JP2805594B2 - ７−（４−カルボキシブタンアミド）−セファロスポラン酸アシラーゼの製法 - Google Patents

７−（４−カルボキシブタンアミド）−セファロスポラン酸アシラーゼの製法

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Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】本発明は、酵素７−（４−カルボキシブタ
ンアミド）−セファロスポラン酸アシラーゼ（「Ｇ
Ａ」）を多量製造する方法に係り、該方法は、好適な培
養条件下で組換えエシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉ
ｃｈｉａ ｃｏｌｉ：大腸菌）Ｋ１２の菌株を生育し、
つづいて得られた培養物から酵素を抽出することからな
る。
【０００２】酵素の産生は、コーンスチープリカー（培
養培地の極めて安価な成分である）によって誘発される
特殊な発現系によって制御される。さらに、特にＥ．ｃ
ｏｌｉＫ１２誘導体（ＥＥＣ規準によって「安全」であ
るとみなされている）が使用される。
【０００３】該酵素は、７−（４−カルボキシブタンア
ミド）−セファロスポラン酸を原料とする７−アミノ−
セファロスポラン酸の酵素的製造に使用される。
【０００４】詳述すれば、本発明の実施に当たっては下
記の工程を包含する。−組換えＤＮＡ技術によるシュー
ドモナス１４６Ｈ９（ＮＣＩＭＢ ４０４７４）及びＳ
Ｙ７７−１（Ｆｅｒｍ ２４１０）から、酵素７−（４
−カルボキシブタンアミド）−セファロスポラン酸アシ
ラーゼのコード遺伝子を単離する工程。−前記遺伝子を
「安全」なもの（クラスＰ１）として分類されるＥ．ｃ
ｏｌｉＫ１２にクローン化する工程。−前記Ｅ．ｃｏｌ
ｉの菌株の発酵によって多量の酵素を製造する工程。−
７−（４−カルボキシブタンアミド）−セファロスポラ
ン酸から７−アミノ−セファロスポラン酸を酵素的に製
造するための酵素を抽出し、不動化させる工程。
【０００５】自然界には、酵素７−（４−カルボキシブ
タンアミド）−セファロスポラン酸アシラーゼ（ＧＡ）
を産生し得る微生物がいくつか存在する。このような能
力は特にシュードモナス属菌に散在していることが観察
されている［ＳｈｉｂｕｙａＹ．ら（１９８１）Ａｒ
ｇ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．４５，１５６１；Ｍａｔｓｕ
ｄａ Ａ．ら（１９８５）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１
６３，１２２２；Ｍａｔｓｕｄａ Ａ．ら（１９８７）
Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６９，５８１５；Ａｒａｍ
ｏｒｉ Ｉ．ら（１９９１）Ｊ．Ｆｅｒｍ ＆ Ｂｉｏ
ｅｎｇ．７２，２２７］。
【０００６】しかしながら、上記微生物の産生レベルが
低い（３〜４Ｕ／ｌ）ため、酵素ＧＡの工業的製造法の
実施が阻害されていた。
【０００７】酵素ＧＡの産生を増大させるために有効に
利用されている方法は組換えＤＮＡ技術を利用するもの
である。詳述すれば、この技術により、プロデューサー
微生物からＧＡコード遺伝子を単離でき、これをＥ．ｃ
ｏｌｉの菌株に移して、その発現を強力なプロモーター
による調節下に置くことが可能となる。
【０００８】かかる技術により、Ｃｒｏｕｘらは、Ｅ．
ｃｏｌｉ Ｋ１２の菌株を変性し、好適な培養培地で生
育させた後、収率が増大し、酵素産生レベルが３０００
Ｕ／ｌに達するとの知見を得ている（ヨーロッパ特許公
開第０ ４６９ ９１９号）。残念なことには、彼等が
使用した微生物はリプレッサーを持たない野生型であ
り、従って酵素の産生はインデューサーの使用によって
調節及び制御されない。この理由により、ＥＥＣ規準は
Ｃｒｏｕｘらの微生物をかなりの制約が予想されるクラ
スＰ３に分類している。
【０００９】組換えＤＮＡ技術によって達成される微生
物の産生能力の改善の他の例はヨーロッパ特許公開第０
５０４ ７９８号に報告されている（１００００Ｕ／
ｌ）。
【００１０】この場合、クラスＰ２に属する「安全な」
微生物として分類されるＥ．ｃｏｌｉＫ１２誘導体が使
用されており、上述の如き制約を受けない。かかるＥ．
ｃｏｌｉ誘導体はリプレッサー（好適なインデューサー
が存在しないかぎり酵素活性体の産生を阻害する）を含
有する。しかしながら、技術文献に報告されているイン
デューサーの例はＩＰＴＧ（イソプロピルβ−Ｄ−チオ
ガラクトピラノシド）のみであり、この物質は非常に高
価である。
【００１１】発明者らは、驚くべきことには、コーンス
チープリカー（培養培地の１成分でもある）の如き極め
て安価な物質によって誘発されるＧＡ遺伝子発現系を配
置することに成功し、本発明に至った。
【００１２】かかる系により、当該発現系を包含する宿
主微生物として、ＥＥＣ規準により非常に安全なもの
（クラスＰ１）として分類されるＥ．ｃｏｌｉ Ｋ１２
の特殊な誘導体が使用される場合であっても、多量の酵
素を産生することが可能となる。
【００１３】従って、本発明は、好適な培養培地中でア
シラーゼコード配列を含有するＥ．ｃｏｌｉの菌株を生
育及び誘導し、つづいて得られた培養物から酵素を抽出
することからなる酵素７−（４−カルボキシブタンアミ
ド）−セファロスポラン酸アシラーゼ（「ＧＡ」）を多
量製造する方法において、インデューサーとしてコーン
スチープリカーを使用し、プロデューサー微生物として
ＮＣＩＭＢ ４０５６０、ＮＣＩＭＢ ４０５５９、
ＮＣＩＭＢ ４０５９２及びＮＣＩＭＢ ４０５９３の
中から選ばれるＥ．ｃｏｌｉの菌株を使用することを特
徴とする７−（４−カルボキシブタンアミド）−セファ
ロスポラン酸アシラーゼの製法に係る。
【００１４】高プロデューサーＥ．ｃｏｌｉ誘導体を得
ることは、下記の工程を包含してなる方法を発展させる
ことを意味する （ａ）酵素ＧＡをコードする配列を含有する微生物の全
ＤＮＡを消化し、バクテリオファージＤＮＡライブラリ
ーを作成する工程。 （ｂ）Ｅ．ｃｏｌｉにライブラリーのファージを感染さ
せる工程。 （ｃ）アシラーゼ配列の一部を含有する宿主Ｅ．ｃｏｌ
ｉのクローンを、目的のアシラーゼに対して特異的に作
られた精製した抗血清を使用することによって確認する
工程。 （ｄ）アシラーゼ遺伝子の一部配列を含有するプローブ
とのハイブリッド形成により完全アシラーゼ配列を含有
するＥ．ｃｏｌｉのクローンをスクリーニングし、その
酵素活性を測定する工程。 （ｅ）ＧＡ合成に必要なＤＮＡ領域によって特徴づけら
れるプラスミドを単離し、これをＥ．ｃｏｌｉの高レベ
ル発現ベクター内に挿入する工程。 （ｆ）宿主菌株のプラスミドからのβ−ラクタマーゼの
産生を阻害するために高レベル発現ベクターを変性する
工程。 （ｇ）異なる炭素及び窒素源を使用して、バッチ式発酵
及び流加発酵による発現プラスミドを含有Ｅ．ｃｏｌｉ
の生育を最適化する工程。
【００１５】ＤＮＡドナーとしてシュードモナス１４６
Ｈ９（ＮＣＩＭＢ ４０４７４）及びＳＹ７７−１（Ｆ
ｅｒｍ２４１０）を使用した。これらは少量の酵素ＧＡ
（それぞれ３Ｕ／ｌ及び４Ｕ／ｌ）を産生できるのみで
ある。
【００１６】染色体ＤＮＡを抽出し、精製し、制限酵素
で部分的に消化した。このようにして得られたＤＮＡフ
ラグメントをその末端で処理し、バクテリオファージラ
ムダＺＡＰＩＩベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に挿
入した。シュードモナス１４６Ｈ９（ＮＣＩＭＢ ４０
４７４）及びＳＹ７７−１（Ｆｅｒｍ２４１０）のバク
テリオファージ ラムダＺＡＰＩＩ遺伝子ライブラリー
を作成するため、組換えファージをＥ．ｃｏｌｉの細胞
と共に平板培養した。
【００１７】シュードモナス属菌からのゲノムＤＮＡか
ら作成されたライブラリーのスクリーニングを行うため
に、酵素ＧＡを認識し得る抗体を下記の操作に従って調
製した。
【００１８】シュードモナス１４６Ｈ９によって産生さ
れた酵素ＧＡを初めに精製し、ついでウサギに注射し
た。その後、ＧＡ特異性抗血清を得て、その感度がライ
ブラリーのスクリーニングに最適であることを確認し
た。（この抗血清は、２００〜１０００×に希釈した後
も、ニトロセルロースペーパーフィルター上にスポット
した酵素ＧＡ１０〜１００ピコｇを特異的に認識し得
る）。抗体と酵素との間の陽性反応は、テストに供した
サンプルへのＥ．ｃｏｌｉの細胞溶解物の添加によって
は変性されなかった。シュードモナス１４６Ｈ９（ＮＣ
ＩＭＢ ４０４７４）からのＧＡに対して作られた抗血
清は、シュードモナスＳＹ７７−１（Ｆｅｒｍ２４１
０）からの精製ＧＡをも認識し得る。
【００１９】このようにして、ＧＡのＤＮＡの部分配列
が単離された。
【００２０】かかる配列（ラベル付けした後、前記遺伝
子ライブラリーを調査するためのプローブとして使用さ
れる）は完全なＡＧ配列を単離することを可能にする。
【００２１】シュードモナス１４６Ｈ９（ＮＣＩＭＢ
４０４７４）及びＳＹ７７−１（Ｆｅｒｍ２４１０）か
らのＤＮＡによって作成したライブラリーにおけるアシ
ラーゼの存在の確認を、さらに、次の２つの異なる方法
に従って操作することによって行った。 （１）ＨＰＬＣ又は比色技術による形質転換コロニーの
アシラーゼ活性の測定［Ｍａｔｓｕｄａ Ａ．ら，（１
９８５），Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６３，１２２
２；Ｍａｔｓｕｄａ Ａ．ら，（１９８７），Ｊ．Ｂａ
ｃｔｅｒｉｏｌ．１６９；Ａｒａｍｏｒｉ Ｉ．ら，
Ｊ．Ｆｅｒｍ．＆ Ｂｉｏｅｎｇ．７２，２３２（１９
９１）］。 （２）アシラーゼ遺伝子の既知配列と同族であり、従っ
て目的の遺伝子を含有するプラスミドを認識することが
できるオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーション
（ヨーロッパ特許公開第０ ５０４ ７９８号）。
【００２２】同定された配列を有するプラスミドを包含
したこれらのＥ．ｃｏｌｉ細胞はアシラーゼ活性を発揮
した。
【００２３】ＧＡ遺伝子を含有するＤＮＡフラグメント
を、さらに、近接する非酵素コードＤＮＡを除去するこ
とによって限定した。
【００２４】ついで、得られたフラグメントをＥ．ｃｏ
ｌｉの発現ベクターでクローン化し、強力な誘導性プロ
モーターによる調節下に置いた。
【００２５】プロモーターの誘導は、ドナーのシュード
モナス１４６Ｈ９（ＮＣＩＭＢ ４０４７４）及びＳＹ
７７−１（Ｆｅｒｍ２４１０）のものよりもかなり高い
アシラーゼ活性（容量及び特異性の両方）を得ることを
可能にする。
【００２６】Ｅ．ｃｏｌｉにおけるＧＡ遺伝子を単離す
るために、ベクター ラムダＺＡＰＩＩ及びｐＢｌｕｅ
ｓｃｒｉｐｔ ＳＫ＋／−（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を
使用した。
【００２７】遺伝子ライブラリー（バクテリオファージ
及びプラスミドを有するコロニーのもの）において融合
タンパク質β−ガラクトシダーゼーＧＡを発現させるた
めには、ｌａｍｂｄａｇｔ １１，ｌａｍｂｄａｇｔ２
２の如きベクター又はｐＵＣシリーズの如きプラスミ
ド、又は融合タンパク質用の発現モジュールを有する他
のベクターも同様に使用できる。
【００２８】詳述すれば、下記の如くしてアシラーゼ遺
伝子をクローン化した。
【００２９】すなわち、ドナー菌株からの染色体ＤＮＡ
を多切断（ｆｒｅｑｕｅｎｔ−ｃｌｅａｖａｇｅ）制限
酵素によって部分的に消化し、得られたフラグメントを
その長さに従って選別した。所望の長さ範囲に入るフラ
グメントをＤＮＡ変性酵素［たとえば、死傷末端（ｃａ
ｓｕａｌ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｅｎｄｓ）を形成するた
めのヌクレアーゼ（Ｂａｌ３１）、及びかかる末端を満
たすためのＤＮＡポリメラーゼ（ｋｌｅｎｏｗ ｆｒａ
ｇｍｅｎｔ）］で処理した。その後、これらフラグメン
トに、ホスホリル化オリゴヌクレオチドでなるリンカー
をＴ４ＤＮＡリガーゼによって付着させた。このように
して処理したフラグメントを制限酵素（リンカー配列を
開裂する）で開裂し、ゲル濾過によって非結合リンカー
から分離した。ＤＮＡベクター（ファージ遺伝子ライブ
ラリーの場合にはバクテリオファージ、又はプラスミド
遺伝子ライブラリーの場合にはプラスミド）を、ＤＮＡ
末端において、変性ドナーＤＮＡの末端に存在するもの
に対する相補配列を生成する制限酵素によっても消化し
た。ついで、ベクター及び得られたフラグメントの両方
をＴ４ＤＮＡリガーゼによってリガーゼ処理した。ドナ
ー微生物からの１以上のＤＮＡフラグメントのベクター
への挿入によって得られた組換えベクターを使用して、
好適な微生物（たとえばＥ．ｃｏｌｉ ＸＬ１ Ｂｌｕ
ｅ）を、感染法（ファージ遺伝子ライブラリーの場合）
により又はＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．ら，（１９８９）Ｍ
ｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈ
ａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒ
ｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ニューヨーク，米国によって開
示された一般的な通常の形質転換法（プラスミド遺伝子
ライブラリーの場合）によって形質転換させる。
【００３０】遺伝子ライブラリーを平板培養し、融合タ
ンパク質の発現を誘発させた。つづいて、平板上にニト
ロセルロース膜を置いて、生成したタンパク質を結合さ
せた。ついで、膜を免疫テスト（膜をＧＡ用の特異的抗
血清（好適に希釈）と接触させ、これにより、部分ＧＡ
配列を含有するプラーク又はコロニーを示す）によって
アッセイした。目的のベクターが配置された後、挿入体
の制限地図を調製する。
【００３１】なお上述の遺伝子ライブラリーを使用し
て、「プラーク又はコロニーリフティング」法［Ｍａｎ
ｉａｔｉｓ，Ｔ．ら（１９８９）］によってＤＮＡをニ
トロセルロース膜に移した後、ＤＮＡを分析する。
【００３２】ついで、ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼー
ションを使用する。融合タンパク質のβ−カラクトシダ
ーゼ部分に近接したフラグメントによってなるラベル付
きプローブ（「Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｎｏｎ−Ｒａｄ
ｉｏａｃｔｉｖｅ Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ Ｋｉｔ」を使
用する常法による）は、遺伝子ライブラリーにおいて酵
素ＧＡに相当する遺伝子の存在を証明できる。ＤＮＡ−
ＤＮＡハイブリダイゼーションの好適な条件下では、Ｇ
Ａ特異性プローブのみ、コード遺伝子の一部又は全体を
含有する組換えベクターにアニールする。
【００３３】ついで、このようにして配置されたプラー
ク又はコロニーをＧＡの産生能力についてテストし、挿
入体の制限地図を調製した。ついで、ＤＮＡをアシラー
ゼ活性の合成に必要な最小の長さに切断し、Ｅ．ｃｏｌ
ｉの宿主細胞に移した。挿入体の制限地図が定義された
後、より正確にＧＡ遺伝子の位置を特定するため、制限
酵素又はＤＮＡヌクレアーゼを使用してＤＮＡフラグメ
ントについて欠失が行われる。
【００３４】制限地図を各種の制限酵素を使用すること
によって決定し、アシラーゼ活性を一般的な分光測光法
又はＨＰＬＣ法によって定量した。
【００３５】Ｅ．ｃｏｌｉにおけるＧＡの発現レベル
を、公知の一般的な遺伝子工学技術によって増大させ
た。これらの１つによれば、目的の遺伝子を、Ｅ．ｃｏ
ｌｉのプロモーター配列（ＰｌａｃＵＶ５，Ｐｔａｃ，
Ｐｔｒｃ，Ｐｔｒｐ，ＰｐｈｏＡ，Ｐｌｐｐ，ＰＬ，Ｐ
Ｒ，Ｐｌａｍｂｄａ１０）又はＥ．ｃｏｌｉでの遺伝子
の発現に使用される他のプロモーターによるコントロー
ル下に置く。
【００３６】発明者らの場合には、ＧＡ遺伝子を含有す
る組換えベクターを各種の制限酵素で消化した。得られ
たＤＮＡフラグメントを、Ｔ４ＤＮＡ リガーゼを使用
して、プラスミド（たとえば、ｐＢＲ３２２，ｐＢｌｕ
ｅｓｃｒｉｐｔ，ｐＵＣ１８，ｐＡＣＹＣ１８４）、又
は予め制限酵素によって消化され、含有すべきフラグメ
ントとの適合部位を示すさらに他のプラスミドに結合さ
せた。ついで、得られた組換えベクターを形質転換によ
ってＥ．ｃｏｌｉの菌株（たとえばＸＬ１ Ｂｌｕｅ）
に導入した。ＧＡを産生する形質転換体は、細胞抽出物
のアシラーゼ活性を測定することによって確認される。
ＤＮＡフラグメント上におけるＧＡ遺伝子の位置を、組
換えベクターの制限地図によって決定した。遺伝子含有
フラグメントを好適に切断し、ついでＰｔａｃプロモー
ター配列［ｄｅ Ｂｏｅｒ，Ｈ．ら，（１９８３）Ｐｒ
ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８０；
２１］を含有するプラスミド（たとえば、ｐＫＫ２２３
−３又はｐＤＲ５４０）又はＰｔｒｃプロモーター配列
を含有するプラスミド（たとえば、ｐＫＫ２３３−２及
びｐＴｒｃ９９Ａ（ｐｈａｒｍａｃｉａ））に挿入す
る。Ｐｔａｃプロモーターのコントロール下のＧＡ遺伝
子を含有する組換えベクターを使用してＥ．ｃｏｌｉ
ＸＬ１ Ｂｌｕｅの細胞を形質転換させ、形質転換体の
ＧＡ活性を上述の如くアッセイした。
【００３７】このようにして、シュードモナス１４６Ｈ
９（ＮＣＩＭＢ ４０４７４）及びＳＹ７７−１（Ｆｅ
ｒｍ２４１０）から誘導されたＧＡ遺伝子のみを含有す
るＥ．ｃｏｌｉの菌株よりもかなり多いＧＡを産生でき
るＥ．ｃｏｌｉの菌株が得られた。この段階で得られる
高産生収率は、遺伝子の高レベル発現を左右するＥ．ｃ
ｏｌｉに特異的なプロモーター配列の使用によるもので
ある。事実、ＧＡ遺伝子はそれ自体のプロモーター（シ
ュードモナス属菌において良好に働くが、宿主である
Ｅ．ｃｏｌｉに包含された場合には、Ｅ．ｃｏｌｉ内で
は働かず、前記遺伝子は低い発現レベルを示す）を有す
る。従って、プロモーターの変更は本発明の方法の本質
的な改良を生ずるものである。
【００３８】シュードモナス１４６Ｈ９（ＮＣＩＭＢ
４０４７４）及びＳＹ７７−１（Ｆｅｒｍ２４１０）の
ＧＡ遺伝子の高発現レベルを達成するために使用される
Ｅ．ｃｏｌｉは、たとえばＸＬ１ Ｂｌｕｅ、ＪＭ１０
５，Ｗ３１１０，ＤＨ１などである。
【００３９】ベクターｐＫＫ２２３−３に含有されるア
ンピシリン耐性の遺伝子（プラスミド源からのβ−ラク
タマーゼの産生に関与する）は、テトラサイクリン、ク
ロラムフェニコール、カナマイシン、ストレプトマイシ
ン耐性をコードする遺伝子、又は抗生物質に対する耐性
をコードする他の公知の遺伝子によって交換される。
【００４０】ＧＡ産生は、好適な培養培地を収容する振
とうエーレンマイヤーフラスコ又は発酵装置内で組換え
Ｅ．ｃｏｌｉの菌株を生育させることによって行われ
る。
【００４１】発酵時間は１２〜９０時間である。
【００４２】培養培地は、炭素源（たとえば、グルコー
ス、ラクトース、スクロース、グリセリン、フルクトー
ス、糖みつ、植物油など）、窒素／ビタミン源（たとえ
ば、酵母エキス、肉エキス、大豆ミール、ピーナッツミ
ール、コーンスチープリカーなど）及び無機塩でなる。
【００４３】生育温度は１８〜３７℃であり、ブロスの
ｐＨ値は５〜９である。
【００４４】発酵（いくつかの数の世代を必要とする）
の間におけるプラスミドの安定性は抗生物質を添加する
ことによって維持される。
【００４５】ＧＡの産生は流加培養法によって改善され
ることが観察された。
【００４６】当該技術は、組換えＥ．ｃｏｌｉの菌株を
コーンスチープリカーを基材とする培地中で平衡段階
（遅生育段階に相当）に達するまで生育させ、ついで炭
素源（たとえば、グルコース又はグリセリン）を添加す
ることによって活発に生育させるものである。
【００４７】ｌａｃＩｑ遺伝子型をもつＥ．ｃｏｌｉの
菌株（ＪＭ１０５又はＸＬ１ Ｂｌｕｅ）又は同じ発現
プラスミド上に存在するｌａｃＩｑを含有する菌株によ
るＧＡの産生は、発酵ブロスへの高価な物質（たとえば
ＩＰＴＧ（イソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトピラノシ
ド））の添加によって誘発される（ヨーロッパ特許公開
第０ ５０４ ７９８号）。ＩＰＴＧはＬａｃ遺伝子か
ら誘導されるＥ．ｃｏｌｉのプロモーター（Ｐ
ｌａｃＵＶ５，Ｐｔａｃ，Ｐｔｒｃ）の抑制解除を生ず
る。
【００４８】この必要かつ高価な誘発は、発酵ブロス内
においてコーンスチープリカーが濃度１〜２０％容量／
容量（ｖ／ｖ）で使用される場合には回避される。
【００４９】従って、本発明の驚くべき結果は、低コス
トの培地成分を使用することによって、Ｅ．ｃｏｌｉの
ｌａｃＩｑ菌株において、プロモーターＰｔａｃのコン
トロール下でＧＡ遺伝子を誘発できることにある。
【００５０】さらに、コーンスチープリカーの存在は、
プラスミドの安定性及び発酵中の酵素ＧＡの発現を保護
する。
【００５１】コーンスチープリカーは、Ｌａｃ遺伝子に
由来のＥ．ｃｏｌｉのプロモーター（たとえば、Ｐ
ｌａｃＵＶ５，Ｐｔａｃ，Ｐｔｒｃ）を含有する高発現
プラスミドがＬａｃ遺伝子型をもつＥ．ｃｏｌｉの菌株
（たとえば、Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ ２７３２５）又は
ＤＨ１）の細胞内に含有される際にもインデューサーと
して作用する。
【００５２】しかしながら、これらの場合には、プラス
ミドの安定性の問題、その結果、ＧＡ遺伝子の発現の問
題が観察された。
【００５３】組換え微生物の使用を含む発酵法による酵
素ＧＡの製造はＥＥＣの規則に拘束される。
【００５４】これら規則は３つのパラメーター（すなわ
ち障害（ｄａｍａｇｅ）ファクター、発現（ｅｘｐｒｅ
ｓｓｉｏｎ）ファクター及びアクセス（ａｃｃｅｓｓ）
ファクター）に従って宿主微生物を分類する。
【００５５】「障害」ファクターは組換え微生物から得
られる生成物の性質を考慮するものである。たとえば、
ＧＡは生物に障害をもたらさない化学的に活性な分子で
なるものであるため、その値は１０−９である。
【００５６】「発現」ファクターは、組換体によるＧＡ
産生の発現が最大である場合１である。
【００５７】最後に、「アクセス」ファクターは、使用
したＥ．ｃｏｌｉの菌株及びプラスミドの種類に左右さ
れる。
【００５８】ヒトの結腸内での増殖の可能性を示すＥ．
ｃｏｌｉの野生型菌株は、アクセスファクター１であ
る。菌株Ｋ１２（たとえばＷ３１１０）に由来のＥ．ｃ
ｏｌｉの菌株（衰弱（ｄｅｂｉｌｉｔａｎｔ）変異体を
もたない）はアクセスファクター１０−３であり、最後
に、Ｋ１２由来ではあるが衰弱化されたＥ．ｃｏｌｉの
菌株（たとえばＸＬ１ Ｂｌｕｅ，ＪＭ１０５，ＤＨ１
など）はアクセスファクター１０−６として分類され
る。
【００５９】これら３つのファクターの積が、いわゆる
「汚染菌カテゴリー」における遺伝子的に変性された微
生物の分類のために使用される。発明者らの場合には、
上述の３種類のＥ．ｃｏｌｉにおける高発現プラスミド
の使用によるＧＡの製造はそれぞれ１０−９、１０
−１２、１０−１５であり、それぞれ０、１及び２の汚
染菌カテゴリーに相当する（ここで、「０」はフル工業
的規模での発酵法でこれら微生物を使用する際に要求さ
れる制限が全くないことを意味する。これに対して、値
「２」は厳重な制限が採用されなければならないことを
意味する）。
【００６０】組換え微生物によって産生されたＧＡは、
遠心分離によって細胞を培養ブロスから分離した後、回
収される。
【００６１】常法（たとえば、音波処理、浸透圧衝撃、
加圧、酵素による溶菌（リゾチーム）など）を使用して
細胞を破壊し、酵素ＧＡを、沈殿、クロマトグラフィー
又は膜の使用による細胞抽出によって精製する。
【００６２】簡単な硫酸アンモニウムグラディエント
（３０〜５５％）及び弱陰イオン交換クロマトグラフィ
ー（ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｃｅｌ；Ｐｈａｒｍａｃｉ
ａ）により、エステラーゼ又はβ−ラクタマーゼの如き
酵素（ＧＡが触媒作用を発揮する反応における基質及び
生成物を分解又は変性する）が、ＧＡを含有するフラク
ションから完全に除去されることが知見された。
【００６３】得られる利点は、エステラーゼ又はβ−ラ
クタマーゼを生成しないＥ．ｃｏｌｉの菌株を使用する
必要なく、又はアンピシリン耐性を他の抗生物質に対す
る耐性で交換する必要なく、不動化されるに充分に高い
純度で酵素が得られることにある。
【００６４】部分的に精製されかつ濃縮された酵素抽出
物は、これらを好適な不活性支持体（たとえばＥｕｐｅ
ｒｇｉｔ Ｃ）と反応させることによって不動化され
る。
【００６５】不動化された酵素は、公知の方法に従って
ＧＬ−７ＡＣＡの溶液の変換及び７ＡＣＡの単離に繰返
し使用される。
【００６６】本発明の方法を詳細に説明するために下記
の実施例を例示するが、これらの実施例は本発明の精神
を制限するものではなく、本発明は特許請求の範囲によ
ってのみ定義される。
【００６７】
【実施例１】抗体の調製 シュードモナス１４６Ｈ９（ＮＣＩＭＢ ４０４７４）
の細胞からの酵素ＧＡを均一になるまで常法によって精
製した。抗体の調製及びテスト法は一般的な免疫学的技
術である。特に特定していない場合には、すべての精製
操作を５℃で実施した。６ＡＰＡの代わりに７ＡＣＡを
使用することにより変更したＢａｌａｓｉｎｇｈａｍ法
（ＢａｌａｓｉｎｇｈａｍＫ．ら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂ
ｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ（１９７２），２７６；２５
０）に従ってＧＡ活性を測定した。１Ｕは、３７℃及び
最適ｐＨ値７〜１１において１分間で７−アミノ−セフ
ァロスポラン酸１μモルを生成するに必要な酵素の量で
ある。
【００６８】
【実施例２】１．シュードモナス１４６Ｈ９（ＮＣＩＭ
Ｂ ４０４７４）から産生された酵素ＧＡの精製 ａ．発酵ブロスから１２０００ｇでの連続遠心分離によ
って細胞を集める。細胞ペレットを−２０℃で保存す
る。凍結した細胞ペレット１００ｇを原料緩衝剤（５０
ｍＭＴｒｉｓ．Ｃｌ，０．１Ｍ ＮａＣｌ，ｐＨ８．
０）３００ｍｌ中に懸濁化させ、懸濁液を音波処理（各
回２００Ｗ、５分間で６回処理；処理と処理との間で冷
却する）して細胞を完全に破壊した。非溶菌ペレット及
び残骸を、２５０００ｇ、４５分間での遠心分離によっ
て除去する。
【００６９】ｂ．３０〜５５％硫酸アンモニウムグラディエント 磁石撹拌機によって撹拌し、０℃に維持した細胞フリー
抽出物（ｃ．ｆ．ｅ．）に固体硫酸アンモニウムを添加
する。ｐＨ値をＮＨ４ＯＨによって８．０に維持する。
【００７０】塩フラクションの添加（３０％飽和溶液を
生成）１時間で生成した沈殿物を４０００ｇ、０℃にお
いて４５分間遠心分離する。ついで、５５％飽和溶液が
得られるまで、上清液に同様にしてさらに固状硫酸アン
モニウムを添加する。０℃で１時間撹拌した後、沈殿物
を遠心分離（上述の如く）によって集め、新たな原料緩
衝剤に溶解させ、同じ緩衝剤に対して透析する。
【００７１】ｃ．ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｃｅｌカラムで
のクロマトグラフィー 上記工程ｂに記載の如くして得られた酵素ＧＡを含有す
る透析物を、予め原料緩衝剤で平衡化したＤＥＡＥ−Ｓ
ｅｐｈａｃｅｌカラム［５００×３２（内径）ｍｍ、２
００ｍｌ（容積）］に負荷した。原料緩衝剤１００ｍｌ
でカラムを洗浄した後、酵素ＧＡを、５０ｍＭ Ｔｒｉ
ｓ．Ｃｌ（ｐＨ８．０）中におけるリニア ＮａＣｌグ
ラディエント（０．１→３５Ｍ、各容器内４００ｍｌ）
で溶出した。カラムを通る流量は精製工程を通して４０
ｍｌ／時間であった。各フラクション２０ｍｌを集め
た。ついで、ＧＡ含有フラクションをプールし、限外濾
過によって濃縮して１００ｍｌとし、５０ｍＭ Ｔｒｉ
ｓ．Ｃｌ、０．１Ｍ ＮａＣｌ（ｐＨ８．８）（Ｑ−原
料緩衝剤）に対して透析した。
【００７２】ｄ．Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ高速カラムで
のクロマトグラフィー 上記工程ｃで得られた酵素ＧＡを含有する透析物を、予
めＱ−原料緩衝剤で平衡化したＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ
高速カラム［５００×３２（内径）ｍｍ、Ｖ＝２００ｍ
ｌ］に負荷した。Ｑ−原料緩衝剤１００ｍｌでカラムを
洗浄した後、酵素ＧＡを、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ．Ｃｌ
（ｐＨ８．８）中におけるリニアＮａＣｌグラディエン
ト（０．１Ｍ→０．３５Ｍ）各容器内４００ｍｌ）で溶
出した。カラムを通る流量は、すべての精製工程におい
て２０ｍｌ／時間であり、各フラクション１０ｍｌずつ
集めた。ついで、ＧＡ含有フラクションをプールし、限
外濾過によって濃縮して最終容積１５ｍｌとし、１０ｍ
Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ７）、３０％飽和硫酸アンモ
ニウム（ＨＩＣ原料緩衝剤）に対して透析した。
【００７３】ｅ．オクチル−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ
４Ｂカラムでのクロマトグラフィー 上記工程で得られた酵素ＧＡの溶液を、予めＨＩＣ原料
緩衝剤で平衡化したオクチル−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｃ
Ｌ４Ｂカラム［５００×１６（内径）ｍｍ、Ｖ＝３０ｍ
ｌ］に負荷した。ＨＩＣ原料緩衝剤３０ｍｌでカラムを
洗浄した後、酵素ＧＡを、１０ｍＭリン酸ナトリウム
（ｐＨ７．０）における飽和硫酸アンモニウム（３０％
→０％）及びエチレングリコール（０％→４０％）のリ
ニアグラディエントで同時に溶出し、各容器内で２５０
ｍｌを集めた。精製工程を通して、カラムを通る流量は
１０ｍｌ／時間であり、各フラクション１０ｍｌを集め
た。ＧＡを含有するこれらフラクションをプールし、限
外濾過によって４ｍｌに濃縮した。
【００７４】ｆ．Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ２００ＨＲで
のゲル濾過 工程ｅで得られた酵素ＧＡの溶液を、予め５０ｍＭ Ｔ
ｒｉｓ．Ｃｌ、０．２Ｍ ＮａＣｌ（ｐＨ８．０）で平
衡化したＳｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ２００ＨＲカラム（１
００×１６（内径）ｍｍ、Ｖ＝１６０ｍｌ）に負荷し、
溶出した。精製工程を通してカラムを流量４ｍｌ／時間
に維持し、各フラクション２ｍｌを集めた。酵素ＧＡを
含有するこれらフラクションを保存した。
【００７５】
【表１】
【００７６】ｇ．非変性ＰＡＧＥ ゲル濾過ピークのフラクションを、非変性ポリアクリル
アミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）によってさらに精製し
た。ゲルセグメントを染色した後、１つの主バンド及び
４つの副バンドが認められた。ついで、染色したセグメ
ントを残留ゲルと整列させ、対応する非染色部分をカッ
トした。ついで、このようにして単離したゲル内に含有
される酵素ＧＡの活性度を評価したところ、主バンドに
相当するゲルセグメント内にのみ含有されることが示さ
れた。
【００７７】その後、透析膜（１２ＫＤカット）内に置
いたゲルから、３７．６ｍＭ Ｔｒｉｓ．Ｃｌ、４０ｍ
Ｍグリシン緩衝剤（ｐＨ８．４８）中、１００ボルト、
５℃において６時間でアシラーゼを電気溶出した。つい
で、最後の２００ｍｌ（膜上に存在するＧＡを再度懸濁
化させるために使用した）を除き、緩衝剤を廃棄した。
得られた懸濁液を非変性ＰＡＧＥに供した。
【００７８】ｈ．変性ＰＡＧＥ 電気溶出によって回収したアシラーゼを、変性［０．１
％ナトリウムドデシルスルフェート（ＳＤＳ）及びβ−
メルカプトエタノール中で５分間沸騰］及び公知の分子
量標準物と共に０．１％ＳＤＳ ＰＡＧＥゲル上での電
気泳動に供した。クマシーブリリアントブルー又はシル
バー染料による染色により、それぞれ１５ＫＤ及び５０
ＫＤの分子量を有する２つのバンドを示した。これら
は、それぞれ酵素のα−サブユニット及びβ−サブユニ
ットに相当する。ゲル濾過ピークのいくつかのフラクシ
ョン（ＳＤＳ変性ＰＡＧＥに供し、つづいて電気溶出し
た）により、純粋な変性酵素ＧＡ数ｍｇが得られた。
【００７９】ｉ．上記工程ｈからの純粋な変性ＧＡをフ
ロインド完全アジュバント（Ｓｉｇｍａ）と混合し、抗
体を高めるために、得られた混合物を白色の雄ニュージ
ーランドウサギに３回（各回の用量２ｍｇ）注射した。
【００８０】その後、血液サンプルを集め、このサンプ
ルから血清を分離した。血清を５６℃で３０分間処理
し、ついで３５％飽和硫酸アンモニウムで沈殿させた。
沈殿物をタンパク質−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ４Ｂ
（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）で精製して抗体を得た。ドット
プロットテストによって、シュードモナス１４６Ｈ９
（ＮＣＩＭＢ ４０４７４）及びＳＹ７７−１（Ｆｅｒ
ｍ２４１０）からの酵素ＧＡ及び上述の如く精製した抗
血清が相互に反応して、免疫沈殿物を生成することを確
認した。コントロール用のウサギ（ＧＡを注射していな
い）から得られたＩｇＧ（免疫グロブリンＧ）フラクシ
ョンは酵素ＧＡとの免疫沈降を示さなかった。
【００８１】２．シュードモナス１４６Ｈ９（ＮＣＩＭ
Ｂ ４０４７４）及びＳＹ７７−１（Ｆｅｒｍ２４１
０）のＤＮＡによる遺伝子ライブラリーの作成 Ｍａｎｉａｔｉｓ Ｔ．らにより開示［Ｍｏｌｅｃｕｌ
ａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍ
ａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａ
ｒｂｏｒ，ニューヨーク，米国（１９８９）］された如
き一般的な組換えＤＮＡ技術によって、ラムダＺＡＰＩ
Ｉにおけるシュードモナス１４６Ｈ９（ＮＣＩＭＢ ４
０４７４）及びＳＹ７７−１（Ｆｅｒｍ２４１０）から
のＤＮＡによる遺伝子ライブラリーを作成した。各供給
者によって与えられた指示に従って酵素を使用した。Ｓ
ｉｌｖａｈｙ Ｔ．らにより開示［Ｅｘｐｅｉｍｅｎｔ
ｓ ｗｉｔｈ ＧｅｎｅＦｕｓｉｏｎｓ，Ｃｏｌｄ Ｓ
ｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃ
ｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ニューヨーク，
米国（１９８４）］された方法を使用することによっ
て、シュードモナス１４６Ｈ９及びＳＹ７７−１からゲ
ノムＤＮＡを抽出した。ゲノムＤＮＡ（２５μｇ）を３
７℃、１時間でＳａｕ ３ＡＩ（２Ｕ）によって部分的
に消化し、消化混合物をアガロースゲルでの電気泳動
（０．４％、１６時間、１５Ｖ）に供し、平均サイズ４
〜１０ｋｂを有する精製されたＤＮＡフラクションを得
た。所望のサイズを有するＤＮＡをＢａｌ３Ｉヌクレア
ーゼで変性した（１０Ｕ、３７℃、３０分）。反応をフ
ェノール／クロロホルムでの抽出及びエタノールでの沈
殿によって停止させた。得られた死傷ＤＮＡフラグメン
トの末端をｄＮＴＰニックトランスレーション緩衝液
中、Ｋｌｅｎｏｗ ＤＮＡポリメラーゼ（１０Ｕ）で満
たし（１時間、２２℃）、ついでＴ４ＤＮＡリガーゼに
よってリガーゼ処理（１６℃で１夜）してホスホリル化
ＥｃｏＲＩ リンカー５μｇに結合させ、ついでＥｃ
ｏＲＩ ２００μで消化した（４時間、３７℃）。Ｓｅ
ｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ４Ｂカラム（Ｓｉｇｍａ）でのク
ロマトグラフィーによって過剰のＥｃｏＲＩリンカーか
らＤＮＡを分離して、一定の平均サイズ（約５ｋｂｐ）
を有するＥｃｏＲＩフラグメントを得た。このＤＮＡ
０．１μｇを、予めＥｃｏＲＩで切断しかつデホスホリ
ル化したバクテリオファージＺＡＰＩＩ（Ｓｔｒａｔａ
ｇｅｎｅ）１μｇに、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（総反応容積
５μｌ）によって室温で１時間、４℃で１夜処理して結
合させた。
【００８２】得られた混合物を、「Ｇｉｇａｐａｃｋ
Ｇｏｌｄ ｐａｃｋｉｎｇ ｅｘｔｒａｃｔｓ（Ｓｔｒ
ａｔａｇｅｎｅ）」を使用する「インビトロ」パッキン
グに供した。宿主微生物としてＥ．ｃｏｌｉ ＸＬ１
Ｂｌｕｅを使用するプラークの形成では、約１００００
０個のプラークを生じた。Ｘ−ｇａｌ及びＩＰＴＧの存
在下において白色のプラークが９５％であり、残りが青
色のプラークであることが観察された。このようにし
て、約１０００００個のクローンで構成されたゲノムＤ
ＮＡの遺伝子ライブラリーが作成された。
【００８３】Ｅ．ｃｏｌｉ ＸＬ１ Ｂｌｕｅ培養物
（０．２ｍｌ）、上述の遺伝子ライブラリー ラムダＺ
ＡＰＩＩ：シュードモナス１４６Ｈ９又はＳＹ７７−１
（クローン約３００００個）及びトップ寒天７ｍｌの混
合物をＬＢ寒天プレート（１４０ｍｍ）上に注ぎ、つい
で４２℃で４時間インキュベートした。予め１０ｍＭＩ
ＰＴＧ溶液中に１時間浸漬し、つづいて室温でなお１時
間乾燥させておいたニトロセルロース膜（直径１３４ｍ
ｍ；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）をプレート上に置いた。得ら
れた構体を３７℃において３．５時間インキュベートし
て遺伝子を発現させ、生成物を膜に移動させた。しかし
ながら、この技術（非常に有効な方法とみられる）は遺
伝子ライブラリーＤＮＡフラグメントの正確な調製を必
要とする。挿入されるシュードモナス遺伝子の開始は、
ＬａｃＺ遺伝子のβ−ガラクトシダーゼの３９ＮＨ２−
末端アミノ酸がこれに対応する解読わく内に存在できる
ようでなければならない（これが、１４６Ｈ９及びＳＹ
７７−１のＤＮＡの末端を変性させる理由である）。
【００８４】ｐｉｃｏ Ｂｌｕｅ免疫検知キット（Ｓｔ
ｒａｔａｇｅｎｅ）及びＧＡに対して特異的に作られた
抗血清を使用するブロッティングテスト法によってテス
トした約３００００個のプラーク中に１つの陽性プラー
クが存在していた。アッセイをキットの製造者によって
示された方法に従って実施した。融合タンパク質を発現
させた後、これらをゼラチンによって膜に固定した。膜
を酵素ＧＡに対する特異的抗血清と共にインキュベート
し、Ｅ．ｃｏｌｉ溶菌物（キット内に含有される）、及
びついでウサギ抗体に対して特異的に作られたＩｇＧで
中和し、アルカリホスファターゼ（これもキット内に含
有される）と接合させた。
【００８５】以下の色素生産反応では、陽性のクローン
は青−紫色のスポットを生成し、一方、陰性のクローン
及びコントロールとして使用したウサギ抗血清は何らス
ポットを生成しない。
【００８６】ついで、陽性を示したプラークをインビボ
切断プロトコール（ＳｔｒａｔａｇｅｎｅラムダＺＡＰ
ＩＩクローニングキット）に供した。この方法で回収さ
れたプラスミドｐＷＥ５６．４はＬａｃＺ遺伝子内にシ
ュードモナス１４６Ｈ９（ＮＣＩＭＢ ４０４７４）の
ＧＡ遺伝子の内部片を含有し、プラスミドｐＺＡＰ１．
１はシュードモナスＳＹ７７−１（Ｆｅｒｍ２４１０）
のものを含有する。遺伝子の配向はＰｌａｃから始ま
る。
【００８７】３．シュードモナス１４６Ｈ９及びＳＹ７
７−１からのＧＡ遺伝子のクローン化 プラスミドｐＷＥ５６．４はシュードモナス１４６Ｈ９
からのＤＮＡの長さ約２．５ｋｂｐのフラグメントを含
有し、ＧＡをコードするＤＮＡの少なくとも一部は当該
酵素に関する抗原性テストにおいて陽性の反応を示す融
合タンパク質を形成する。定義によれば、このフラグメ
ントはＧＡをコードする全遺伝子を含有しない。プラス
ミドｐＷＥ５６．４から長さ約１．２ｋｂｐのＳａｃＩ
Ｉ−ＳａＩＩフラグメントを単離し、ＤＮＡプローブと
して使用するため、ジゴキシゲニン−ｄＵＴＰ（Ｂｏｅ
ｈｒｉｎｇｅｒ Ｎｏｎ−Ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ Ｌ
ａｂｅｌｌｉｎｇ Ｋｉｔ）でラベル付けした。同じラ
ムダＺＡＰＩＩシュードモナス１４６Ｈ９遺伝子ライブ
ラリーを、このプローブとハイブリダイズするＤＮＡを
含有するプラークの存在を確認するためにアッセイし
た。１つの陽性プラークがアッセイした１００００個の
プラークの中に存在していた。
【００８８】相当するプラスミドをインビボ切断プロト
コールによって抽出し、このプラスミド（ｐＷＥ３．１
と命名した）［図１：プラスミドｐＷＥ３．１の遺伝子
地図を示す。黒点を付した部分はシュードモナス１４６
Ｈ９（ＮＣＩＭＢ ４０４７４）からのＧＡ遺伝子を含
有する。斜線を付した領域はプラスミドｐＢｌｕｅｓｃ
ｒｉｐｔ ＳＫ＋／−に属する。］で形質転換したＥ．
ｃｏｌｉ細胞を、ＧＬ−７ＡＣＡを７ＡＣＡに加水分解
する能力に関してアッセイした。ｐＷＥ３．１はシュー
ドモナス１４６Ｈ９のＤＮＡの長さ１０ｋｂｐのフラグ
メントを含有し、アシラーゼ活性をＥ．ｃｏｌｉに転移
させることが認められた（表２）。このフラグメントで
は、ＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＢａｍＨＩ、Ｂｃｌ
Ｉ、ＫｐｎＩ、ＳｃａＩ、ＨｐａＩ、ＭｌｕＩ、Ｐｖｕ
Ｉ、ＰｖｕＩＩ、Ａｓｐ７１８、ＤｒａＩ、ＳｍａＩに
関する部位は認められなかった。ＳａｃＩＩ、Ｐｓｔ
Ｉ、ＸｂａＩ、ＥｃｏＲＶ、ＢｇｌＩＩに関する部位を
図１に示す。
【００８９】プラスミドｐＺＡＰ１．１は、ＧＡをコー
ドするＤＮＡの少なくとも一部を含有する（酵素ＧＡに
対する抗原性テストにおいて陽性反応を示す融合タンパ
ク質をコードできるため）シュードモナスＳＹ７７−１
のＤＮＡの長さ３ｋｂｐのフラグメントを有する。定義
により、このフラグメントは完全な長さのＧＡ遺伝子を
含有できない。このプラスミドｐＺＡＰ１．１から０．
６ｋｂｐのＥｃｏＲＩ−ＰｓｔＩフラグメントを単離
し、ＤＮＡプローブとしての使用のため、ジゴキシゲニ
ン−ｄＵＴＰ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｎｏｎ−Ｒｅｄ
ｉｏａｃｔｉｖｅＬａｂｅｌｌｉｎｇ Ｋｉｔ）でラベ
ル付けした。
【００９０】かかるプローブによりシュードモナスＳＹ
７７−１のラムダＺＡＰＩＩ遺伝子ライブラリーをスク
リーニングし、スクリーニングした７０００個のプラー
クから、同プローブにハイブリダイズし得る１つのプラ
ークが認められた。
【００９１】相当するプラスミドをインビボ切断法によ
って抽出し、Ｅ．ｃｏｌｉを形質転換させるために使用
した。このプラスミド（ｐＷＧ２と命名）を含有する細
胞を、ＧＬ−７ＡＣＡを７ＡＣＡに加水分解する能力に
関してテストした。
【００９２】プラスミドｐＷＧ２は、Ｅ．ｃｏｌｉをア
シラーゼ陽性菌株に形質転換させうるシュードモナスＳ
Ｙ７７−１のＤＮＡの３ｋｂｐフラグメントを含有する
（表２）。
【００９３】４．ＧＡをコードする必須領域を見出すた
めのＤＮＡの制限 プラスミドｐＷＥ３．１（１μｇ）をＸｂａＩを切断
し、電気溶出によって長さ７ｋｂｐのフラグメントを単
離し、ついでＴ４ＤＮＡリガーゼによって再度環化させ
た。Ｅ．ｃｏｌｉ ＸＬ１ Ｂｌｕｅの細胞を同じ混合
物によって形質転換させ、得られたプラスミドｐＷＥ
２．２０を単離した。ｐＷＥ３．１からの６ｋｂｐ Ｘ
ｂＩフラグメントの欠失によってｐＷＥ２．２０（同様
の酵素活性を発揮する）が生じた（表２）。従って、シ
ュードモナス１４６Ｈ９のＧＡをコードする遺伝子は、
ＥｃｏＲＩ部位とＸｂａＩ部位との間の長さ４ｋｂｐの
ＤＮＡフラグメント上に存在しなければならない。ＳＹ
７７−１からのＧＡ遺伝子を含有するｐＷＧ２の長さ３
ｋｂｐのフラグメントは、既に、発現ベクターへ移動さ
れるに十分なほど切断されているものと考えられる。
【００９４】５．原核性発現ベクターにおけるＧＡをコ
ードする遺伝子のクローン化 シュードモナス１４６Ｈ９からのＧＡ遺伝子を含有する
ｐＷＥ３．１の長さ４ｋｂｐのＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩフ
ラグメントをｐｋｋ２２３−３（ｐｈａｒｍａｃｉａ）
（強力かつ誘導性の発現シグナルとしてハイブリッドト
リプトファン／ラクトースプロモーター（Ｐｔａｃ）を
使用する）にクローン化した。ＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩフ
ラグメント（１ｇ）をＫｌｅｎｏｗ ＤＮＡポリメラー
ゼ（２Ｕ）でＸｂａＩ部位でのみ変性させ、当該部位に
ニックトランスレーション緩衝液中、０．２ｍＭ ｄＣ
ＴＰ及びｄＴＴＰを満たし（１時間、室温）、ＥｃｏＲ
Ｉ−ＨｉｎｄＩＩＩで消化したｐｋｋ２２３−３におけ
るクローニングに好適なフラグメントを得た。
【００９５】得られたプラスミドｐＷＥ４．３．１［図
２：プラスミドｐＷＥ４．３．１の遺伝子地図を示す。
黒点を付した領域はシュードモナス１４６Ｈ９（ＮＣＩ
ＭＢ４０４７４）からのＧＡ遺伝子を含有する。］を使
用してＥ．ｃｏｌｉ ＸＬ１ ＢｌｕｅをＧＡ陽性細胞
に形質転換させた。形質転換細胞はアシラーゼ活性６０
Ｕ／ｌ（これはｐＷＥ３．１によって見られる活性の３
０倍、元のシュードモナス属菌の活性の約２０倍であ
る）を示した。
【００９６】菌株ＸＬ１ Ｂｌｕｅ（ｐＷＥ４．３．
１）はＮＣＩＭＢに寄託してあり、受託番号ＮＣＩＭＢ
４０５６０が付与されている。
【００９７】プラスミドｐＷＧ２の長さ３ｋｂｐのＥｃ
ｏＲＩフラグメント（シュードモナスＳＹ７７−１の酵
素ＧＡをコードする遺伝子を含有する）をｐｋｋ２２３
−３のＥｃｏＲＩ部位にクローン化し、リゲーション混
合物を使用してＥ．ｃｏｌｉＸＬ１ Ｂｌｕｅを形質転
換させた。
【００９８】得られた形質転換体からプラスミドｐＣＳ
１９．１を単離した（図３：プラスミドｐＣＳ１９．１
の遺伝子地図を示す。ＳＹ７７−１のＧＡ遺伝子は黒の
矢印で示す領域内に存在する。）。
【００９９】菌株ＸＬ１ Ｂｌｕｅ（ｐＣＳ１９．１）
はＮＣＩＭＢに寄託してあり、受託番号はＮＣＩＭＢ
４０５５９が付与されている。
【０１００】さらに、プラスミドｐＣＳ１９．１を使用
してＷ３１１０（ＡＴＣＣ２７３２５）及びＤＨ１を形
質転換させた。これら両菌株はＬａｃ＋遺伝子型を有す
る。
【０１０１】さらに、ｐｋｋ２２３−３ベクターを、ア
ンピシリン耐性の代わりにテトラサイクリン耐性を挿入
し、これにより当該プラスミドから誘導されるβ−ラク
タマーゼを除去することによって変性させた。この目的
のため、プラスミドｐＢＲ３２２から約１．４ｋｂのＡ
ｖａＩ−ＨｉｎｄＩＩＩＤＮＡフラグメント（テトラサ
イクリン耐性の遺伝子を含有する）を単離した。このＤ
ＮＡフラグメントをＫｌｅｎｏｗ ＤＮＡポリメラーゼ
によって処理して、平滑末端を形成させた。一方、ｐｋ
ｋ２２３−３ベクターをアンピシリン耐性の遺伝子内に
含有されるＳｃａＩ部位で切断し、ついでデホスホリル
化した。
【０１０２】得られたフラグメント及びベクターをＴ４
ＤＮＡリガーゼにより１６℃で１夜リガーゼ処理し、得
られたリゲーション混合物を使用して、Ｅ．ｃｏｌｉ
ＪＭ１０５を形質転換させた。テトラサイクリン（５０
μｇ／ｍｌ）に対して耐性を示すクローンはプラスミド
ｐＴｅｔｔａｃを含有する（図４）。
【０１０３】ついで、このプラスミドを単離し（１０μ
ｇ）、酵素ＥｃｏＲＩ １００Ｕと共に３７℃で１時間
インキュベートし、ついでデホスホリル化した。さら
に、プラスミドｐＷＧ２から、酵素ＥｃｏＲＩによっ
て、ＳＹ７７−１からのＧＡ遺伝子を含有する３ｋｂフ
ラグメントを切取った。得られたリニアライズドベクタ
ー及びフラグメントをＴ４ＤＮＡリガーゼによってリガ
ーゼ処理した。このようにして、プラスミドｐＷＢ１４
（ＧＡ遺伝子がＰｔａｃプロモーターと同じ方向で配列
している）（図５）及びプラスミドｐＷＢ１（ＧＡ遺伝
子がＰｔａｃプロモーターと逆方向で配列しており、こ
れにより、その発現はＰｔａｃに左右されない）（図
６）を得た。
【０１０４】プラスミドｐＷＢ１４及びｐＷＢ１はいず
れも、β−ラクタマーゼを生成することなく（テトラサ
イクリン耐性に交換されているため）酵素ＧＡを産生で
きる。さらに、ｐＷＢ１では、酵素ＧＡはプロモーター
Ｐｔａｃによるコントロール下にはない。なお、これら
プラスミドｐＷＢ１４及びｐＷＢ１で形質転換させた
Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０５は、それぞれ受託番号ＮＣＩ
ＭＢ４０５９３及びＮＣＩＭＢ４０５９２としてＮＣＩ
ＭＢに寄託してある。
【０１０５】
【表２】
【０１０６】
【実施例３】この実施例は、実施例２に記載の如くして
得られたＥ．ｃｏｌｉ ＸＬ１ Ｂｌｕｅ（ｐＷＥ４．
３．１）による酵素ＧＡの製造に係る。−当該菌株をＹ
Ｔグリセリン培地（組成：グリセリン１５％、ｂａｃｔ
ｏ−酵母エキス０．７％、ｂａｃｔｏ−トリプトン０．
４％、ＮａＣｌ０．４％、テトラサイクリン１０μｇ／
ｍｌ、アンピシリン５０μｇ／ｍｌ）において−４０℃
で保存した。−ＹＴ−グリセリン培地上で保存した菌株
の１ループを、ＬＢ寒天培地（組成：ｂａｃｔｏ−酵母
エキス０．５％、ｂａｃｔｏ−トリプトン１％、ＮａＣ
ｌ１％、寒天１．５％、テトラサイクリン１０μｇ／ｍ
ｌ、アンピシリン５０μｇ／ｍｌ）を収容するペトリ皿
に画線し、３７℃で１夜インキュベートした。−ＬＢ＋
Ｔｃ＋Ａｐ培地（組成：ｂａｃｔｏ−酵母エキス０．５
％、ｂａｃｔｏ−トリプトン１％、ＮａＣｌ１％、テト
ラサイクリン１０μｇ／ｍｌ、アンピシリン５０μｇ／
ｍｌ）２ｍｌを収容する無菌試験管にＬＢ寒天平板から
１つの単一コロニーを接種し、２００ｒｐｍで振とうし
ながら３０℃で１６時間インキュベートした。−ＬＢ＋
Ｔｃ＋Ａｐ＋ＩＰＴＧブロス（組成：ｂａｃｔｏ−酵母
エキス０．５％、ｂａｃｔｏ−トリプトン１％、ＮａＣ
ｌ１％、テトラサイクリン１０μｇ／ｍｌ、アンピシリ
ン５０μｇ／ｍｌ、ＩＰＴＧ １ｍＭ）１００ｍｌを収
容するエーレンマイヤーフラスコ（容積５００ｍｌ）に
ＬＢ培養物１００μｌを接種し、３００ｒｐｍで振とう
しながら３０℃で２４時間インキュベートした。培養物
のＯＤ５５０（５５０ｎｍにおける光学密度）は６．０
であった。−ついで、細胞を５０００ｒｐｍで１０分間
遠心分離し、元の容量と同じ容量の０．１ＭＴｒｉｓ．
Ｃｌ、０．０５Ｍ ＮａＣｌ（ｐＨ８．０）中に再度懸
濁化させた。音波処理によって細胞を破壊し、細胞抽出
物中の酵素ＧＡの活性度を比色法によって評価した。Ｇ
Ａの活性度は６０Ｕ／ｌであり、これは元の菌株シュー
ドモナス１４６Ｈ９の２０倍である。
【０１０７】
【実施例４】この実施例は、酵素ＧＡ製造用の新しい発
酵ブロスにおけるＥ．ｃｏｌｉ ＸＬ１ Ｂｌｕｅ（ｐ
ＷＥ４．３．１）の発酵に係る。
【０１０８】接種材料を実施例３に記載の如くして調製
した。
【０１０９】ＣＳＬブロス（組成：コーンスチープリカ
ーｅｘ Ｓｏｃｉｅｔａ Ｐｉｅｍｏｎｔｅｓｅ Ａｍ
ｉｄｏ Ｄｅｒｉｖａｔｉ １４％、テトラサイクリン
１０μｇ／ｍｌ、アンピシリン５０μｇ／ｍｌ、ｐＨ
７．５）１００ｍｌを収容するエーレンマイヤーフラス
コ（容積５００ｍｌ）にＬＢ培養物１００μｌを接種
し、ついで３００ｒｐｍで振とうしながら３０℃で２４
時間インキュベートした。培養物のＯＤ５５０は６．５
であった。
【０１１０】細胞を５０００ｒｐｍで１０分間遠心分離
し、元の容量と同じ容量の０．１ＭＴｒｉｓ．Ｃｌ、
０．０５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ８．０中に再度懸濁化させ
た。音波処理によって細胞を破壊し、細胞抽出物におけ
る酵素ＧＡの活性度を比色法によって測定した。
【０１１１】活性度は５５Ｕ／ｌであり、これは元の菌
株シュードモナス１４６Ｈ９の約１８倍である。
【０１１２】
【実施例５】この実施例は、酵素ＧＡを製造するための
Ｅ．ｃｏｌｉ ＸＬ１ Ｂｌｕｅ（ｐＷＥ４．３．１）
の新たなタイプの発酵に係る。
【０１１３】接種材料は実施例３に記載の如く調製した
ものである。
【０１１４】ＬＢ＋Ｔｃ＋Ａｐブロス（組成：ｂａｃｔ
ｏ−酵素エキス０．５％、ｂａｃｔｏ−トリプトン１
％、ＮａＣｌ１％、テトラサイクリン１０μｇ／ｍｌ、
アンピシリン５０μｇ／ｍｌ）１００ｍｌを収容するエ
ーレンマイヤーフラスコ（容積５００ｍｌ）にＬＢ培養
物１００μｌを接種し、３０℃、３００ｒｐｍで２４時
間インキュベートした。培養物のＯＤ５５０は６．０で
あった。−ＣＳＬ（組成：コーンスチープリカー１４
％、ｐＨ７．５）１．５リットルを収容する発酵器（２
リットル、ＩＮＦＯＲＳ ＨＧ）にＬＢ培養物１００ｍ
ｌを接種した。発酵パラメーターは次のとおりである。
Ｔ：３０℃、撹拌：１３００ｒｐｍ、空気流量１ｖｖ
ｍ、２０時間（ＯＤ５５０＝６．０となるまで）。
【０１１５】つづく１０時間中、培養物にグルコース又
はグリセリン溶液（５０％ｗ／ｖ）を連続流として初め
に１．５ｍｌ／ｌ・時間及びついで６ｍｌ／ｌ・時間の
流量で約１５時間添加し、その間ｐＨを７．５に維持し
（５Ｍ ＮａＯＨの添加）、溶存酸素レベルをｐＯ２＝
１０％に維持した。観察された最終増殖はＯＤ５５０＝
９０であった。培養終了時、バイオマス８９ｇ／ｌ（乾
燥重量１８ｇ／ｌ）が蓄積された。
【０１１６】発酵５４時間（最大生産量となるに必要な
時間）後、プラスミドｐＷＥ４．３．１は細胞の７０％
内になお存在していた。
【０１１７】細胞を５０００ｒｐｍで１０分間遠心分離
し、つづいて、元の容量と同じ容量の０．１ＭＴｒｉ
ｓ．Ｃｌ、０．０５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ８．０に再度懸
濁化させた。音波処理によって細胞を破壊し、細胞抽出
物におけるＧＡの活性度を比色法によって測定した。Ｇ
Ａの活性度は６０００Ｕ／ｌであり、これは元の菌株シ
ュードモナス１４６Ｈ９の２０００倍である。
【０１１８】
【実施例６】この実施例は、実施例２に記載如くして得
たＥ．ｃｏｌｉ ＸＬ１ Ｂｌｕｅ（ｐＣＢ１９．１）
による酵素ＧＡの製造に係る。
【０１１９】接種材料を実施例３に記載の如くして調製
した。
【０１２０】ＬＢ＋Ｔｃ＋Ａｐ＋ＩＰＴＧブロス（組
成：ｂａｃｔｏ−酵素エキス０．５％、ｂａｃｔｏ−ト
リプトン１％、ＮａＣｌ１％、テトラサイクリン１０μ
ｇ／ｍｌ、アンピシリン５０μｇ／ｍｌ、ＩＰＴＧ １
ｍＭ）１００ｍｌを収容するエーレンマイヤーフラスコ
（容積５００ｍｌ）にＬＢ培養物１００μｌを接種し、
３０℃、３００ｒｐｍで２４時間インキュベートした。
培養物のＯＤ５５０は６．０であった。
【０１２１】細胞を５０００ｒｐｍで１０分間遠心分離
し、ついで元の容量と同じ容量の０．１Ｍ Ｔｒｉｓ．
Ｃｌ、０．０５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ８．０中に再度懸濁
化させた。音波処理によって細胞を破壊し、細胞抽出物
における酵素ＧＡの活性度を比色法で測定した。ＧＡの
活性度は１４０Ｕ／ｌであり、これは元の菌株シュード
モナスＳＹ７７−１の３５倍である。
【０１２２】
【実施例７】この実施例は、ｐＣＳ１９．１で形質転換
したＥ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０による酵素ＧＡの製造に
係る。−当該菌株をＹＴグリセリン培地（組成：グリセ
リン１５％、ｂａｃｔｏ−酵母エキス０．７％、ｂａｃ
ｔｏ−トリプトン０．４％、ＮａＣｌ０．４％、アンピ
シリン５０μｇ／ｍｌ）中に−４０℃で保存した。−Ｙ
Ｔグリセリンブロス上で生育させた菌株の１ループを、
ＬＢ寒天＋Ａｐ（組成：ｂａｃｔｏ−酵母エキス０．５
％、ｂａｃｔｏ−トリプシン１％、ＮａＣｌ１％、寒天
１．５％、アンピシリン５０μｇ／ｍｌ）を収容するペ
トリ皿上に接種し、３７℃で１夜インキュベートした。
−ＬＢ＋Ａｐ培地（組成：ｂａｃｔｏ−酵母エキス０．
５％、ｂａｃｔｏ−トリプトン１％、ＮａＣｌ１％、ア
ンピシリン５０μｇ／ｍｌ）２ｍｌを収容する無菌試験
管にＬＢ寒天平板から１つの単一コロニーを接種し、２
００ｒｐｍで振とうしながら３０℃で１６時間インキュ
ベートした。−ＬＢ＋Ａｐブロス（組成：ｂａｃｔｏ−
酵母エキス０．５％、ｂａｃｔｏ−トリプトン１％、Ｎ
ａＣｌ１％、アンピシリン５０μｇ／ｍｌ）１００ｍｌ
を収容するエーレンマイヤーフラスコ（容積５００ｍ
ｌ）にＬＢ培養物１００μｌを接種し、３００ｒｐｍで
振とうしながら３０℃で２４時間インキュベートした。
培養物のＯＤ５５０（５５０ｎｍにおける光学密度）は
６．０であった。−ついで、細胞を５０００ｒｐｍで１
０分間遠心分離し、つづいて元の容量と同じ容量の０．
１Ｍ Ｔｒｉｓ．Ｃｌ、０．０５Ｍ ＮａＣｌ（ｐＨ
８．０）中に再度懸濁化させた。音波処理によって細胞
を破壊し、細胞抽出物における酵素ＧＡの活性度を比色
法によって測定した。
【０１２３】ＧＡの活性度は１３６Ｕ／ｌであり、これ
は元の菌株シュードモナスＳＹ７７−１の３４倍であ
る。
【０１２４】
【実施例８】この実施例は、ｐＣＳ１９．１で形質転換
させたＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ１の菌株による酵素ＧＡの製
造に係る。
【０１２５】接種材料は実施例７に記載の如く調製した
ものである。−ＬＢ＋Ａｐ培地（組成：ｂａｃｔｏ−酵
母エキス０．５％、ｂａｃｔｏ−トリプトン１％、Ｎａ
Ｃｌ１％、アンピシリン５０μｇ／ｍｌ）２ｍｌを収容
する無菌試験管にＬＢ寒天平板から１つの単一コロニー
を接種し、２００ｒｐｍで振とうしながら３０℃で１６
時間インキュベートした。−ＬＢ＋Ａｐブロス（組成：
ｂａｃｔｏ−酵母エキス０．５％、ｂａｃｔｏ−トリプ
トン１％、ＮａＣｌ１％、アンピシリン５０μｇ／ｍ
ｌ）１００ｍｌを収容するエーレンマイヤーフラスコ
（容積５００ｍｌ）にＬＢ培養物１００μｌを接種し、
３００ｒｐｍで振とうしながら、３０℃で２４時間イン
キュベートした。培養物のＯＤ５５０は６．０であっ
た。−ついで、細胞を５０００ｒｐｍで１０分間遠心分
離し、つづいて、元の容量と同じ容量の０．１Ｍ Ｔｒ
ｉｓ．Ｃｌ、０．０５Ｍ ＮａＣｌ（ｐＨ８．０）中に
再度懸濁化させた。音波処理によって細胞を破壊し、細
胞抽出物における酵素ＧＡの活性度を比色法によって測
定した。
【０１２６】ＧＡの活性度は１３５Ｕ／ｌであり、これ
は元の菌株シュードモナスＳＹ７７−１の３４倍であ
る。
【０１２７】
【実施例９】この実施例は、酵素ＧＡ製造用の新しい発
酵ブロスにおけるＥ．ｃｏｌｉＸＬ１ Ｂｌｕｅ（ｐＣ
Ｓ１９．１）の発酵に係る。
【０１２８】接種材料を実施例３に記載の如くして調製
した。
【０１２９】ＣＳＬブロス（組成：コーンスチープリカ
ーｅｘ Ｓｏｃｉｅｔａ Ｐｉｅｍｏｎｔｅｓｅ Ａｍ
ｉｄｏ Ｄｅｒｉｖａｔｉ １４％、テトラサイクリン
１０μｇ／ｍｌ、アンピシリン５０μｇ／ｍｌ、ｐＨ
７．５）１００ｍｌを収容するエーレンマイヤーフラス
コ（容積５００ｍｌ）にＬＢ培養物１００μｌを接種
し、ついで３００ｒｐｍで振とうしながら３０℃で２４
時間インキュベートした。培養物のＯＤ５５０は６．７
であった。
【０１３０】細胞を５０００ｒｐｍで１０分間遠心分離
し、元の容量と同じ容量の１Ｍ Ｔｒｉｓ．Ｃｌ、０．
０５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ８．０中に再度懸濁化させた。
音波処理によって細胞を破壊し、細胞抽出物における酵
素ＧＡの活性度を比色法によって測定した。
【０１３１】活性度は３０７Ｕ／ｌであり、これは元の
シュードモナスＳＹ７７−１の約７７倍である。
【０１３２】
【実施例１０】この実施例は、酵素ＧＡ製造のための
Ｅ．ｃｏｌｉ ＸＬ１ Ｂｌｕｅ（ｐＣＳ１９．１）の
新たなタイプの発酵に係る。
【０１３３】接種材料は実施例３に記載の如く調製した
ものである。
【０１３４】ＬＢ＋Ｔｃ＋Ａｐブロス（組成：ｂａｃｔ
ｏ−酵素エキス０．５％、ｂａｃｔｏ−トリプトン１
％、ＮａＣｌ１％、テトラサイクリン１０μｇ／ｍｌ、
アンピシリン５０μｇ／ｍｌ）１００ｍｌを収容するエ
ーレンマイヤーフラスコ（容積５００ｍｌ）にＬＢ培養
物１００μｌを接種し、３０℃、３００ｒｐｍで２４時
間インキュベートした。培養物のＯＤ５５０は６．０で
あった。−ＣＳＬ（組成：コーンスチープリカー１４
％、ｐＨ７．５）１．５リットルを収容する発酵器（２
リットル、ＩＮＦＯＲＳ ＨＧ）にＬＢ培養物１００ｍ
ｌを接種した。発酵パラメーターは次のとおりである。
Ｔ：３０℃、撹拌：１３００ｒｐｍ、空気流量１ｖｖ
ｍ、２０時間（ＯＤ５５０＝６．０となるまで）。
【０１３５】つづく１０時間中、培養物にグルコース又
はグリセリン溶液（５０％ｗ／ｖ）を連続流として初め
に１．５ｍｌ／ｌ・時間及びついで６ｍｌ／ｌ・時間の
流量で約１６時間添加し、その間ｐＨを７．５に維持し
（５Ｍ ＮａＯＨの添加）、溶存酸素レベルをｐＯ２＝
１０％に維持した。観察された最終増殖はＯＤ５５０＝
９０であった。培養終了時、バイオマス８７ｇ／ｌ（乾
燥重量１８ｇ／ｌ）が蓄積された。
【０１３６】発酵５４時間（最大生産量となるに必要な
時間）後、プラスミドｐＣＳ１９．１は細胞の８４％内
になお存在していた。
【０１３７】細胞を５０００ｒｐｍで１０分間遠心分離
し、つづいて、元の容量と同じ容量の０．１ＭＴｒｉ
ｓ．Ｃｌ、０．０５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ８．０に再度懸
濁化させた。音波処理によって細胞を破壊し、細胞抽出
物におけるＧＡの活性度を比色法によって測定した。Ｇ
Ａの活性度は９７８０Ｕ／ｌであり、これは元の菌株シ
ュードモナスＳＹ７７−１の２４４５倍である。
【０１３８】
【実施例１１】この実施例は、実施例２に記載の如くし
て得られたＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０５（ｐＷＢ１４）に
よる酵素ＧＡの製造に係る。−当該菌株をＹＴグリセリ
ン培地（組成：グリセリン１５％、ｂａｃｔｏ−酵母エ
キス０．７％、ｂａｃｔｏ−トリプトン０．４％、Ｎａ
Ｃｌ０．４％、テトラサイクリン２５μｇ／ｍｌ、スト
レプトマイシン１２５μｇ／ｍｌ）において−４０℃で
保存した。−ＹＴ−グリセリン培地上で保存した菌株の
１ループを、ＬＢ寒天培地（組成：ｂａｃｔｏ−酵母エ
キス０．５％、ｂａｃｔｏ−トリプトン１％、ＮａＣｌ
１％、テトラサイクリン２５μｇ／ｍｌ、ストレプトマ
イシン１２５μｇ／ｍｌ）を収容するペトリ皿に画線
し、３７℃で１夜インキュベートした。−ＬＢ＋Ｓｍ＋
Ｔｃ培地（組成：ｂａｃｔｏ−酵母エキス０．５％、ｂ
ａｃｔｏ−トリプトン１％、ＮａＣｌ１％、テトラサイ
クリン２５μｇ／ｍｌ、ストレプトマイシン１２５μｇ
／ｍｌ）２ｍｌを収容する無菌試験管にＬＢ寒天平板か
ら１つの単一コロニーを接種し、２００ｒｐｍで振とう
しながら３０℃で１６時間インキュベートした。−ＬＢ
＋Ｔｃ＋Ｓｍ＋ＩＰＴＧブロス（組成：ｂａｃｔｏ−酵
母エキス０．５％、ｂａｃｔｏ−トリプトン１％、Ｎａ
Ｃｌ１％、テトラサイクリン２５μｇ／ｍｌ、ストレプ
トマイシン１２５μｇ／ｍｌ、ＩＰＴＧ １ｍＭ）１０
０ｍｌを収容するエーレンマイヤーフラスコ（容積５０
０ｍｌ）にＬＢ培養物１００μｌを接種し、３００ｒｐ
ｍで振とうしながら３０℃で２４時間インキュベートし
た。培養物のＯＤ５５０（５５０ｎｍにおける光学密
度）は５．０であった。−ついで、細胞を５０００ｒｐ
ｍで１０分間遠心分離し、元の容量と同じ容量の０．１
Ｍ Ｔｒｉｓ．Ｃｌ、０．０５Ｍ ＮａＣｌ ｐＨ８．
０中に再度懸濁化させた。音波処理によって細胞を破壊
し、細胞抽出物における酵素ＧＡの活性度を比色法によ
って評価した。ＧＡの活性度は１３５Ｕ／ｌであり、こ
れは元の菌株シュードモナスＳＹ７７−１の３４倍であ
る。
【０１３９】
【実施例１２】この実施例は、酵素ＧＡ製造用の新しい
発酵ブロスにおけるＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０５（ｐＷＢ
１４）の発酵に係る。
【０１４０】接種材料を実施例１１に記載の如くして調
製した。
【０１４１】ＣＳＬブロス（組成：コーンスチープリカ
ーｅｘ Ｓｏｃｉｅｔａ Ｐｉｅｍｏｎｔｅｓｅ Ａｍ
ｉｄｏ Ｄｅｒｉｖａｔｉ １４％、テトラサイクリン
２５μｇ／ｍｌ、ストレプトマイシン１２５μｇ／ｍ
ｌ、ｐＨ７．５）１００ｍｌを収容するエーレンマイヤ
ーフラスコ（容積５００ｍｌ）にＬＢ培養物１００μｌ
を接種し、ついで３００ｒｐｍで振とうしながら３０℃
で２４時間インキュベートした。培養物のＯＤ５５０は
８であった。
【０１４２】細胞を５０００ｒｐｍで１０分間遠心分離
し、元の容量と同じ容量の０．１ＭＴｒｉｓ．Ｃｌ、
０．０５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ８．０中に再度懸濁化させ
た。音波処理によって細胞を破壊し、細胞抽出物におけ
る酵素ＧＡの活性度を比色法によって測定した。
【０１４３】活性度は３３０Ｕ／ｌであり、これは元の
菌株シュードモナスＳＹ７７−１の約８３倍である。
【０１４４】
【実施例１３】この実施例は、実施例２に記載の如くし
て得られた菌株Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０５（ｐＷＢ１）
による酵素ＧＡの製造に係る。−当該菌株をＹＴグリセ
リン培地（組成：グリセリン１５％、ｂａｃｔｏ−酵母
エキス０．７％、ｂａｃｔｏ−トリプトン０．４％、Ｎ
ａＣｌ０．４％、テトラサイクリン２５μｇ／ｍｌ、ス
トレプトマイシン１２５μｇ／ｍｌ）において−４０℃
で保存した。−ＹＴ−グリセリン培地上で保存した菌株
の１ループを、ＬＢ寒天培地（組成：ｂａｃｔｏ−酵母
エキス０．５％、ｂａｃｔｏ−トリプトン１％、ＮａＣ
ｌ１％、テトラサイクリン２５μｇ／ｍｌ、ストレプト
マイシン１２５μｇ／ｍｌ）を収容するペトリ皿に画線
し、３７℃で１夜インキュベートした。−ＬＢ＋Ｓｍ＋
Ｔｃ培地（組成：ｂａｃｔｏ−酵母エキス０．５％、ｂ
ａｃｔｏ−トリプトン１％、ＮａＣｌ１％、テトラサイ
クリン２５μｇ／ｍｌ、ストレプトマイシン１２５μｇ
／ｍｌ）２ｍｌを収容する無菌試験管にＬＢ寒天平板か
ら１つの単一コロニーを接種し、２００ｒｐｍで振とう
しながら３０℃で１５時間インキュベートした。−ＬＢ
＋Ｔｃ＋Ｓｍブロス（組成：ｂａｃｔｏ−酵母エキス
０．５％、ｂａｃｔｏ−トリプトン１％、ＮａＣｌ１
％、テトラサイクリン２５μｇ／ｍｌ、ストレプトマイ
シン１２５μｇ／ｍｌ）１００ｍｌを収容するエーレン
マイヤーフラスコ（容積５００ｍｌ）にＬＢ培養物１０
０μｌを接種し、３００ｒｐｍで振とうしながら３０℃
で２４時間インキュベートした。培養物のＯＤ
５５０（５５０ｎｍにおける光学密度）は５であった。
−ついで、細胞を５０００ｒｐｍで１０分間遠心分離
し、元の容量と同じ容量の０．１Ｍ Ｔｒｉｓ．Ｃｌ、
０．０５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ８．０中に再度懸濁化させ
た。音波処理によって細胞を破壊し、細胞抽出物におけ
る酵素ＧＡの活性度を比色法によって評価した。ＧＡの
活性度は１４０Ｕ／ｌであり、これは元の菌株シュード
モナスＳＹ７７−１の３５倍である。
【０１４５】
【実施例１４】この実施例は、実施例２に記載如くして
得た菌株Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０５（ｐＷＢ１）による
酵素ＧＡの製造に係る。
【０１４６】接種材料を実施例１３に記載の如くして調
製した。
【０１４７】ＬＢ＋Ｔｃ＋Ｓｍ＋ＩＰＴＧブロス（組
成：ｂａｃｔｏ−酵素エキス０．５％、ｂａｃｔｏ−ト
リプトン１％、ＮａＣｌ１％、テトラサイクリン２５μ
ｇ／ｍｌ、ストレプトマイシン１２５μｇ／ｍｌ、ＩＰ
ＴＧ １ｍＭ）１００ｍｌを収容するエーレンマイヤー
フラスコ（容積５００ｍｌ）にＬＢ培養物１００μｌを
接種し、３０℃、３００ｒｐｍで２４時間インキュベー
トした。培養物のＯＤ５５０は５であった。
【０１４８】細胞を５０００ｒｐｍで１０分間遠心分離
し、ついで元の容量と同じ容量の０．１Ｍ Ｔｒｉｓ．
Ｃｌ、０．０５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ８．０中に再度懸濁
化させた。音波処理によって細胞を破壊し、細胞抽出物
における酵素ＧＡの活性度を比色法で測定した。ＧＡの
活性度は１３０Ｕ／ｌであり、これは元の菌株シュード
モナスＳＹ７７−１の３３倍である。
【０１４９】
【実施例１５】この実施例は、酵素ＧＡ製造用の新しい
発酵ブロスにおけるＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０５（ｐＷＢ
１）の発酵に係る。
【０１５０】接種材料を実施例１３に記載の如くして調
製した。
【０１５１】ＣＳＬブロス（組成：コーンスチープリカ
ーｅｘ Ｓｏｃｉｅｔａ Ｐｉｅｍｏｎｔｅｓｅ Ａｍ
ｉｄｏ Ｄｅｒｉｖａｔｉ １４％、テトラサイクリン
２５μｇ／ｍｌ、ストレプトマイシン１２５μｇ／ｍ
ｌ、ｐＨ７．５）１００ｍｌを収容するエーレンマイヤ
ーフラスコ（容積５００ｍｌ）にＬＢ培養物１００μｌ
を接種し、ついで３００ｒｐｍで振とうしながら３０℃
で２４時間インキュベートした。培養物のＯＤ５５０は
８．５であった。
【０１５２】細胞を５０００ｒｐｍで１０分間遠心分離
し、元の容量と同じ容量の０．１ＭＴｒｉｓ．Ｃｌ、
０．０５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ８．０中に再度懸濁化させ
た。音波処理によって細胞を破壊し、細胞抽出物におけ
る酵素ＧＡの活性度を比色法によって測定した。
【０１５３】ＧＡの活性度は７８Ｕ／ｌであり、これは
元の菌株シュードモナスＳＹ７７−１の約１９７倍であ
る。
【図面の簡単な説明】
【図１】プラスミドｐＷＥ３．１の遺伝子地図を示す図
である。
【図２】プラスミドｐＷＥ４．３．１の遺伝子地図を示
す図である。
【図３】プラスミドｐＣＳ１９．１の遺伝子地図を示す
図である。
【図４】プラスミドｐＴｅｃ ｔａｃの遺伝子地図を示
す図である。
【図５】プラスミドｐＷＢ１４の遺伝子地図を示す図で
ある。
【図６】プラスミドｐＷＢ１の遺伝子地図を示す図であ
る。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/86 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｒ 1:38） (72)発明者 アントネッラ・ベルナルディ イタリー国ノバーラ市ビア・アオスタ21 (72)発明者 アルド・ボゼッチ イタリー国ベルチェーリ市コルソ・イタ ーリア６ (72)発明者 ジュリアーナ・フランツォージ イタリー国ミラノ州カルビニャスコ ビ ア・モンテネーロ45 (72)発明者 ピエトロ・チェスチ イタリー国ノバーラ州サン・マルチー ノ・ディ・トレカーテ ビア・トリノ51 (56)参考文献 欧州特許出願公開469919（ＥＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) C12N 9/86 C12N 15/00 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＥＰＡＴ（ＱＵＥＳＴＥＬ)

Claims (11)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】好適な培養培地中で酵素７−（４−カルボ
    キシブタンアミド）−セファロスポラン酸アシラーゼア
    シラーゼをコードする配列を含有する大腸菌（Ｅ．ｃｏ
    ｌｉ）の菌株を生育及び誘導し、つづいて得られた培養
    物から当該酵素を抽出することからなる７−（４−カル
    ボキシブタンアミド）−セファロスポラン酸アシラーゼ
    アシラーゼを多量製造する方法において、インデューサ
    ーとしてコーンスチープリカーを使用し、プロデューサ
    ー微生物としてＮＣＩＭＢ ４０５６０、ＮＣＩＭＢ
    ４０５５９、ＮＣＩＭＢ ４０５９２及びＮＣＩＭＢ
    ４０５９３の中から選ばれる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の
    菌株を使用することを特徴とする、７−（４−カルボキ
    シブタンアミド）−セファロスポラン酸アシラーゼの製
    法。
  2. 【請求項２】得られるセファロスポリンアシラーゼの活
    性度が少なくとも９７００Ｕ／ｌである、請求項１記載
    の７−（４−カルボキシブタンアミド）−セファロスポ
    ラン酸アシラーゼの製法。
  3. 【請求項３】接種から２４時間内に、一定期間では流量
    １．５ｍｌ／ｌ・時間で、残りの発酵期間では６ｍｌ／
    ｌ・時間で培地にグルコース又はグリセリン溶液（５０
    ％ｗ／ｖ）を添加すると共に、ｐＨを７．５に維持し、
    溶存酸素を一定レベル（ｐＯ２＝１０％）に維持するこ
    とによって栄養強化を行う、請求項１記載の７−（４−
    カルボキシブタンアミド）−セファロスポラン酸アシラ
    ーゼの製法。
  4. 【請求項４】培養培地中のコーンスチープリカーの濃度
    が１〜２０％（ｖ／ｖ）である、請求項１〜３のいずれ
    か１項記載の７−（４−カルボキシブタンアミド）−セ
    ファロスポラン酸アシラーゼの製法。
  5. 【請求項５】遺伝子地図 を有する組換えプラスミドｐＷＥ４．３．１で形質転換
    させてなることを特徴とする、インデューサーとしての
    コーンスチープリカーの存在下で多量の酵素７−（４−
    カルボキシブタンアミド）−セファロスポラン酸アシラ
    ーゼを産生し得るＥ．ｃｏｌｉ ＸＬ１ Ｂｌｕｅ（ｐ
    ＷＥ４．３．１）（ＮＣＩＭＢ ４０５６０）。
  6. 【請求項６】シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｍｏｎａｓ）
    １４６Ｈ９の７−（４−カルボキシブタンアミド）−セ
    ファロスポラン酸アシラーゼアシラーゼ遺伝子に相当す
    る４Ｋｂ ＥｃｏＲ Ｉ−Ｘｂａ Ｉフラグメントを含
    有し、遺伝子地図 を有することを特徴とする、プラスミドｐＷＥ４．３．
    １。
  7. 【請求項７】遺伝子地図 を有する組換えプラスミドｐＣＳ１９．１で形質転換さ
    せてなることを特徴とする、インデューサーとしてのコ
    ーンスチープリカーの存在下で多量の酵素７−（４−カ
    ルボキシブタンアミド）−セファロスポラン酸アシラー
    ゼを産生し得るＥ．ｃｏｌｉＸＬ１ Ｂｌｕｅ（ｐＣＳ
    １９．１）（ＮＣＩＭＢ ４０５５９）。
  8. 【請求項８】遺伝子地図 を有する組換えプラスミドｐＷＢ１４で形質転換させて
    なることを特徴とする、インデューサーとしてのコーン
    スチープリカーの存在下で多量の酵素７−（４−カルボ
    キシブタンアミド）−セファロスポラン酸アシラーゼを
    産生し得るＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０５（ｐＷＢ１４）
    （ＮＣＩＭＢ ４０５９３）。
  9. 【請求項９】シュードモナスＳＹ７７−１の７−（４−
    カルボキシブタンアミド）−セファロスポラン酸アシラ
    ーゼアシラーゼ遺伝子と共に、３Ｋｂ ＥｃｏＲ Ｉ−
    ＥｃｏＲ Ｉフラグメントを含有するベクターｐＴｅｔ
    ｔａｃでなり、遺伝子地図 を有することを特徴とする、プラスミドｐＷＢ１４。
  10. 【請求項１０】遺伝子地図 を有するプラスミドｐＷＢ１で形質転換させてなること
    を特徴とする、インデューサーとしてのコーンスチープ
    リカーの存在下で多量の酵素７−（４−カルボキシブタ
    ンアミド）−セファロスポラン酸アシラーゼを産生し得
    るＥ．ｃｏｌｉＪＭ１０５（ｐＷＢ１）（ＮＣＩＭＢ
    ４０５９２）。
  11. 【請求項１１】Ｐｔａｃプロモーターに対して逆方向で
    配向するシュードモナスＳＹ７７−１の７−（４−カル
    ボキシブタンアミド）−セファロスポラン酸アシラーゼ
    遺伝子と共に、３Ｋｂ ＥｃｏＲ Ｉ−ＥｃｏＲ Ｉフ
    ラグメントを含有するベクターｐＴｅｔ ｔａｃでな
    り、遺伝子地図 を有することを特徴とする、プラスミドｐＷＢ１。
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