigtem Ammonium-Sulfat (30%-0%) und Ethylen-Glycol (0-40%), 250 ml in jedem Container in 10 mM Natriumphosphat pH 7.0 ausgewaschen; während der Reinigungsschritte betrug die Flußrate durch die Säule 10 ml/Stunde und 10 ml Mengen wurden gesammelt. Die Mengen, welche GA enthielten, wurden zusammengelegt und mittels Ultrafiltration auf 4 ml konzentriert.
- f. Gel-Filtration mittels Sephacryl S200HR. Die durch den oben beschriebenen Schritt erhaltene GA-Enzym-Lösung, wurde in einer Sephacryl-S200HR-Säule (100 · 16 mm I. D., V = 160 ml), welche zuvor mit 50 mM Tris. Cl 0.2M NaCl, pH 8.0 ausgeglichen worden war, angewendet und ausgewaschen; während der Reinigungsschritte wurde ein konstanter Fluß von 4 ml/Stunde aufrechterhalten und es wurden Fraktionen von 2 ml gesammelt. Diejenigen Fraktionen, welche GA-Enzym enthielten, wurden gesammelt. Tabelle 1 Reinigung von GA von Pseudomonas 146H9 unter Anwendung eines Ammoniumsulfat-Gradienten, Ionenaustausch-Chromatographie, hydrophobischer Interaktions-Chromatographie und Gelfiltration
- Der Teil des Gelfiltrations-Peaks wurde durch nicht denaturierende Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese (PAGE) gereinigt. Nach dem Markieren eines Gelsegments wurde ein großes und vier kleinere Bänder beobachtet. Das markierte Segment wurde dann mit Rest-Gel zusammengebracht und der entsprechende nicht-markierte Teil wurde weggeschnitten.
- Die enzymatische Aktivität von GA, welche in einem auf diese Weise isolierten Gel enthalten ist, wurde dann bewertet, um damit zu demonstrieren, daß es nur in dem Gel- Segment enthalten ist, welches dem größten Proteinband entspricht. Die Acylase wurde dann vom Gel, welches in eine Dialyse-Membran (mit 12 kD Schnitt), und dann in 37.6 mM Tris. Cl 40 mM Glycin, pH 8.48-Puffer, 6 Stunden bei 100 Volt und 5ºC, hineingelegt worden war, mittels Elekroelution gewonnen. Der Puffer wurde dann, bis auf die letzten 200 ml, welche für eine erneute Suspension in der Membran noch vorhandener GA benutzt wurde, verworfen. Die entstehende Suspension wurde einer denaturierenden PAGE zugeführt.
- Die Acylase, welche mittels Elektroelution wiedergewonnen wurde, wurde einer Denaturierung [5 Minuten in 0.1% Natrium-Dodecylsulfat (SDS) und β-Mercaptoethanol] und einer Elektrophorese auf 0.1% SDS PAGE Gel mit einem bekannten Molekulargewichts-Standard unterzogen. Das Markieren mit Coomassie Brilliant-, Blue- oder Silber- Markierung zeigten zwei Bänder mit einem Molekulargewicht von je 18 kD und 50 kD; diese entsprechen jeweils der d- Subeinheit und der β-Subeinheit des Enzyms. Mittels einiger Mengen vom Gel-Filtrations-Gipfel, welche eine SDS- Denaturierungs-PAGE und folglich eine Elektroelution durchliefen, konnten einige Milligramm reines denaturier tes GA-Enzym gewonnen werden.
- i. Die reine denaturierte GA aus dem in Punkt h. beschriebenen Schritt wurde mit einem vollständigen Freunds- Adjuvans (Sigma) gemischt, und die resultierende Mischung wurde den Männchen von weißen Neuseeland-Kaninchen drei mal in einer Dosierung von 2 mg/Injektion gespritzt, um Antikörper zu züchten.
- Danach wurden Blutproben entnommen, von welchen Serum getrennt wurde. Dieses wurde bei 56ºC 30 Minuten lang behandelt und wurde dann mit einem 35%igen Ammonium-Sulfat ausgefällt. Um die Antikörper zu erhalten, wurde das Präzipitat mit Protein-Sepharose CL-4B (Pharmacia) gereinigt. Das "Dot Blot" - Testverfahren bestätigte, daß GA- Enzyme von Pseudomonas 146H9 (NCIMB40474) und SY77-1 (Ferm2410)-Stämmen und das gereinigte Antiserum, wie oben beschrieben, miteinander reagieren, wodurch ein Immunpräzipitat entsteht. Die IgG (Immunglobulin G)-Fraktion, welche von einem Kontroll-Kaninchen, dem keine GA gespritzt wurde, stammt, zeigte keine Immun-Präzipitation mit den GA-Enzymen.
- Gen-Bibliotheken mit der DNA von Pseudomonas 146H9 (NCIMB40474) und SY77-1 (Ferm2410)-Stämmen in LambdaZAPII wurden konstruiert, mittels konventioneller Verfahren aus rekombinanter DNA, beschrieben in Maniatis, T. et al [Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Library, Cold Spring Harbor, New York, U.S.A. (1989)]. Die Enzyme wurden gemäß der Anleitungen ihrer jeweiligen Lieferanten verwendet. Genom tragende DNA wurde von Pseudomonas sp. 146H9 und SY77-1 extrahiert, mittels der Methode, welche in Silvahy T. et al. [Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, U.S.A. (1984)] beschrieben ist. Die Genom tragende DNA (25 ug) wurde teilweise eine Stunde lang bei 37ºC mit Sau3AI (2 U) aufgeschlossen, die aufgeschlossene Mischung wurde dann einer Elektrophorese auf Agarose-Gel (0.4%, 16 Stunden, 15 V) unterzogen, um eine gereinigte DNA-Menge mit einer Durchschnittsgröße von 4-10 kb zu erhalten. Die DNA mit einer geeigneten Größe wurde mit Bal31 Nuclease (10 U, 37ºC, 30 min.) modifiziert; die Reaktion wurde durch Extraktion mit Phenol/Chloroform und Ausfällung mit Ethanol gedämpft. Die terminalen Enden der resultierenden zufälligen DNA - Fragmente wurden mit Klenow DNA-Polymerase (10 U), dNTPs in Einschnitt-Translations-Puffer (1 Stunde, 22ºC), gefüllt und wurden dann mittels T4 DNA-Ligase (über Nacht bei 16ºC) an 5 ug phosphorylierte EcoRI-Linker geknüpft und wurden dann mit 200U EcoRI (4 Stunden, 37ºC) aufgeschlossen. Die DNA wurde durch Chromatographie auf Sepharose-CL4B- Säule (Sigma) von den überschüssigen EcoRI-Linkern getrennt, um EcoRI-Mengen mit einer konstanten Durchschnittsgröße von ungefähr 5 kbp zu erhalten. 0.1 ug dieser DNA wurde mit 1 ug ZAPII Bakteriophage verknüpft, welche zuvor mit EcoRI geschnitten und mittels T4-DNA-Ligase (Gesamtreaktionsvolumen 5 ul) bei Raumtemperatur eine Stunde lang und bei 4ºC über Nacht dephosphoryliert wurde.
- Die resultierende Mischung wurde einem "in vitro packaging" (in vitro-Verpackung)unterzogen, wobei "Gigapack Gold packaging extracts" (Stratagene) verwendet wurden. Bei einer Plaquebildung als Folge des Einsatzes von E. coli XL1 Blue als Wirts-Organismus, entstanden ungefähr 100000 Plaques. In Gegenwart von X-gal und IPTG wurden ungefähr 95% weiße Plaques, wobei es sich bei dem Rest um blaue handelte, beobachtet. Auf diese Weise wurde eine Gen-Bibliothek von Genom tragender DNA, bestehend aus ungefähr 100000 Klonen, hergestellt.
- Eine Mischung von E. coli XL-Blue-Kultur (0.2 ml), die oben beschriebene Gen-Bibliothek lambdaZAPII: Pseudomonas 146H9 oder SY77-1 (ungefähr 30000 Klone), und 7 ml Top-Agar wurden auf eine Platte mit LB-Agar (140 mm) gegeben, welche dann 4 Stunden lang bei 42ºC inkubiert wurde. Eine Nitrocellulose- Membran (134 mm Durchmesser; Millipore), welche vorher 1 Stunde lang in einer 10 mM IPTG-Lösung eingelegt war und dann nochmals eine Stunde lang bei Raumtemperatur getrocknet wurde, wurde dann auf die Platte gebracht. Die resultierende Verbindung wurde bei 37ºC 3.5 Stunden lang inkubiert, um die Expression der Gene zu ermöglichen, und ihre Produkte auf die Membran übertragen zu können. Dieses Verfahren, welches als sehr effektiv angesehen wird, erfordert jedoch eine genaue Vorbereitung der DNA-Fragmente der Gen-Bibliothek: der Anfang eines jeden eingefügten Pseudomonas-Gens muß so sein, um den 39 NH2-terminalen Aminosäuren der β-Galactosidase des lacZ'- Gens zu ermöglichen, in einem ihm entsprechenden Leseraster zu sein (dies ist der Grund, warum die terminalen Enden der DNA von 146H9 und SY77-1 modifiziert wurden).
- Von den ungefähr 30000 Plaques, welche mit Hilfe des Blott- Verfahrens unter Verwendung eines picoBlue Immun-Ermittlungs- Sets (Stratagene) getestet wurden, wobei das Antiserum eine spezifische Ausrichtung auf GA hatte, eine positive Plaque getestet wurde. Der Test wurde gemäß der vom Hersteller des Sets empfohlenen Methode durchgeführt. Nach der Expression der Fusionsproteine, wurden diese mittels Gelatine auf Membran fixiert. Die Membran wurde mit dem spezifischen Antiserum für das GA-Enzym inkubiert, wurde mit E. coli-Lysat (im Set enthalten) neutralisiert, und dann spezifisch gegen Antikörper von Kaninchen gerichtet und mit alkalischer Phosphatase (ebenfalls im Set enthalten) verbunden.
- In der folgenden chromogenetischen Reaktion erzeugte der positive Klon blau-violette Punkte, während die negativen Klone und das zur Kontrolle verwendete Kaninchen-Antiserum keinerlei Punkte erzeugte.
- Die Plaque, welche sich als positiv erwies, wurde dann einem in vivo Exzisions-Protokoll (Stratagene lambdaZAII Klon-Set) unterzogen; pWE56.4 Plasmid, welches mittels dieser Methodologie neu entdeckt wurde, enthält im lacZ'-Gen ein inneres Stück des GA-Gens von Pseudomonas 146H9 (NCIMB40474), und pZAP1.1 Plasmid enthält das von Pseudomonas SY77-1 (Ferm2410). Gen-Orientierung stammt vom nachkommenden Plac.
- Das pWE56.4-Plasmid enthält ein ungefähr 2.5 kbp langes Fragment der DNA von Pseudomonas 146H9, mit mindestens einem Teil von DNA-Codierung für GA, welche ein Fusionsprotein bildet, welches auf den Antigen-Test für dasselbe Enzym positiv reagiert. Dieses Fragment kann, definitionsgemäß, nicht die vollständige Gen-Kodierung für GA enthalten. Ein SacII-SalI- Fragment, welches ungefähr 1.2 kbp lang war, wurde von Plasmid pWE56.4 isoliert und mit Digoxigenin-dUTP (Boehringer Non-Radioactive Labelling Kit) zur Verwendung als DNA-Sonde gekennzeichnet. Dieselbe lambdaZAPII Pseudomonas 146H9 Gen- Bibliothek wurde getestet, um die Gegenwart von Plaques zu identifizieren, welche DNA enthält, die mit dieser Sonde hybridisiert. Unter 10000 getesteten Plaques wurde eine positive Plaque entdeckt.
- Die entsprechenden Plasmide wurden in Übereinstimmung mit dem in vivo Exzisions-Protokoll extrahiert und die mit dem gleichen Plasmid, welches mit "pWE3.1" bezeichnet wurde, transformierten E. coli-Zellen wurden auf ihre Fähigkeit, GL-7ACA in 7ACA zu transformieren, getestet. (Abb. 1: Physikalische Karte von Plasmid "pWE3.1". Der schattierte Bereich enthält das GA-Gen von Pseudomonas 146H9 (NCIMB40474). Der tiefschwarze Bereich gehört zu dem pBluescriptSK+/- Plasmid). Man hat festgestellt, daß pWE3 ein 10 kbp langes Fragment von Pseudomonas sp. 146H9 DNA enthält und die Eigenschaft be sitzt, die Acylase-Aktivität auf E. coli (Tabelle 2) zu übertragen. Auf diesem Fragment wurden keine Stellen für EcoRI, HindIII, BamHI, BclI, KpnI, ScaI, HpaI, Mlul, PvuI, PvuII, Asp718, Dral, SmaI gefunden. Die Orte, an denen sich SacII, PstI, XbaI, EcoRV, BglII befanden, sind in Abb. 1 dargestellt. pZAP1.1-Plasmid enthält ein 3 kbp langes Fragment von Pseudomonas SY77-1 DNA, welches mindestens einen Teil der DNA- Kodierung für GA enthält, denn es kann so kodieren, daß ein Fusions-Protein entsteht, welches auf den Antigenizität-Test gegen GA-Enzyme positiv reagiert. Definitionsgemäß kann dieses Fragment nicht das GA-Gen mit vollständiger Länge enthalten. Von diesem pZAP1.1-Plasmid wurde ein 0.6 kbp EcoRI-PstI- Fragment isoliert und mit Digoxigenin-dUTP (Boehringer Non- Radioactive Labelling Kit) bezeichnet, welches als DNA-Sonde verwendet wurde.
- Mit dieser Sonde wurde auch die Pseudomonas SY77-1 lambdaZA- PII-Gen-Bibliothek durchgesucht, wobei von 7000 durchsuchten Plaques ein Plaque die Eigenschaft aufwies, mit dergleichen Sonde zu hybridisieren.
- Die entsprechenden Plasmide wurden in Übereinstimmung mit dem in vivo Exzisions-Protokoll extrahiert, und wurden für die Transformation von E. coli-Zellen verwendet; die Zellen, welche besagtes Plasmid, namens "pWG2", enthielten, wurden dann auf ihre Eigenschaft GL-7ACA in 7ACA zu hydrolisieren getestet.
- pWG2-Plasmid enthält ein 3 kbp langes Fragment von Pseudomonas sp. SY77-1 DNA, welche die Eigenschaft besitzt E. coli in einen Acylase-positiven Stamm zu transformieren (Tabelle 2).
- pWE3.1-Plasmid (1 ug) wurde mit XbaI geschnitten, und ein 7 kbp langes Fragment wurde mittels Elektroelution isoliert, und wurde dann wieder mittels T4 DNA-Ligase kreisförmig gemacht. Zellen von E. coli XL1 Blue wurden mit dergleichen Mischung transformiert und das resultierende Plasmid, pWE2.20, wurde isoliert. Das Entfernen eines 6 kbp XbaI-Fragments aus pWE3.1 erzeugte pWE2.20, welches eine ähnliche enzymatische Aktivität aufweist (Tabelle 2). Deshalb muß sich die Gen- Codierung für Pseudomonas 146H9 GA auf einem 4 kbp langen DNA-Fragment zwischen EcoRI und XbaI Orten befinden. Wir gehen davon aus, daß das 3 kbp lange Fragment von pWG2, welches das GA-Gen von SY77-1 enthält, schon genug begrenzt ist, um auf einen Expressions-Vektor transferiert zu werden.
- Das 4 kbp langes EcoRI-XbaI-Fragment von pWE3.1, welches das GA-Gen von Pseudomonas 146H9 enthält, wurde an pKK223-3 (Pharmacia) geklont, welches den hybriden Triptophan/Lactose- Promotor (Ptac) als ein deutliches und induzierbares Signal verwendet. Das EcoRI-XbaI-Fragment (1 g) wurde nur am XbaI Ort mit Klenow DNA-Polymerase (2 U) verändert, welches den Ort (teilweise) mit 0.2 mM dCTP und dTTP in Einschnitt- Translations-Puffer (1 Stunde, Raumtemperatur) füllt, um ein geeignetes Fragment zum Klonen in pKK223-3, welches mit Eco- RI-HindIII aufgeschlossen wurde, zu erhalten.
- Das resultierende pWE4.3.1.-Plasmid wird verwendet, um E. coli XL1 Blue in GA-positive Zellen zu transformieren [Abb. 2: physikalische Karte von pWE4.3.1. Plasmid. Der schattierte Bereich enthält das GA-Gen von Pseudomonas 146H9 (NCIMB40474)]; die transformierten Zellen zeigten eine Acylase-Aktivität von 60 U/l, welche 30 mal so hoch ist, wie die Aktivität, welche mit pWE3.1 entsteht und 20mal so hoch, wie die Aktivität des ursprünglichen Pseudomonas-Stammes.
- XL1Blue-Stamm (pWE4.3.1) wurde mittels NCIMB abgelegt und mit der Eingangs-Nr. NCIMB40560 versehen.
- Das 3 kbp lange EcoRI-Fragment des pWG2 Plasmids, welches die Gen-Codierung für GA-Enzyme von Pseudomonas SY77-1 enthält, wurde in die EcoRI Orte von pKK223-3 geklont und wurde mittels der Ligasen-Mischung in E. coli XLIBlue transformiert.
- Von den erhaltenen Transformanten wurde das pCS19.1 Plasmid isoliert (Abb. 3: Physikalische Karte von pCS19.1.-Plasmid. Das GA-Gen von SY77-1 ist durch den schwarzen Pfeil auf der Karte dargestellt), wobei eine Überproduktion der GA stattfindet.
- XL1Blue-Stamm (pCS19.1) wurde mittels NCIMB abgelegt und erhielt die Eingangs-Nr. NCIMB40550.
- Das pCS19.1-Plasmid wurde auch für die Transformation von W3110 (ATCC27325) und DH1 verwendet. Beide Stränge haben einen Lac&spplus;-Genotyp.
- Der pKK223-3-Vektor wurde dann modifiziert mittels Einbringen von Tetracylin-Resistenz anstatt Ampicillin-Resistenz, wodurch die von diesem Plasmid ausgehenden β-Lactamasen ausgeschlossen wurden. Zu diesem Zwecke wurde das etwa 1.4 Kb schwere AvaI-HindIII-DNA-Fragment, welches das Gen für Tetracyclin-Resistenz enthält, vom pBR322-Plasmid isoliert. Dieses DNA-Fragment wurde mit Klenow-DNA-Polimerase-Enzym behandelt, um so stumpfe terminale Enden zu erhalten. Im Gegensatz dazu, wurde pKK223-3-Vektor an der ScaI-Stelle, welche im Gen für Ampicillin-Resistenz enthalten ist, abgeschnitten, und dephosphoryliert.
- Fragment und Vektor, welche man auf diese Art und Weise erhalten hat, wurden bei 16ºC über Nacht mittels T4 DNA-Ligase verbunden, und die resultierende Mischung wurde für die Transformation von E. coli JM105 verwendet. Die Kolonien, wel che Tetracyclin-Resistenz (50 ug/ml) aufweisen, enthalten das pTet tac-Plasmid (Abb. 4).
- Dieses Plasmid wurde dann isoliert (10 ug) und bei 37ºC eine Stunde lang mit 100 U EcoRI-Enzymen inkubiert und dann dephosphoryliert; weiter wurde das 3Kb-Fragment, welches das GA-Gen von SY77-1 enthält, mittels EcoRI-Enzym vom pWG2- Plasmid abgeschnitten. Sowohl der hierdurch entstehende linearisierte Vektor, als auch das Fragment, wurden dann mittels T4-DNA-Ligase verbunden. Auf diese Weise erhielt man pWB14 Plasmid (Abb. 5), sofern das GA-Gen die gleiche Richtung wie Ptac-Promotor aufwies, und pWB1-Plasmid (Abb. 6), sofern GA- Gen die entgegengesetzte Richtung von Ptac-Promotor aufwies (hierbei ist dessen Expression unabhängig von Ptac).
- Sowohl pWB14, pWB1, als auch pCS19.1-Plasmide ermöglichen zwar die Entstehung von GA-Enzymen, jedoch nicht die von β- Lactamasen, welche von Tetracyclin-Resistenzen ersetzt wurden; weiterhin ist das GA-Enzym in pWB1 nicht unter der Kontrolle von Ptac-Promotor. Tabelle 2. Acylase-Aktivität der im Patent genannten Stämme
- Dieses Beispiel bezieht sich auf die in Beispiel 1 beschriebene Produktion von GA-Enzym von E. coli XL1Blue (pWE4.3.1)- Stamm.
- Der Stamm wird bei -40ºC in YT-Glycerol-Flüssigkeit (Zusammensetzung: Glycerol 15%, bacto-Hefeextrakt 0.7%, bacto- Trypton 0.4%, NaCl 0.4%, Tetracyclin 10 ug/ml, Ampicillin 50 ug/ml) gelegt.
- Eine in YT-Glycerol-Lauge gelegte Schlinge wurde auf eine Petrischale mit LB Agar (Zusammensetzung: bacto-Hefeextrakt 0.5%, bacto-Trypton 1%, NaCl 1%, Agar 1.5%, Tetracyclin 10 ug/ml, Ampicillin 50 ug/ml))gestrichen, und die Schale wurde bei 37ºC über Nacht inkubiert.
- Einem sterilen Röhrchen mit 2 ml LB+Tc+Ap Lauge (Zusammensetzung: bacto-Hefeextrakt 0.5%, bacto-Trypton 1%, NaCl 1%, Tetracyclin 10 ug/ml, Ampicillin 50 ug/ml) wurden eine einzelne Kolonie von der LB Agarschale eingeimpft, und wurde bei 30ºC 16 Stunden lang inkubiert und bei 200 rpm geschüttelt.
- Einem 500 ml-Erlenmeyerkolben, welcher 100 ml LB+Tc+Ap+IPTG- Flüssigkeit (Zusammensetzung: bacto-Hefeextrakt 0.5%, bacto- Trypton 1%, NaCl 1%, Tetracyclin 10 ug/ml, Ampicillin 50 ug/ml, IPTG 1 mM) enthielt, wurden 100 ul LB-Kultur eingeimpft, bei 30ºC 24 Stunden lang inkubiert und bei 300 rpm geschüttelt.
- Die OD550 (Optische Dichte bei 550 nm) der Kultur betrug 6.0.
- Die Zellen wurden dann bei 5000 rpm 10 Minuten lang zentrifugiert und wurden dann in Trias. Cl 0.1 M NaCl 0.05M pH 8.0 gleichen Volumens wie das ursprüngliche, wieder suspendiert. Die Zellen wurden dann mittels Beschallung aufgebrochen, und die Aktivität des GA-Enzyms im zellularen Extrakt wurde unter Anwendung eines colorimetrischen Verfahrens gemessen.
- Die Aktivität von GA betrug 60 U/l, 20mal so hoch wie die des ursprünglichen Pseudomonas sp. 146H9-Stammes.
- Dieses Beispiel bezieht sich auf die Fermentation von E. coli XL1Blue (pWE4.3.1) in einer neuen Fermentationslösung für GA- Enzym-Produktion.
- Der Impfstoff wurde wie in Beispiel 2 beschrieben zubereitet.
- Einem 500 ml-Erlenmeyerkolben, gefüllt mit 100 ml CSL-Lösung [Zusammensetzung: wässerige Getreidelösung (Corn-Steep Liquor ex Società Piemontese Amido Derivati 14%), Tetracycline 10 ug/ml, Ampicillin 50 ug/ml, pH 7.5]wurden 100 ul LB-Kultur eingeimpft und wurde dann bei 30ºC 24 Stunden lang unter Schütteln bei 300 rpm inkubiert. Die OD550 der Kultur betrug 6.5.
- Die Zellen wurden bei 5000 rpm 10 Minuten lang gedreht und wurden dann in Tris. Cl 0.1 M NaCl 0.05M pH 8.0 gleichen Volumens wie das ursprüngliche, suspendiert. Die Zellen wurden mittels Beschallung aufgebrochen und die Aktivität des GA- Enzyms im zellularen Extrakt wurde unter Anwendung eines colorimetrischen Verfahrens titriert.
- Es wurde eine Aktivität von 55 U/l ermittelt, was etwa 18 mal so hoch ist, wie die des ursprünglichen Pseudomonas sp. 146H9-Stammes.
- Dieses Beispiel betrifft eine neue Art der Fermentation von E. coli XL1Blue (pWE4.3.1) für GA-Enzym-Produktion.
- Der Impfstoff wurde entsprechend der Beschreibung in Beispiel 2 zubereitet.
- Einem 500 ml-Erlenmeyerkolben mit 100 ml LB+Tc+Ap-Lösung (Zusammensetzung: bacto-Hefeextrakt 0.5%, bacto-Trypton 1%, NaCl 1%, Tetracyclin 10 ug/ml, Ampicillin 50 ug/ml) wurden 100 ug/ml LB-Kultur eingeimpft und wurde bei 30ºC unter Schütteln bei 300 rpm 24 Stunden lang inkubiert. Die OD550 der Kultur betrug 6.0.
- Einem Fermentor (21, INFORS HG) gefüllt mit 1.51 CSL [Zusammensetzung: Corn-Steep-Liquor (wässerige Getreidelösung) 14%, pH 7.5] wurden 100 ml LB-Kultur eingeimpft. Die Fermentationsparameter waren: T 30ºC, Rühren 1300 rpm, Luftstromrate 1 von 20 Stunden lang bis OD550 = 6.0.
- Während der folgenden 10 Stunden wurde der Kultur eine 24 Stunden lang kontinuierlich fließende Glucose- oder Glycerol- Lösung (50% W/v) hinzugefügt, mit einer Flußrate, welche zunächst 1.5 ml/l. h und dann 6 ml/l. h betrug, und einem pH-Wert mit NaOH 5M auf 7.5 gehalten, und mit gelöstem Sauerstoff, dessen Niveau bei PO&sub2; = 10% lag. Das beobachtete Endwachstum betrug OD550 = 90. Am Ende der Kultur betrug die kumulierte Biomasse 89 g/l (Trockengewicht 18 g/l).
- Das pWE4.3.1-Plasmid war in 70% der Zellen nach einer 54-Stündigen Fermentation bei Maximalproduktion immer noch vorhanden.
- Die Zellen wurden bei 5000 rpm 10 Minuten lang zentrifugiert und danach in Trias. Cl 0.1 M NaCl 0.05M pH 8.0 gleichen Volumens wie das ursprüngliche resuspendiert. Die Zellen wurden mittels Beschallung aufgebrochen und in den zellularen Extrakten wurde die GA-Aktivität mittels Colorimetrie titriert. Es wurde eine GA-Aktivität von 6000 U/l festgestellt, 2000mal so hoch wie die des ursprünglichen Pseudomonas 146H9-Stammes.
- Dieses Beispiel betrifft die Produktion von GA-Enzyme von E. coli XL1Blue (pCS19.1) entsprechend der Beschreibung in Beispiel 1.
- Der Impfstoff wurde entsprechend der Beschreibung in Beispiel 2 zubereitet.
- Einem 500 ml-Erlenmeyerkolben, gefüllt mit 100 ml LB+Tc+Ap+IPTG-Lösung (Zusammensetzung: bacto-Hefeextrakt 0.5%, bacto-Trypton 1%, NaCl 1%, Tetracyclin 10 ug/ml, Ampicillin 50 ug/ml, IPTG 1 mW) wurden 100 ul LB-Kultur eingeimpft und wurde bei 30ºC und 300 rpm 24 Stunden lang inkubiert. Die OD550 der Kultur betrug 6.0.
- Die Zellen wurden 10 Minuten lang bei 5000 rpm zentrifugiert, und dann in Tris. Cl 0.1 M NaCl 0.05M pH 8.0 gleichen Volumens wie das ursprüngliche resuspendiert. Die Zellen wurden mittels Beschallung aufgebrochen und die GA-Aktivität in den zellularen Extrakten wurde mittels Colorimetrie titriert. Es wurde eine GA-Aktivität von 140 U/l festgestellt, welche 35mal so hoch ist wie die des ursprünglichen Pseudomonas sp. SY77-1-Stammes.
- Dieses Beispiel betrifft die Produktion von GA-Enzym vom E. coli W3110-Stamm, welcher mit pCS19.1 transformiert wurde.
- Der Stamm wird bei -40ºC in YT-Glycerol-Flüssigkeit (Zusammensetzung: Glycerol 15%, bacto-Hefeextrakt 0.7%, bacto- Trypton 0.4%, NaCl 0.4%, Amplcillin 50 ug/ml)gelegt.
- Der auf YT-Glycerol-Flüssigkeit gewachsene Stamm wurde in Form einer Schleife auf eine Petrischale mit LB Agar+Ap (Zusammensetzung: bacto-Hefe-Extrakt 0.5%, bacto-Trypton 1%, NaCl 1%, Agar 1.5%, Ampicillin 50 ug/ml) ausgesät, und die Schale wurde bei 37ºC über Nacht inkubiert.
- In ein steriles Röhrchen mit 2 ml LB+Ap-Lösung (Zusammensetzung: bacto-Hefeextrakt 0.5%, bacto-Trypton 1%, NaCl 1%, Ampicillin 50 ug/ml) wurden eine einzelne Kolonie von der LB- Agarschale geimpft, und dies wurde bei 30ºC 16 Stunden lang inkubiert und bei 200 rpm geschüttelt.
- In einen 500 ml-Erlenmeyerkolben mit 100 ml LB+Ap-Lösung (Zusammensetzung: bacto-Hefeextrakt 0.5%, bacto-Trypton 1%, NaCl 1%, Ampicillin 50 ug/ml) wurden 100 ul LB-Kultur geimpft, und dieser wurde bei 30ºC 24 Stunden lang inkubiert und bei 300 rpm geschüttelt.
- Die OD550 (optische Dichte bei 550 nm) der Kultur betrug 6.0.
- Die Zellen wurden dann bei 5000 rpm 10 Minuten lang zentrifugiert und dann in Tris. Cl 0.1 M NaCl 0.05 M pH 8.0 im gleichen Volumen wie im ursprünglichen wieder suspendiert. Die Zellen werden dann mittels Beschallung aufgebrochen, und die Aktivität der GA-Enzyme im zellularen Extrakt wurde unter Anwendung eines colorimetrischen Verfahrens titriert.
- Die resultierende GA-Aktivität betrug 136 U/l, 34mal so hoch wie die des ursprünglichen Pseudomonas SY77-1-Stammes.
- Dieses Beispiel betrifft die Produktion von GA-Enzym vom E. coli DHI-Stamm, welcher mit pCS19.1 transformiert wurde.
- Der Impfstoff wurde entsprechend der Beschreibung in Beispiel 6 zubereitet.
- Einem sterilen Röhrchen, gefüllt mit 2 ml LB+Ap-Lösung (Zusammensetzung: bacto-Hefeextrakt 0.5%, bacto-Trypton 1%, NaCl 1%, Ampicillin 50 ug/ml) wurde eine einzelne Kolonie der LB- Agarschale eingeimpft, und wurde dann bei 30ºC 16 Stunden lang inkubiert und bei 200 rpm geschüttelt.
- Einem 500 ml-Erlenmeyerkolben mit 100 ml LB+Ap-Lösung (Zusammensetzung: bacto-Hefe-Extrakt 0.5%, bacto-Trypton 1%, NaCl 1%, Ampicillin 50 ug/ml) wurden 100 ul der LB-Kultur eingeimpft; dann wurde dieser bei 30ºC 24 Stunden lang inkubiert und bei 300 rpm geschüttelt.
- Die OD550 (optische Dichte bei 550 nm) der Kultur betrug 6.0.
- Die Zellen wurden dann bei 5000 rpm 10 Minuten lang zentrifugiert, und anschließend in Tris.Cl 0.1 M NaCl 0.05M pH 8.0 im gleichen Volumen wie das ursprüngliche resuspendiert. Die Zellen wurden mittels Beschallung aufgebrochen, und die Aktivität der GA-Enzyme im zellularen Extrakt wurde unter Anwendung eines colorimetrischen Verfahrens titriert.
- Die resultierende GA-Aktivität betrug 135U/l, 34mal so hoch wie die des ursprünglichen Pseudomonas SY77-1-Stammes.
- Dieses Beispiel betrifft die Fermentation von E. coli XL1Blue (pCS19.1) in einer neuen Fermentations-Flüssigkeit für die Herstellung von GA-Enzymen.
- Der Impfstoff wurde entsprechend der Beschreibung in Beispiel 2 hergestellt.
- Einem 500 ml-Erlenmeyerkolben mit 100 ml CSL-Lösung (Zusammensetzung: Corn-Steep Liquor ex Società Piemontese Amido Derivati 14%, Tetracyclin 10 ug/ml, Ampicillin 50 ug/ml, pH 7.5) wurden 100 ul der LB-Kultur eingeimpft, und dieser wurde dann bei 30ºC 24 Stunden inkubiert und bei 300 rpm geschüttelt.
- Die OD550 (optische Dichte bei 550 nm) der Kultur betrug 6.7.
- Die Zellen wurden dann bei 5000 rpm 10 Minuten lang zentrifugiert und wurden anschließend in Tris. Cl 1 M NaCl 0.05 M pH 8.0 im gleichen Volumen wie das ursprüngliche wieder suspendiert. Die Zellen wurden mittels Beschallung aufgebrochen und die Aktivität der GA-Enzyme im zellularen Extrakt wurde unter Anwendung der colorimetrischen Methode titriert.
- Die resultierende Aktivität betrug 307 U/l, etwa 77mal so hoch wie die des ursprünglichen Pseudomonas sp. SY77-1- Stammes.
- Dieses Beispiel betrifft eine neue Art der Fermentation von E. coli XL1Blue (pCS19.1) für die Produktion des GA-Enzyms.
- Der Impfstoff wurde entsprechend der Beschreibung in Beispiel 2 hergestellt.
- Einem 500 ml-Erlenmeyerkolben mit 100 ml LB+Tc+Ap-Lösung (Zusammensetzung: bacto-Hefeextrakt 0.5%, bacto-Trypton 1%, NaCL 1%, Tetracyclin 10 ug/ml, Ampicillin 50 ug/ml) wurden 100 ul der LB-Kultur eingeimpft und er wurde dann bei 30ºC, und bei 300 rpm 24 lang inkubiert. Die OD550 der Kultur betrug 6.0.
- Einem Fermentor (21, INFORS HG) mit 1.51 CSL [Zusammensetzung: Corn-Steep Liquor (wässerige Getreidelösung) 14%, pH 7.5] wurden 100 ml der LB-Kultur eingeimpft. Die Fermentationsparameter waren: T 30ºC, Rühren 1300 rpm, Luftstromrate 1 vom 20 Stunden lang bis OD550 = 6.0 erreicht ist.
- Während der folgenden 10 Stunden wurden der Kultur eine Glucose- oder Glycerollösung (50% W/w) als konstanter Strom mit einer Flußrate von 1.5 ml/l. h zugeführt, und während der nächsten 16 Stunden mit einer Flußrate von 6 ml/l. h, wobei der pH-Wert (mit NaOH 5M) auf 7.5 gehalten wurde, und einem solchen Grad an gelöstem Sauerstoff, um ein PO&sub2; von 10% zu haben. Das beobachtete Endwachstum betrug OD550 = 90. Am Ende der Kultur betrug die kumulierte Biomasse 87 g/l (Trockengewicht 18 g/l).
- Nach einer 54-stündigen Fermentation, die notwendige Zeit für eine Maximalproduktion, war pCS19.1-Plasmid immer noch in 84% der Zellen vorhanden.
- Die Zellen wurden bei 5000 rpm 10 Minuten lang zentrifugiert, und wurden anschließend in Tris. Cl 0.1 M NaCl 0.05 M pH 8.0, im gleichen Volumen wie im ursprünglichen, wieder suspendiert. Die Zellen wurden mittels Beschallung aufgebrochen, und die Aktivität der GA wurde unter Anwendung der Colorimetrie titriert. Die GA-Aktivität betrug 9780 U/l, 244Smal so hoch wie die des ursprünglichen Pseudomonas sp. SY77-1-Stammes.
- Dieses Beispiel betrifft die Produktion von GA-Enzym vom E. coli JM 105 (pWB14)-Stamm wie in Beispiel 1 beschrieben.
- Der Stamm wird bei -40ºC in YT-Glycerol-Lösung (Zusammensetzung: Glycerol 15%, bacto-Hefeextrakt 0.7%, bacto-Trypton 0.4%, NaCl 0.4%, Tetracyclin 25 ug/ml, Streptomycin 125 ug/ml) gelegt.
- Der Stamm, welcher in YT-Glycerol-Lösung gelegt worden war, wurde in Form einer Schlinge auf eine Petrischale mit LB-Agar (Zusammensetzung: bacto-Hefe-Extrakt 0.5%, bacto-Typton 1%, NaCl 1%, Tetracyclin 25 ug/ml, Streptomycin 125 ug/ml) gestrichen, und die Schale wurde dann bei 37ºC über Nacht inkubiert.
- Einem sterilen Röhrchen mit 2 ml LB+Sm+Tc-Lösung (Zusammensetzung: bact-Hefeextrakt 0.5%, bacto-Trypton 1%, NaCl 1%, Tetracyclin 25 ug/ml, Streptomycin 125 ug/ml) wurden eine einzelne Kolonie von der Agarschale eingeimpft, und wurde bei 30ºC 16 Stunden lang inkubiert, und bei 200 rpm geschüttelt.
- Einem 500 ml-Erlenmeyerkolben mit 100 ml LB+Tc+SM+IPTG-Lösung (Zusammensetzung: bacto-Hefeextrakt 0.5%, bacto-Trypton 1%, NaCl 1%, Tetracyclin 25 ug/ml, Streptomycin 125 ug/ml, IPTG 1 mM) wurden 100 ul der LB-Kultur eingeimpft, und er wurde dann bei 30ºC 24 Stunden lang inkubiert und bei 300 rpm geschüttelt.
- Die OD550 (Optische Dichte bei 550 nm) der Kultur betrug 5.0.
- Die Zellen wurden dann bei 5000 rpm 10 Minuten lang zentrifugiert und anschließend in Tris. Cl 0.1 M NaCl 0.05 M pH 8.0 im gleichen Volumen wie das ursprüngliche wieder suspendiert, und die Aktivität von GA-Enzym im zellularen Extrakt wurde unter Anwendung eines colorimetrischen Verfahrens ermittelt.
- Die GA-Aktivität betrug 135U/l, 34mal so hoch wie die des ursprünglichen Pseudomonas sp. SY77-1-Stammes.
- Dieses Beispiel betrifft die Fermentation von E. coli JM105 (pWB14) in einer neuen Fermentationslösung für die Produktion von GA-Enzymen.
- Es wurde ein Impfstoff entsprechend der Beschreibung in Beispiel 10 zubereitet.
- Einem 500 ml-Erlenmeyerkolben mit 100 ml CSL-Lösung (Zusammensetzung: Corn-Steep Liquor ex Società Piemontese Amideo Derivati 14%; Tetracyclin 25 ug/ml, Streptomycin 125 ug/ml, pH 7.5) wurden 100 ul der LB-Kultur eingeimpft und er wurde dann bei 30ºC, unter Schütteln bei 300 rpm, 24 Stunden lang inkubiert. Die OD550 der Kultur betrug 8.
- Die Zellen wurden bei 5000 rpm 10 Minuten lang zentrifugiert und dann in Tris. Cl 0.1 M NaCl 0.05 M pH 8.0 im gleichen Volumen wie im ursprünglichen wieder suspendiert. Die Zellen wurden mittels Beschallung aufgebrochen und die Aktivität von GA-Enzym im zellularen Extrakt wurde unter Anwendung des colorimetrischen Verfahrens titriert.
- Es wurde eine Aktivität der GA-Enzyme von 330U/l ermittelt, 83mal so hoch wie die des ursprünglichen Pseudomonas sp. SY77-1-Stammes.
- Das Beispiel betrifft die Produktion von GA-Enzym vom E. coli JM105 (pWB1)-Stamm wie in Beispiel 1 beschrieben.
- Der Stamm wird bei -40ºC in YT-Glycerol-Lösung (Zusammensetzung: Glycerol 15%, bacto-Hefeextrakt 0.7%, bacto-Trypton 0.4%, NaCl 0.4%, Tetracyclin 25 ug/ml, Streptomycin 125 ug/ml) gelegt.
- Der Stamm, welcher in YT-Glycerol-Lösung gelegt wurde, wird in Form einer Schlinge auf eine Petrischale mit LB Agar (Zusammensetzung: bacto-Hefeextrakt 0.5%, bacto-Trypton 1%, NaVl 1%, Tetracyclin 25 ug/ml, Streptomycin 125 ug/ml) gestrichen, und die Platte wurde dann bei 37ºC über Nacht inkubiert.
- Einem sterilen Röhrchen mit 2 ml LB+Sm+Tc-Lösung (Zusammensetzung: bacto-Hefeextrakt 0.5%, bacto-Trypton 1%, NaCl 1%, Tetracyclin 25 ug/ml, Streptomycin 125 ug/ml) wurde eine einzelne Kolonie von der LB Agarschale eingeimpft, und es wurde dann bei 30ºC 15 Stunden lang inkubiert und bei 200 rpm geschüttelt.
- Einem 500 ml-Erlenmeyerkolben mit 100 ml LB+Tc+Sm-Lösung (Zusammensetzung: bacto-Hefeextrakt 0.5%, bacto-Trypton 1%, NaCl 1%, Tetracyclin 25 ug/mll, Streptomycin 125 ug/ml) wurden 100 ul der LB-Kultur eingeimpft, und er wurde dann bei 30ºC 24 Stunden lang inkubiert, und bei 300 rpm geschüttelt.
- Die OD550 (optische Dichte bei 550 nm) der Kultur betrug 5.
- Die Zellen wurden bei 5000 rpm 10 Minuten lang zentrifugiert und anschließend in Tris. Cl 0.1 M NaCl 0.05 M pH 8.0 im gleichen Volumen wie das ursprüngliche wieder suspendiert. Die Zellen wurden dann mittels Beschallung aufgebrochen, und die Aktivität der GA-Enzyme im zellularen Extrakt wurde unter Anwendung eines colorimetrischen Verfahrens ermittelt.
- Die ermittelte Aktivität der GA betrug 140, 35mal höher als die des ursprünglichen Pseudomonas sp. SY77-1-Stammes.
- Dieses Beispiel betrifft die Produktion von GA-Enzym von E. coli JM195 (pWB1) wie in Beispiel 1 beschrieben.
- Der Impfstoff wurde entsprechend der Beschreibung in Beispiel 12 zubereitet.
- Einem 500 ml-Erlenmeyerkolben mit 100 ml LB+Tc+Sm+IPTG-Lösung (Zusammensetzung: bacto-Hefeextrakt 0.5%, bacto-Trypton 1%, NaCl 1%, Tetracyclin 25 ug/ml, Streptomycin 125 ug/ml, IPTG 1 mW wurde 100 ul LB-Kultur eingeimpft und dann wurde er bei 30ºC, unter Schütteln bei 300 rpm, 24 Stunden lang inkubiert. Die OD550 der Kultur betrug 5.
- Die Zellen wurden bei 5000 rpm 10 Minuten lang zentrifugiert und anschließend in Tris. Cl 0.1 M NaCl 0.05 M pH 8.0 im gleichen Volumen wie das ursprüngliche wieder suspendiert. Die Zellen wurden mittels Beschallung aufgebrochen und die Aktivität vom GA-Enzym im zellularen Extrakt wurde unter Anwendung des colorimetrischen Verfahrens titriert.
- Es wurde eine GA-Aktivität von 130 ermittelt, 33mal so hoch wie die des ursprünglichen Pseudomonas sp. SY77-1-Stammes.
- Dieses Beispiel betrifft die Fermentation von E. coli JM105 (pWB1) in einer neuen Fermentationslösung für die GA-Enzym- Produktion.
- Der Impfstoff wurde entsprechend der Beschreibung in Beispiel 12 hergestellt.
- Einem 500 ml-Erlenmeyerkolben mit 100 ml CSL-Lösung (Zusammensetzung: Corn-Steep Liquor ex Società Piemontese Amido Derivati 14%, Tetracyclin 25 ug/ml, Streptomycin 125 ug/ml, pH 7.5) wurden 100 ul der LB-Kultur eingeimpft und dann wurde er bei 30ºC, unter Schütteln bei 300 rpm, 24 Stunden lang inkubiert. Die OD550 der Kultur betrug 8.5.
- Die Zellen wurden bei 5000 rpm 10 Minuten lang zentrifugiert und anschließend in Tris. Cl 0.1 M NaCl 0.05 M pH 8.0 im gleichen Volumen wie das ursprünglichen wieder suspendiert. Die Zellen wurden mittels Beschallung aufgebrochen und die Aktivität vom GA-Enzym im zellularen Extrakt wurde unter Anwendung des colorimetrischen Verfahrens titriert.
- Es wurde eine GA-Aktivität von 78 U/l ermittelt, 197mal so hoch wie die Aktivität des ursprünglichen Pseudomonas sp. SY77-1-Stammes.
Claims (18)
1. Verfahren zur Herstellung großer Mengen des Enzyms 7-(4-
carboxy-butanamid)-Cephalosporansäure-Acylase (GA),
welches Verfahren das Züchten eines E. coli-Stammes auf einem
geeigneten Nährboden, der die Acylase Kodierungs-Sequenz
enthält, und anschließend das Herauslösen des Enzyms aus
der resultierenden Kultur umfaßt,
dadurch gekennzeichnet, daß zum Aufziehen Corn Steep Liquor
(wässerige Getreidelösung) benutzt wird, und daß als
Herstell-Mikroorganismus ein E. coli-Stamm benutzt wird, der
ausgewählt ist aus NCIMB40560, NCIMB40559, NCIMB40592 und
NCIMB40593.
2. Verfahren nach Anspruch 1, bei welchem eine Aktivität der
Cephalosporin-Acylase von wenigstens 9700 U/l erreicht
wird.
3. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, bei welchem
die Fermentation bei einer Temperatur durchgeführt wird,
die in dem Bereich von 18 bis 38ºC liegt, und in einem
Bereich des ph-Wertes von 5 bis 9.
4. Verfahren nach Anspruch 3, wobei die Fermentation bei 30
ºC und bei einem ph-Wert von 7,5 durchgeführt wird.
5. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, bei welchem
hohe Erträge erreicht werden durch Anreicherung des
Nährbodens während der Durchführung der Fermentation.
6. Verfahren nach Anspruch 5, bei welchem die Anreicherung
durchgeführt wird mittels Zugabe einer Glukose- oder
Glyzerin-Lösung (50% w/v) innerhalb von 24 Stunden ab Impfung
bei einer kontinuierlichen Flußrate von 1,5 ml/l · h während
einer bestimmten Zeitperiode und dann 6 ml/l · h während der
restlichen Fermentationszeit, währenddessen der ph-Wert bei
7,5 (mit 5 M NaOH) und ein konstanter Pegel von gelöstem
Sauerstoff (PO&sub2; = 10%) gehalten wird.
7. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, bei welchem
die Konzentration von Corn Steep Liquor (wässeriger
Getreidelösung) in dem Nährboden im Bereich von 1 bis 20 v/v
gehalten wird.
8. Verfahren nach Anspruch 5, bei welchem die Konzentration
von Corn Steep Liquor (wässerige Getreidelösung) in dem
Nährboden bei 14 v/v gehalten wird.
9. E. coli Stamm XL1Blue (pWE4.3.1) angelagert mittels NCIME,
welchem die Zugangsnummer NCIMB40560 zuwiesen wurde,
welcher in der Lage ist große Mengen des Enzyms
7-(4-carboxybutanamid)-Cephalosporansäure-Acylase zu produzieren.
10. pWE4.3.1.-Plasmid mit dem 4-kb-EcoRIXbaI-Fragment
entsprechend dem GA-Gen von Pseudomonas 146H9 und eingebracht in
den Stamm nach Anspruch 9.
11. E. coli Stamm XL1Blue (pCCS19.1) angelagert mittels NCIMB,
welchem die Zugangsnummer NCIMB40559 zuwiesen wurde,
welcher in der Lage ist große Mengen an
7-(4-carboxybutanamid)-cephalosporanische Säureacylase Enzymen zu
produzieren.
12. pCCS19.1-Plasmid mit dem 3-kb-EcoRI-Fragment entsprechend
dem GA-Gen von Pseudomonas SY77-1 und eingebracht in den
Stamm nach Anspruch 11.
13. pTet tac Plasmid-Vektor mit 3-ECORI-Fragment entsprechend
dem GA-Gen von Pseudomonas SY77-1.
14. Wirt-Mikroorganismus umgeformt durch den Plasmid-Vektor
nach Anspruch 13.
15. E. coli Stamm JM105 (pWB14) angelagert mittels NCIMB,
welchem die Zugangsnummer NCIMB40593 zuwiesen wurde, welcher
in der Lage ist große Mengen des Enzyms
7-(4-carboxybutanamid)-Cephalosporansäure-Acylase zu produzieren.
16. PWB14-Plasmid gebildet durch den pTet tac Plasmid-Vektor
mit dem 3-kb-EcoRI-Fragment das GA-Gen von Pseudomonas
SY77-1 mitführend und eingebracht in den Stamm gemäß
Anspruch 15.
17. E. coli Stamm JM105 (pWB1) angelagert mittels NCIMB,
welchem die Zugangsnummer NCIMB40592 zuwiesen wurde, welcher
in der Lage ist große Mengen des Enzyms
1-(4-carboxybutanamid)-Cephalosporansäure-Acylase zu produzieren.
18. pWB14-Plasmid gebildet durch den pTet tac Plasmid-Vektor
mit dem 3-kb-EcoRI-Fragment das GA-Gen von Pseudomonas
SY77-1 mitführend, welches in entgegengesetzter Richtung
zum ptac-Aktivator ausgerichtet ist, und eingebracht in den
Stamm nach Anspruch 15.
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